DE2804567C2

DE2804567C2 - Pentapeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2804567C2
Application number: DE2804567A
Authority: DE
Inventors: Gideon Short Hills N.J. Goldstein; David H. Lombard Ill. Schlesinger
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1977-11-15
Filing date: 1978-02-03
Publication date: 1986-01-16
Also published as: FR2408581A1; FR2408581B1; BE864122A; JPH0137400B2; SE446866B; JPS6150999A; CH640217A5; JPS6149320B2; SE7801031L; JPS5476522A; DE2804567A1; CA1105923A

Description

sowie deren pharmakologisch unbedenkliche Salze.

2. Tyrosyl-Asparaglnyl-Isoleucyl-Glutaminyl-Lysln sowie dessen Derivate und Salze gemäß Anspruch 1.

3. Verfahren zur Herstellung der Pentapeptlde nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils In an sich bekannter Weise

a) eine Pentapeptld-Sequenz aus den betreffenden, gegebenenfalls an funktioneilen Gruppen der Seitenkette geschützten Aminosäurederivaten Ober den durch kovalente Bindung des Lysylrestes an ein unlösliches Polymerharz erhaltenen Ester schrittweise aufbaut,

b) mit dem im Falle der Verknüpfung geschützter Aminosäurereste erhaltenen Zwischenprodukt, das übliche Schutzgruppen für die Jeweilige funktionell Gruppe In der Selten kette bzw. die a-Amlnogruppe der

N-termlnalen Aminosäure enthalt, entweder nach vorangehender selektiver Abspaltung der N-termlnalen

Schutzgruppe Acetylderivate herstellt und/oder die Abspaltung der sonstigen Schutzgruppen und des polymeren Tragers durchführt und

c) das so hergestellte Pentapeptld gegebenenfalls In die angegebenen Amide oder Salze Oberführt.

3> 4. Verwendung der Pentapeptlde nach Ansprüchen 1 und 2 bei der Differenzierung sowohl von

T-Lymphozyten als auch Komplement-Rezeptor-(CR*)-B-Lymphozyten.

' "

Die Erfindung betrifft die in Anspruch I und 2 genannten Pentapeptlde, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Differenzierung sowohl von T-Lymphozyten als auch Komplement-Rezeptor-(CR*)-B-Lymphozyten. Zahlreiche Polypeptide sind bekanntlich aus verschiedenen Organen von Tieren Isoliert worden. Ungefähr bis

«o zum vergangenen Jahrzehnt war jedoch sehr wenig über den Thymus, ein Organ, das beim Menschen bei der Geburt etwa 0,8% seines Körpergewichts ausmacht, bekannt, obwohl, bisher angenommen wurde, daß eine neuromuskuläre Blockierungssubstanz Im Thymus vorhanden war. Trotz sehr starkem Interesse an möglichen Funktionen des Thymus und frühzeitiger Spekulation und Versuchen war bis vor kurzem wenig Ober die Funktion des Thymus bekannt. Man weiß jedoch heute, daß der Thymus ein Verbindungsorgan sowohl mit eplthe-

« Haien (endokrinen) und lympholden (Immunologischen) Verbindungen Ist und bei den Immunltatsfunktlonen des Körpers eine Rolle spielt. Der Thymus Ist bekanntlich ein Verbundorgan, das aus einem vom dritten Branchlalbogen stammenden Eplthellalstroma und Lymphozyten besteht, die aus Stammzellen kommen, die ihren Ursprung In hamopoetlschen Geweben haben; siehe Goldstein und Mitarbeiter »The Human Thymus«, Heinemann, London 1969. Lymphozyten werden Innerhalb des Thymus differenziert und treten als reife, vom

5" Thymus abgeleitete Zellen, sog. T-Zellen aus, die zum Blut, zur Lymphdrüse, zur Milz und zu den Lymphknoten zirkulieren. Die Induktion der Differenzierung von Stammzellen Innerhalb des Thymus scheint durch Sekretionen der Epithellaizeilen des Thymus ausgelöscht zu werden, jedoch verhinderten Schwierigkelten mit biologischen Versuchen bisher die vollständige Isolierung und strukturelle Charakterisierung etwaiger Hormone, die vorhanden sein können.

" Es Ist seit einiger Zelt bekannt, daß Beziehungen zwischen dem Thymus und den Immunitätscharakteristiken des Körpers bestehen, so daß großes Interesse für Substanzen, die vom Thymus isoliert worden sind, gezeigt wurde. In dieser Hinsicht wurden In den letzten Jahren verhältnismäßig zahlreiche Artikel auf der Grundlage der wissenschaftlichen Arbelt veröffentlicht, die Stoffe, die Im Rlnderthymus vorhanden sind, betrifft. Von der Anmelderin wurde eine Anzahl von Artikeln veröffentlicht, die die Forschung auf diesem

M Gebiet betreffen. Einschlagige Veröffentlichungen erschienen beispielsweise In »The Lancet«, 20. 7. 1968, Seite 119-122; »Triangle«, Band 11, Nr. 1 (1972) 7-14; Annals of the New York Academy of Sciences 183 (1971) 230-240; Clinical and Experimental Immunology 4, Nr. 2 (1969) 181-189; »Nature« 247 (1974) 11-14; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 71 (1974) 1474-1478; »Cell« 5 (1975) 361-365 und 367-370; »Lancet« 2 (1975) 256-259; »Proceedings of the National Academy of Sciences USA« 72 (1975) 11-15; »Blo-

« chemistry« 14 (1974) 2214-2218 und »Nature« 255 (1975) 423-424.

In der Veröffentlichung von Goldstein und Manganaro In »Annals of the New York Academy of Sciences« 183 (1971) 230-240 wird über die Anwesenheit eines Thymus-Polypeptlds berichtet, das einen myasthenlschen neuromuskulären Block bei Tieren hervorruft, der der menschlichen Krankheit Myasthenla gravls analog Ist.

Ferner wird in diesem Artikel festgestellt, daß zwei unterschiedliche Effekte durch gesonderte Polypeptide im Rinderthymus hervorgebracht werden. Es wurde angenommen, daß eines dieser Polypeptide, als »Thymotoxin« bezeichnet, Myosltls verursacht, jedoch wurde ferner darauf hingewiesen, daß dieses Polypeptid nicht isoliert worden war, obwohl es sich als Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 erwies, eine starke reine positive Ladung hatte und am Ionenaustauscherharz »CM-Sephadex« bei pH 8,0 zurückgehalten wurde.

