JPH03123798A

JPH03123798A - アデニレートサイクラーゼ刺激活性を有する新規な視床下部由来ポリペプチド

Info

Publication number: JPH03123798A
Application number: JP2158895A
Authority: JP
Inventors: Akira Arimura; 有村　章; Atsuro Miyata; 宮田　篤郎
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1989-06-19
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1991-05-27
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: JP2897169B2; EP0404652A1; CA2018714A1; CA2018714C; US5128242A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１上血に皿免乱本発明は新規な、視床下部由来のポリペプチドに関する
。すなわち、本発明は脳下垂体の細胞中のアデニレート
サイクラーゼ活性を刺激して、その細胞から多数のホル
モンを放出させる能力のある新規な２７〜３８アミノ酸
残基のポリペプチドに関する。

中枢神経系が脳下垂体前葉と連絡する神経内分泌系の通
路は視床下部下垂体門脈系（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ
−ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ｐｏｒｔａｌ　５ｙｓｔｅ
ＩＩｌｓ）を経由している。下垂体刺激ホルモン（ｈｙ
ｐｏｐｈｙｓｉｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｌｕｏｎｅｓ）
として公知の多数の小さなペプチド（例えば、３−４４
のアミノ酸）ホルモンは視床下部細胞によって極く少量
生成される。これらのホルモンの各々は異なった特定の
機能を持っている。しかし、全般的に見て、大部分のも
のが脳下垂体のある定まった細胞を刺激して特定の脳下
垂体前葉ホルモンを放出させる。公知の下垂体刺激ホル
モン中、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ｃｏｒｔ
ｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏ
ｎｅｓ）は副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ：ａｄｒｅ
ｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｍｏｎｅ）と
β−エンドルフィンとを放出させる。性腺刺激ホルモン
放出ホルモン（ＧｎＲＨ）　、これはまた黄体形成ホル
モン放出ホルモン（ＬＨＲＨ：ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ
　ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎ
ｅ）としても知られているが、これは黄体形成ホルモン
（ＬＨ：　ｌｕｔａｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ）と
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ：ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉ
ＩＩｌｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）とを分泌させ
る。成長ホルモン放出ホルモン（Ｇ！（ＲＨ：ｇｒｏｗ
ｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍ
ｏｎｅ）は成長ホルモン分泌を促進する。

甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ：ｔｈｙｒｏ
ｔｒ。

ｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）は甲状
腺刺激ホルモン（ＴＳ）Ｉ：ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍ
ｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）とプロラクチンを放
出させる。しかしながら、南下垂体因子のいくつかは抑
制的なものである。例えば、ソマトトロピン放出抑制因
子すなわちソマトスタチンは成長ホルモンとＴＳＨ（甲
状腺刺激ホルモン）の分泌を抑制し、ドーパミン（一種
のカテコールアミン）はプロラクチンの分泌を抑制する
。

南下垂体因子としての特徴はあまりよく分っていないが
、関係あると思われる幾つかのホルモンがこれ迄に記載
されてきた。それらの多くは、視床下部よりも消化腺に
関連がある。これらのペプチドの中の一群としてセクレ
チン−グルカゴン族があり、Ｖ　Ｉ　Ｐ　（ｖａｓｏａ
ｃｔｉｖｅ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ、
血管作用性腸管ペプチド）はその−員である。

この群にはＧＨＲＨ、セクレチン、グルカゴンのような
よく知られた幾つかの化合物が含まれるが、それらの活
性は非常に明らかな特徴を持っている。

ＶＩＰは元来消化管から単離され、血圧を低下させる働
きを示す。しかし、日常の代謝におけるその役割は未だ
完全に分っている訳ではない。

分子レベルにおいて、多くのペプチドホルモンの作用は
、環状アデノシン−燐酸塩（環状ＡＭＰあるいはｃＡＭ
Ｐ）によって媒介される。一般的な言い方をすれば、ホ
ルモンは標的とする細胞の表面で先ず受容体に結びつく
。この受容体とホルモンとの相互作用が細胞膜の内部表
面にあるアデニレートサイクラーゼを刺激してＡＴＰよ
り、ｃＡＭＰを生成する。ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの役割は酵素
である蛋白質キナーゼＡを活性化することにある。受容
体ホルモン結合の結果生成するｃ　Ａ　Ｍ　Ｐが、酵素
の調節サブユニットに可逆的に結びつき、それによって
酵素の触媒サブユニットに作用を行なわせるものである
。蛋白質キナーゼＡの作用の究極の効果は燐酸塩グルー
プのＡＴＰからセリン水酸基または他の酵素類への転移
において触媒として働くことであり、その結果、これら
のものの活性が増加するか、または減少することになる
。この変化が特定のホルモンの作用を特徴づける生理的
な効果を発現させる訳である。

上記の論議から分かるように、成る物質が試験管内の（
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）アデニレートサイクラーゼの活性を
刺激する能力は、その生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での生
理活性を判定する有力な指標となる。ＶＩＰ族ペジペプ
チド知の全ての視床下部放出ホルモンは、たとえ下垂体
細胞のアデニレートサイクラ−ゼ刺激が必ずしも下垂体
ホルモン放出にとって必須の過程でなくても、大なり小
なりこの活性を持っている。

そこでこの下垂体細胞アデニレートサイクラーゼの刺激
活性を有する化合物を見出すことによって、下垂体ホル
モン調節を行える新化合物を発見することができるもの
であり、そのような薬剤の開発あるいはホルモン自体の
研究にも役立つであろうと考えられる様になった。

課　を　゛するための手このたび、新しい系列のペプチドが、初めて羊の視床下
部から単離されたのである。このペプチドは培養したラ
ットの脳下垂体細胞のアデニレートサイクラーゼ活性を
刺激する。このペプチドはＶＩＰの１００倍ないし１，
０００倍の上記刺激効果を持っている。このように、こ
れらの化合物は、アデニレートサイクラーゼ活性の増大
が好ましい試験管内および生体内の適用に有用性がある
ものである。

即ち、本発明は式％式％を含有するペプチドおよび同様の生理的活性のある類似
物に関する。

更に特定すれば、この式を基にして３８個に及ぶアミノ
酸残基を含む一連のペプチドが、事実上治療的に興味の
ある生物活性を持つことが明らかにされた。このカテゴ
リーに入るペプチドは次のとおりである。

