JPH02504274A

JPH02504274A - ヒトインシユリンアナログ類

Info

Publication number: JPH02504274A
Application number: JP63506422A
Authority: JP
Inventors: カッツォヤニス　パナヨティス　ジー．; シュワルツ　ジェラルド　ピー．
Original assignee: マウント　サイナイ　スクール　オブ　メディシン　オブ　ザ　シティー　ユニバーシティー　オブ　ニューヨーク
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-07
Publication date: 1990-12-06
Anticipated expiration: 2013-03-18
Also published as: EP0382732B1; HUT54178A; DK13990A; AU2126988A; AU616131B2; JP2729498B2; WO1989000580A1; EP0382732A1; KR970009353B1; FI98731B; DE3887338D1; HU205145B; DK13990D0; FI900249A0; KR920700227A; DE3887338T2; FI98731C; US4992418A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称超活性ヒトインシュリンアナログ類本願は、１９８７年７月１７日付米国出願第０７４゜５５８号の一部係属出願である。

発明の背景本発明は、新規超活性インシュリンアナログ類及び糖尿病治療用薬剤組成物におけるそれらの用途に関する。

インシュリンは、を椎動物の成長と代謝の調節に重要な役割を果たすホルモンである。多くの細胞がグルコース及びアミノ酸類を正常に利用できない結果、インシュリン欠乏により重篤な代謝異常が発生する。グルコース代謝不可によって、炭水化物、脂肪及びタンパク質の異常代謝が起こる複雑な慢性代謝疾患である糖尿病がヒトで発症する。糖尿病が最も完全に発症した臨床症状では、インシュリン又はインシュリン活性が全く又は実質的に欠乏していることが糖尿病の特徴であり、糖尿、ケトン尿、成長阻害及び負のチッ素バランスと関連している。こうした状態は、無制限の脂肪酸酸化による急性代謝性アシド−シス又はケトン体産主に必要な充分な脂質貯留の欠乏による栄養失調によって最終的に死に至ることがある。栄養失調とは、著明な疲労感、極端な体重減少及び食物が長期にわたり極端に欠乏していることから起こる代謝低下を特徴第２５版。

１９２０年代になってインシュリンが発見され精製されたこと及び糖尿病との関連から、本疾患に介入すシカゴ大学出版局（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｃａｇｏ　Ｐｒｅｓｓ　）　。

シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ　）　、イリノイ州を参照。現在、糖尿病患者へのインシュリン投与は本疾患コントロールの第一義的な治療手段となっている。

インシュリンは、Ａ及びＢと称される二つの短いポリペプチド鎖が一定のジスルフィド架橋で互いに連結し構成されている６０００ダルトンのポリペプチドである。検討されたほとんど全てのインシュリンでは、アミノ酸２１個の長さのＡ鎖はまた内部ジスルフィド架橋を有している。Ｂ鎖は、アミノ酸３０個の長さである。多くの真核生物タンパク質と同様に、インシュリンは前駆体として合成され、合成後２つのポリペプチド鎖の成熟活性ホルモンにプロセシングされる。

インシュリンの直接前駆体はプロインシュリンで、隣接する塩基対残基によってＣペプチドと称されるアミノ酸約３１個の連結ペプチドに結合するＢ鎖及びＡ鎖から成る単一鎖のポリペプチドである。プロインシュリン分子中におけるこの３個のペプチド類の順序は、ＮＨ２−Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−ペプチド−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ鎖−〇〇ＯＨである。しかし、インシュリンｍＲＮＡの転写産物は、細胞膜を介して運搬されるか又はその中に挿入されるタンパク質に特徴的で２４個のアミノ酸から成る主に疎水性のシグナルペプチドをＮＨ２末端に有するプロインシュリンのプレプロインシュリン（プロインシュリン前駆体）である。

プレプロインシュリンは膵臓全域に拡散しているランゲルハンス島内部に局在した膵臓β細胞中で合成される。このシグナルペプチドの除去が粗面小細胞で起こり、生成した完全に折りたたまれている酸化プロインシュリンがイルジ器官に運搬され分泌顆粒に充填される。折りたたまれたプロインシュリンはジスルフィド結合によって安定化される。この分泌顆粒の成熟時において、折りたたまれたプロインシュリン分子はその対となった塩基残基で特異的プロテアーゼによって切断され、インシュリン及び先のＣ−ペプチドを放出する。

これまで述べたように、糖尿病患者の治療として、コントロール量のインシュリンを糖尿病患者に投与することが挙げられる。このようにして投与されるインシュリンは、はとんどの場合、動物の膵臓、特にウシ及びブタから得られてきた。

ウシ及びブタインシュリンはヒトインシュリンと同一の方法でほとんど同一の力価でホルモンの恒常性を維持するべく作用するが、しかし、それらは外来タンパク質であるので免疫反応を惹起し有用性を減退させている。更に最近になって、組換えＤＮＡ技術によって作製されたヒトインシュリンが治療手段に付は加えられた。組換えＤＮＡ又はその他の技術により作製されたヒトインシュリンを使用することで動物インシュリンの使用に付随した有害な免疫学上の問題が起こる可能性はないようである。しかし、天然のヒトインシュリンが入手できるようになっても糖尿病患者に本ホルモンを投与することで正常代謝の回復に常に充分であるとは限らない。従って、より活性に優れた別のインシュリン又は糖尿病治療のその他の手段が必要である。

家族内の高プロインシュリン血症は、プロインシュリン様分子が血清中に著明に増加することを特徴とする遺伝的疾患である。この稀有疾患を有する３家族が同定されている。この家族中２家族で構造異常のプロインシュリン様分子が見られた。この遺伝的欠陥は、プロインシュリンにアミノ酸置換を起こしその結果インシュリン形成プロテアーゼによるプロインシュリン切断が不完全となる突然変異として同定された。

第３番目の家族中の疾患を有する者は、プロインシュリンとほぼ同じ大きさのプロインシュリン様分子を産生じ、これはレセプター結合アッセイで正常プロホルモンと同様に挙動する。この第３番目の家族中の疾患を有する２名から採取したクローン化インシュリン遺伝子の配列解析から、インシュリンＢ鎖の第１０位に対応する位置でプロインシュリン分子のヒスチジンの代わりにアスパラギン酸１個で置換する単一コード突然変異が明らかとなった。チャン（Ｃｈａｎ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）（１９８７）、８４巻、２１９４−２１９７頁。この突然変異はその後のプロインシュリンからインシュリンへのプロセシングを阻害し、それにより突然変異プロインシュリンの蓄積が起こると信じられてきた。本突然変異が次のプロセシングを阻害する方法の詳細は現在公知でない。ヒトインシュリンアナログの［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンはこの突然変異プロインシュリンに対応し、今合成され、かつ、天然のインシュリンより強い力価を有することが示された。

又、インシュリンＢ鎖のカルボキシ末端の構成要素は同様にインシュリンの生物活性に影響を及ぼすらしいことも見い出された。特に、このＢ２５部位はインシュリンアナログ類の力価に関与しているようである。

インシュリンＢ鎖のＣ末端ペンタペプチド配列の除去及びこの新規形成Ｃ末端ＰｈｅＢ２５のカルボキシル基のアミド化によって、（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ｐｈｅ１２５−α−カルボキサミド］インシュリンという１個のアナログが生成し、これは天然のホルモンに匹敵する力価を示すことが明らかと２６１　：　７３３２−４１　（１９８６）；コスマトス（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、）　、　　１４　；　４５７−７１（１９７９）；カサレト（Ｃａｓａｒｅｔｏ）　　ら、バイオロジカル−ケミストリ・ホッペーセイラ−（Ｂｉｏｌ、　　Ｃｂｅｍ。

Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ）　、　　３６８　：　７０９−１６　　（１９８７）を参照。ＰｈｅＢ２５を２〜３の他のアミノ酸残基と置換すること及びこの置換インシュリン類のＢ２６−Ｂ３０部位をさまざまに改変することによってほとんど全く無活性から天然のインシュリンより高い力価に至るまで力価の異なるアナログ類が作られた。ナカガ（１９８７）。これらのうちで、（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ｔｙｒ”５−α−カルボキサミド］インシュリン及びそのＨｉｓＢ２’アナロクはインシュリンよりも約２７０−３００％高い力価を示す。

これらの研究に基づき、インシュリンのＢ２５アミノ酸残基は受容体と相互作用しそれによってホルモン受容体結合に関係するインシュリン分子内のある未確定領域に構造変化を誘起すると示唆された。このＢ２５受容体相互作用は、Ｂ２５残基に対する改変の性質及びＢ鎖Ｃ末領域が変えられる度合に応じＣ末Ｂ鎖領域によってプラスにもマイナスにも変えることができる。

もうひとつのヒトインシュリンアナログの（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［ＡＳｐ６１０゜Ｔｙ　ｒ　１２５−α−カルボキサミトコインシュリンも同様に合成されかつ天然のインシュリン類よりも高い力価を有することが明らかとなった。

発明の要旨本発明によって、構造；を有する［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンという超活性インシュリンアナログが提供される。

このインシュリンアナログ（本文で“１０−アスパラギン酸−Ｂ”）は、Ｂ鎖の第１０位にヒスチジンを有する天然のヒトインシュリンよりも有意に高い力価を示す。

また、本発明によって、構造；を有する超活性インシュリンアナログの（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失 −［Ａ　Ｓ　Ｉ）　８１０゜ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリン（本文で“Ａｓｐ”’アナログ）が提供される。Ｂ鎖の第１０位の変化に加えてＢ２６−８３０部位が除去されＰｈｅＢ２５がＴｙｒ−α−カルボキサミドで置換された。このインシュリンアナログは、前記の［１０−アスパラギン酸− Ｂ］　ヒトインシュリンよりもはるかに高い力価を示す。