In der Veröffentlichung in »Nature« 247 (4. 1. 1975) 11 werden als Thymln I und Thymin II Identifizierte Produkte beschrieben, die sich als neue Polypeptide erwiesen, die vom Rinderthymus isoliert wurden und spezielle Anwendungen auf verschiedenen therapeutischen Gebieten haban. Auf Grund des Gebrauchs ähnlicher Namen für andere Produkte, die bereits vom Thymus isoliert worden waren, werden diese Produkte Thymii I und Thymin II nun als Thymopoletln I und Thymopoietin II bezeichnet. Diese Piodukte und Verfahren zu ihrer Herstellung werden in der US-PS 41 20 951 beschrieben.

Die US-PS 40 02 602 beschreibt langkettlge Polypeptide, die als ubiquitSres immunopetisches Polypeptid (UBIP) bezeichnet werden. Dieses Peptid wurde später in Ubiquitln umbenannt. Dieses Polypeptid ist ein 74-Amlnosäurepotypeptid, das durch seine Fähigkeit gekennzeichnet Ist, in vitro In Konzentrationen von Nanogramm die Differenzierung sowohl von T-Zellen- als auch B-Zellen-Immunocyten aus Vorstufen, die im Knochenmark oder in der MHz vorhanden sind, auszulosen. Das Polypeptid ist somit wertvoll bei der Therapie von mangelnder Funktion des Thymus oder Immunitätsmängeln.

Die US-PS 40 02 740 beschreibt synthetisierte Tridecapeptldmlschungen, die die Fähigkeit haben, die Differenzierung von T-Lymphozyten, aber nicht von Koniplementrezeptor-B-Lymphozyten auszulösen. Dieses Polypeptid zeigte sei-iit viele der Eigenschaften der langkettigen Polypeptide, die gemäß der vorstehend genannten *j US-PS 41 20955 isoliert und als Thynsopoietln bezeichnet wurden.

Gegenstand der Erfindung sind die synthetisierten Pentapeptlde gemäß Anspruch 1 und 2 mit einer ganz bestimmten Sequenz mit aktiven Stellen, die, wie gefunden wurde, viele der Eigenschaften des isolierten langkettigen Polypeptids aufweisen, das In den vorstehend genannten Veröffentlichungen und in der US-PS 40 02 602 als ublqultäres Immunopoetisches Polypeptid (UBlP) bezeichnet wird. «

Die Erfindung stellt sich demgemäß die Aufgabe, neue Pentapeptlde, die biologisch wichtig sind und die Fähigkeit haben in Konzentrationen von Nanogramm die Differenzierung sowohl von T-Vorstufenzellen als auch B-Vorstufenzellen auszulösen und hierdurch äußerst wertvoll in den Immunitätssystemen von Mensch und Tier sind, verfügbar zu machen.

Die Erfindung ist ferner auf Verfahren zur Herstellung der neuen Pentapeptlde gemäß der Erfindung sowie » auf die Verwendung in Zubereitungen mit biologischen Wirkungen gemäß Anspruch 4 gerichtet.

Die verstehend genannten Aufgaben und Vorteile werden gemäß der Erfindung durch neue Pentapeptide verwirklicht, die als aktive Stelle die Sequenz

-X-Y-Z-GLN-LYS-

aufweisen, worin X für TYR oder, in Verbindung mit Y = ASN und Z = ILE, ALA, Y für ASN oder ALA und Z für ILE oder ALA steht, sowie deren pharmakolglsch unbedenkliche Salze.

Die Erfindung Ist ferner auf ein Verfahren zur Herstellung der Pentapeptlde gemäß der Ecfisdung durch Peptldsynthese In der festen Phase sowie auf die Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 4 gerichtet, in -w Arzneimitteln, die die Pentapeptlde enthalten und Menschen und Tieren verabreicht werden, urn biologische Wirkungen darauf auszuüben.

Die erfindungsgemäßen Pentapeptide haben therapeutischen Wert auf verschiedenen Gebieten.

Als hauptsächliche Ausführungsform umfaßt die Erfindung Pentapeptlde, die die folgende Aminosäuresequenz als aktive Stelle aufweisen:

X-Y-Z-GLN-LYS I.

Hierin steht X für TYR oder, in Verbindung mit Y = ASN und Z = ILE, ALA, Y für ASN oder ALA und Z für ILE oder ALA, wobei die Aminosäuresequenz, in der X für TYR, Y für ASN und Z für ILE steht, besonders bevorzugt wird.

Als weitere Ausführungsform Ist die Erfindung auf Pentaoeptlde gerichtet, die die vorstehend genannte Sequenz als aktive Stelle aufweisen und durch die folgende allgmelne Formel beschrieben werden können:

R-X-Y-Z-GLN-LYS-R' II.

Hierin haben X, Y und Z die oben genannten Bedeutungen, während R für Wasserstoff oder einen Acetylresi und R' für eine Hydroxy- oder eine Aminogruppe stehen. Beide Reste R und R' sind die biologische Aktivität der grundlegenden aktiven Sequenz nicht wesentlich beeinflussende Substituenten an der Pentapeptldsequenz. Unter dieser Angabe Ist zu verstehen, daß ilie endständigen Aminosäuren an dieser Pentapeptidkette modifiziert tn werden können, wenn funktionell Gruppen oder Derivate (R und R') an diese endständigen Aminosäuren gebunden werden, ohne die biologische Aktivität des Moleküls wesentlich zu beeinflussen. Es ist somit festzustellen, daß die endständigen Amino- und Carbonsäuregruppen nicht wie bei einigen Polypeptiden für die biologische Aktivität des Pentapeptlds wesentlich sind. In den Rahmen der Erfindung fallen daher Pentapeptlde, die endständig unsubstitulert sind (R = H; R' = OH) und die endständig durch eine oder mehrere funktioiielle ft? Gruppen R und/oder R', die die hier offenbarte biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen, substituiert sind.

