JPH01206997A

JPH01206997A - 血管収縮ペプチド

Info

Publication number: JPH01206997A
Application number: JP63240791A
Authority: JP
Inventors: Tomoo Mazaki; 知生真崎; Katsutoshi Goto; 後藤　勝年; Sadao Kimura; 木村　定雄; Yoji Mitsui; 三井　洋司; Yoshio Yazaki; 矢崎　義雄; Masashi Yanagisawa; 正史柳沢; Hironori Kurihara; 栗原　裕基
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1988-09-28
Publication date: 1989-08-21
Anticipated expiration: 2013-09-10
Also published as: JP2795346B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産１し跣のオ団Ｌｒ野− 本発明は血管平滑筋収縮作用を有するペプチドに関する
。

更に詳しくは、本発明は分子量２，５００±３００で血
管収縮作用を有する新規なポリペプチドに関し、このも
のは好ましくは、哺乳動物もしくは鳥類の血管内皮細胞
から得られるものであり、また本発明はこのポリペプチ
ドを製造および使用する方法に関し、またこのようなポ
リペプチドを用いた薬剤組成物に関するものである。

従来の技術内皮依存性の血管拡張反応とならんで１種々の刺激に対
する内皮依存性の血管拡張反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、さ
らにはニューロペプチドＹ（竹本、プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｌｌ、Ｓ。

Ａ、）、副、　５４８５　（１９８２）　；シー、ミン
ス等、同、８ｉ。

４５７７　（１９８４）　）によるノルアドレナリン収
縮の増強などがその例である。アメリカン・ジャーナル
・オブ・フィジオロジ−（Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、）。

２４８、　Ｃ５５０（１９８５）（ｚ−、’）　ＩＪ　
スチン等）オヨヒジャーナル・オブ・セルラー・フィジ
オロジ−（Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、　１３２．２６３　（
１９８７）　（アールエフオブライエン等）には内皮細
胞由来の冠血管収縮因子（分子量はそれぞれ８，５００
および：ｌ、０００）が記載されているが構造は不明で
ある。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・ア
ンド・エクスペリメンタル・セラビューティクス（Ｊ、
　Ｐｈａｒｍａｃｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）、　２
３６．３３９　（１９８５）　　（Ｚムエヌ　ギレスピ
ー等）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されて
いるが、これも構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレッ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ　）やブラジキニン（Ｒ
ｒａｄｙｋｉｎｉｎ　）などのペプチドが知られていて
、それらのアミノ酸配列も明確にされているが、これら
のペプチドが哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジ
ンとして得られたという報告はない。また、血管収縮作
用を有するアンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ
　）がウシ大動脈の内皮細胞から得られるという報告（
アイ　カイフォーおよびヴイ　ジエ　ドザブ、サーキュ
レーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）、　６０．４２２　（１９８７））があ
るが。

アンジオテンシンは分子量ｔ、ｏｏｏのペプチドである
。

明が　゛しようとする１１題、々本発明者らは、ブタ大動脈の内皮細胞が産生ずる強い血
管平滑筋収縮因子を見出し、この活性因子が新規なペプ
チドであることをつきとめ、さらに検討を加えて本発明
を完成した。

、　点を解決するための手段本発明は哺乳類または鳥類の血管内皮細胞から得られる
、人間を含めた動物に対し、血管平滑筋収縮作用を有す
る分子量２，５００±３００のペプチドを提供するもの
であり１本発明者等は、これをエンドセリンと命名した
。

哺乳類としては、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ
、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムス
ターなどがあげられる。鳥類としては、ニワトリ、カモ
、ガチョウ、シチメンチョウなどがあげられる。扱いや
すい動物であることと内皮細胞を取り出しやすいことか
ら、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギが好適である。これら哺
乳類や鳥類の血管内皮細胞は、常法によって容易に得ら
れるが、例えば血管の内壁を解剖用メスなどで擦過する
か、あるいはトリプシンなどの酵素で常法通りに処理す
ることにより容易に得られる。血管は太いほうが扱いや
すいので大動脈や調帯静脈を用いるのがよい。得られた
内皮細胞は参考例に記載するアッセイ系において観測さ
れ１強い血管平滑筋収縮活性を有している。また１強心
作用（心臓に対する変時作用および変力作用）も認めら
れる。