もうひとつのアナログである（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ｇ　１　ｕ”０．　　Ｔｙ　ｒＢ２５−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン（本文で、“Ｇ　１　ｕ　”’アナログ）は構造；を有し、第１０位のＡｓｐの代わりにＧｌｕを含有している点で先のアナログと異なっている。このインシュリンアナログは、天然のインシュリンよりも少なくとも２０倍活性が高い。

（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＸＢ１１１゜Ｔｙｒ”５−α−カルボキサミトコインシュリン（式中、Ｘは置換される残基である）分子中のＢＩＯアミノ酸残基（Ｘ）を更にα−アミノアジピン酸又は高度の同族体と置換すること、又はその他の天然にない酸性アミノ酸とすら置換することで、はるかに強力な力価のインシュリンアナログが産生ずると確信されている。又、８１０位に置換した酸性アミノ酸の中心となる疎水性性質がこれらのアナログが示す強力な力価に寄与する因子であると信じられている。このＢ１０アミノ酸残基（Ｘ）を、環状構造又は、開放鎖となっており疎水性特性を有しかつ遊離カルボキシ基又は他の荷電部位を保持する種々のアミノ酸と置換することで、又、他の極めて強力なインシュリンアナログが結果的に生成できる。

本発明は又、治療を要する患者の糖尿病治療用薬剤組成物に関し、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失［Ａｓ　ｐ　Ｂ　１°、ＴｙｒＢ２’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン、（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失［Ｇｌ　ｕ　８１０　、７　ｙ　ｒ　１２５　　ａ−カルボキサミトコ又は高度のＢＩＯ同族体から成る群から選択したヒトインシュリンアナログの有効治療量と薬剤学的に許容できる担体から成る。

更に、本発明は、インシュリン療法を必要とする糖尿病患者に対し、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６．Ｂ５０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”０．　　Ｔ　ｙ　ｒＢ２’−ａ−カルボキサミド）ヒトインシュリン、又は上述の他のＢＩＯアナログ類のいずれかから成る群から選択したヒトインシュリンアナログの有効治療量を薬剤学的に許容できる担体とともに投与することから成る糖尿病の治療方法に関する。

図面の簡単な説明第１図は、ＣＭ−セルロースカラムからの粗ヒト［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖Ｓ−スルホン酸エステルの溶出を示したクロマトグラムである。

第２図は、ヒトＡ鎖Ｓ−スルホン酸エステルとヒト［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖Ｓ−スルホン酸エステルの組合せ混合物の溶出を示したＨＰＬＣクロマトグラムである。Ａ図は、最初のクロマトグラフィ分離を示しており、Ｂ図はＡ図に示した３２．３２分に溶出したピークの内容物の再クロマトグラフィを図示したものである。

第３図は、１２５■−インシュリンのラット肝血漿インシュリン受容体の［１０ −アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン（０）及びウシインシュリン（０）による競合阻害を示したグラフである。

第４図は、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン及びウシインシュリンのラット肥満細胞における脂質生合成刺激に及ぼす効果を示したグラフである。

第５図は、ＣＭ−セルロースカラムからの粗ヒト（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐｌｏ、Ｔｙｒ−ａ−カルボキサミド２５）Ｂ鎖Ｓ−スルホン酸エステルの溶出を示したクロマトグラムである。

第６図は、ヒトＡｆｌＳ−スルホン酸エステル及びヒト（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐｌｏ、Ｔｙｒ−α−カルボキサミド２５］Ｂ鎖Ｓ −スルホン酸エステルの組合せ混合物の溶出を示したＨＰＬＣクロマトグラムである。Ａ図は最初のクロマトグラフィ分離を示している。Ｂ図は、Ａ図に示した３６゜８６分に溶出したピークの内容物を再クロマトグラフィし示したものである。

第７図は、１２５１−インシュリンのラット肝血漿インシュリン受容体に対する結合の（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　＋　Ｔ　ｒ　ｙ””　−ｔｉ−カルボキサミドコヒトインシュリン（０）及びウシインシュリン（０）による競合阻害を示したグラフである。

第８図は、（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［ＡＳｐＢｌｏ　７　ｙ　ｒ　＠　２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリン及びウシインシュリンのラット肥満細胞における脂質生合成刺激に及ぼす効果を示したグ本発明は、構造；の超活性インシュリンアナログ［１０−アスパラギン酸−Ｂコヒトインシュリンを提供する。

本発明はまた、構造；の超活性インシュリンアナログ（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”０．　　Ｔｙ　ｒ１２’　−ａ　−カルボキサミド）ヒトインシュリン及びＧｌｕ”０゜α−アミノアジピン酸８ユ０又はより高度のＢＩＯ同族体に関する。

インシュリンアナログという用語は、ヒト（及び他種の）インシュリンの基本的Ａ鎖及びＢ鎖構造を有し天然のインシュリン内におけると同位置に半システィン残基を全て有するタンパク質を言う。従って、インシュリンアナログ類は、天然のインシュリンのジスルフィド架橋結合を保持している。有用なインシュリンアナログ類は、分子の単鎖又は両鏡内で１個以上のアミノ酸が付加、欠失、置換又は改変されていることによって天然のインシュリンと異なることがあるが、インシュリンカ価の少なくとも一部は保持していなければならない。例えば、カッツォヤニス（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ）。

トリートメント・オブ・アーリー・ダイアビーテス（Ｔｒｃａｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｅａｒ１７　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　）　　（１９７９）　。

３１９−３２７頁、プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌ。

Ｃｏｒｐ、　）　　ンブロンデル（Ｂｌｏｎｄａｌｌ）　、　アドバンシイズ・イン・プロティン・ケミストリ（Ａｄｖ、Ｐｒｏｔ。Ｃｂｅｍ、）（１９７２）、２６巻、３３０−３６２頁を参照。

Ｂ鎖の第１０位のヒスチジンのアスパラギン酸又はグルタミン酸との置換及び／又はＰｈｅＢ２５のＴｙｒ−α−カルボキサミド置換と８２６−８３０消失によってヒトインシュリンと異なる本発明のインシュリンアナログ類が天然のインシュリン類、特に糖尿病治療に用いられているインシュリン類よりも優れた力価を有することが見い出されたことは予測外であった。

［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン。

（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−Ａｓｐ！１１’。

７ｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリン又は他のＢＩＯ置換アナログ類は、当業者に公知のいずれの種々の技術によっても製造できる。例えば、インシュリンアナログの成分Ａ鎖及びＢ鎖は、例えばフラグメント縮合のような固相ペプチド合成技術及び液相技術も含めた公知のペプチド合成技術のいずれによっても合成できる。例えば、エリックソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）及びメリフィールド（Ｍｃｒｒｉｆｉｅｌｄ）　、ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　　（１９７６）　、　　２巻、３章、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、　ニューヨーク；ブレーク（Ｂｒａｋｅ　）ら、プロシーディングズーオブ・ナショナルアカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ　）　　（１９８３）　、　　８０巻。

１５５６−１５５９頁をペプチド合成技術の検討のために参照。ヒトインシュリンアナログ類は、正常膵インシュリン又は組換えインシュリンの還元又は酸化的亜硫酸分解後に単離したヒト又はブタのＡ鎖を［１０−アスパラギン酸］、　　（Ｂ２６−８３０）ペンタプチド消失−［ＡｓｐｌＯ，Ｔｙｒ−α−カルボキサミド２５］又はＧｌｕ”’Ｂ鎖又はそのアナログをペプチド合成技術又は組換えＤＮＡ法で調製したものと結合することによって調製できる。ブタ及びヒトインシュリンのＡ鎖はアミノ酸配列において全く同一であり、ブタＡ鎖は、［１０− アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ”’　、Ｔｙ　ｒ”’−ａ−カルボキサミトコ又はＧｌｕＢ１ °ヒトインシュリンアナログ類を製造するいずれでの方法でもヒトＡ鎖と容易に置換できる。その他のＡ鎖アナログ類もまた本発明の改変Ｂ鎖と結合できる。

アスパラギン酸、グルタミン酸又はαアミノアジピン酸又は高度同族体を１０位に有し及び／又はＢ２６−Ｂ３０部位の消失及び２５位ＰｈｅのＴｙｒ−ａ−カルボキサミドによる置換を有するヒトインシュリンＢ鎖を製造する組換えＤＮＡ法として上記のようなり鎖アミノ酸配列をコードするインビトロ合成りＮＡのクローン化と発現が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これとは異なり、ヒトインシュリン位特異的突然変異技術のいずれによっても改変Ｂ鎖を産生ずるように誘発できた。例えば、スミス（ＳｍＮｈ）。

アニュアルーレビュー・オブ・ジエネテイックス（Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）　　（１９８５）　、　　１９巻、４２３−４６３頁；ボッスタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、サイエンス（１９８５）、２２９巻、１１９３−１２０１頁を参照。

一般に、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”０．　　Ｔｙ　ｒＢ２’　−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン又はその他のＢＩＯ改変アナログを調製するためには、いずれかの公知技術で得られたヒト又はブタインシュリンＡ鎖をいずれかの簡便な方法で調製された改変ヒトＢ鎖と結合する。このＡ鎖及び改変Ｂ鎖が安定したＳ−スルホン化形態であることが好適で、次いでこれらを公知の操作で再結合し正常活性ヒトインシュリンアナログ類を製造できる。公知の再結合技術は、カッツォヤニス（Ｋａｊｓｏｌａｎｎｉｓ　）の米国特許第３．４２０，８１０号及びチャンス（Ｃｈａｎｃｅ）らの米国特許第４．４２１，６８５号でわかる。例えば、米国特許第４．４２１，６８５号は、水性媒体中でジチオスレイトール又はシスティンのようなチオール還元剤の存在下においてＳ−スルホン化Ａ鎖とＳ−スルホン化Ｂ鎖を一緒にするインシュリン形成の一段階工程を提供している。再結合条件として、（１）約８から１２のｐＨ，（２）約０．　１から５０ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度、（３）混合物中に存在する総Ａ鎖及びＢ鎖Ｓ −スルホン酸エステル類中の各５−ＳＯ３基当りＳＨ基約０．　４から２．５個を産生ずる濃度のチオール換言材が挙げられる。［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ ”’　、　Ｔ　ｙ　ｒＢ２’　−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン又はその他の３３１０置換アナログ類のいずれかの形成は、インシュリンＳ−８結合を形成できる酸素源を提供する環境中において約Ｏ℃から２５℃の温度に反応を維持することによって起こる。