Diese Feststellung ist so zu verstehen, daß diese funktlonellen Gruppen eine normale Substitution, wie Acylierung an der freien Amlnogruppe und Amidierung an der freien Carbonsäuregruppe, einschließen.

Von diesen Aspekten aus erweisen sich die Pentapeptide gemäß der Erfindung als außergewöhnlich, da die Pentapeptide die gleiche biologische Aktivität wie langkettige natürliche Peptide aufweisen, in denen diese Pentapeptldsequenz einen Teil bildet oder darin vorhanden ist. Es wird daher angenommen, daß die Aktivitäts- Voraussetzungen des Molekflis durch Stereochemie des Moleküls, d. h. die besondere »Faltung« des Moleküls erzeugt werden. In diesem Zusammenhang Ist zu bemerken, daß Polypeptidblndungen nicht starr, sondern flexibel sind und in flächiger Form, als Schraube oder Helix u. dgl. vorliegen können. Als Ergebnis 1st das gesamte Molekül flexibel und »faltet sich« in ganz bestimmter Weise. Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß das Pentapeptld sich In der gleichen Weise wie das langkettige natürliche Polypeptld »faltet« und daher die gleichen

ίο biologischen Eigenschaften aufweist. Aus diesem Grunde kann das Pentapeptid mit verschiedenen funktioneilen Gruppen R und/oder R' substituiert werden, solange die Substltuenten die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinträchtigen oder die natürlichen »Falten« des Moleküls nicht stören.

Gemäß einer spezielleren Ausführungsform umfaßt die Erfindung neue Pentapeptide mit der folgenden Sequenz:

R-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-R' III.

Hierin steht R für Wasserstoff oder Acetyl und R' steht für OH oder NH₂. Besonders bevorzugt werden Pentapeptide, in denen R Wasserstoff und R' OH ist.

In den Rahmen der Erfindung fallen ferner die pharmakologlsch unbedenklichen Salze der Pentapeptide. Als Beispiele von Säuren, die Salze mit den Pentapeptlden bilden können, selen genannt: anorganische Säuren, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perch'orsäurs, Salpetersäure, Thlocyansäure, Schwefelsäure ur_d Phosphorsäure, und organische Säuren, z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure, Zimtsäure, Naphtha- llnsulfonsäure und Sulfanllsäure.

In der vorstehenden Struktur werden die Amlnosäurekomi.onenten des Peptids der Einfachheit halber durch Abkürzungen gekennzeichnet. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

Aminosäure Abgekürzte Bezeichnung L-Tyrosin TYR L-Asparagin ASN L-Isoleucin ILE L-Glutamin GLN

L-Lysin LYS

L-Alanin ALA

·

Die Pentapeptide gemäß der Erfindung sind durch fünf Aminosäuren gebildete Peptide, die, wie festgestellt wurde, ähnliche Eigenschaften wie das aus 74 Aminosäuren gebildete, vom Rlnderthymus isolierte und In der US-PS 40 02 602 beschriebene Polypeptid Ubiqultln (oder UBIP) aufweisen. Die Peptide gemäß der Erfindung zeichnen sich Insbesondere durch Ihre Fähigkeit aus, die selektive Differenzierung von T-Vorstufeüzellen sowie

B-Vorstufenzellen in Nanogramm-Konzentratlonen auszulösen.

Es wurde gefunden, daß die Pentapeptide gemäß der Erfindung die Differenzierung von Immunocyten-Vorstufenzellen In vitro In der gleichen Weise wie die langkettlgen Polypeptide auslösen, die in der US-PS 4002 602 beschrieben werden. So hat sich gezeigt, daß die Pentapeptide gemäß der Erfindung selbst In Nanogrammkonzentrationen die Differenzierung sowohl der T-Vorstufenzellen, gemessen durch die Vermehrung der Thymus-Dlfferenztorungsantigene TL und THY-I (Θ), als auch der B-Vorstufenzellen auslösen, gemessen durch d'e Vermehrung von Rezeptoren für das Komplement, ein charakteristisches Merkmal der B-Zellen.

Um die Bedeutung der differenzierenden biologischen Eigenschaften der Pentapeptide gemäß der Erfindung verständlich zu machen, ist zu bemerken, daß die Funktion des Thymus In Relation zur Immunität grob als Bildung von aus dem Thymus stammenden Zellen oder L/mphozyten, sog. T-Zellen, angegeben werden kann.

5' Die T-Zellevi bilden einen großen Anteil der Gesamtmenge der zirkulierenden kleinen Lymphozyten. Die T-Zellen weisen immunologische Spezlfltät auf und sind direkt an durch Zellen vermittelten Immunreaktionen (z. B. Homograft-Reaktlonen) als Nervenendorganzellen beteilig.. Die T-Zellen sondern jedoch keine humoralen Antikörper ab, da diese Antikörper durch Zellen abgesondert werden, die direkt vom Knochenmark unabhängig vom Einfluß des Thymus stammen. Diese letzteren Zellen werden als ."-Zellen bezeichnet. Für viele Antigene

W) erfordern jedoch die B-Zellen die Anwesenheit von entsprechend reaktiven T-Zellen, bevor sie Antikörper

bilden können. Der Mechanismus dieses Prozesses der Zusammenarbeit der Zellen 1st nocht nicht völlig geklärt.

Auf der Grundlage dieser Erklärung kann festgestellt werden, daß, in funktlonelien Ausdrücken, der Thymus

für die Entwicklung der zellulären Immunität und zahlreiche Reaktionen der humoralen Antikörper notwendig

Ist und diese Systeme beeinflußt, indem er im Thymus die Differenzierung von hämopoetlschen Stammzellen

zu T-Zellen auslöst. Dieser Induktive Einfluß wird durch Vermittlung νο,ι Sekretionen der Eplthellalzellen des Thymus, d. h. der Thymus-Hormone ausgeübt.

Um die Funktirr». des Thymus und des Zellsystems der Lymphozyten sowie die Zirkulation von Lymphozyten Im Körper zu verstehen, ist ferner darauf hinzuweisen, daß die Stammzellen Im Knochenmark entstehen und

den Thymus durch den Blutstrom erreichen. Innerhalb des Thymus werden die Stammzellen zu Immunologisch kompetenten T-Zellen differenziert, die zum Blutstrom wandern und zusammen mit den B-Zellen zwischen den Geweben, Lymphgefäßen und dem Blutstrom zirkulieren.