本発明の血管収縮因子を多量得ようとする場合は、上記
のようにして得られた内皮細胞を培養するとよい。培養
は血清培養でも無血清培養でもよいが、本発明の血管平
滑筋収縮因子を嘔離する目的には無血清培養が適してい
る。培養方法は特に限定されないが、通常は、単層継代
培養する。培養に用いる培地としては高等動物細胞培養
に通常用いられる培地（たとえばハム（Ｈａｍ）　Ｆ−
１０培地など）がよく、内皮細胞１０’個に対して培地
は０．０５〜５　ｍ　Ｑ、好ましくは０．１〜０．２ｍ
　（ｌ使用する。無血清培養の培養期間は０．５ないし
８日間が適当であるが、５ないし６日間が最もよい。培
養温度は通常３７℃±１℃である。血管平滑筋収縮作用
と強心作用は培養上清中に観測される。

本発明の血管平滑筋収縮因子は単離・精製の結果、ペプ
チドであることが確認された。本発明の血管平滑筋収縮
ペプチドの単離・精製は、抽出、イオン交換またはゲル
ろ過のカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー、電気泳動、再結晶のようなペプチドの通常の
ｌｉｔ　ｆｉ−精製法が用いられる。本発明の目的には
イオン交換または逆相のカラムクロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーが特に適している。

本発明によるペプチドたるエンドセリンは２１個のアミ
ノ酸残基を有し、その中には上記アミノ酸配列のＮ末端
から数えて第１番目、第３番目、第１１番目、第１５番
目に位置する４個のシスティン基が含まれ、それらは２
組のジスルフィド結合を形成している。このジスルフィ
ド結合の組合せとしては、１−１５．３−１１の組合せ
、およびｌ　−１１゜３−１５の組合せがあるが、前者
の組合せのものの方が活性が高い。

単離・精製された本発明のエンドセリンのうちの一つは
、アミノ酸分析にンヒドリン法）２分子量間室およびそ
の他のデータから、次のアミノ酸２１個からなるペプチ
ド（以後、エンドセリンＡと表す）であることが分かっ
ている。エンドセリンＡのアミノ酸配列はＣｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｌｅｕ　　ＭｅｔＡｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＣｙｓ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｒｐで
あり、ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−８結合が２組存在する
。分子量は２，４９２である。

作」−二汰來エンドセリンＡを含む本発明の血管収縮ペプチドは低血
圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用することができ
るのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解析
や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与
えるものである。

例えば、本発明の血管収縮ペプチドは血管収縮剤として
種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような効
果を有する。またこのものは種々のショック症状を回復
させる効果をも有する。このペプチドは経ロ的１局所的
、静注もしくは非経口的に投与することができるが９局
所もしくは静注投与が好ましい。・投与量は０．００１
μｇ−１００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ−１
０μｇ／ｋｇであり、体重に応じた投与量を１〜１０ｍ
　ｍの生理的食塩水中に溶解して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳剤
、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤１粒剤。

カプセル剤、丸刑などの種々の形態に製剤化したものと
して使用できる。副成分としては、薬理的に許容され得
る賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、
充填剤、担体などが用いられる。

これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳糖、ぶ
どう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉、アルギン酸
ナトリウム、寒天末、カルボキシメチルセルローズカル
シウムなどが、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、流動パラフィンなどが、結合剤としては単
シロップ、ゼラチン溶液、エタノール、ポリビニルアル
コールなどが１分散剤としてはメチルセルロース、エチ
ルセルロース、セラックなどが、可塑剤としてはグリセ
リン、澱粉などが挙げられる。

参考例（１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を綿棒によ
る擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（２
Ｘ２０＋ｍ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５：９５、
Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲル液（３
ｍＡ）中に懸垂する。

刺激前張力（ｂａｓａｌ　ｔｅｎｓｉｏｎ）を１ｇに設
定したのち、張カドランスデューサーで等尺性張力を測
定する。

（２）強心作用のアッセイ法前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標法を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心臓
数を測定する。

（３）ＥＤ５゜平均効果投与琥のことで、５０％の被験体に有効な投与
量をいう。

実施例１（１）培養１０〜２０継代のブタ大動脈内皮細胞（３，６Ｘ　１０
’個）をのべ培養面積３６，０００ｄのプラスチックデ
イツシュ上で、１０％ウマ血清を含むダルベツコ変法イ
ーグル最小培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）　９．６ｆｌにて３７℃、５％
炭酸ガスを含む大気中で飽和（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細
胞密度に至るまで単層培養した。１０日間を要した。こ
のときの細胞密度は１０’／ｌｎで、すなわち総細胞数
は４，８Ｘ１０’個であった。次に培地を、血清を含ま
ないダルベツコ変法イーグル最小培地（９，６Ｑ　）に
交換し、３７℃、５日間培養を継続した。培養後の培地
をｔｏ、０ＯＯＧ、　２０分間遠心分離して浮遊物を除
去し、上清（９，６Ｑ　）を得た。