一旦再結合反応が完了すると、インシュリンアナログを単離し当業者に公知の種々の技術で純度及び活性をアッセイできる。インシュリン及びインシュリンアナログ類の精製に通常用いられる技術は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィのようなりロフトグラフィ法である。生成物の純度は、ＨＰＬＣ，ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸分析及びアミノ酸配列決定などを含む種々の方法で決定できる。

一般にインシュリンアナログ類は一部残存インシュリン活性を保持しているが、こうしたアナログ類の力価は天然のインシュリンの力価の一部に過ぎないことが通常である。米国薬局方（ＵＳＰ）基準ではヒト。

ウシ及びブタインシュリンの力価はタンパク質１ｍｇ当たり約２５−２６１Ｕ（国際単位）である。インシュリンカ価を測定するアッセイで［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンが天然のインシュリン類よりも約４−６倍強力であると決定されたのは驚くべきことであったし、（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐＢｌｏ、　　Ｔｙ　ｒＢ２’　−ａ−カルボキサミトコ　ヒトインシュリンは天然のインシュリンよりもおよそ１１−１３倍強力であることが見い出され、更にＧｌｕ！＋１０アナログは天然のインシュリンよりも２０倍強力であった。

インシュリンカ価を測定する標準的アッセイ法として、（１）例えば、ラット肝血漿膜分画のような細胞膜上に存在するインシュリン受容体に特異的に結合した！２５　Ｉ−インシュリンの５０％を置換するのに要するインシュリン対インシュリンアナログの比としであるインシュリンの相対的効果を定義するインシュリンラジオレセプターアッセイ法、（２）［３−３Ｈ］グルコースの有機抽出可能物質（すなわち脂質）への最大変換の５０％を達成するのに要するインシュリン対インシュリンアナログの比として相対的インシュリンの力価を定義する例えばラット肥満細胞を用いて行う脂質生金性アッセイ法、（３）グルコース−１−［ ”Ｃ］の［１４ＣＯ２］への最大変換の５０％を達成するのに要するインシュリン対インシュリンアナログの比として相対的インシュリンアナログの力価を定義する単離脂肪細胞中におけるグルコース酸化アッセイ法、（４）特異的抗インシュリン抗体への結合をインシュリン又はインシュリンアナログが１２５Ｉ−インシュリンと競合する作用を測定することによってインシュリンアナログ類の免疫原性を測定できるインシュリンラジオイムノアッセイ法、及び（５）培養リンパ球のような特異的インシュリン受容体を保持することが公知の細胞に対するインシュリン又はインシュリンアナログの結合を測定するその他の方法、などが挙げられる。例えば上述のアッセイ法（１）、　（２）及び（５）のような相対的インシュリンカ価を測定する標準アッセイ法では、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンは天然のインシュリン類よりもおよそ４−６倍活性が高いことが測定され、ＣＢ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　、　　Ｔ　ｙ　ｒＢ２’　、　　−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは天然のインシュリン類よりも１１−１３倍更に強力であることが見い出され更にＧｌｕ！１１０アナログは天然のインシュリンよりも２０倍更に強力であった。

本発明のヒトインシュリンアナログ類はまた、糖尿病患者に投与する薬剤組成物に調剤できる。この薬剤組成物は、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ　Ｂ　１°、ＴｙｒＢ２’、ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン又はその他いずれかのＢＩＯアナログ類から成る群から選択されたヒトインシュリンアナログの糖尿病患者のホルモン恒常性の達成促進に有効な治療量と薬剤学的に許容できる担体から成る。糖尿病治療用のすべてのインシュリン製剤と同様に、各患者においてホルモン恒常性を達成するために活性化合物の適切な治療量を決定しなければならない。考慮すべき要因として、糖尿病症状の重篤度及び組成物投与経路が挙げられる。最終的には、糖尿病患者を治療する特定の内科医がこの薬剤組成物の量と投与経路を決定する。天然のインシュリン類は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０２から約５単位のヒトインシュリン活性を付与できる治療投与量として通常患者に投与される。

例えば、米国特許第４．６５２，５４７号を参照。

これらの新規インシュリンアナログ類はインビトロで天然のインシュリンよりも強力であるので、糖尿病患者で恒常性を達成するのに要するそれらの治療量は、現在糖尿病治療に用いられる天然のインシュリン治療量よりも少ないと信じられている。更に、これらのインシュリンアナログ類のもうひとつの重要な利点として、糖尿病患者血中からのクリアランスが大きいことが挙げられる。血中からのインシュリンクリアランスが細胞上のインシュリン受容体によって媒介されることは公知である。［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンは天然のインシュリン類に比較してこのインシュリン受容体に約５位強く結合し、（Ｂ２６ −８３０）　−［ＡｓｐＢｌｏ、Ｔｙｒ”５−ａ−カルボキサミド］　ヒトインシュリンは１１倍から１３倍。

Ｇ　１　ｕ　１１１０アナログは２０倍強く結合することが明らかとされて以来、これらのインシュリンアナログ類は患者血中から天然のインシュリンよりも早い速度で消失するのであろうと信じられている。その結果、循環インシュリンの成長促進効果関連血管毒性が［１〇−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［：ＡＳｐ！ｌｉ０゜Ｔ　ｙ　ｒ　Ｂ２’−α−カルボキサミトコヒトインシュリン。

ＧｌｕＢ１０アナログ又はその他のアミノアジピン酸又はより高度のＢＩＯ同族体の使用によって糖尿病患者治療において軽減できると信じられている。

［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＡｓｐＢｌｏ、Ｔｙｒ１１２’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン、Ｇｌｕ”°アナログ又はその他のαアミノアジピン酸又はより高度のＢＩＯアナログ類から成る群から選択されたインシュリンアナログの有効治療量を含有する薬剤組成物は、インシュリン治療を必要とする糖尿病患者に非経口的に投与できる。本組成物を筋注、皮下注文は静注投与するのが好適である。

本組成物はまた、鼻腔スプレによって患者に投与できる。一方長期恒常性コントロールのためには、本組成物を患者に投与するために埋め込み可能なポンプに入れることができる。長期間にわたり患者にコントロールしながら薬物投与するこのような埋め込み可能型装置が当技術で公知である。本組成物は更に、薬剤学的に許容できる担体から成るが、これらの担体は投与患者に有害であってはならない。本担体はまた、本組成物の活性成分すなわちヒトインシュリンアナログに全く有害な影響を示してはならない。活性成分として有効治療量の［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、又は（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ”’　、Ｔｙ　ｒ”’　−α−カルボキサミトコヒトインシュリン、又はＧｌｕ”’アナログを含有する薬剤組成物の適切な担体及びその他賦形剤は、インシュリン含有組成物を提供する米国特許第４，６５２゜５４７号に見い出すことができる。

本発明を更に下記の特定実施例で例示するが、これらは本発明の範囲をいかなる方法でも制限することを意図していない。［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐｌ） ’　、　　Ｔｙ　ｒ”　−ａ−カルボキサミトコの合成に関し特定例を示しているが、同操作はＧｌｕＢｌｏ、　　α−アミノアジピン酸ｍｓｏ又は他の高度ＢＩＯ同族体の合成に用いられる。

［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンは゛フラグメント縮合法を用いるペプチド合成によって合成した。（例えば、全般的技術について、ブレーク（Ｂｒａｋｅ　）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ。

ＡｃａＬ　　Ｓｃｉ、）　　（１９８３）　、　　８０巻、１５５６−１５５９頁参照）。全ての中間ペプチド誘導体の均質性は、６０６０シリカゲル（イースマン・クロマトグラム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）シート）上の薄層クロマトグラフィによって確認した。このクロマトグラムの展開に用いた溶媒系は、クロロホルム・メタノール・水（４５：１０：１；８９：１０：１；及び２００ニア５：１３）であった。

［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンは、チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）らの米国特許第４，４２１，６８５号に述べられているように、ジチオスレイトール存在下においてＳ−スルホン化形態のヒトインシュリンＡ鎖をヒトインシュリン［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖の合成Ｓ−スルホン化誘導体と組み合わせることによって調整された。このＳ−スルホン化ヒトＡ鎖はブタインシュリンの各鎖と同一であり（ニコル（Ｎｉｅｏｌ　）ら、ネーチャ（Ｎａｊｕｒｅ）　　（１９６０）　、　　１８１巻。

４８３−４８５頁）、カッツォヤニス（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ　）らがバイオケミストリ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　（１９６７）　。

６巻、２６３５−２６２４頁に記載の如くブタインシュリンの酸化亜硫酸分解及び生成したＳ−スルホン化Ａ及びＢ鎖のカラムクロマトグラフィによる分離によって調整された。Ｓ−スルホン化ヒト［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖の合成は、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）及びカッツォヤニス（Ｋａｊｓｏｙａｎｎｉｓ　）がジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティ・パーキン・トランザクションズ（Ｊ、　　Ｃｂｅｍ、　　Ｓｏｃ、　　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒ＋＋ｎｓ）　　Ｉ　　（１９７３）、２８９４−２９０１頁に記載の如くＳ−スルホン化天然のヒトＢ鎖の合成と同様に行なわれた。Ｃ末端のへキサベ力ペブチド（配列Ｂ１５− Ｂ２Ｏ）を隣接するヘキサペプチド（配列Ｂ９　７３１４）に結合し、Ｃ末端ドコサペプチド（配列Ｂ９−Ｂｏｏ）を生成した。次にこれをＮ末端オクタペプチド（配列ＢニーＢ８）に結合し保護Ｂ鎖アナログを生成後、これを液体フッ化水素に曝し生成したスルフヒドリル基を酸化的亜硫酸分解しＳ−スルホン化形態の［１０−アスパラギン酸コＢ鎖を得た。

