JP2795346B2

JP2795346B2 - 血管収縮ペプチド

Info

Publication number: JP2795346B2
Application number: JP63240791A
Authority: JP
Inventors: 知生真崎; 勝年後藤; 定雄木村; 洋司三井; 義雄矢崎; 正史柳沢; 裕基栗原
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1988-09-28
Publication date: 1998-09-10
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: JPH01206997A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は血管平滑筋収縮作用を有するペプチドに関す
る。

更に詳しくは、本発明は分子量2,500±300で血管収縮
作用を有する新規なポリペプチドに関し、このものは好
ましくは、哺乳動物もしくは鳥類の血管内皮細胞から得
られるものであり、また本発明はこのポリペプチドを製
造および使用する方法に関し、またこのようなポリペプ
チドを用いた薬剤組成物に関するものである。

従来の技術内皮依存性の血管拡張反応とならんで、種々の刺激に
対する内皮依存性の血管拡張反応が報告されている。血
管の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、
さらにはニューロペプチドＹ（竹本、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー（Proc.Natl.Acad.S
ci.,U.S.A.），79,5485（1982）；シー，ミンス等、
同，81,4577（1984））によるノルアドレナリン収縮の
増強などがその例である。アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・フィジオロジー（Amer.J.Physiol.），248,C550（1
985）（エー，クリスチン等）およびジャーナル・オブ
・セルラー・フィジオロジー（J.Cell Physiol.），13
2,263（1987）（アールエフオブライエン等）には
内皮細胞由来の冠血管収納因子（分子量はそれぞれ8,50
0および3,000）が記載されているが構造は不明である。
また、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・
エクスペリメンタル・セラビューティクス（J.Pharmac
l.Exp.Ther.），236,339（1985）（エムエヌギレスピ
ー等）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されて
いるが、これも構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレ
ッシン（Vasopressin）やブラジキニン（Bradykinin）
などのペプチドが知られていて、それらのアミノ酸配列
も明確にされているが、これらのペプチドが哺乳類また
は鳥類の血管内皮細胞をオリジンとして得られたという
報告はない。また、血管収縮作用を有するアンジオテン
シン（Angiotensin）がウシ大動脈の内皮細胞から得ら
れるという報告（アイカイフォーおよびヴィジェ
ドザブ、サーキュレーション・リサーチ（Circulation
Research），60,422（1987））があるが、アンジオテン
シンは分子量1,00のペプチドである。

発明が解決しようとする問題点本発明者らは、ブタ大動脈の内皮細胞が産生する強い
血管平滑筋収縮因子を見出し、この活性因子が新規なペ
プチドであることをつきとめ、さらに検討を加えて本発
明を完成した。

問題点を解決するための手段本発明は哺乳類または鳥類の血管内皮細胞から得られ
る、人間を含めた動物に対し、血管平滑筋収縮作用を有
する分子量2,500±300のペプチドを提供するものであ
り、本発明者等は、これをエンドセリンと命名した。

哺乳類としては、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イ
ヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハム
スターなどがあげられる。鳥類としては、ニワトリ、カ
モ、ガチョウ、シチメンチョウなどがあげられる。扱い
やすい動物であることと内皮細胞を取り出しやすいこと
から、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギが好適である。これら
哺乳類や鳥類の血管内皮細胞は、常法によって容易に得
られるが、例えば血管の内壁を解剖用メスなどで擦過す
るか、あるいはトリプシンなどの酵素で常法通りに処理
することにより容易に得られる。血管は太いほうが扱い
やすいので大動脈や臍帯静脈を用いるのがよい。得られ
た内皮細胞は参考例に記載するアッセイ系において観測
され、強い血管平滑筋収縮活性を有している。また、強
心作用（心臓に対する変時作用および変力作用）も認め
られる。