Die Zellen des Körpers, die Antikörper abscheiden, entwickeln sich auch aus hämopoeilschen Stammzellen, jedoch wird Ihre Differenzierung nicht durch den Thymus bestimmt. Sie werden daher als vom Knochenmark stammende Zellen oder B-Zellen bezeichnet. Bei Vögeln werden sie In einem dem Thymus analogen Organ differenziert, das als Bursa von Fabrlclus bezeichnet wird. Bei Saugetieren wurde kein gleichwertiges Organ entdeckt, und es wird angenommen, daß die B-Zellen Innerhalb des Knochenmarks differenzieren. Die physiologischen Substanzen, die diese Differenzierung diktieren, bleiben vollständig unbekannt.

Wie bereits erwähnt, sind die Pentapeptlde gemäß der Erfindung für die Behandlung von Mensch und Tier therapeutisch wertvoll. Da die neuen Pentapeptlde die Fähigkeit haben, die Differenzierung der In den hämopoetlschcn Geweben gebildeten lymphopoetlschen Stammzellen zu vom Thymus stammenden Zellen oder T-Zellen auszulösen, die In die Immunreaktion des Körpers einzugreifen vermögen, haben die Produkte gemäß der Erfindung vielfache therapeutische Anwendungen. Da die Verbindungen die Fähigkeit haben, einigt. -.. genannten Funktionen des Thymus auszuüben, finden sie In verschiedenen Thymusfunktlons- und Immunltätsberelchen Anwendung. Ein primäres Anwendungsgebiet Ist die Behandlung des DlGeorge-Syndroms, eines Zustandes, bei dem das Fehlen des Thymus angeboren Ist. Durch Injektion der Pentapeptlde wird dieser Mangel überwunden. Eine weitere Anwendung finden die Pentapeptlde bei Agammaglobulinämle, die auf einen Defekt des mutmaßlichen, die B-Zellen differenzierenden Hormons des Körpers beruht. Durch injektion der Peu'iapeptlde wird dieser Defekt ausgeschaltet. Auf Grund Ihrer biologischen Eigenschaften sind die Pentapeptlde, die bei niedrigen Konzentrationen äußerst aktiv sind, dadurch wertvoll, daß sie die kollektive Immunität des Körpers dadurch unterstützen, daß sie die therapeutische Stimulation der zellulären Immunität und humoralen Immunität steigern oder unterstützen und hierdurch wertvoll für die Behandlung von Krankheiten werden, bei denen chronische Infektionen In vivo, z. B. fungöse Infektionen oder Mycoplasmalnfektlonen, Tuberkulose, Lepra, akute und chronische Virusinfektionen u. dgl. auftreten. Ferner werden die Peptide für wertvoll auf -s jedem Gebiet gehalten, auf dem zelluläre oder humorale Immunität umstritten Ist, insbesondere dann, wenn Immunitätsmängel wie beispielsweise bei dem oben genannten DlGeorge-Syndrom vorliegen. Auf Grund der Eigenschaften der Pentapeptlde sind ferner wertvoll In vitro durch Auslösen der Entwicklung von Oberflächenantlgenen der T-Zellen, durch Auslösung der Entwicklung der funktioneilen Fähigkeit, Empfindlichkeit für Mltogene und Antigene und Mitwirkung der Zellen In der Steigerung der Fähigkeit der B-Zellen, Antikörper zu M bilden, zu erreichen. Sie sind In vitro wertvoll durch Auslösung der Entwicklung der B-Zellen, gemessen an der Entwicklung der Oberflächenrezeptoren für das Komplement. Die Peptide sind ferner dadurch wertvoll, daß sie die unkontrollierte Proliferation von Lymphozyten, die auf Ublqultin ansprechen, hemmen. Eine wichtige Eigenschaft des Pentapeptids Ist seine Fähigkeit In vivo, Zellen mit den Eigenschaften von T-Zellen wiederherzustellen, sowie seine Fähigkeit in vivo. Zellen mit den Eigenschaften von B-Zellen wiederherzustellen.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Peptide gemäß der Erfindung besteht darin, daß sie bei sehr niedrigen Konzentrationen äußerst wirksam sind. So wurde festgestellt, daß die Peptide bereits be! Konzentrationen v_On 10 Nanogramm/ml wirksam und bei Konzentrationen von etwa 0,05 bis 1 pg/ml maximal wirksam sind. Als Träger eignen sich alle für diesen Zweck bekannten Träger einschließlich normaler Kochsalzlösungen vorzugsweise mit einem Protein als Verdünnungsmittel, z. B. Rinderserumalbumin, um Verluste durch Adsorption an Glasgeräte bei diesen niedrigen Konzentrationen zu verhindern. Die Peptide gemäß der Erfindung sind In einer Dosierung oberhalb von etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht wirksam. Für die Behandlung des DlGeorge-Syndroms können die Pentapeptlde in einer Dosis von etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Im allgemeinen kann eine Dosis im gleichen Bereich für die Behandlung der anderen genannten Zustände oder Krankheiten angewendet werden.

Die Pentapeptide gemäß der Erfindung wurden nach ähnlichen Verfahren hergestellt, wie sie von Merrifield In Journal of American Chemical Society 85 (1963) 2149 bis 2154 beschrieben werden. Die Synthese bestand aus der stufenweisen Anlagerung von geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptldkette, die durch kovalente Bindungen an ein festes Harzteilchen gebunden war. Durch diese Arbeltswelse wurden Reagentlen und Nebenprodukte durch Filtration entfernt, und die Umkristalllsatlon von Zwischenprodukten war überflüssig. Das allgs- so meine Konzept dieses Verfahrens beruht auf der Bindung der ersten Aminosäure der Kette an ein festes Polymerisat durch eine kovalente Bindung und die einzelne, stufenweise Anlagerung der nachfolgenden Aminosäuren, bis die gewünschte Sequenz zusammengesetzt 1st. Abschließend erfolgt die Entfernung des Peptlds vom festen Träger und die Entfernung der Schutzgruppen. Bei diesem Verfahren wird eine wachsende Peptldkette erhalten, die an ein vollständiges unlösliches festes Teilchen gebunden Ist, so daß sie in einer zweckmäßigen 5S Form für die FÜlratlon und die Entfernung von Reagentlen und Nebenprodukten durch Waschen vorliegt.