表１に本ペプチドの合成に用いられた化合物及びアミノ酸ブロック剤の一部を述べ、それらに関連する略語を示した。

ｔ−ブトキシカルボニル　　　　　　　　　　Ｂｏｃｔ−ブチル　　　　　　　　　　　　　　　　Ｂｕ’シクロヘキシル　　　　　　　　　　　　　ｃＨｅｘジシクロへキシルアミン　　　　　　　　　ＤＣＨＡジメチルホルムアミド　　　　　　　　　　　　ＤＭＦジメチルスルホキシド　　　　　　　　　　ＤＭＳＯジフェニルメチル　　　　　　　　　　　　　ＤＰＭＮ、　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド　ＤＣＣｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール　　　　ＨＯＢＴベンジルオキシカルボニル　　　　　　　　　　　ＺＡ、Ｓ−スルホン化［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖の合成　Ｚ、Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）　・ＯＨ，ＤＣＨＡ　（化合物■）本化合物は、各Ｂｏｃ誘導体（ベニンシュラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａ’ｂｏｒａｌｏｒｉｅｓ））　からトリフルオロ酢酸による脱ブロック及び生成した産物のカルボベンゾキシル化によって調製された。生成した誘導体は、ジシクロヘキシルアミン塩としてエーテルから結晶化した。融点１３１− １３２℃。

Ｃ，ユＨ４ａ　Ｎ　２０　ｂ分析計算値：Ｃ，ｓｅ、４．Ｈ。

８、　８８；Ｎ、　　５．　４゜実験値：Ｃ，６８，３；Ｈ９，１１，Ｎ、　　５．　１．　　Ｚ。

Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）−Ａｌａ−ＯＢｕ’　　（化合物■）化合物Ｉ　（９，８ｇ）を０．２ＮＨ２ＳＯ２及びエチル酢酸で分配し有機層を分離し、水洗後乾燥（ＭｇＳ０４）、更に乾燥するまで濃縮した。残渣のＤＭＦ（３０ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、Ｈ−Ａｌａ・ＯＢｕ’　　［シュワルツ（Ｓｃｈｖａｔｔｘ）及びカッツォヤニス（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ　）　、同上が記載の如くＺ−Ａｌａ・ＯＢｕ”　　（５，６ｇ）から調製コを添加後ＨＯＢＴ（２，３ｇ）及びＤＣＣ（３，７ｇ）を加えた。室温で２４時間後、尿素副産物をろ去しろ液を酢酸エチル（５００ｍｌ）で希釈後、ＩＭＮａＨＣＯ，、水。

０．２ＮＨＣ１及び水で順次洗浄し乾燥後、減圧下で　・乾燥するまで濃縮した。生成物は薄層クロマトグラフィ上で均一な油状物［８ｇ（９０％）コとして得られ、更に全く特性解析を行うことなく化合物■の合成に用いられた。

Ｚ、Ｖａ　１−Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）−Ａｌａ−ＯＢｕ″（化合物■）メタノール（１５０ｍｌ）中化合物ＴＩ（８ｇ）を１０％ｐｄ／Ｃ触媒（２ｇ）上で３時間水素化した。

本触媒をろ去しろ液を減圧下で乾燥するまで濃縮した。残渣をＤＭＦ　（３０ｍｌ）中Ｚ−ｖａｌ−ｏＨ（４，１ｇ）、ＨＯＢＴ　（２，７ｇ）　及びＤＣＣ（３，３ｇ）の活性化化合物と混合した（アミノ成分添加前に室温で３０分活性化した）。２４時間後、化合物■で記載した方法と同一方法で生成物を単離した；油状物、８．７ｇ　（８５％）。本物質は薄層クロマトグラフィ上で均一で、更に特性解析を行うことなく下記の合成段階で用いた。

Ｚ拳Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）−Ａｌａ　・ＯＢｕ’　　（化合物ＩＶ）上述の如く化合物ＩＩ［（８ｇ）を水素化し生成した油状残渣をＤＭＦ　（３０ｍｌ）に溶解した。この溶液に対してＺ−ロイシンＰ−ニトロフニニルエステル（５，５ｇ）及びＨＯＢＴ　（１，８ｇ）　を添加した。

４８時間後混合物を酢酸エチル（２５０ｍ　ｌ）で希釈後０．５ＮＮＨ４０Ｈ，水、０．２ＮＨＣ１及び水で順次洗浄、乾燥（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　）後、イン・バキュオで乾燥するまで濃縮した。残渣９５％エタノールから再結晶した。重量８．ｊｇ　（８８％）融点１９〇−１９４°　；［α］％’−２０，３°　（ｃｌ、ＤＭＦ）。

Ｃ３７Ｈ５ＢＮ　４０９分析計算値；Ｃ，６３，２，Ｈ。

８、　３１　、Ｎ、　　８．　　Ｏ，実験値：Ｃ，６２，９，Ｈ。

８、３７；Ｎ、　８．１゜Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）−Ａｌａ・ＯＢｕ’　　（化合物Ｖ）先に記載のように化合物ＩＶ　（１，５ｇ）を水素化−しこの残渣をＢｏｃ−Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）・ＯＨ（ペニンシュラ・ラボラトリーズ（ＰｅｎｉｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）　　（０，８ｇ）　、　ＨＯＢＴ　（０，３４ｇ）及びＤＣＣ（０，５２ｇ）のＤＭＦ　（１０ｍ　ｌ）中活性化混合物に添加した（アミノ成分添加前に室温で３０分活性化した）。２４時間後、反応混合物を化合物■について記載にように処理し、本生成物を酢酸エチル・石油エーテルから再沈殿によって精製した。

重量１．５ｇ　（８５％）、融点２０３−２０５°　；口αコ　２Ｄ’−８，９ °　（ｃ　　１．　　ＤＭＦ）、Ｃ４４Ｈ，、Ｎ。

０１□の分析計算値：Ｃ，６１，Ｏ；Ｈ，８，７２；Ｎ。

８．１゜実験値：Ｃ，６０，７，Ｈ，８，５６，Ｎ。

７．８．ＢＯＣ−３ｅｒ　（Ｂ２１）−Ａｓｐ　（ｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）　−Ａｌａ・ＯＨ（化合物ＶＩ）化合物Ｖ（Ｉｇ）のトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）溶液を室温で２時間保存し次いでインバキュオで乾燥するまで濃縮し残渣を冷エーテルで粉末とした。固体状の脱ブロツクペンタペプチドトリフルオロ酢酸塩が形成されこれをろ過しＫＯＨ上で乾燥した。ＤＭＦ（１０ｍ　ｌ）中Ｂｏｃ−８ｅｒ　（Ｂ２１）　・ＯＨ（１゜２ｇ）、ＨＯＢＴ　（０，５ｇ）及びＤＣＣ（０，６ｇ）の活性化混合物を調製し３０分間インキュベーション後、ペンタペプチドトリフルオロ酢酸塩のＮ −メチルモルホリン（０，１３ｍ１）含有ＤＭＳＯ（１０ｍ　ｌ）溶液中にろ過した。２４時間後、反応混合物を冷水（１００ｍ　ｌ）で希釈し沈殿した生成物をろ去し乾燥、更に酢酸エチル・石油エーテルから再沈殿した。

重量０．９ｇ（９０％）；融点２００−２０３°　；［αコ　２Ｄ６−１７．８ °　（ＣＩ、　　ＤＭＦ）ｏ　　Ｃ３０Ｈ７８Ｎ６０ユ４分析計算値：Ｃ，ｓｏ、　　８；Ｈ，７，９６；Ｎ、　　８．　５゜実験値：Ｃ，６１，４，Ｈ，８，２５；Ｎ、　　８．　７゜酸加水分解後のアミノ酸比：Ａｓｐ□。

Ｓ　ｅ　ｒｏ、Ｂ　Ｇ　１　ｕｌ、ｏ　Ａ　１　ａｓ、ｏ　Ｖａ　ｔｌ、）Ｌｅｕｌ。。

Ｂｏｃ−３ｅｒ　（Ｂ２１）−Ａｓｐ　（ｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ｇｌｕ　（ｃＨｅｘ）−Ａｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　（Ｂ２１）−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ（Ｄｐｍ）　−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（Ｂ２１）　　Ａｒｇ（Ｎｏ２）−Ｇ１３’　　１）ｈｅ−ｐｈｅ−Ｔｙｒ（Ｂ２１）−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　（Ｚ）−Ｔｈｒ（Ｂ２　１　）　　・ＯＨ２１（化合物ｖｌ）シュワルツ（Ｓｃｂｖａｒｊｚ）らがインタナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・エンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　ＰｅｐＬ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）　　（１９３ｌ）　。

１７巻、２４３−２５５頁に記載の如く調製したヒトインシュリンＢ鎖部分保護へキサデカペプチド（配列Ｂ１５−Ｂ３°）の遊離塩基（４００ｍｇ）、化合物ＶＩ（４９４ｍｇ）及びＨＯＢＴ　（８０ｍｇ）の懸濁液を溶液となるまで攪拌した。ＤＣＣ（１００ｍｇ）添加抜本溶液を４８時間４℃で攪拌し次に９５％エタノール（１５０ｍ　ｌ）で希釈した。沈殿したドコサペプチド（配列Ｂ９−Ｂ３°）をろ去し、９５％エタノールで洗浄後乾燥した。重量４５０ｍｇ　（８８％）。酸加水分解後のアミノ酸解析で、モル比で示した下記の組成が得られた。