１、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙ　ｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｍｅｔ−Ａ
　ｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙ　ｓ−Ｌｙ　５−Ｔｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ。

２、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａ　
ｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙ　５−Ｔｙｒ−Ｌａｕ−
Ａ　１ａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ。

３、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｉｎ−Ｍｅｔ−Ａ
　ｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ。

４、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｉｎ−Ｍｅｔ−Ａ
　ｌａ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ。

５、　　Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｉｎ−Ｍｅ　ｔ−
Ａ　ｌａ　−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ。

６　、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−，５ｅｒ−
Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−
Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ
−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ。

７、　　Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｍｅｔ−Ａ
　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−
Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ。

８　、　０ｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａ　
ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｎｅｔ−Ａ
　１ａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−Ａ　ｌａ−Ａ　ｌａ　−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ
−Ｌｙ　ｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ。

９、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｓｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｍｅｔ−Ａ　
ｌａ−Ｖａ　１−Ｌｙ　５−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　１ａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ
−Ｌｙ　ｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ。

１０、　　Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａ
　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｎ−Ｍｅｔ
−Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙｒ−Ｌ
ａｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　ｌａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｇ　１
ｙ−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ。

１１、　　Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｉｎ−Ｍｅ　ｔ−
Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｙ　ｓ−Ｌｙ　ｓ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　１ａ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙ　ｓ−Ｇｉｎ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ。

本発明はこれらの有用なペプチドのカルボキシル基末端
においてアミド化された配列をも包含し、また、生物活
性のあるこれらのペプチドの類似物をも包含するもので
ある。例えば、元の化合物の刺激活性を保持する上記ペ
プチドの誘導体を含む。

これらの類似物としては、上記ペプチドにおけるアミノ
酸の置換、欠除、付加、修飾が包含される。

なお、これらのペプチドは、以下の明細書中でＰ　Ａ　
ＣＡ　Ｐ　（ＰＡＣＡＰ：Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ａｄｅ
ｎｙｌａｔａ　Ｃｙｃｌａｓｅ　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ、脳下垂体アデニレートサイ
クラーゼ活性化ポリペプチド）として述べられている。

有効量では、本発明のペプチドはアデニレートサイクラ
ーゼの有力な活性化剤である。本発明はコノヨうに、脊
椎動物の細胞（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｃｅｌｌｓ）内
におけるアデニレートサイクラーゼ活性を刺激する方法
をも提供し、この方法は本発明のペプチドの有効量を細
胞に接触させる方法を包含するものである。本発明はま
た、薬学的に許容し得る担体と組合せた本発明のペプチ
ドを含む薬剤の組成物をも提供する。

基１乱圭髪樹艮本発明のペプチドは、これまで知られていなかった下垂
体刺激ホルモンまたは因子を明らかにしようとする努力
によって、羊視床下部から発見された。羊の視床下部抽
出物が、ラットの培養脳下垂体細胞中のアデニレートサ
イクラーゼ活性刺激（ＡＣＳＡ）活性によってスクリー
ニングされた。ＡＣ３Ａ活性は凡ての視床下部放出ホル
モンの活性にとって必ずしも必要なものではないが、公
知の白下垂体ホルモンは全て脳下垂体細胞中のアデニレ
ートサイクラーゼを程度の差こそあれ刺激することが示
されている。この作用はｃＡＭＰの細胞内または培養媒
体中における増加と関連している。

第二の伝達子（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）としてｃ　Ａ　Ｍ
　Ｐを必要としないＬＨＲＨやＴＲＨのようなホルモン
でも培養脳下垂体細胞中においてｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを増加
するのである。それゆえに、このスクリーニング法が潜
在的なホルモン活性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｈｏｒｍｏ
ｎｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）の初期段階の指標として利用
されたのである。

新鮮な羊の視床下部を煮沸して抽出し、６６％のアセト
ンで処理したにの上澄み液中のペプチドをＣ−１８カラ
ム上で吸着し、１ｏ、２ｏ、３ｏ、４ｏ、５ｏ、６０％
（７）ＣＨ，ＣＮ１０．１％ＴＦＡ１’段階的に溶出し
、それぞれ分画Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆを得た。著しい
ＡＣ３Ａ活性を示した分画Ｃと分画りは別々にＳＰ−セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムに負荷し、Ｌ
Ｍ　ＡｃＯＨ（ＳＰ−１）、２Ｍピリジン（ＳＰ−■）
および２Ｍピリジンアセテート（ｓｐ−ｍ）を使用して
段階的に溶離した。分画Ｃと分画りの双方から採ったｓ
ｐ−ｍは有意のＡＣＳＡを示した。

分画Ｄ／ＳＰ−ｍのゲル濾過により約５０００の分子量
に相当するＡＣＳＡの大きなピークを得た。活性のある
分画を精製したところ、羊のＧＨＲＨであることが分か
った。しかしながら分画Ｃ／ＳＰ−■のゲル濾過は分子
量が１０００〜７０００に相当するＡＣＳＡの幅広いピ
ークを得た。分子量約４０００に相当する分画を更に精
製し、この結果基本的な３８残基のペプチドを同定する
ことができたが、このものの特性は上記のようなもので
あり、また上記の配列を有することが解析された。この
ペプチドはＰＡＣＡＰ３８と命名された。ＰＡＣＡＰ３
８アミノ酸配列を第４図に示した。このペプチドの初期
のＣ末端分析はカルボキシペプチダーゼＢまたはＹ消化
法で行い、次に、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社のピ
コターグ法（ＰｉｃｏＴａｇ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いて
、放出されたＣ末端アミノ酸のＰＴＣアミノ酸分析を行
ったが、ペプチドのＣ末端がアミド化されていることを
示唆するものであった。

上記で分かったアミノ酸配列に基づいて、この配列を有
し遊離またはアミド化したＣ末端を有する２個の３８−
残基のペプチドが同相法によって合成され、それらの保
持時間がＲＰＨＰＬＣ上で天然のＰＡＣＡＰ３８ペプチ
ドと比較された。天然のペプチドは合成ＰＡＣＡＰ３８
−ＮＨ２とともに溶離し、ＰＡＣＡＰ３８−ＯＨより分
離された。このことは、天然のペプチドのＣ末端がアミ
ド化されていることを確認するものであった。