本発明の血管収縮因子を多量得ようとする場合は、上
記のようにして得られた内皮細胞を培養するとよい。培
養は血清培養でも無血清培養でもよいが、本発明の血管
平滑筋収縮因子を単離する目的には無血清培養が適して
いる。培養方法は特に限定されないが、通常は、単層継
代培養する。培養に用いる培地としては高等動物細胞培
養に通常用いられる培地（たとえばハム（Ham）Ｆ−10
培地など）がよく、内皮細胞10⁵個に対して培地は0.05
〜5ml、好ましくは0.1〜0.2ml使用する。無血清培養の
培養期間は0.5ないし８日間が適当であるが、５ないし
６日間が最もよい。培養温度は通常37℃±１℃である。
血管平滑筋収縮作用と強心作用は培養上清中に観測され
る。

本発明の血管平滑筋収縮因子は単離・精製の結果、ペ
プチドであることが確認された。本発明の血管平滑筋収
縮ペプチドの単離・精製は、抽出、イオン交換またはゲ
ルろ過のカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー、電気泳動、再結晶のようなペプチドの通常
の単離・精製法が用いられる。本発明の目的にはイオン
交換または逆相のカラムクロマトグラフィーや高速液体
クロマトグラフィーが特に適している。

本発明によるペプチドたるエンドセリンは21個のアミ
ノ酸残基を有し、その中には上記アミノ酸配列のＮ末端
から数えて第１番目、第３番目、第11番目、第15番目に
位置する４個のシステイン基が含まれ、それらは２組の
ジスルフィド結合を形成している。このジスルフィド結
合の組合せとしては、１−15,3−11の組合せ、および１
−11,3−15の組合せがあるが、前者の組合せのものの方
が活性が高い。

単離・精製された本発明のエンドセリンのうちの一つ
は、アミノ酸分析（ニンヒドリン法），分子量測定およ
びその他のデータから、次のアミノ酸21個からなるペプ
チド（以後、エンドセリンＡと表す）であることが分か
っている。エンドセリンＡのアミノ酸配列はであり、CysとCysの間でＳ−Ｓ結合が２組存在する。分
子量は2,492である。

作用・効果エンドセリンＡを含む本発明の血管収縮ペプチドは低
血圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用することがで
きるのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解
析や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを
与えるものである。

例えば、本発明の血管収縮ペプチドは血管収縮剤とし
て種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような
効果を有する。またこのものは種々のショック症状を回
復させる効果をも有する。このペプチドは経口的、局所
的、静注もしくは非経口的に投与することができるが、
局所もしくは静注投与が好ましい。投与量は0.001μｇ
〜100μg/kg、好ましくは0.01μｇ〜10μg/kgであり、
体重に応じた投与量を１〜10mlの生理的食塩水中に溶解
して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳
剤、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤、粒剤、カプセル剤、
丸剤などの種々の形態に製剤化したものとして使用でき
る。副成分としては、薬理的に許容され得る賦形剤、崩
壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、充填剤、担体
などが用いられる。これらの副成分の例としては、賦形
剤としては乳糖、ぶどう糖、白糖などが、崩壊剤として
は澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、カルボキシメ
チルセルローズカルシウムなどが、滑沢剤としてはステ
アリン酸マグネシウム、タルク、流動パラフィンなど
が、結合剤としては単シロップ、ゼラチン溶液、エタノ
ール、ポリビニルアルコールなどが、分散剤としてはメ
チルセルロース、エチルセルロース、セラックなどが、
可塑剤としてはグリセリン、澱粉などが挙げられる。

参考例（１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を綿棒による擦過にて除去したブタ右冠状動脈ス
パイラル標本（２×20mm）を炭酸ガスと酸素の混合ガス
（5:95、V/V）で飽和した37℃のクレブスーリンゲル液
（3ml）中に懸垂する。刺激前張力（basal tension）を
1gに設定したのち、張力トランスデューサーで等尺性張
力を測定する。

（２）強心作用のアッセイ法前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパ
イラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標法を
使用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心
脈数を測定する。