Ａｓｐｌ、□Ｔｈｒ２．ｏ　５ｅｒ１．、Ｇｌｕ２．。

Ｐ　ｒｏｌ、ｏ　Ｇ　１　ｙ２，２　Ａｌａｏ、Ｖａ　１１．ｇＬ　ｅ　ｕ２．９　　Ｔｙ　ｒｌ、９　　Ｐ　ｈｅ２．ｏ　　Ｌ　ｙ　Ｓｌ、ｌＡｒｇｏ７　（ＣｙＳは測定しなかった。）Ｈ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ　− Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　（ＳＯ３）−Ｇｌｙ−８ｅ　ｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１− Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ化合物ＶＩＩ　（４００ｍｇ）のトリフルオロ酢酸・酢酸（７：３；ｖ／ｖ）（１０ｍｌ）溶液を室温で１時間保存し次にエーテルで希釈した。沈殿したドコサペプチドのトリフルオロ酢酸塩をろ過しエーテルで洗浄後乾燥した。本生成物のＮ−メチルピロリドン（６ｍｌ）及びトリエチルアミン（０，１ｍ　ｌ）含有ＤＭＦ（６ｍｌ）溶液をエーテルで希釈後乾燥した。

本生成物及びシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｘ）及びカッツオヤニス（Ｋａｔｓｏ７ａｎｎｉｓ　）がジャーナル・オブ拳ケミカル・ソサイエティ・パーキン・トランザクションズ（Ｊ。

Ｃｈｅｍ、　　Ｓａｃ、　　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、）　　Ｉ　　（１９７３）　。

２８９４−２９０１頁に記載の方法で調製したＢｏｃ・ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ −Ｇｌｎ−Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｃｙ　ｓ　（Ｄｐｍ）　−Ｇ　１　ｙ　・ＯＨ（５００ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）及びＨＯＢＴ　（９０ｍｇ）含有ＤＭＳｏ　（５ｍｌ）の混合物中に溶解し、次いでＤＣＣ（１００ｍｇ）を添加した。室温で４８時間後、本混合物をＩ　Ｎ　Ｎ　Ｈａ　ＯＨ（５ｍ　ｌ　）含有冷水（２５０ｍｌ）に注ぎ沈殿した保護トリアコンタペプチドをろ過し洗浄（水、５０％メタノール及びメタノール）乾燥し、ＤＭＦ・メタノールから再沈殿した。重量４００ｍｇ　（９０％）。

本生成物は、ヒトインシュリンＢ鎖Ｓ−スルホン酸エステルの合成でシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｌｘ）及びカッツォヤニス（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ）、　風１が記載の液体フッ化水素による脱ブロックその後の酸化的亜硫酸分解によりＳ− スルホン酸エステル化［１０−アスパラギン酸］Ｂ鎖に変換した。この保護トリアコンタペプチド（２００ｍｇ）をｍ−クレゾール（１ｍｌ）含有無水液体フッ化水素（９ｍｌ）で１時間、０℃で処理した。このフッ化水素を次に除去し残渣を順次酢酸エチル及び石油エーテルで粉末とした。本生成物の０．１ＭＴｒｉｓ −Ｈｅ　ｌ　（ｐＨ８，８，）緩衝８Ｍ塩酸グアニジン（２０ｍｌ）溶液に対し、亜硫酸ナトリウム（７００ｍｇ）及び四チオン酸ナトリウム（５００ｍｇ）を添加した。室温で３時間後、反応混合物を例えばスペクトラポア（Ｓｐθｃｔｒａｐｏｒ■）メンブレンチュービングＮｏ、３のような透析用試験官に入れ蒸留水を４回交換（各回４１）しながら４℃で２４時間透析し凍結乾燥した。

精製のため、この凍結乾燥物質を尿素酢酸バッファ（０，０４Ｍ酢酸−８Ｍ尿素、ｐＨ４，０）３ｍｌ中に溶解しＣＭ−セルロースカラム（２，５ｘ４０ｃｍ）にかけ同バッファで一定状態で（イソクラティックに）溶出した。例えば、カッツォヤニス（Ｋａｊｓｏｙａｎｎｉｓ　）ら、バイオケミストリ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｆＢ）　　（１９６７）　。

６巻２６３５−２６４２頁を参照。カラム溶出物を分光光度計（ＩＳＣＯモデルＵ−５Ａ）でモニターし、第１図に示した溶出パターンを得た。主ピーク下の溶出液（１２５−１６８ｍｌ）を集め上述の如く透析後凍結乾燥し、Ｓ−スルホン化［１０アスパラギン酸］Ｂ鎖を白色粉末として得た。重量２２ｍｇｏ酸加水分解後の精製鎖のアミノ酸分析から、下記のモル比で示した組成が得られ、理論値と一致していた。

Ａｓｐ２゜Ｉ　Ｔｈ　ｒ２．ｌ　Ｓ　ｅ　ｒｌ、Ｉ　Ｐ　ｒ　ｏ、ＩＧｌｕ３ｏＧｌｙ２．、ＡｌａよｏＶａ１３゜Ｌｅｕ３．、Ｔｙｒ、、、Ｐｈｅ２，９Ｌｙｓ、、。

Ｈｉ　ｓ、、。Ａｒｇ。、、（Ｃｙｓは測定しなかった。）Ｓ−スルホン化ヒト（ブタ）Ａ鎖（４０ｍｇ）及びＳ−スルホン化ヒト［１０−アスパラギン酸−Ｂ］鎖（２０ｍｇ）の４℃に冷却したＯ、ＬＭグリシンバッファ１０ｍ１溶液中に、ジチオスレイトール（７ｍ　ｇ　）を添加した。４℃で２４時間後、本混合物を酢酸（１ｍｌ）で希釈し生成した沈殿物を遠心分離（インターナショナルｅセントリフニーシュ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｅｎｌｒｉｆｕｇｅ）、モデルＨＮ；３０００ｒｐｍ）によって除去した。活性物質含有上清を０．４５μのセルロースアセテートフィルター（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））に通し、更にＬＫＢ液体クロマトグラフィ装置に接続したバイダック（ＶＭａｃ＠）　２１８　Ｔ　ｐカラム（０，４５ｘ２５ｃｍ）使用逆相ＨＰＬＣに供した。

バッチ（それぞれタンパク質およそ５ｍｇ）を２−プロパツールの０．１％トリフルオロ酢酸１０−５０％直線勾配で流速０．５ｍｌ／分で７０分間にわたりクロマトグラフィにかけた。第２Ａ図にこのクロマトグラフィパターンを示した。

実施例２−４に記載の生物学的アッセイは、およそ３２．３分時に溶出した物質のみが実質的なインシュリン活性を有することを示唆した。これらと同じクロマトグラフィ条件下でウシインシュリンは３０分時に溶出した。活性物質含有分画を濃縮し、同一カラム及び０．１％トリフルオロ酢酸中２−プロパツールの２０乃至３５％直線勾配を用いた８５分間にわたり流速０．５ｍｌ／分で再度クロマトグラフィを行った。第２Ｂ図に溶出パターンを示した。およそ４７．２分時に溶出した活性成分含有分画を集め濃縮後、実施例２−４に記載の生物学的研究に用いた。これらと同じクロマトグラフィ条件でウシインシュリンはおよそ３８分時に溶出した。上述のＡ鎖及びＢ鎖組み合わせ混合物から、高度に精製された産物２ｍｇが得られた。この精製合成物質を酸加水分解後アミノ酸分析したところ、下記のモル比で示される組成が得られ、理論値と良く一致していた。

Ａ　Ｓ　ｐａ、ｏ　Ｔｈ　ｒ２．ａ　Ｓ　ｅ　ｒ３ユＰ　ｒ　Ｏｌ、。

Ｇ　１　ｕ７ｏＧ　１７４．。Ａ　ｌ　ａｌ、Ｉ　Ｖａ　１３．４Ｉ　１ｅ１４Ｌｅｕ５．ｇ　Ｔｙｒ３，６　Ｐｈｅ２．ｅＬＹＳｌｌＨｉ　Ｓｌ、ｏ　Ａｒｇｌ、ｏ　　（Ｃｙｓは測定しなかった。）ラット肝形質膜を用いるレセプター結合アッセイをキタガワ（Ｋｉｊａｇａｗａ）らがバイオケミストリ（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、　　（１９８４）　、　　２３巻、１４０５−１４１３頁に記載の如く行った。ラット肝形質膜は、ホーバット（Ｈｏｒｖａｔ）らがバイオケミ力・エト・バイオフィジックス・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）（１９７５）、３８２巻、６０９−６２０頁に記載の如く調製した。

簡単に述べると、０．２ｍｌインキュベーショントリブリケットに３Ｘ１０−１０Ｍの１２５Ｉ−インシュリン、非標識インシュリン又は実施例１と同様に調製した［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン及び０．６％フラクション■ウシ血清アルブミン含有ｐＨ７，４の０．１Ｍリン酸ナトリウム中形質膜（タンパク質２０−４０μｇ）を入れた。２４℃で４５分間インキュベーション後、０．１％フラクションＶウシ血清アルブンミン含有水冷０．１Ｍリン酸ナトリウム。

ｐ）！’７．　４の２．０ｍｌで本混合物を希釈後直ぐにセルロース・アセテートフィルターを通してろ過した。

本フィルターを水冷バッファで二度洗浄後乾燥し、次に放射能をフィルトロン− Ｘ　（Ｆｉｌｆｒｏｎ　−Ｘ＠　）を用いるシンチレーショインカウンターで計測した。インキュベーションがｌＸｌ０−５Ｍの非標識インシュリンを含んでいる時フィルター上に残存する放射能として定義される非特異的結合を全ての値から減算した。

１２５　ｉ−インシュリンの受容体調製物に対する特異的結合を５０％阻害するのに用する［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンに対する非標識インシュリンの濃度比として、相対的力価を得た。