（２）エンドセリンＡの単離・精製（ｉ）逆相カラムによる濃縮と脱塩（１）で得た培養上清を０．１％トリフルオロ酢酸水溶
液（ｐｌ＋　２．０）にて平衡化したＣｈｅｍｃｏｓｏ
ｒｂ　５Ｐ−ｃ−ｏｏｓ逆相カラム（ケムコ社製、直径
３　ａｎ　Ｘ長さＩ８■）にかけ、吸着物を０．１％ト
リフルオロ酢酸／７０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ２
，０、：ｌＯｍ　Ｑ　）にて溶出した。溶出液をジエチ
ルエーテル（３００ｎ＋　Ｑ　）で抽出したのち有機層
を捨て、水層（２０ｍ　Ｑ　）に１Ｍトリス塩基（Ｔｒ
ｉｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅ
ｔｈａｎｅ）水溶液を加えてｐ　Ｈを７．０とした。

（ｉｔ　）陰イオン交換クロマトグラフィーによる粗分
画（ｉ）で得られた分画（２０ｍ　Ｑ　）を高速液体クロ
マトグラフィーに接続し、２０［１１Ｍトリス塩酸（ρ
１１７゜０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌｐａｋ　
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−６５０Ｍ（東洋昔達製、直径２．２
１Ｘ長さ２０口）にかけ、２０ＩＩＩＭトリス塩酸（ｐ
ｌ＋　７．０）中、０．３Ｍから０．８Ｍの食塩濃度勾
配（３０分間、カラム流速４　ｒａ　Ｑ　／ｍ１ｎ）で
溶出し、各分画の血管収縮活性を検定し１食塩濃度０．
５Ｍで溶出される分画４０ｎ＋　Ｑを活性分画として用
いた。

（ｉｉｉ）逆相高速液体クロマトグラフィーによる最終
精製　　　　　　　・（…）で得られた活性分画４’Ｏｉｎ　Ｑを、０．１％
トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したＵｎｉｃｉｌ　Ｑ
Ｃ１８カラム（ガスクロ工業、直経７．５１ｍ×長さ３
０■）にかけ、吸着物を０１１％トリフルオロ酢酸中、
１５％から５０％のアセトニトリル濃度勾配（７０分間
、カラム流速３　ｍ　Ｑ　／ｗｉｎ）で溶出し、各分画
の活性を検定し、３５％アセトニトリルで溶出される活
性分画１２１Ｑを得た。これを０．１％トリフルオロ酢
酸で３倍に希釈し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化
したＣｈｅｎ＋５ｏｒｂ　５−ＯＤＳ−）１カラム（ケ
ムコ社製、直径４．６ｍｍＸ長さ２５１）にかけ、０．
１％トリフルオロ酢酸２０％から５０％のアセトニトリ
ル濃度勾配（１２０分間、カラム流速１　ｍ　Ｑ　／ｍ
１ｎ）で溶出した。溶出液の２８０ｎｒａｌ外吸光をモ
ニターし、吸光のピークごとに分画し、活性のある分画
（ピーク）を精製エンドセリンＡとした。エンドセリン
Ａの収量は７．３μｇ（２゜！ＪｎＩ＋１ｏｌｅ）。

（３）アッセイ上記２（市）で得られたエンドセリンＡの活性が参考例
（１）および（２）の方法で測定された。

アッセイ法（１）（ブタ冠状動脈によるアッセイ）によ
るＥＤ、。は４〜５Ｘ１０−１０モル／Ｑであった・アッセイ法（２）（モルモット左心房による強心作用）
によるＥＤ、０は１×１０−９モル／Ｑであった。

（４）注射剤の製造（２）で得られたエンドセリンＡ　１２μｇを生理的食
塩水に溶解し、ミリポアフィルタ−でろ過、次いで凍結
乾燥した。使用時に静注剤を製造するに当り、上記凍結
乾燥物を生理的食塩水に溶解し。

全量を５１１Ｑとして注射剤とした。

実施例２　エンドセリンＡの合成市販の保護トリプトファン樹脂（ＢｏＣ−Ｔｒｐ（Ｃｌ
ｌ（））−ＰＡＭ樹脂、アプライド・バイオシステムズ
社製）　０．７ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペ
プチド合成機（アプライド・バイオシステムズ社製・モ
デル４３０Ａ）を使用し、通常の方法により合成した。

縮合方法は、樹脂上のＢｏＣ基を塩化メチレン中５０％
トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基を遊離させ、
この遊離のアミノ基にＢｏＣ−１１ｅ。

Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（○Ｂ　ｚ　ｌ　）　、　Ｂ　ｏ　ｃ
　−Ｌ　ｅ　ｕ　。

Ｂｏｃ−ＴＩｉｓ　　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　　
（ＡＣｍ）、Ｂｏａ−Ｔｙｒ　（Ｂｒ−ｚ）、ＢｏＣ−
Ｖａ　１．Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＢｏＣ−Ｇｌ　ｕ　　（Ｏ
Ｂｚ　１）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＱ−Ｚ）、Ｂｏｃ
−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−８ｅｒ　（Ｂｚ　ｌ）をＣ末端側よ
りエンドセリンのアミノ酸配列通りに、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下に縮合させる反応
をくり返した。

この様にして得られた保護エンドセリン樹脂１゜８ｇの
うち８００■をアニソール１　ｍ　Ｑ、１，２−エタン
ジオチール１　ｍ　ｎで膨潤させ、０℃でフッ化水素１
０ｍ　Ｑと６０分間処理した後、過剰のフッ化水素を減
圧留去した。残査を酢酸エチル５　ｍ　Ｑで洗った後、
５０％−酢酸水に抽出し、デキストランゲル（セファデ
ックスＬＨ−２０）カラム（２Ｘ９０■）に付し、同溶
媒で溶出した主分画を集め凍結乾燥し、　１２０１Ｔ１
ｇの白色粉末を得た。これの２０１１Ｉｇを８０％−酢
酸ノト２０ｍＱに溶解し、トリフルオロ酢酸第二水銀１
５■を加え、室温で６０分間撹拌したのち、同溶媒３０
ｍ１２で希釈し、硫化水素ガスを通じ、析出物をろ去し
、凍結乾燥した。これを希酢酸４００ｍＱに溶解し、重
炭酸アンモニウムでＰＨ８に調節したのち６時間空気酸
化に付し、酢酸を加えｐＨ；３としたのち、凍結乾燥し
た。これを３０％−酢酸で充填したセファデックスＬＨ
−２０のカラム（２Ｘ９０Ｃ１１）に付し、主要分画を
集め、さらにＨＰＬＣ（カラム：　ＹＭＣ，溶媒：０．
１　％−トリフルオロ酢酸水と０．１％−トリフルオロ
酢酸含有アセトニトリルの直線型濃度勾配溶出）で分取
し目的物のエンドセリンＡを２．７■得た。

以上のように合成されたエンドセリンＡは、Ｉ（ＰＬＣ
で実施例１の天然抽出物と一致する位置に溶出された。

測定条件■ カラム；ケムコ社製ヌクレオシル５０ＤＳ−Ｈ（４，６
１ｎｎφｘ２５０ｍｍ）溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（
０，１％−トリフルオロ酢酸含有−５０％含水アセトニ
トリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２０分）流　速：　１．Ｏｍ　Ｑ　／分測定条件■ カラム：東洋ソーダ製　ＤＥＡＥ−２８Ｗ（４，６１＋
ｒｔＲφｘ２５０＋ｍ＋）溶離液：Ａ液（１０ｍＭ　　
トリス・塩酸ｐ　Ｈ７，５）Ｂ液（ＩＭＮａＣＱ含有Ａ
液）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（４０分）流　速：　１．Ｏｍ　Ｑ　／分溶出位置　２１．５分（測定条件■）２１．３分（測定条件■）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）血管平滑筋収縮作用を有する分子量２，５００±
３００のペプチド。
（２）血管内皮細胞から得られる請求項１記載の血管収
縮ペプチド。
（３）２１個のアミノ酸からなり、その内の４つのシス
テインが２組のＳ−Ｓ結合を有する、請求項１または２
記載の血管収縮ペプチド。
（４）次のアミノ酸配列：【遺伝子配列があります】を有する請求項１、２または３記載の血管収縮ペプチド
。
（５）均質な請求項１、２、３または４記載の血管収縮
ペプチド。
（６）請求項１記載のペプチド産生細胞の培養を行い培
養物から該ペプチドを回収することを包含する該ペプチ
ドの製造法。
（７）請求項１記載のペプチド産生細胞が血管内皮細胞
から得られるものである請求項６記載の方法。
（８）培養が無血清培地で行われる請求項６または７記
載の方法。
（９）回収が高速液体クロマトグラフィーを含む方法に
よって行われる請求項６記載の方法。
（１０）請求項１、２、３、４または５記載の血管収縮
ペプチドの有効量および薬剤的に許容し得る添加剤を有
する薬剤組成物。
（１１）有効量が０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇで
ある請求項１０記載の薬剤組成物。
（１２）薬剤的に許容し得る添加剤が担体、崩壊剤、潤
滑剤、結合剤、分散剤、充填剤を包含する請求項１０ま
たは１１記載の薬剤組成物。