（３）ED₅₀ 平均効果投与量のことで、50％の被験体に有効な投与
量をいう。

実施例１（１）培養 10〜20継代のブタ大動脈内皮細胞（3.6×10⁴個）をの
べ培養面積36,000cm²のプラスチックディッシュ上で、1
0％ウマ血清を含むダルベッコ変法イーグル最小培地（D
ulbecco's modified Eagle's minimal essential mediu
m）9.6にて37℃、５％炭酸ガスを含む大気中で飽和
（confluent）細胞密度に至るまで単層培養した。10日
間を要した。このときの細胞密度は10⁵/cm²で、すなわ
ち総細胞数は4.8×10⁹個であった。次に培地を、血清を
含まないダルベッコ変法イーグル最小培地（9.6）に
交換し、37℃、５日間培養を継続した。培養後の培地を
10,000G、20分間遠心分離して浮遊物を除去し、上清
（9.6）を得た。

（２）エンドセリンＡの単離・精製（ｉ）逆相カラムによる濃縮と脱塩（１）で得た培養上清を0.1％トリフルオロ酢酸水溶
液（pH2.0）にて平衡化したChemcosorb SP−Ｃ−ODS逆
相カラム（ケムコ社製、直径3cm×長さ18cm）にかけ、
吸着物を0.1％トリフルオロ酢酸/70％アセトニトリル水
溶液（pH2.0、30ml）にて溶出した。溶出液をジエチル
エーテル（300ml）で抽出したのち有機層を捨て、水層
（20ml）に1Mトリス塩基〔Tris（hydroxymethyl）amino
methane〕水溶液を加えてpHを7.0とした。

（ii）陰イオン交換クロマトグラフィーによる粗分画（ｉ）で得られた分画（20ml）を高速液体クロマトグ
ラフィーに接続し、20mMトリス塩酸（pN7.0）で平衡化
したToyopearlpak DEAE−650M（東洋曹達製、直径2.2cm
×長さ20cm）にかけ、20mMトリス塩酸（pH7.0）中、0.3
Mから0.8Mの食塩濃度勾配（30分間、カラム流速4ml/mi
n）で溶出し、各分画の血管収縮活性を検定し。食塩濃
度0.5Mで溶出される分画40mlを活性分画として用いた。

（iii）逆相高速液体クロマトグラフィーによる最終精
製（ii）で得られた活性分画40mlを、0.1％トリフルオ
ロ酢酸水溶液で平衡化したUnicil QC18カラム（ガスク
ロ工業、直径7.5mm×長さ30cm）にかけ、吸着物を0.1％
トリフルオロ酢酸中、15％から50％のアセトニトリル濃
度勾配（70分間、カラム流速3ml/min）で溶出し、各分
画の活性を検定し、35％アセトニトリルで溶出される活
性分画12mlを得た。これを0.1％トリフルオロ酢酸で３
倍に希釈し、0.1％トリフルオロ酢酸で平衡化したChems
orb 5−ODS−Ｈカラム（ケムコ社製、直径4.6mm×長さ2
5cm）にかけ、0.1％トリフルオロ酢酸20％から50％のア
セトニトリル濃度勾配（120分間、カラム流速1ml/min）
で溶出した。溶出液の280nm紫外吸光をモニターし、吸
光のピークごとに分画し、活性のある分画（ピーク）を
精製エンドセリンＡとした。エンドセリンＡの収量は7.
3μｇ（2.9nmole）。

（３）アッセイ上記２（iii）で得られたエンドセリンＡの活性が参
考例（１）および（２）の方法で測定された。

アッセイ法（１）（ブタ冠状動脈によるアッセイ）に
よるED₅₀は４〜５×10^-10モル／であった。

アッセイ法（２）（モルモット左心房による強心作
用）によるED₅₀は１×10^-9モル／であった。

（４）注射剤の製造（２）で得られたエンドセリンA12μｇを生理的食塩
水に溶解し、ミリポアフィルターでろ過、次いで凍結乾
燥した。使用時に静注剤を製造するに当り、上記凍結乾
燥物を生理的食塩水に溶解し、全量を5mlとして注射剤
とした。