第３図は、ラット肝形質膜中のインシュリン受容体結合において１２５１−インシュリンと競合するウシインシュリン（０）及び［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン（０）の能力を図示したものである。

最大値に対するパーセントとして示した結合阻害を競合初濃度関数としてプロットした。第３図に示したデータポイントは、４回実施した代表的アッセイにおけるトリブリケット測定の平均を示している。これらのアッセイにおける最大結合は、添加放射能の８．２％に達した。

第３図から明らかであるように、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン及びウシインシュリンの用量反応曲線は本質的に平行であった。しかし、上述の如くして算出した［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンの力価は、ウシインシュリンに比較しておよそ５３４±１４６％であった。

インシュリンアナログの効果を測定する脂質生合成如〈実施した。本アッセイでは、ウシインシュリンに比較してインシュリンアナログの［３−３Ｈコゲルコースの脂質変換能を測定した。

肥満細胞は、体重２００−３００ｇの雄性ラットから得た精巣及び腎周囲脂肪層をコラゲナーゼ１．Ｏｍｇ／ｍｌと３７℃で６０分間インキュベート後ガーゼ次いで細かいメツシュの絹でろ過することによって調製した。細胞は、臨床用遠心分離器内における浮上法によって二度洗浄後、懸濁し使用した。インキュベーション媒体は、推奨カルシウムの半量、０．５ｍＭグルコース及び３％脂肪酸遊離ウシ血清アルブミンを気相としての９０％ｏ２−５％Ｃｏ２と共に含むクレブス・リンゲル（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ）重炭酸塩である。トリブリケットとした脂質生合成インキュベーションは、肥満細胞懸濁液（乾燥重量細胞２０−４２０−４Ｏ。

０ｍｌ及びウシインシュリンまたは実施例１の如く調製した［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンを含有した。細胞は、［３−３Ｈ］グルコースの添加前に３７℃で４５分間ブレインキュベートした。インキュベーションは６０分間継続し、５ＮＨ２Ｓ０４０．２ｍｌ及び脂質抽出を補助するコーンオイル０．２ｍｌを添加し停止した。試料は、室温下で３０分間ソルシントー〇　（Ｓｏｌｕｓｃｉｎｔ−Ｑ■）１０ｍｌで抽出後シンチレーションカウンターで放射能を計数した。

これらの条件下で、−［３−３Ｈ］グルコースはシンチレーション液含有有機相に抽出されず本質的に計数されなかった。脂質生合成のゼロ刺激及び１００％刺激は、それぞれ９．ｌＸｌ０−１０Ｍインシュリン（５゜５ｎｇ／ｍｌ）の非存在及び存在下において見られる放射能として定義された。脂質生合成最大刺激の５０％を起こすのに要する［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンに対するインシュリンの濃度比として相対的力価を得た。

第４図は、実施例１の如くして調製した［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン（０）及びウシインシュリン（０）による単離ラット肥満細胞中における［３−　’Ｈ］グルコースの有機抽出可能物質（すなわち、脂質）への変換刺激を示したものである。最大値に対するパーセントとして表わした刺激をアゴニスト濃度の関数としてプロットした。本データポイントは、４回実施した代表的アッセイにおけるトリブリケット測定の平均を示したものである。アッセイにおいて、０％刺激及び１００％刺激とは、それぞれ１時間１　ｍ　ｇ細胞当り０．　３及び３．５ｎｍｏｌグルコースを示す。

第４図に示したデータは、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンが本アッセイにおいて充分なアゴニストであり、天然のウシインシュリンによる脂質生合成と同等の最大刺激に到達することを示している。しかし、［１０−アスパラギン酸−Ｂ’］　ヒトインシュリンの相対的力価は、ウシインシュリンに比較して４３５±１４４％であると算出された。

実施例２の受容体結合アッセイ及びこの脂質生合成アッセイで算出された［１０ −アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンの力価値は、統計的に異なっていないと判定された（スチューデント（Ｓｊｕｄｅｎｔ　）のｔ検定により０．４＞ｐ＞０．３）。

従って、［１０アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュ易にわかる。

ノアッセイ分析を実施し、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンが天然のインシュリンと免疫学的に識別可能であるかどうかを評価した。

ブタインシュリンに対するモルモット抗血清及びヤギ抗モルモットγ−グロブリンをアッセイバッファ（０，１５４ＭＮａＣ１，０，１％ゼラチン及び０゜０１％チメロサール含有リン酸ナトリウム、０．０４Ｍ、ｐＨ７，６）中で１＝２５に希釈し使用した。シュブリケットアッセイチューブには、抗インシュリン抗血清０．１ｍｌ、　　１２Ｎ−インシュリン０．０７２ｎｇ及びウシインシュリン（０，０６−０，３６ｎｇ）又は実施例１と同様にして調製した［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン（１−４，０ｎｇ）が総量０．８ｍｌとして含まれていた。室温で一晩インキュベーション後、沈殿抗体（ヤギ抗モルモット γ−グロブリン）０．２ｍｌを添加し、更にこの試験管を室温で一晩インキユベートした。免疫沈殿をセルロース・アセテートフィルター上に集め、水冷アッセイバッファｌ、Ｑｍｌずつで２回連続洗浄した。フィルターを乾燥し放射能をフィルトロン−Ｘ＠　　（Ｆｉｌｔｒｏｎ　−ＸＲ）中でシンチレーションカウンターで計測した。

ヘイルズ（Ｈａｌｅｓ　）らがバイオケミカルジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　　（１９６３）、　　８８巻、１３７−１４６頁に記載の線形回帰分析によって、ＣＯ／Ｃ１の直線プロットを得、ウシインシュリンと比較した［１〇− アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンの力価を、上記プロットの傾きの比として求めた。

合成［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンは、このラジオイムノアッセイにおいてウシ又はブタインシュリンとほとんど同等の力価を示した。この結果から、Ｂ１０位のヒスチジンをアスパラギン酸で置換することは本分子の免疫原性決定基に有意な影響を及ぼさないことが示唆された。

実施例５（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ”０．Ｔｙ　ｒ”５−ａ− カルボキサミトコヒトインシュリン（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　、　Ｔｙ　ｒｓ２５−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは、フラグメント縮合法を用いるペプチド合成によって合成した。（例えば、ブレーク（Ｂｌａｋｅ　）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）（１９８３）、８０巻、１５５６−１５５９頁を全般技術について参照。）全ての中間体ペプチド誘導体の均質性を６０６０シリカゲル（イーストマン・クロマトグラム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）シート）上の薄層クロマトグラフィで確認した。タロマドグラム展開に用いた溶媒系は、クロロフォルム・メタノール・水（４５：１０：１；８９：１０：１；及び２００ニア５：１３）であった。

（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐＨｌＯ，Ｔｙ　ｒＢ２５ −ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは、チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）らの米国特許第４．４２１，６８５号に記載の如（ジチオスレイトール存在下においてＳ−スルホン化形態のヒトインシュリンＡ鎖をヒトインシュリンの合成Ｓ−スルホン化誘導体（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＡｓｐｌＯ，Ｔｙｒ− ａ−カルボキサミド２５コＢ鎖と結合することによって調製した。このＳ−スルホン化ヒトＡ鎖はブタインシュリンの各鎖と同一であり（ニコル（Ｎｉｃｏｌ　）らネーチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）　（１９６０）　。

１８１巻、４８３−４８５頁）、カッツォヤニス（Ｋａｊｓｕｙａｎｎｉｓ）らがバイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９６７）、６巻、２６３５−２６２４頁に記載の如くブタインシュリンの酸化的亜硫酸分解及び生成したＳ−スルホン化Ａ及びＢ鎖のカラムクロマトグラフィによる分離によって調製した。Ｓ−スルホン化二重改変Ｂ鎖の合成は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　。

ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ　　（Ｊ、　　　Ａｔｎ、　　　Ｃｂｅｍ、　　　Ｓｏｃ、　　　）　　、　　　８５　　：　　２１４９−５４（１９６３）及びバラニイ（Ｂａｒａｎｙ）ら、“ザ・ペプチド（ＴｈｅＰｅｐｊｉｄｅｓ）　”グロス（Ｇｒｏｓ）ら著、２：１−２８４．アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）にニーヨーク。１９８０）に記載のように固体支持体としての４−メチルベンズヒドリルアミンレジン（Ｉｇ当りアミン０．５ｍｍｏ　１　；　１　ｇ）を用いる段階的固相合成によって構築した。

ベンジルオキシカルボニル基によって保護した末端フェニルアラニン残基の場合を除き、ＢＯＣ基をＮａ保護に用いた。

表■は、本ペプチド合成に用いられた化合物及びアミノ酸ブロック剤を示した。

シクロヘキシル　　　　　　　　　グルタミン酸及びアスパラギン酸ペンチルオキシメチル　　　　　　ヒスチジン２．６−ジクロロペンチル　　　　チロシンＮＧ−Ｐ−）ルエンスルホニル　　アルギニン４−メチルペンチル　　　　　　　システィン、　　メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、バイオケミストリ　　（Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、）、　　　　２１　　　：５０２０− ３１　　　（１９８２）に従い、３倍量の活性化保護アミノ酸類（ジメチルホルムアミド中１−ヒドロキシベンゾトリアゾールーディーンクロへキシルカルボジイミド）を用いて手動ダブルカップリングプロトコールを行った。反応の完了は、カイザー（Ｋａｉｓｔｒ）　　ら、アナリティカルバイオケミストリ　（Ａｎａ！、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、　　３４　：　５９５−９８（１９７０’）の定性的ニンヒドリン試験でモニターし、各ダブルカップリング後において無反応であった。