本格的分離作業に先だって分画ＣとＤに果して新しい活
性ペプチドがあるかどうかの検定を行った。

これについては第１図にその結果を示す。

第１図はアデニレートサイクラーゼ刺激活性（ＡＣＳＡ
：Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｃｙｃｌａｓｅ　Ｓｔｉｍｕｌ
ａｔｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）物質を示すものであり
、逆相ＨＰＬＣ上の保持時間は疎水性を表わすものとし
て横座標上にプロットし、縦座標上に電荷を表わすＩＥ
Ｘ　ＨＰＬＣの保持時間ををプロットした。このように
して各々の活性のある分画の疎水性と電荷との二次元の
マツプを作成した。ＲＰ　ＨＰＬＣは第２図すの凡例に
記載されたのと同じ溶離条件下でＴＳＫＯＤＳ　１２０
Ｔカラム上で行われた。ＩＥＸ　　ＨＰＬＣは蟻酸アン
モニウム、ｐ）＋　６．５で１００分間に１０ｍ河ない
し０．５Ｍ、次に２０分間１．０Ｍの勾配でＴＳＫＣＭ
　　ＺＳＷＳタカラム上われた。種々の既知の視床下部
放出ホルモン（ＲＨｓ）　（０）もまた同じ条件下でＲ
Ｐ　ＨＰＬＣおよびＩＥＸ　ＨＰＬＣにかけられ、既知
のＲＨｓとは異なる位置に何らかの新規な視床下部物質
（・）の存在を示すマツプを作った。各々の活性部分も
またＧＨＲＨおよびＣＲＨＲＩＡｓにかけた。

しかしながら、両合成ペプチドを天然のペプチドと比較
したときに、その何れにも同様のＡＣ８Ａ活性が認めら
れた（第２図）。最初のＲＰ　ＨＰＬＣカラムまたはＴ
ＳＫ　ＯＤＳカラム中の最初の別のピークもまた精製さ
れて、ＰＡＣＡＰ３８と同じ配列を示した。このものは
［Ｍ　ｅ　ｔ　（ｏ　）１７］−ＰＡＣＡＰ３８と同定
され、ＲＰ　ＨＰＬＣ上で過ギ酸を用いて酸化した合成
ＰＡＣＡＰ３８と同じ保持時間であることが示された。

ＰＡＣＡＰ３８は３つの二塩基性アミノ酸対を持ってい
て、これらはホルモンの前駆体の切断部位であることが
知られている。特に、第３番目の２８−２９の対の残基
の前にはＧｌｙがあり、これは残基をアミド化するため
の窒素ドナーとして役立ち。

Ｃ−末端のアミド化に必須のものである。この構造は通
常Ｃ−末端がアミド化された他のホルモンの前駆体にお
いても見られる。それゆえに、推定されている切断工程
（ｐｕｔａｔｉｖｓ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）とアミド
化がＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２を生成するのであろうと予測
された。このペプチドもまた合成され、ＰＡＣＡＰ３８
よりも大きくはないにしても、同様のＡＣ８Ａ作用性を
持っていることが分かった（第６図）。引き続きＰＡＣ
ＡＰ２７ＮＨ２も羊視床下部組織から分離され同定され
た。

イ　性　　ＨＯＭＯＬＯＧＩＥＳコンピューターを用いたＰＡＣＡＰ３８配列の類似性の
調査により、そのＮ−末端部分［１−２８］が、豚およ
び羊のＶＩＰ　（血管作用性腸管ポリペプチド）と６８
％の類似性を有することが明らかになった。一方、Ｃ−
末端部分［２９−３８］の配列は他のいずれの既知のペ
プチドとも類似性を示さなかった。我々は以前に、ＧＨ
放出作用をもつ羊の視床下部ペプチド（ＨＰ：ｈｙｐｏ
ｔｈａｌａｍｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ）の単離とその部分
構造について報告した。すなわち、ＨＰは試験管内でラ
ットの脳下垂体の断片を刺激して成長ホルモン（ＧＨ）
を放出させる〔有材（Ａｒｉｍｕｒａ）ら：ペプチズ（
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　　５、補遺　１：４１．１９８４
）。そのＮ−末端アミノ酸配列は次のとおりであった。

Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈ　ｒ−Ａ　５ｐ−５ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙ　ｓ−Ａ　
ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａ　ｓｏ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｕ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−、当時充分な量の羊の視床下部組織が
なかったので、このペプチドの一次構造を同定すること
も確認することもできなかった。しかしＰＡＣＡＰ３１
１１がこのペプチドと同族か、または非常に近縁の族で
あることはあり得る。ＰＡＣＡＰ３８はまたＧ　ＨＲＨ
、Ｐ　ＨＩ　（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　
１ｓｏ１ｅｕｃｉｎｅ　、ペプチドヒスチジンイソロイ
シン）、セクレチン、グルカゴンとある程度の同族関係
を示し、これらのペプチドのキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）
であると思われる（第４図）。いずれにしても、ＶＩＰ
の配列に共通の配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−
＾１ａ−Ｖａ１−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−は
ＶＩＰとＰＡＣＡＰ：ｌとの間の遠い祖先の同族関係を
反映しているのかも知れない。

生物活性　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＡＣＴＩＶＩＴＹＰ
ＡＣＡＰ３８とＶＩＰとの間の第一次構造の類似性のゆ
えに、生物活性上、この二つのペプチド間にどのような
類似点があるかを決定するために比較がなされた。ウレ
タン麻酔したラットにおいて両ペプチドは０．３３　ｎ
ｍｏｌｅから１．０　ｎｍｏｌの範囲の投与量で同等の
血圧降下活性を示した。しかしながら、ＰＡＣＡＰ３８
は豚ＶＩＰよりも少なくとも１００倍も大きいＡＣ３Ａ
を示した。最近の研究においてラットの脳下垂体膜組織
標本中のＰ　ＡＣＡＰ３ｇ受容体はＶＩＰの受容体とは
異なっている事が分った。このことはＰＡＣＡＰ３８が
ＶＩＰとは異なる生理的役割を持っていることを示して
いる。