Die Aminosäuren können an beliebige geeignete Polymerisate gebunden werden, die lediglich In den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form, die leichte Filtration ermöglicht, aufweisen müssen. Das Polymerisat mu3 eine funktionell Gruppe enthalten, an die die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung fest gebunden wenden kann. Für diesen Zweck eignen sich die ω verschiedensten Polymerisate, z. B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat und sulfoniertes Polystyrol, jedoch wurde für die Synthese gemäß der Erfindung ein chlormethyllertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol verwendet.

Die verschiedenen funktioneilen Gruppen an der Aminosäure, die aktiv waren, aber nicht an den Reaktionen teilnehmen soiiten, waren durch übiiche Schutzgruppen, wie sie auf dem Gebiet der Polypeptide verwendet werden, während der gesamten Reaktion geschützt. Beispielsweise waren die funktionellen Gruppen an Tyrosin und Lysin durch Schutzgruppen geschützt, die bei Vollendung der Sequenz entfernt werden konnten, ohne das als Endprodukt gebildete Pentapeptid nachteilig zu beeinflussen. Die Synthese wurde insofern nach einer Modi-

flkatlon der Feststoffsynthese durchgeführt, als Fluorescamln verwendet wurde, um durch ein Anzeichen von i!f. positiver Fluoreszenz zu bestimmen, ob die Kupplung vollständig war [siehe Feilx und Mitarbeiter In Analyt. ϊ| Blöchern. 52 (1973) 377]. Wenn die vollständige Kupplung nicht angezeigt wurde, wurde die Kupplung mit der || gleichen geschützten Aminosäure wiederholt, bevor die Schutzgruppen entfernt wurden.

' Bei dem allgemeinen Verfahren wurde zunächst das an seinen Aminogruppen geschützte L-Lysln In absolutem Alkohol, der ein AmIn enthielt, zum Harz verestert. Das gekuppelte Aminosäureharz wurde dann filtriert, mit Alkohol und Wasser gewaschen und getrocknet. Die Schutzgruppe an der ar-Amlnogruppe der Aminosäure Lysin (ζ. B. t-BOC, d. h. t-Butyloxycarbonyl) wurde dann entfernt, ohne andere Schutzgruppen zu beeinflussen. Das hierbei erhaltene gekuppelte AmlnosSureharz, das die freie Aminosäure enthielt, wurde dann mit einem

"ι geschützten L-Glutamln, vorzugsweise r-t-ßOC-L-Glutamln umgesetzt, um das L-Glutamln zu kuppeln. Die Reaktionen wurden dann mit geschütztem L-Isoleucln, L-Asparagln und L-Tyrosln wiederholt, bis das vollständige Molekül gebildet war. Die Aufeinanderfolge von Reaktionen wurde wie folgt durchgeführt: *i

15 fi

55 %

Harz

. α-BOC-Lys-OH α-BOC-Lys-Harz

Entfernung der Schutzgrupppe
an der a-Aminogruppe

R₂

H-Lys-Harz

a-BOC-L-Gln

o-BOC-Gln-Lys-Harz

Entfernung der Schutzgruppe
der a-Aminogruppe

R₂

H-Gln-Lys-Harz

a-BOC-Ile-OH R₂

a-BOC-Ile-Gln-Lys-Harz

JIl

Entfernung der Schutzgruppe
der a-Aminogruppe

R₂

H-Ile-Gln-Lys-Harz

a-BOC-Asn-OH R₂

a-BOC-Asn-r.f-Gln-Lys-Harz

Entfernung der Schutzgruppe
der a-Aminogruppe

R₂

H-Asn-Ile-Gln-Lys-Harz R₁

R₁

a-Ra-Tyr-ÜH R₂

55

a-R₃-Tyr-Asn-Iie-Gln-Lys-Harz

Entfernung aller Schutzgruppen

H-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-OH

In der vorstehenden Reaktionsfolge sind Ri und R₂ Schutzgruppen an den verschiedenen reaktionsfähigen Seltenketten an den Aminosäuren, die nicht beeinflußt oder entfernt werden, wenn die Schutzgruppe an der st-Aminogruppe entfernt wird, um die weitere Reaktion zu gestatten. cr-Rs ist eine Schutzgruppe der cr-Aminogruppe. Vorzugsweise steht in dem vorstehenden, als Zw'schenprodukt gebildeten Pentapeptidharz R_t für eine Schutzgruppe wie O₂ oder 6-Dichlorbenzyl. R: für fi-2-Chiorbenzyioxycarbonyi und R₃ für t-Butyloxycarbonyl. Als Harze eignen sich alle Harze, die vorstehend als für das Verfahren geeignet genannt wurden. In der vorstehenden Reihe von Reaktionen werden die Peptide, bei denen ALA an die Stelle von TYR, ASN oder Il E tritt.

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in der gleichen Weise heigestellt.

Nachdem das letzte Zwischenprodukt gebildet worden Ist, wird das Peptld-Harz gespalten, um die Schutzgruf/pen R,, R₁ und R] und das Harz zu entfernen. Die Schutzgruppen wurden nach üblichen Methoden, z. B. durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, entfernt, worauf das erhaltene freie Peptid Isoliert wurde.

Während die bevorzugte Methode zui Hersteilung der Pentapeptlde gemäß der Erfindung untf.r Verwendung eines unlöslichen, festen Polymeren erfolgt, wie es be! der Methode von Merrlfield beschrieben Ist, kann man natürlich auch andere Herstellungsmethoden verwenden. Zum Beispiel kann ein verschieden fester Träger verwendet werden, wie z. B. ein N-Methyl-benzhydrylamlnharz, das unter gewissen Bedingungen von Vorteil Ist. Bei diesem Verfahren wird die am endständigen C-Atom hängende Aminosäure direkt an das Harz gebur·-

>ⁿ den und das fertige Peptid kann vom Substrat In HF abgespalten werden, um endständige C-Amlne zu bilden. Verfahren zur Verwendung eines n-Methylbenzhydrylamlnharzes sind von Monahan et al in Biochemical and Biophysical Research Communications, 48, 1100-1105 (1972) beschrieben. Verfahren zur Verwendung eines Benzhydrylamlnharzes sind von J. Rlvler et al In Journal of Medicinal Chemistry 1973, Bd. 16, S. 545-549 beschrieben.