鎖が構築された後このペプチド・レジンを塩化メチレン及びメタノールで充分に洗浄後乾燥し、最終重量を３．０ｇとした。本産物の一部（７００ｒｎｇ）を、タム（Ｔａｍ　）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ、　Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、　）　。

１０５　：　６４４２−５５　（１９８３）に従い低−高フツ化水素法によって脱保護した。第一段階においてこのペプチド・レジンをｐ−クレゾール（１ｍｌ）、　ジメチルスルフィド（６，５ｍ　ｌ）及び液体フッ化水素（２，５ｍ１）から成る混合物で処理した。０℃で２時間後、本混合物を真空下に濃縮し残渣を０℃で１時間、液体フッ化水素で処理した。このフッ化水素を次に除去し残渣を酢酸エチル及び石油エーテルで粉末とした。亜硫酸ナトリウム（７００ｍｇ）及び四チオン酸ナトリウム（５００ｍｇ）を、０．１ＭＴｒ　ｉ　ｓ　−Ｈ（１（ｐｈ８．８）緩衝８Ｍグアニジン塩酸（２０ｍｌ）中本産物の懸濁液に添加した。室温で３時間後反応混合物をろ過し、レジンを除去し、ろ液をスペクトラボア（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）メンブレンチュービングｎｏ、３に入れ、精製水を４回交換（各回４１）しながら４℃で２４時間透析した。この透析物を凍結乾燥し、２５０ｍｇの白色粉末として粗Ｓ−スルホン化Ｂ鎖アナログを得た。

凍結乾燥物質は、水：　０．０２ＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ。

ｐＨ７，５含有２−プロパツール（２：　１．　ｖ／ｖ）混合物中に溶解し、ＬＫＢ液体クロマトグラフィ装置接続シンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）　Ａ　Ｘ　３００カラム（ＩＸ２５ｃｍ）高速液体イオン交換クロマトグラフィによって精製した。それぞれタンパク質７０ｍｇのバッチを、上述の溶媒中の０．５Ｍ塩化ナトリウム０−８０％直線勾配を用いて流量１．５ｍｌ／分で１４０分間にわたりクロマトグラフィにかけた。第５図に、クロマトグラフィパターンを示した。主ピーク（およそ６０分）下の溶出物をその当初の容積のおよそ５０％にまで真空下で濃縮し、精製水に透析（スペクトラボア（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）メンブレンチュービング）後凍結乾燥した。粗物質２５０ｍｇから精製産物１５０ｍｇが白色フラッフ状粉末として得られた。精製Ｓ−スルホン化Ｂ鎖アナログを酸加水分解後アミノ酸解析し下記のモル比で示した組成が得られ、理論値（カッコ内に示した）と一致していた。Ａ　Ｓ　ｐ　１．９（２）Ｓ　ｅ　ｒ　１．ｏ＋ｚ＞Ｇ　ｌ　ｕ３．ｏ＋３．Ｇ　Ｉ　Ｙｉ、ｏ＋ｉ＋Ａ　１　ａｘ、ｓ＜ □ｒＶａ　＋２．７＋３）Ｌｅ　ｕｘ、ａｕ＋ＴＹ　ｒ　１．９（２）Ｐ　ｈ　Ｇ２．０（２）ＨｉＳＯ，ｇ（１）Ａｒｇよ、。（１）（システィンは測定しなか（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　、　　Ｔ　ｙ　ｒ”’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンの合成と単離Ｓ−スルホン化ヒト（ブタ）Ａ鎖（２０ｍｇ）及びＳ−スルホン化ヒト（Ｂ２６ −８３０）プンタペプチド消失−［ＡｓｐｌＯ，’ｌ’ｙｒ−α−カルボキサミド２５］Ｂ鎖（１０ｍｇ）のＯ，１ＭグリシンバッファｐＨ１０，６の６ｍｌ溶液を４℃に冷却し、ジチオスレイトール（３，５ｍｇ）を添加した。４℃で２４時間後、本混合物を氷酢酸（１ｍｌ）で希釈し生成した沈殿を遠心分離（インタナショナルセントリフユージ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉ）　、モデルＨＮ、３０００ｒｐｍ）によって除去した。活性物質を含有する上滑を０．４５μセルロースアセテートフイルター（ザルトリウス（Ｓａｒ＋ｏｒｉｎｓ））を通し、ＬＫＢ液体りｏｖトグラフィ装置に接続したバイダック（Ｖｙｄａｃ■）２１８ＴＰカラム（０，４５Ｘ２５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣに供した。それぞれおよそ５ｍｇのタンパク質のバッチを、０．１％トリフルオロ酢酸中２−プロパツールの１０から５０％直線勾配によって流速０．５ｍｌ／分で７０分間かけクロマトグラフィを行った。クロマトグラフィパターンを第６Ａ図に示した。

インシュリンアッセイで求めた活性物質含有分画を濃縮し、同一カラム及び０．１％トリフルオロ酢酸中２０から３５％の２−プロパツール直線勾配を用いて１１０分間かけ流速０．５ｍｌ／分で再度クロマトグラフィを行った。溶出パターンを第６Ｂ図に示した。

およそ６３．１分時に溶出した活性物質含有分画を集め凍結乾燥した。上述のＡ鎖及びＢ鎖の混合物から、高精製の産物１．４ｍｇが得られた。この精製合成物質のアミノ酸分析から下記のモル比で示した組成を得、理論値と良く一致していた。

Ａ　Ｓ　ｐａ、　１（４）Ｔｈ　ｒ　Ｏ，９＋１１　Ｓ　ｅ　ｒ　３．０＋３）Ｇ　１　ｕ７．ｏ（７）Ｇ　Ｉ　Ｙｘ、ａｕ＋Ａ　１　ａ、、、、Ｖａ　１３．３（４１Ｉ　１　ｅｚ、４＋ｚ＋Ｌ　ｅ　ｕ６．ｏｆ６］Ｔ　７　ｒ　３．８＋４１　Ｐ　ｈ　ｅ　２．０＋２１Ｈ１ｓｌ、０（１）Ａ　ｒ　ｇｏ、ｎ、（Ｃｙ　ｓは測定しなかった）。

２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓｐｌ＋１０゜実施例２と同アッセイを用いた。

第７図は、ラット肝形質膜中のインシュリン受容体結合を１２５１−インシュリンと競合するウシインシュリン（０）及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ”０．Ｔｙ　ｒＢ２’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン（０）の能力を図示したものである。

最大値に対するパーセントとして示した結合阻害を、競合物濃度の関数としてプロットした。第７図に示したデータポイントは、３つの異なる合成化合物調製物を用いて４回行った代表的アッセイにおけるトリブリケット測定の平均を示している。これらのアッセイにおいては、競合物非存在下のおける１２５Ｉ−インシュリンの結合は添加放射能の９．１％に達し、非特異的結合は総結合の９．６％に達した。

第７図から明らかなように、天然のインシュリンに必要な濃度の１０分の１以下の濃度で合成化合物は特異的に結合した１２５■インシユリンの５０％を置換した。しかし、上述のようにして計算した（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失 −［Ａ　ｓ　ｐ”０゜ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミドコヒトインシニリンの力価は、ウシインシュリンに比較して約１１６６±３１．２％であった。

実施例８脂質生合成アッセイによる（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓｐ” ０．ＴｙｒＢ２’　−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンカ価の解析実施例３と同じアッセイを用いた。

第８図は、実施例５で調製した（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ”０．　　Ｔｙ　ｒＢ２’　−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリン（０）及びウシインシュリン（０）による単離ラット肥満細胞中における［３−３Ｈ］グルコースの有機抽出可能物質（すなわち、脂質）への刺激を示したものである。最大値に対するパーセントとして示した刺激をアゴニスト濃度の関数としてプロットした。データポイントは、３つの異なる合成化合物調製物を用い４回行った代表的アッセイにおけるトリブリケット測定の平均を示している。本アッセイにおいて、０％刺激及び１００％刺激とは、それぞれ、１時間に１ｍｇ細胞当たり１１．４及び７８．８ｎｍｏｌのグルコースを意味している。

第８図に示されたデータは、天然のウシインシュリンの場合に要した濃度よりもはるかに低い濃度で（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓｐｌｌｏ。

ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミトコヒトインシュリンが脂質生合成の最大値の半量の刺激を産生じた。（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓｐｌｌｏ。

Ｔ　ｙ　ｒ　Ｂ２’−α−カルボキサミトコヒトインシュリンの相対的力価はウシインシュリンに比較して１３５２±１１４％であると算出された。脂質生合成の最大刺激は、両化合物で同じであった。

以上より、（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　、　Ｔｙ　ｒＢ２’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンが天然のインシュリンよりも１１から１３倍強いインビトロ力価を示す超活性インシュリンであることが容易に明らかとなる。

このＡ　ｓ　ｐ　”０アナログと同操作によって調製した単離（Ｂ２６−８３０）ペンタペプチド消失−［Ｇ　１　ｕ！１１０．　　Ｔ　ｙ　ｒＩ′２５−ａ− カルボキサミトコヒトインシュリンは、天然インシュリンよりもおよそ２０倍強い力価を示した。

実施例９（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓｐ”０．Ｔｙ　ｒＢ２’−ａ− カルボキサミトコヒトインシュリンのラジオイムノアッセイ分析実施例４と同アッセイを用いた。

合成（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐＢ１’　、　Ｔｙ　ｒ！１２５−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは、ラジオイムノアッセイにおいてウシインシュリンにほとんど等しい力価を示した。この結果から、インシュリン受容体に対する強い結合をもたらす構造上の差及びそれに伴って合成化合物が示したインビトロにおける高インシュリン様活性は、本分子の免疫原性決定基に有意な効果を示さないことが示唆された。