ＰＡＣＡＰはラットの脳下垂体細胞を表面環流すること
によって、幾つかの下垂体ホルモンを放出させる能力を
持っていることが証明されている。

特に例を挙げれば、ＰＡＣＡＰ３８は投与量範囲約１０
−”Ｍ〜１０″″＠Ｍで投与量に比例してＧＨ，ＰＲＬ
、ＡＣＴＨの放出を促進した。更に投与量を増加すると
反応は衰え、このホルモンに対してベル形の用量反応曲
線を示した（第５図）。しかしながら、ＬＨの用量反応
は１０″″′〜１０″″ＧＭの投与量範囲では直線的で
あった（第５図）。ＦＳＨとＴＳＨの放出は同じ条件下
ではおこらなかった。

ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ生成を促すＰＡＣＡＰの能力は、細胞内
および細胞外蓄積の両方の見地から、神経細胞。

脳下垂体細胞および星状膠細胞を含む多数の異なったタ
イプの細胞においても評価された。

第７図は、ＰＡＣＡＰ３８．ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２およ
び豚ＶＩ　Ｐ　（ｐＶＩ　Ｐ）によるラットの脳下垂体
細胞培養における細胞外ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの増加をプロッ
ト表示したデータを示す。我々はまた。ラットの脳下垂
体細胞培養における細胞内ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐレベル中の時
間の変化もｗｔ察した。第３図に示されているように、
ＰＡＣＡＰ３８、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，およびＣＲＨは
同程度のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ蓄積作用を示した。ＧＲＨは最
大のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ蓄積作用を示した。一方、ｐＶＩＰ
はこの濃度では何の効果も示さなかった。

神経についての研究のために、ラット神経細胞培養を、
ライザダ（Ｒａｉｚａｄａ）らによって記載された方法
によって調製した（Ｒａｉｚａｄａら、アメリカンジャ
ーナルオブフィジオロジー（Ａｍ、　Ｊ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　　２４７：Ｃ３６４，１９８４）
　、又、非神経細胞である星状膠細胞培養はクラーク（
Ｃ１ａｒｋ）等によって記載された単一段階移動法によ
って調製した。（ＣＬａｒｋら、ジや−ナルオブバイオ
ロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、
）　　２５９：１１６７２゜１９８４）　、　１０″″
′ＭのＰＡＣＡＰ３８を培養媒体に加えると神経細胞と
星状膠細胞の両者において細胞内ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐが増加
した。しかしながら、神経細胞の反応（第６図Ｃ）に較
べて星状膠細胞の反応は異常に大きかった（第６図ｂ）
。ＰＡＣＡＰ３８の添加後１分で早くもｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ
が増加した。星状膠細胞内では細胞内ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの
レベルは少な（とも６０分間は高められたままであった
が、神経細胞内では１０分後に減少し始めた。神経細胞
または星状膠細胞培養の何れにおいても、１０″″″Ｍ
の豚のＶＩＰは感知できるほどのｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの刺激
を誘発することはなかった。

ゞ療寿としてのＰＡＣＡＰＰＡＣＡＰペプチドの生物活性を観察した結果、有意の
治療的能力を示唆する事が認められた。特に興味がある
のは、神経細胞の死の阻止である。

これは、エイズ（ＡＩＤＳ）感染または脳の機械的損傷
による神経細胞死の病態生理的条件に関連しているのか
も知れない。ＶＩＰは、ＰＡＣＡＰに有意の類似性のあ
るペプチドであるが、エイズウィルスのｇ　ｐ　１２０
表面糖蛋白によって誘発される細胞の死より、神経細胞
を保護することができるということが以前記述された［
Ｄｅ　Ｂｒｅｎｎｅ＋ｎａｎら、ジャーナルオブセルバ
イオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　　１０４
：１６０３−１６１０．１９８７；Ｄｅ　Ｂｒｅｎｎｅ
ｍａｎ　ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　３３５　
：　６３９−６４２．１．９８８）　。

ＰＡＣＡＰはＶＩＰと構造上の類似性、およびＰＡＣＡ
Ｐが示す、より大きなレベルのＡＣ８Ａ活性を考えれば
、ＰＡＣＡＰは神経細胞死を予防する上でもＶＩＰより
大きな能力が期待される。実際上、ＰＡＣＡＰ３８は１
０−”Ｍという低濃度でｇ　ｐ　１２０による神経死を
完全に予防した。この予防作用はＶＩＰの１０００倍で
ある。

適切な治療的組成物は、製剤学的に許容し得る担体と結
合した有効量のペプチドを組み込むことによって調製で
きる。非経口投与の場合は、担体は生理食塩水または生
理的に許容し得る緩衝液のような適切な賦形剤の中のい
ずれでもよい。経口投与の場合は、ペプチドはまた適切
な結合剤もしくは増量剤と組み合わせることができる。

このような組成物の調製方法および成分はこの分野でよ
く知られているものである。

１皿本発明の新規なポリペプチドはアデニレートサイクラー
ゼ刺激活性を有し、生体内のホルモンによっ−で制御さ
れた生理現象を調節する化合物となり得る。

夾五匠（１）迫偶Ｊ■」とＬ隨４３００個の羊の視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉ）
を採取して抽出に供するまで一７０℃で凍結した。２４
００　ｇの組織を１０倍量の水のなかで１０分間煮沸し
て内因性のプロテアーゼを不活性化した。氷の上で冷却
してから氷酢酸（ＡｃＯＨ）とβ−メルカプトエタノー
ル（β−ＭＥ）を添加して最終濃度がそれぞれ２Ｍと０
．０２％になるようにした。それから、４℃でホモジナ
イザー、ポリトロンを用いて均質化した。

抽出物を１７，０ＯＯＸ　ｇで遠心分離して、上澄液に
アセトンを加えて最終的に６６％の濃度にした。沈殿物
を除去してから上澄液を真空内で蒸発させて乾燥した。

残留物質を０．５ＭのＡｃＯＨに溶解してヴイダック（
Ｖｙｄａｃ）　Ｃ１８（２０−３０ｃｍ）カラム（ザセ
パレーションズグループ社）　　（３Ｘ１３ｃｍ）上に
置き、０．５ＭのＡ　ｃ　ＯＨで予め平衡状態にしてお
いた。０．１％トリフルオロ酢＠　（ＴＦＡ）中のアセ
トニトリル濃度をそれぞれ１０．２０．３０．４０．５
０．６０％と段階的に増加してＣ１８カラムから溶離し
て、それぞれＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆの６分画を得た。