ι* Verschiedene Derivate des Grundpentapeptlds können auch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden. Es Ist offensichtlich, daß bei der Herstellung solcher Derivate es nöt.g Ist, funktionell Gruppen zu blockleren, die mit der Reaktlonsfolge In Wettstrelt treten können, um das gewünschte Produkt herzustellen. Beispielswelse sollte die or-Carboxylsäuregruppe der Asparaginsäure oder die ar-Amlnogruppc von Lysin während ucr Herstellung uicsci Dciivaic biuckieri werden.

W Wie bereits erwähnt. Ist es bei der Durchführung des Verfahrens notwendig, die Aminogruppen zu schützen oder blockieren, um die Reaktion zu steuern und die gewünschten Produkte zu erhalten. Zu den geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppen, die erfolgreich verwendet werden können, gehören die Salzbildung zum Schutz von stark basischen Aminogruppen oder Urethan-Ersatzschutzgruppen (urethane protecting substitutes), ζ. B. Benzyloxycarbonyl und t-Butyloxycarbonyl. Vorzugswelse werden t-Butyloxycarbonyl (tBOC) oder t-Amyloxycarbonyl (AOC) zum Schutz der sr-Amlnogruppe In den reagierenden Aminosäuren am Carboxylende des Moleküls verwendet, da die Schutzgruppen BOC und AOC (t-Amyloxycarbonyl) sich nach dieser Reaktion und vor der anschließenden Stufe (In der die ar-Amlnogruppe selbst umgesetzt wird) durch verhältnismäßig milde Einwirkung von Säuren (z. B. Trlfluoresslgsäure) leicht entfernen lassen. Diese Behandlung beeinflußt Im übrigen keine Gruppen, die zum Schutz anderer reaktionsfähiger Seltenketten verwendet werden. Die a-

"> Aminogruppen können somit durch Umsetzung mit einem beliebigen Material geschützt werden, das die Aminogruppen für die anschließende Reaktion bzw. die anschließenden Reaktionen schützt, aber später unter Bedingungen, die das Molekül nicht anderweitig beeinträchtigen, entfernt werden könnein. Als Beispiele solcher Materialien sind organische Carbonsäurederivate zu nennen, die die Amlnogruppe acylieren.

Im allgemeinen kann jede der Aminogruppen durch Umsetzung mit einer Verbindung, die eine Gruppe der Formel

Il

R—O—C —

enthält, worin R eine Gruppe ist, , jrhlndert, daß die Amlnogruppe anschließende Kupplungsreaktionen eingeht und ohne Zerstörung des Moleküls entfernt werden kann, geschützt werden. Beispielsweise Ist R ein geradketttger oder verzweigter Alkylrest, der ungesättigt sein kann und vorzugsweise 1 bis 10 C-Ato«ne enthält, ein Arylrest vorzugsweise mit 6 bis 15 C-Atomen, ein Cycloalkylrest vorzugsweise mit 5 bis 8 C-Atomen, ein

•«5 Aralkylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen, ein Alkarylrest vorzugsweise mit 7 bis 18 C-Atomen oder ein Heterocyclus, z. B. Isonicotlnyl. Die Aryl-, Aralkyl- und Alkarylkomponenten können außerdem beispielsweise durch einen oder mehrere Alkylreste mit 1 bis etwa 4 C-Atomen welter substituiert werden. Bevorzugt als Gruppen für R werden beispielsweise t-Butyl, t-Amyl, Phenyl, Tolyl, XyIyI und Benzyl. Besonders bevorzugte spezielle Schutzgruppen für die Amlnogruppe sind beispielsweise Benzyloxycarbonyl, substituiertes Benzyloxycarbonyl, worin der Phenylring durch ein oder mehrere Halogenatome, z. B. Cl oder Br, substituiert Ist, Nitro, niedere Alkoxyreste, z. B. Methoxy, niedere Alkylreste, tertiäres Butyloxycarbonyl, tertiäres Amyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Vlnyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyi und Blphenyllsopropoxycarbonyl. Ferner können als Schutzgruppen beispielsweise Isonicotlnyloxycarbonyl, Phthaloyl, p-Tolysulfonyl und Formyl verwendet werden.

Bei der Durchführung des allgemeinen Verfahrens gemäß der Erfindung wird das Peptid durch Umsetzung der freien cr-Aminogruppe mit einer Verbindung, die geschützte Aminogruppen enthält, aufgebaut. Für die Reaktion oder Kupplung wird die Verbindung, die angegriffen wird, an ihrer Carboxylgruppe aktiviert, so daß die Carboxylgruppe dann mit der freien ar-Aminogruppe an der angefügten Peptidkette reagieren kann. Um die Aktivierung zu erreichen, kann die Carboxylgruppe In eine beliebige reaktionsfähige Gruppe, z. B. einen Ester,

ό ein Anhydrid, ein Azid oder Säurechlorid, umgewandelt werden.

Es ist ferner zu bemerken, daß wahrend dieser Reaktionen die Aminosäurekomponenten sowohl Aminogruppen als auch Carboxylgruppen enthalten, und daß gewöhnlich eine Gruppe in die Reaktion eingeht, während die andere geschützt ist. Vor der Kupplungsstufe wird die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe oder endständigen Aminogruppe des angegriffenen Peptids unter Bedingungen entfernt, die andere Schutzgruppen, z. B. die Gnjppe an der s-Aminogruppe des LysinrnciekSis, nacht wesentlich beeinträchtigen. Bevorzugt als Verfahren für die Durchführung dieser Stufe 1st eine milde Acidolyse beispielsweise durch Umsetzung mit Trlfluoressigsäure bei Raumtemperatur.
Es ist einleuchtend, daß die vorstehend beschriebene Reihe von Verfahrensstufen zur Bildung des speziellen

Pentapeptids der folgenden Formel führt: H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH

Dieses Pentapeptid umfaßt femer die Sequenz des Pentapeptids gemäß der Erfindung mit basischen aktiven Stellen. Das substituierte Pentapeptid der Formel II, worin die endständigen TYR- und LYS-Aminosäuregruppen in der oben beschriebenen Weise weiter substituiert werden können, wird dann durch Umsetzung mit diesem basischen Pentapeptid mit für die Herstellung der gewünschten Derivate geeigneten Reagenüen hergestellt. Die Reaktionen dieser Art, z. B. Acylierung, Veresterung und Amidlerung, sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung wirf durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die π Teile als Gewichtstelle, falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Für die Herstellung des Pentapeptids gemäß der Erfindung würfen die folgenden Materialien im Handel i: bezogen:

ct-BOC-L-GIutamin-O-nitrophenylester

cr-BOC-e^-Chlor-benzyloxycarbonyl-L-lysin

ct-BOC-asparagln

Ä-BOC-L-Isoieucin

ar-BOC-O^o-Dlchlorbenzyl-L-tyrosin

In diesen Reagentlen bedeutet BOC t-Butyloxycarbonyl.

Reagentien von »Sequenalw-Qualltät für Bestimmungen der Aminosäuresequenz, Dicyclohexylcarbodfimid, Fluorescamln und das Harz wurden ebenfalls Im Handel bezogen. Als Harz wurde ein Polystyroldlvlnylbenzolharz verwendet, das eine Teilchengröße von 37-74 μπι hatte und 1% Divlnylbenzol und 0,75 mMol Chlorid pro g Harz enthielt.

Zur Herstellung des Pentapeptids würfen 2 mMol cr-BOC-e-chlorbenzyloxycarbonyl-L-Lysin 24 Stunden bei 80° C zu 2 mMol chlormethyliertem Harz In absolutem Alkohol, der 1 mMol Triäthylamin enthielt, verestert. Das erhaltene gekuppelte Aminosäureharz würfe filtriert, mit absolutem Alkohol gewaschen und getrocknet. Anschließend wurden andere cr-BOC-Amlnosäuren In der gleichen Welse an die von der Schutzgruppe befreite ct-Aminogruppe des Peptid-Harzes In der richtigen Reihenfolge gekuppelt, wobei das Pentapeptid gemäß der Erfindung unter Verwendung äquivalenter Mengen Dlcyclohexylcarbodllmit mit Ausnahme von a-BOC-L-Glutamin-O-nitrophenylester, der direkt gekuppelt wurde, erhalten würfe. Nach jeder Kupplungsreaktion wurde ein aüquoter Teil des Harzes mit Fiuorcscamin getestet. Wenn positive Fluoreszenz festgestellt wurde, wurde die Kupplung als unvollständig angesehen und mit der gleichen schützenden Aminosäure wiederholt. Als Ergebnis der verschiedenen Kupplungsreaktionen wurde als Zwischenprodukt das Pentapeptid-Harz hergestellt.

In einer Kelf-Spaltapparatur (Peninsula Laboratories, Inc.) wurden dieses Peptld-Harz gespalten und die Schutzgruppen unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C für 60 Minuten mit 1,2 ml Anisol -»ο pro g Peptld-Harz als Radikalfänger entfernt. Das Peptldgemlsch wurde gefriergetrocknet und mit wasserfreiem Äther gewaschen. Das Peptid wurde an P-6-Blo-Gel In 1 n-Esslgsäure Chromatographien. Für das erhaltene Pentapeptid wurde festgestellt, daß es eine Reinheit von 94% und die folgende Sequenz hatte:

H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH Beispiel 2

Zur Ermittlung der Aktivität und der Eigenschaften des Pentapeptids wurden Bestimmungen an gesunden, 5 bis 6 Wochen aiien nu/nu-Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt, die auf einer BALB/c-Grundlage gezüchtet (wobei Thymocyten das Thy-1,2-Oberflächenantlgen ausdrücken) und unter üblichen Bedingungen gehalten wurden. Für die Antiseren wurden Antl-Thy-1,2-Seren In Thy-1-Mäusen beiderlei Geschlechts (Thy-1 congenlc mice) hergestellt.

Für die Auslösung der Differenzierung von Thy-1*-T-Zellen oder CR*-B-Zellen In vitro wurde die Induktion der Thymocytendifferenzlerung von Prothymocyten In vitro durchgeführt, wie von Komuro und Boyse beschrieben [Lancet 1 (1973) 7401, wobei das Auftreten von Thy-1,2 als Anzeichen der Differenzierung der T-Zellen diente. Die Induktion der Differenzierung der CR*-B-Zellen von CR-B-Zellenvorstufen In vitro erfolgte unter ähnlichen Bedingungen, wobei als Kriterium des Tests die Fähigkeit der CR*-B-Zellen diente, Schafserythrocyten, die mit subagglutinierenden Mengen von Kaninchen-Antikörpern und nlcht-lytlschem Komplement bedeckt (coated) waren, zu binden. Mllzzellenpopulatlonen von gesunden nu/nu-Mäusen, an die kontlnuler- «> liehen Rlnderserumalbumln-Gradlenten fraktioniert, wurden als Quelle beider Vorstufentypen (Thy-1" und CR" verwendet, weil sie sehr wenig oder keine Thy-1*-Zellen und geringe Anzahlen von CR'-Zellen aufweisen.

Als Ergebnis dieser Bestimmung wurde gefunden, daß das Pentapeptid eine Selektivität von Wirkungen ähnlich derjenigen von Ublquitln in der Induktion der Differenzierung von T-Lymphozyten und von Komplernentrezeptoren -(CR*)-B-Lymphozyten zeigten. Das Pentapeptid führte die Differenzierung von Thy-1*-T-Zellen <■■< in Konzentrationen von IO ng bis 1 Mg/ml sowie die Differenzierung von CR'-B-Zellen In Konzentrationen von IO ng bis 1 Mg/ml herbei.