実施例２エンドセリンＡの合成市販の保護トリプトファン樹脂（Boc−Trp（CHO）−P
AM樹脂、アプライド・バイオシステムズ社製）0.7g（0.
5m mole）を用い、ペプチド合成機（アプライド・バイ
オシステムズ社製・モデル430A）を使用し、通常の方法
により合成した。縮合方法は、樹脂上のBoc基を塩化メ
チレン中50％トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基
を遊離させ、この遊離のアミノ基にBoc−Ile,Boc−Asp
（OBzl）,Boc−Leu,Boc−His（Tos）,Boc−Cys（Acm）,
Boc−Tyr（Br−ｚ）,Boc−Val,Boc−Phe,Boc−Glu（OBz
l）,Boc−Lys（Cl−Ｚ）,Boc−Met,Boc−Ser（Bzl）を
Ｃ末端側よりエンドセリンのアミノ酸配列通りに、ジシ
クロヘキシルカルボジイミド（DCC）の存在下に縮合さ
せる反応をくり返した。

この様にして得られた保護エンドセリン樹脂1.8gのう
ち800mgをアニソール1ml、1,2−エタンジオチール1mlで
膨潤させ、０℃でフッ化水素10mlと60分間処理した後、
過剰のフッ化水素を減圧留去した。残査を酢酸エチル5m
lで洗った後、50％−酢酸水に抽出し、デキストランゲ
ル（セファデックスLH−20）カラム（２×90cm）に付
し、同溶媒で溶出した主分画を集め凍結乾燥し、120mg
の白色粉末を得た。これの20mgを80％−酢酸水20mlに溶
解し、トリフルオロ酢酸第二水銀15mgを加え、室温で60
分間撹拌したのち、同溶媒30mlで希釈し、硫化水素ガス
を通じ、析出物をろ去し、凍結乾燥した。これを希酢酸
400mlに溶解し、重炭酸アンモニウムでpH8に調節したの
ち６時間空気酸化に付し、酢酸を加えpH3としたのち、
凍結乾燥した。これを30％−酢酸で充填したセファデッ
クスLH−20のカラム（２×90cm）に付し、主要分画を集
め、さらにHPLC（カラム:YMC,溶媒:0.1％−トリフルオ
ロ酢酸水と0.1％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ
ルの直線型濃度勾配溶出）で分取し目的物のエンドセリ
ンＡを2.7mg得た。

以上のように合成されたエンドセリンＡは、HPLCで実
施例１の天然抽出物と一致する位置に溶出された。

測定条件カラム：ケムコ社製ヌクレオシル50DS−Ｈ（4.61mmφ
×250mm）溶離液:A液（0.1％−トリフルオロ酢酸水） B液（0.1％−トリフルオロ酢酸含有−50％含
水アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾
配溶出（20分）流速:1.0ml/分測定条件カラム：東洋ソーダ製 DEAE−2SW（4.61mmφ×250m
m）溶離液:A液（10mM トリス・塩酸pH7.5） B液（1M NaCl含有Ａ液）を用いＡ液からＢ液
へ直線型濃度勾配溶出（40分）流速:1.0ml/分溶出位置 21.5分（測定条件） 21.3分（測定条件）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者木村定雄茨城県つくば市並木２丁目1867番地 207棟105号 (72)発明者三井洋司茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者矢崎義雄東京都文京区小日向３丁目12番地の４ (72)発明者柳沢正史茨城県つくば市竹園１丁目８番地の14 907棟303号 (72)発明者栗原裕基東京都江東区亀戸３丁目３番６―904号審査官斉藤真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C07K 14/00 - 14/825 A61K 37/24 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列：で表されるペプチド。
【請求項２】均質な請求項１記載のペプチド。
【請求項３】請求項１記載のペプチド生産細胞の培養を
行い培養物から該ペプチドを回収することを特徴とする
該ペプチドの製造法。
【請求項４】請求項１記載のペプチド生産細胞が血管内
皮細胞から得られるものである請求項３記載の方法。
【請求項５】培養が無血清培地で行われる請求項３また
は４記載の方法。
【請求項６】回収が高速液体クロマトグラフィーを含む
方法によって行われる請求項３、４または５記載の方
法。
【請求項７】請求項１または２記載のペプチドの有効量
および薬剤的に許容し得る添加剤を含有する血管収縮
剤。
【請求項８】有効量が0.001μｇ〜100μg/kgである請求
項７記載の血管収縮剤。