各分画の一定量（ａｌｉｑｕｏｔ）を蒸発して乾燥し、
ラットの脳下垂体細胞培養を用いアデニシートサイクラ
ーゼ刺激活性（ＡＣ５Ａ　：　ＡｄｅｎｙｌａｔｅＣｙ
ｃｌａｓｅ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ）を生物検定（ｂｉｏａｓｓａｙ）　した。分画Ｃお
よび分画りに活性があることが分かった。分画りの活性
の大部分はＧＲＨによる事が分ったので、分画Ｃを精製
の出発物質として使用した。ＩＭのＡｃＯＨに溶解した
分画ＣをＩＭのＡｃＯＨを用いて予め平衡状態に保った
Ｓ　Ｐ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−２５（Ｈ型）のカラム
にかけ、次いでＩＭのＡ　ｃ　ＯＨ１２Ｍのピリジン、
２Ｍのピリジン−Ａ　ｃ　ＯＨ（ｐＨ５，０）を用いて
段階的に溶出して、それぞれ５Ｐ−Ｉ、５ｐ−ｎ、ｓｐ
−ｍの三つの分画を得た。各分画の一定量についてＡＣ
８Ａを測定した。ｓｐ−ｍが活性を持っていることが分
った。次いでｓｐ−ｍを、２ＭのＡ　ｃ　ＯＨｌｏ、０
２％β−ＭＥを溶離用緩衝液として用いて、セファデッ
クスＧ−５０微細（ｆｉｎｅ）カラム上でゲル濾過した
。カラム流出物の２８０１でのＯ，Ｄ、を測定し、各分
画の生物活性（ＡＣ８Ａ）を検定した。ＡＣ８Ａ活性を
持った分画をプールし、凍結乾燥した。残留物を１０ｍ
Ｍの蟻酸アンモニウム（ｐＨ６，５）とＣＨ，ＣＮとの
比が９０：１０の混合液で再構成して、１０ｍＭ蟻酸ア
ンモニウムとＣＨ，ＣＮの比が９０：１０のものを用い
て予め平衡状態に保ったＣＭ−５２セルロース（Ｗｈａ
ｔＩＩｌａｎ）カラム（Ｉ　Ｘ　３８ｃｍ）に吸着させ
た。第２図の凡例に記載されているように１０ｍＭ〜０
．８Ｍの蟻酸アンモニウムの直線勾配を使用してクロマ
トグラフィーを行った。

第２図ａはセファディックスＧ−５０ゲル濾過法（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０ｇｅｌ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
）によって得られたＡＣ８ＡＣ８Ａ活性４−８０の陽イ
オン交換クロマトグラフィである。

サンプルニゲル濾過法により得られた凍結乾燥した（ｌ
ｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）分画７４−８０カラム二ワツト
マン　ＣＭ−５２、ｌＸ２０ｃｍ分画の量：　４ｍｌ／
１ｕｂｅ流出速度：　８ｍｌ／ｈｒ溶媒系（ｓｏｌｖｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ）　　：（Ａ）
から（Ｂ）への線状勾配溶出（Ａ）　１０ｎ＋Ｍ蟻酸アンモニウム、（ｐＨ６，５）
：ＣＨ，ＣＮ＝９０：　１０（ν／ν）（Ｂ）０．８Ｍ蟻酸アンモニウム、（ｐＨ６，５）：Ｃ
Ｈ３ＣＮ　＝９０　：　１０　（ｖ／ｖ）ｃ　Ａ　Ｍ　
Ｐ蓄積量（・）：ラットの脳下垂体培養液中に３時間の
インキュベーション後に蓄積されたもの、がＡＣ３Ａの
反応変数として使用された。

白ぬきの四角が主たる有力なＡＣ８Ａ　（分画７０〜７
７）を示している。このものがＰＡＣＡＰ３８の現在の
精製への材料に使われた。二番目に大きいＡＣＳＡ部分
（第２番目のピーク）がら精製の後ＰＡＣＡＰ２７がと
り出された。

第２図すはＡＣ８Ａ活性のあるイオン交換クロマトグラ
フィ分画（分画７０〜７７）の逆相ＨＰＬＣである。

サンプル：分画７０−７７流出速度：　１．０ｍｌ／ｍｉｎカラム：ＴＳＫ　　ＯＤＳ　　１２０Ｔ（４，６Ｘ２５
０ｍｍ、東洋曹達）溶媒系：（Ａ）から（Ｂ）への直線勾配溶離１２０分（
Ａ）Ｈ，Ｏ：　ＣＨ３ＣＮ：　１０％ＴＦＡ＝９０　：
　１０　：　１　（ｖ／ｖ）（Ｂ）Ｈ２Ｏ：　ＣＨ３Ｃ
Ｎ：　１０％ＴＦＡ＝４０　：　６０　：　１　（ｖ／
ｖ）黒い棒グラフはＡＣ８Ａ　（ＡおよびＢ）を示す。

ＡＣ８Ａの大部分（ａ）は３４〜３５分後に■、３５〜
３６分後にＨの部分に分かれた。それぞれが紫外線ピー
クピークに対応する。

第２図ＣはＲＰ　　ＨＰＬＣによるＰＡＣＡＰの最終的
な精製を示す。

サンプル：先のＲＰ　　ＨＰＬＣで３５〜３６分で溶出
したＡＣ３Ａ分画［Ａ−ＩＩ］流出速度：　１．０ｍｌ／ｍｉｎ。

カラム：　Ｖｙｄａｃフェニル（４，６Ｘ　２５０ｍｍ
）溶媒系：（Ａ）から（Ｂ）への直線勾配溶離１２０分
（Ａ）Ｈ２Ｏ：　ＣＨ，ＣＮ　：　１０％ＴＦＡ＝９０
　：　１０　：　１　（ｖ／ｖ）（Ｂ）Ｈ２Ｏ：　ＣＨ
ｌＣＮ　：　１０％ＴＦＡ＝４０　：　６０　：　１　
（ｖ／ｖ）ＡＣ８Ａ分画（１）もまた同じ条件で精製さ
れた。