20

25

30

40

45

50

55

60

65

Beispiel 3

Das auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellte Pentapeptld wurde, während es noch an das Harz gekuppelt 1st, mit Trifluoressigsäure in Dlchlormethan behandelt, um die t-BOC-Schutzgruppe von dem Tyrosiniest zu entfernen. Das erhaltene Peptid wird dann mit Essigsäureanhydrid acyllert, worauf es vom Harzsubstrat abgespalten und alle Schutzgmppen mit HF entfernt werden. Dabei wird das folgende acyllerte Derivat erhalten:

A CHjCO-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH Beispiel 4

Um das amldierte Derivat des Pentapeptlds von Beispiel 1 herzustellen, wird das geschätzte Pentapeptld hergestellt, indem ein Benzhydrylaminharz als Substrat verwendet wird, indem man der Methode von J. Rlvler et al In Joum. of Medicinal Chemistry, 1973, Bd. 16, 545-549 folgt. Das amldierte Derivat wird hergestellt. Indem das an das basische Harz gebundene Pentapeptld durch Umsetzung mit Fluorwasserstoff abgespalten wird. Das amldierte Pentapeptid hat folgende Formel

B. H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-Nh₂

Die Identifizierung erfolgte durch Dunnschichtchrornaiographie und Elektrophorese, wobei die folgenden Werte erhalten wurden:

Dünnschichtchromatographie:

Probe: 30 μg . .

Kieselgel (Brinkman-Glasplatte, 5 x 20 cm, 0,25 mm dick)

r/ : n-BuOH : Pyridin : HOAc : H₂O r/ : EtOAc : Pyridin : HOAc : H₂O r/ : EtOAc : n-BuOH : HOAc : H₂O Spray-Reagenz: Pauly, Ninhydrin & I₂

30 :	15	: 3	: 12
5 :	5	: 1	: 3
1 :	1	: 1	: 1

Verbindungen:

Elektrophorese Peptid wanderte zur Kathode

Ac-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys (Beispiel 3)

Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-N^ (Beispiel 4)

0,47 0,87 0,54 -1,35 cm 0,48 0,87 0,37 -6,60 cm

Elektrophorese: Whatman-Papler 3 mm (11,5 cm χ 56,5 cm)

Probe: 100 μ&

pH 5,6, Pyrldin-Acetat-Pufferlösung

1000 V, 1 Stunde

Spray-Reagens: Pauly und Ninhydrin

Das acetyllerte Pentapeptld von Beispiel 3 zeigte, wenn es In einer Konzentration von 1 Mg/ml In 14%lger Twomey-Lösung verwendet wurde, maximale und minimale Aktivitäten, die mit dem basischen Pentapeptld von Beispiel 1 vergleichbar waren.

Das amldierte Pentapeptld von Beispiel 4 zeigte bei Verwendung In einer Konzentration von 1 μg/ml In 6%lger Twomey-Lösung eine Aktivität, die mit derjenigen des basischen Pentapeptids von Beispiel 1 vergleichbar war.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird das gemäß Beispiel 3 hergestellte acyllerte Pentapeptld, während es noch an das Harzsubstrat gebunden ist, durch Umsetzung mit wasserfreiem Ammoniak unter Amldlerungsbedlngungen abgespalten, um die Verbindung freizusetzen, worauf die Schutzgmppen entfernt werden und das folgende Polypeptld erhalten wird:

C H ,CO-T Y R-ASN-ILE-GLN-LYS-NH,

Die gemäß Beispiel 5 hergestellten Pentapeptiderivate bewahren die für die basische Aminosäuresequenz beschriebene biologische Aktivität.

Beispiele 6 bis 8 Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen stufenweisen Verfahren werden die folgenden Pentapeptide hergestellt:

Beispiel 6 H-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-OH Beispiel 7 H-TY R-ALA-ILE-GLN-LYS-OH Beispiel 8 H-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-OH

Zur Bestimmung der pharmakoiogischen Aktivität und der pharmakologischen Eigenschaften dieser Pentapeptide wurde die Induktion von Th-1-(T-Zellen)-Antigen am Knockenmark von Küken zur Testung der Peptide bei einer Konzentration von 1 ug/ml angewendet. Diese Methode wird von Brand und Mitarbeitern in »Science« 193 (Juli 1976) 319-321 beschrieben. Bei dieser Methode werden die zusammengegebenen Zellen von Femur und Tibiotarsus von gerade ausgeschlüpften Küken des Stammes SC (Hy-Linie) durch Ultrazentrifugierung an einem fünfschichtigen diskontinuierlichen Rinderserumalbumin-(BSA)-Gradienten (11) fraktioniert. Zellen aus jeder Grenzfläche werden gewaschen und für die Inkubation in einer Konzentration von 5 χ 10' Zellen pro ml mit dem Peptid (0,1 μg/ml im Medium RPMI 1630 suspendiert, das mit 15 mMol Hepes, 5% yglobulinfreiem fetalem Kalbsserum, Desoxyrlbonuclease, (14-18 Einheiten/ml), Heparin (5 Einheiten/ml), Peni- clllin (100 Eißh-üiten/ml) und Streptomycin (100 μg/mI) ergänzt ist. Kontrollproben werden mit BSA (1 ug/ml) oder Medium allein Inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen im Zytotoxizitätstest unter Verwendung von Küken- und Meerschweinchenkomplementfraktionen geprüft. Der Anteil von Bu-I*- bzw. Th-1⁺-Zellen in jeder Schicht wird als Zytotoxizitätslndex 100 (a-b)la berechnet, wobei α und b die Prozentsätze lebensfähiger Zellen in der Komplementkontrolle bzw. im Testpräparat sind. Der Prozentsatz von induzierten Zellen wird durch Subtraktion der Mittelwerte bei den Kontrollinkubationen ohne Induktionsmittel (gewöhnlich 1 bis 3%) von denen der Test-Induktionen ermittelt.

Als Ergebnis der Charakterisierungen dieser Art wurde gefunden, daß die gemäß den Beispielen 6, 7 und 8 hergestellten Pentapeptide die folgenden Prozentsätze von Induktionen von Th-I-(T-Zellen)-Antigen am Knochenmark von Küken zeigen:

Beisp.';l Nr. Induktion

6 12%

7 15%

8 21%

Claims

Patentansprüche:

1. Pentapeptlde und deren Derivate der allgemeinen Formel R-X-Y-Z-GLN-LYS-R'

mit den Bedeutungen

X = TYR oder. In Verbindung mit Y = ASN und Z = ILE, ALA; '0 Y= ASN oder ALA; Z = ILE oder ALA; R = Wasserstoff oder Acetyl und R' = Hydroxy oder Amino,