実施例の検討先行Ｘ線解析から、Ｂ１０位のヒスチジンがインシュリン単体の表面に局在し亜鉛インシュリン６量体の形成に重要であることが示唆された。例えば、ブロンデル（ｂｌｏｎ＋１ｅｌｌ）ら、アドバンシイズ・イン・プロティン・ケミストリ（Ａｄｖ、　　Ｐｒｏｔ、　　Ｃｂｅｍ、）　　（１９７２）　。

２６巻、２７９−４０２頁を参照。先の研究では、Ｂ１０位のヒスチジンをロイシン、リシン、又はアスパラギンで置換するとこの天然型ホルモンに比較し約１４から４５％低下した生物力価を示す合成インシュリンアナログ類が産生ずることが示された。シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｘ）ら、ジャーナル・オブ・ケミカル・リサーチ（Ｓ）　　（Ｊ、　Ｃｂｅｍ、　Ｒｅｓ、　（ｓ））　、　　２２０−２２１頁、ジャーナル・オブ・ケミカル・リサーチ（Ｍ）（Ｌ　Ｃｈｅｍ、Ｒａｓ、（Ｍ））　、　２４５３−２４６９頁（１９７７）　　；シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｘ）　　ら、ジャーナル拳オブ・プロティン・ケミストリ（Ｊ、　Ｐｒｏｊ、　Ｃｈｅｍ、）（１９８２）、１巻、１７７−１８９頁；バーク（Ｂｕｒｋｅ　）ら、インタナショナル・ジャーナル・オブ・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　Ｐｒｏｊｅｉｎ　Ｒｅｓ、）（１９８４）、２３巻、３９４−４０１頁を参照。これらの研究から　Ｂ１６位などにおける親水性はインシュリンの生物活性の決定に実質的に重要ではないこと及びこの位置において強塩基性アミノ酸残基の存在は有害であることが結論されてきた。更に、生理的ｐＨ近辺でプロトン化又は非プロトン化状態のいずれかで存在できる能力はヒスチジン残基に特徴的性質であり、これが高生物活性のために１３１０位に必要であると信じられていると示唆されてきた。例えばパーク（Ｂｕｒｋｅ　）ら、同上を参照。しかし、生理的ｐＨにおいてＢ１０位に負の電荷を有する［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンは、実施例で示したようにインビトロ実験において天然のインシュリンよりも数倍活性が高いことが見い出された。

［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンの超活性は、明らかにインシュリン受容体への強い結合から生じている。本アナログが同受容体に強く結合することは、Ｂ１０位の負の電荷に関連した分子内相互作用（例、塩架橋）の結果、この受容体への結合による好適なアナログ構造上の変化に起因するのであろうと信じられている。一方、強結合は、正の電荷を有する受容体上で補体表面との直接相互作用の結果であることもあり得る。第２図に示したように逆相ＨＰＬＣでは、［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリンは２つのクロマトグラフィ条件下で天然のインシュリンよりも有意に遅く溶出した。この挙動は、この合成アナログがより非極性の分子であることを示唆していた。天然のインシュリンと［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリンの間に見られる極性の大きな差は、１個の親水性残基を別のものに置換したことによるとすることはできない。極性差の最も合理的な説明として、極性差は構造上の変化を反映すると信じられており、この結果、インシュリン受容体に本アナログが強く結合すると信じられている。

（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”０．　　Ｔ　ｙ　ｒ” ’−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは２個の改変を行っており、これらが別個にインシュリン分子に導入された場合天然のホルモンよりも高い力価を示すアナログ類が産生される。

これらの個々の改変は、（ｉ）Ｂ２６−Ｂ３０部位の除去とｐｈｅＢ２５のＴｙｒ−α−カルボキサミドによる置換、及び（ｉｉ）ＨｉｓＢｌｏのＡｓｐによる置換、である。このアナログ（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａ　ｓ　ｐ”’　、　Ｔｙ　ｒＢ２５−ａ−カルボキサミトコヒトインシュリンは、これまで記載された内で最も強力なインシュリンアナログである。この生物活性は、いずれか一方の、改変のみを含有するアナログ類が示す増強力価の和よりも高い。この知見は、Ｂ２５及びＢＩＯ部位が離れた受容体結合インシュリン領域の構造を変化させ受容体結合高アフィニテイ（親和性）部位とすることを示唆している。実際、さまざまな組織におけるインシュリン・受容体複合体の高会合定数（およそ１０’　Ｍ−” ）は、いくつかの結合種が協奏作用することを必要とするらしい。Ｂ１０位のヒスチジン残基は、受容体によるインシュリン認識に寄与すると提起されてきた残基のひとつではない。

２７９−４８２　（１９７２）；ブランデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）（１９７６）、しかし、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｘ）ら。

［Ｌ　ｅ　ｕ　Ｂ１０　コ　　−　、　　　　［Ａｓｎ”’　　コ　　−　、　　及　び［Ｌ　ｙ　ｓ　＋１１０　］インシュリン類の力価減少と同様に［Ａ　５ｐ１１０　コインシュリン（［：１０−アスパラギン酸−Ｂ］］インシユリンの増強力価は、この部位における置換が生成分子のインシュリン受容体との相互作用及び生物応答の誘起能力に極めて大きな影響を有することができることを示している。このＢＩＯ部位が受容体結合領域の構成要素であるのか、又は、本部位における改変が遠くの結合領域に影響を及ぼすのかについては、入手可能なデータからあいまいでないように決定することができない。本アナログ類の超高力価を説明する多くのモデルが提案できる。Ｂ２５及びＢＩＯ部位は遠隔の受容体結合インシュリン部位の構成要素で、これらの部位がそれぞれ個別にＢ２５及び８１０位の改変によって変化され、本アナログ類の場合には高アフィニティ受容体結合状態を生みだすこともあり得る。更に、Ｂ２５及びＢＩＯ改変が独立しかつ協奏しながら、インシュリンの重要受容体結合領域を構成する他の遠隔領域の構造に影響を及ぼすことができる。

溶出物容量（１″″Ｌ′ ＦＩＧ、１溶出時間（分）　溶出時間（分）［＋ｚｓ＋］インシュリン結合阻害脂質生合成刺激ＦｊＧ、　５溶出時間（分）ＦＩＧ、　６ａＦＩＧ、　６ｂ溶出時間（分）［＋２５．１インシュリン結合阻害脂質生合成刺激補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２２８°９２、発明の名称超活性ヒトインシュリンアナログ類３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国　１００２９名　称　マウント　サイナイ　スクール　オブ１９８９年１１月１日６、添付書類の目録補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１　通請求の範囲超活性インシュリンアナログ。

５、薬剤学的に許容できる担体と共に［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＡＳｐＢｌｏ、ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミトコヒトインシュリン及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ｇ１ｕＢユ０゜ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］天然のインシュリンより４から６倍強い力価を有するヒトインシュリンから成る群から選択された超活性ヒトインシュリンアナログの有効治療量から成る糖尿病治療の必要性のある患者における糖尿病治療用薬剤組成物。

６、請求の範囲第５項記載の筋注投与用薬剤組成物。

７、請求の範囲第５項記載の皮下性投与用薬剤組成物。

８、請求の範囲第５項記載の静注投与用薬剤組成物。

９、請求の範囲第５項記載の埋め込み型ポンプによる投与用薬剤組成物。

１０、請求の範囲第５項記載の鼻腔スプレーによる投与用薬剤組成物。

１１、薬剤学的に許容できる担体と共に［１０−アスパラギン酸−Ｂ］　ヒトインシュリン、　　（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ａｓ　ｐ　Ｂ　１ °。

ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミトコ　ヒトインシュリン及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［Ｇ１　ｕ”０．Ｔｙ　ｒＢ２５−ａ−カルボキサミトコ天然のインシュリンより４から６倍強い力価を有するヒトインシュリンから成る群から選択された超活性ヒトインシュリンアナログの有効治療量を糖尿病治療の必要性がある患者に投与することから成る前記患者の糖尿病治療方法。

国際調査報告一１陶ア１ム、□−０ＰＣτ）υＳ　８８１０２２８９　　２国際′調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．構造；【配列があります】を有する超活性インシュリンアナログ。
２．構造；【配列があります】を有する超活性インシュリンアナログ。
３．構造；【配列があります】を有する超活性インシュリンアナログ。
４．構造；【配列があります】を有する超活性インシュリンアナログ。［式中、Ｘはα−アミノ−アジピン酸又は高度同族体である］。
５．薬剤学的に許容できる担体と共に〔１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン，（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＡｓｐＢ１０，ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリン及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＧｌｕＢ１０，ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリンから成る群から選択された超活性ヒトインシュリンアナログの有効治療量から成る糖尿病治療の必要性のある患者における糖尿病治療用薬剤組成物。
６．請求の範囲第５項記載の筋注投与用薬剤組成物。
７．請求の範囲第５項記載の皮下注投与用薬剤組成物。
８．請求の範囲第５項記載の静注投与用薬剤組成物。
９．請求の範囲第５項記載の埋め込み型ポンプによる投与用薬剤組成物。
１０．請求の範囲第５項記載の鼻腔スプレーによる投与用薬剤組成物。
１１．薬剤学的に許容できる担体と共に［１０−アスパラギン酸−Ｂ］ヒトインシュリン，（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＡｓｐＢ１０，ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリン及び（Ｂ２６−Ｂ３０）ペンタペプチド消失−［ＧｌｕＢ１０，ＴｙｒＢ２５−α−カルボキサミド］ヒトインシュリンから成る群から選択された超活性ヒトインシュリンアナログの有効治療量を糖尿病治療の必要性がある患者に投与することから成る前記患者の糖尿病治療方法。
１２．前記超活性インシュリンアナログが筋注で投与される請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．前記超活性インシュリンアナログが皮下注で投与される請求の範囲第１１項記載の方法。
１４．前記超活性インシュリンアナログが静注で投与される請求の範囲第１１項記載の方法。
１５．前記超活性インシュリンアナログが埋め込み可能ポンプによって投与される請求の範囲第１１項記載の方法。