第３図においては、ラットの脳下垂体細胞培養を用イテ
測定したｖｒｐ　（ロ）、ＣＲＨ（ム）、単離した天然
の羊（７）ＰＡＣＡＰ３８　（０）、合成ＰＡＣＡＰ３
８ＮＨ，（・）、および合成ＰＡＣＡＰ３８０Ｈ（Δ）
のＡＣ８Ａが示されている。

羊の視床下部より調製されたＣＩ８分画Ｃと分画りより
得られた塩基性のペプチド分画（ｓｐ−ｍ）は著しいＡ
Ｃ８Ａ活性を示した。分画Ｄ／ＳＰ−■は分子量がｓ、
ｏｏｏに相当するＡＣ８Ａ活性の一つの有効なピークを
得た。この活性分画を精製純化した。この物質の配列分
析の結果、この活性物質が羊のＧＨＲＨ［１−４４］で
あることが分かった。

このことは、更に羊のＧＨＲＨの放射性同位元素標識免
疫検定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
）によっても確認された。

一方、分画Ｃのｓｐ−ｍのゲル濾過では分子量がｓ、ｏ
ｏｏ〜７，０００に相当するＡＣ８Ａ活性の幅広いピー
クが得られた。分子量が約３　、０００〜４　、０００
に相当する分画を集め凍結乾燥し、さらにイオン交換Ｈ
ＰＬＣにより精製した。第２図ａに示されるようにＡＣ
ＳＡ活性の一つの大きなピークと三つの小さいピークが
クロマトグラムに出現し、この主要活性分画７０〜７７
を精製に使いＰＡＣＡＰ３８を得た。分画２８〜４３に
溶出したＡＳＣＡ活性の三つのピーク分画は、ＲＩＡに
よるＧ　ＨＲＨ様免疫活性を示したものもあったが、そ
れ以外のＡＣ３Ａ活性を精製単離してＰＡＣＡＰ２７が
得られた。

主要ピーク分画７０〜７７のＡＣ３Ａ活性は更にＴＳＫ
　ＯＤＳ　１２０Ｔカラム上で逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃニよっ
て精製した。次いでＡＣ８Ａ活性は−っの大きなピーク
と一つの小さなピークに分離した（第２図ｂ）。二つの
鋭い紫外線のピークが先に示した主要ＡＣ８Ａピークの
領域に見られた。これらの二つの紫外線ピーク分画を、
別々に、ヴアイダック（Ｖｙｄａｃ）フェニル　カラム
上で他の逆相ＨＰＬＣを用いて精製した（第２図Ｃ）。

その各々はそれぞれ４１分間と４３分間で溶離した対称
型の紫外線ピークを作った。各々のアミノ酸配列を分析
したところ同一のアミノ酸配列を示した。早期に溶離し
たピークは酸化型を示し、後期に溶離したピークは還元
型を示すことが分かった。各ペプチドの純度はまた他の
逆相ＨＰＬＣ系によって確認された。

（２）配ｌすＬ児ペプチドの量が非常に少ないので、全ての分析はナノモ
ル（ｎａｎｏｍｏｌｅ：　１０”−’ｍｏｌｅ）以下と
いった極微量の規模で行った。

高度に精製した、ＡＣ３Ａ活性（約１００　ｐｍｏｌｅ
）を有するペプチドの１／６を直接、自動蛋白／ペプチ
ドシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、　Ｍｏｄｅｌ　４７７Ａ）にかけ、オンライン
のＰＴＨ１２０Ａアミノ酸分析機によって得られたアミ
ノ酸が測定された。この装置の操作はベールエドマン（
Ｐｅｈｒ　Ｅｄｍａｎ）の配列崩壊化学に基づいて行っ
た。このＰＴＨ分析機は勾配ミクロボアクロマトグラフ
ィを使用してこのエドマン崩壊産物を分離して検出する
。このシークエンサー制御装置はクロマトグラフィーデ
ータを分析し、配列情報を翻訳処理する。

Ｐ　Ａ　ＣＡ　Ｐ　［１−３８］のカルボキシ末端分析
は、３７℃において、１０μｌの０．１Ｍ重炭酸アンモ
ニウム中でカルボキシペプチダーゼＹおよびＢ　（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ
ｉｓ、　Ｎｏ；　１００ｎｇｅ１００ｎを用いて消化す
ることによって行なった。１時間の後、放出されたアミ
ノ酸の分析を、前標識化分析系（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｐｉ
ｃｏ−Ｔａｇ）を用いてピコモル（ｐｉｃｏｍ。

ｌａ：１０″″”　ｍｏｌｅ）レベルで行った。

ピコ標識法はアミノ酸のプレカラムの誘導体化において
、標識試薬としてフェニルインチオシアネート（ＰＩＴ
Ｃ）を利用する。アミノ酸とＰＩＴＣとの間の１段階の
反応で安定なフェニルチオカルバメート（ＰＴＣ）アミ
ノ酸誘導体が生成し、各誘導体は、第１および第２アミ
ノ酸の両者に対する紫外線活性発色団を含んでいる。次
いで得られたＰＴＣアミノ酸は、逆相ＨＰＬＣ上で分離
されて測定された。

（３）アデニレートサイクラーゼ　　の般単層ラット脳下垂体前葉細胞培養が前記（Ｃｕｌｌｅｒ
ら、　１９８４）のようにして調製された。体重が約２
００　ｇの＠ＣＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ
　ＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｓ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ
、　ＭＡ）から発情周期（ｅｓｔｒｏｕｓ　ｃｙｃｌｅ
）に拘らず採取した脳下垂体前葉を、コラゲナーゼタイ
プ■とＤＮＡアーゼ（ＤＮＡｓｅ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ
ｎｕｃｌａａｓｅ）タイプ■を用いて酵素的に分散した
。

分散した細胞は遠心分離して採集し、ＨＥＰＥＳ緩衝液
を用いて３回洗浄し、最後に１０％の馬血清。

２．５％の牛の胎児の血清、１％の抗生物質・抗真菌物
質溶液（Ｂｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｒｓｌｅ、　ＮＹ）を含むＤＭＥ
Ｍ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅ
ａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した。この細胞を
、１．５Ｘ　１０’　ｃａｌｌｓ／耐／ｗｅｌｌの密度
で２４−マルチウェル組織培養プレートで培養しくＦａ
ｌｃｏｎ、　０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ）、次いで空気９５
％、炭酸ガス５％の水蒸気で飽和させた大気中、３７°
Ｃで４日間インキュベートした。急性の刺激に先立って
、培養した細胞を無血清ＤＭＥＭ中で溶媒を二度取り替
えて３時間インキュベートした。次にその細胞を試験物
質を含んだＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭの０．５ｍｌ中で３
時間インキュベートした。アスコルビン酸（２，５Ｘ　
１０−’　Ｍ　）と０．２５％のＢＳＡを、試料の酸化
と吸着を防ぐために、分析のためのインキュベーション
用の溶媒に添加した。それぞれのインキュベーションの
終りに、溶媒を各ウェルから別個に採取し、夫々の放射
免疫検定法によってｃ　Ａ　Ｍ　Ｐおよび脳下垂体ホル
モンを分析するまで、−７０℃で貯蔵した。

培養媒体中のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐは、ハーバ−とプルツカ−
（Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｂｒｏｏｋｅｒ）ジャーナルオブ
サイクリック　ヌクレオフィリック　リサーチ（Ｃｙｃ
ｌｉｃ　Ｎｕｃｌｅａ、　Ｒｅｓ、）　１：２０７．１
９７５によって記述されているＲＩＡ法によって決定さ
れた。５００μｍのサンプルおよび標準ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ
は、トリエチルアミンと無水酢酸（２：１）の混合物１
５μｍを添加してアセチル化した。ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐに対
する抗血清は田村誠博士によって生成されたものであり
、よう素化のためのＴ　ｙ　ｒ　−Ａ　Ｍ　Ｐはヤマサ
■（日本）から寄贈を受けたものである。Ｔｙｒ−ＡＭ
Ｐはラクトペルオキシダーゼ法を用いてＬａｓ工によっ
てよう素化され、ＨＰＬＣによって精製された。この方
法で我々は１ｆモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ：１０−１ｓ
１０−１ｓ　／試験管の微量までｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを検出
することができた。

培養媒体中の脳下垂体ホルモンの測定は、ＮＩＤ　Ｄ　
Ｋ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｈｏｒ
ｍｏｎｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ。

国立脳下垂体ホルモンプログラム）より提供された、そ
れぞれのＲＩＡキットを用いてなされた。

ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの細胞内と細胞外ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの蓄積
のデータはそれぞれ第６図と第７図に示されている。

第６図は合成ＰＡＣＡＰ３８、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、
ＣＲＨ，ＶＩＰを加えてからラットの神経細胞、星状膠
細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）　、脳下垂体細胞の細胞
内ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ蓄積を示したものである。

第６図ａは培養した脳下垂体細胞内のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの
蓄積、第６図すは培養した星状膠細胞内のｃＡＭＰの蓄
積、第６図Ｃは培養した神経細胞内のＣＡＭＰの蓄積の
時間的経過に関するものである。

第７図は天然のＰＡＣＡＰ３８、および合成ＰＡＣＡＰ
２７ＮＨ２、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰ３８ｔＣよルラット下
垂体細胞培養液中のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ蓄積を測定したもの
である。

サンプルによる脳下垂体ホルモン分泌作用を測定するた
め脳下垂体細胞スーパーフュージョン法が、ヴイーグ（
Ｖｉｇｈ）とシャリ−（Ｓｃｈａｌｌｙ）の報告（１９
８４）に従って行われた。３匹の雌成熟ラットから採っ
た脳下垂体を細かく刻み、０．５％のコラゲナーゼ（Ｓ
ｉｇｍａ　Ｔｙｐｅ　Ｉ）　、０．２５％ＢＳＡ、５０
μｍ／ｌ１１１　　硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）
を含む酸素添加培養液１９９　（Ｇｉｂｏｃｏ／Ｌｉｆ
ｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１０ｍｌ中で３７℃で
４５分間デュブノフ（Ｄｕｂｎｏｆｆ）インキュベータ
ー中でインキュベートした。このインキュベート後は脳
下垂体組織には明瞭な変化は見られなかったが、バスト
ウールピペットによる吸引と排出の繰り返しによってこ
の断片が容易に単細胞に分散することができた。ピペッ
ト操作を３０ないし６０回くり返した後、その組織はば
らばらになった。この細胞懸濁液を室温で１０分間、１
００×ｇで遠心分離した０次いでその細胞ペレットを１
゜Ｏｗｌの培養液中で再び懸濁した。少量の一定量を希
釈して細胞数を数え、懸濁液の残りを２等分した。各容
量（約５Ｘ１０”個の細胞を含み１通常は３゜５Ｘ１０
”〜７．ＯＸ　１０＠個）を、予め酸素添加した培養液
を加えて平衡状態に保った０、５ｍｌのセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１５と混合した。脳下垂体
細胞とセファデックスとの混合物をスーパーフュージョ
ン装置の二つのカラムに移して培養液を加えた。この培
養液は常に酵素分散法に使った時と同様の方法で新しく
調製し、コラゲナーゼを除外し、ミリポア（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ）濾過器を通過させ、実験中絶え間なく酸素（
９５％）と二酸化炭素（５％）の混合物を供給し続けた
。このスーパーフュージョン装置中を環流する培養液の
流速は複数チャンネルポンプ（ＧｉＬｓｏｎ　Ｍｉｎｉ
ｐｕｌｓａ　Ｔｙｐｅ　）ＩＰ−８）によって調節され
た。このポンプはスーパーフュージョンチャンバーの後
ろに取り付けられており、下部の差し込みのチューブは
ポンプに連結され、そこから二つのチャンネルの分画採
集器に連結されている。即ち、この系は流速の変動を少
なくするために負の圧力で操作されたのである。サンプ
ルは３分間パルスで添加され、次いでサンプルを含まな
い培養液が環流する。スーパーフュージョンされたサン
プルは３分ごとの分画として、１分画につき０　、９ｍ
ｌ採取された。第５図に見られるようにこのペプチドは
プロラクチン（ＰＲＬ）、成長ホルモン（ＧＨ）、副腎
皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ：ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ）の放出
を刺激する。ＰＲＬ、ＧＨ，ＡＣＴＨ反応ではＰＡＣＡ
Ｐ３８は１０″″８Ｍで最大の効果を持ったベル形の、
用量反応曲線を示した。最小効果を示した投与量は１０
−１１１Ｍであった。ＬＨ放出では投与量１０−１０Ｍ
〜１０−ＧＭで直線の用量反応関係がみられた。このペ
プチドはＴＳＨおよびＦＳＨ放出に対しては効果がなか
った。

第５図はスーパーフュージョンされた脳下垂体細胞から
放出される脳下垂体ホルモンについての合成ＰＡＣＡＰ
３８の効果を示すものであり、その方法はヴイーグとシ
ャリ−（Ｖｉｇｈ　ａｎｄ　５ｃｈａｌｌｙ）の報告に
従った。ペプチドは３分間添加された。

上部の数字は次のものを示す。

１および７　：　１００ｍＭ　　ＫＣ１２：　１０−”
Ｍ　　ＰＡＣＡＰ３８３：１０″″’Ｍ　　ＰＡＣＡＰａ８４　：　１０”−”Ｍ　　ＰＡＣＡＰ３８５　：　１０
−’Ｍ　　ＰＡＣＡＰ３８６　：　１０−＠Ｍ　　ＰＡ
ＣＡＰ３８０．９ｍｌの分画が３分ごとに採取され、各
分画はＮＩ　Ｄ　Ｄ　Ｋ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｏｒ
ｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｐｒ。

ｇｒａｍ）より提供された夫々のＲＩＡキットを用いて
、ＲＩＡによってＧＨ，ＰＲＬ、ＡＣＴＨ，ＬＨ，ＦＳ
Ｈ，ＴＳＨが測定された。

（５）１五五１立失定ウレタン（１５０ｍｇ／１００ｇ　ｉｐ）によって麻酔
をかけられた雄成熟ラットの動脈血圧を測定した。血圧
トランスデユーサ−Ｐ−１０００Ｂ　（Ｎａｃｒｏ　Ｂ
ｉｏ−３ｙｓｔｅｍｓ）と連結したポリエチレンの管（
ＰＨ５０）を大腿動脈（ｆｅｍｏｒａｌ　ａｒｔｅｒｙ
）に挿入した。血圧はナルコトレース４０　（Ｎａｒｃ
ｏ−ｔｒａｃｅ　４０、ナルコ社）を使用して記録した
。　０．５ｍｌの０．９％生理的食塩水に溶解した試験
物質の注射のためにラットの大腿静脈（ｆｅａ＋ｏｒａ
ｌ　ｖｅｉｎ）に他のポリエチレンノ管（ＰＥ５０）を
挿入した。

ＶＩＰは血管の平滑筋の弛緩を促し血圧を低下させるの
で、ＶＩＰと同様の構造を持っているＰＡＣＡＰについ
て血圧降下活性を検査した。ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ２と豚
のＶＩＰは麻酔をかけたラットにおいて類似の血圧降下
活性を示した。ＰＡＣＡＰ３８もまた有意であるがＰＡ
ＣＡＰ２７ＮＨ，よりは幾分弱い血圧降下活性を示した
。

【図面の簡単な説明】

第１図は既知の視床下部放出ホルモン（ＲＨｓ）（０）
と本発明で得られた新規の視床下部物質（・）に関する
、ＡＣＳＡに基くマツプである。第２図は羊の視床下部抽出物からのＡＣ８Ａ活性分の精
製過程を示すクロマトグラムである。第３図はラットの脳下垂体細胞培養を用いて測定した、
ＶＩ　Ｐ　（ロ）、ＣＲＨ（Ａ）、精製ｔ、　タ羊の天
然（７）ＰＡＣＡＰａ８　（０）、合成ＰＡＣＡＰ３８
（・）および合成ＰＡＣＡＰ３８０Ｈ（Δ）のＡＣＳＡ
に関するグラフである。第４図はＰＡＣＡＰ３８のアミノ酸配列と、ＰＡＣＡＰ
３８と関連したペプチドのアミノ酸配列を示す。羊のＨ
Ｐ、ＶＩＰ、羊のＧＨＲＨ，ＰＨＩ、セクレチン、グル
カゴンのアミノ酸配列を示す。下線を付した残基はＰＡ
ＣＡＰ３８と同一のアミノ酸を示す、上部の数字は示さ
れたペプチドのアミノ酸番号を示す。第５図はスーパーフュージョンされた脳下垂体細胞から
放出される脳下垂体ホルモンについての合成ＰＡＣＡＰ
ａ８の効果を示す図である。第６図は合成ＰＡＣＡＰ３８、ＰＡＣＡＰ２７ＮＨ，、
ＣＲＨ，ＶＩＰを加えてから培養したラットの神経細胞
、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）　、脳下垂体細
胞のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ細胞内蓄積について検査したもので
、第６図ａは培養した脳下垂体細胞内のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ
の蓄積を、第６図すは培養した星状膠細胞内のｃ　Ａ　
Ｍ　Ｐの蓄積を、第６図Ｃは培養した神経細胞内のｃ　
Ａ　Ｍ　Ｐの蓄積を示す。第７図は天然のＰＡＣＡＰ３８、および合成ＰＡＣＡＰ
２７ＮＨ，，ＶＩ　Ｐ％ＰＡＣＡＰ３８４Ｃよるラット
の下垂体培養液中のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐを測定したグラフで
ある。第１図

Claims

【特許請求の範囲】（１）配列【遺伝子配列があります】を含有するペプチ
ドおよび生理活性のある類似物。（２）配列【遺伝子配
列があります】を含有する請求項１記載のペプチド。（３）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（４）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（５）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（６）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（７）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（８）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（９）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求項
１記載のペプチド。（１０）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１１）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１２）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１３）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１４）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１５）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１６）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１７）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１８）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（１９）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２０）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２１）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２２）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２３）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２４）配列【遺伝子配列があります】を含有する請求
項１記載のペプチド。（２５）請求項１から２４までの何れかの少なくとも一
つのペプチドを含有する薬剤組成物。（２６）請求項１から２４までの有効量のペプチドを脊
椎動物の細胞に接触させることを包含する該細胞におけ
るアデニレートサイクラーゼ活性を促進する方法。