DE3211263C2

DE3211263C2 -

Info

Publication number: DE3211263C2
Application number: DE3211263A
Authority: DE
Inventors: Fumio Shimizu; Yasukazu Tokushima Jp Ohmoto; Kenichi Itano Tokushima Jp Imagawa
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-03-31
Filing date: 1982-03-26
Publication date: 1987-09-24
Also published as: FR2503145A1; DE3211263A1; FR2503145B1; US4474754A; SE457352B; CH652411A5; GB2102810A; SE8202012L; GB2102810B

Description

Die Erfindung betrifft Human-Interferon-Antikörper, erhalten durch Sammeln eines Antikörpers, der im Körper eines Säugers gebildet wurde, indem man dem Säuger ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, sowie die Verwendung dieser Antikörper.

DE-OS 30 40 825 beschreibt ein Tridekapeptid der folgenden Sequenz:

H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH.

Die vorstehende Druckschrift beinhaltet auch die Verwendung dieses Peptids als Hapten, Tracer oder Antikörper.

Chem. Pharm. Bull. 29, Band 5 (1981), Seiten 1390-97, offenbart ein Eicosapeptid der folgenden Sequenz:

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu- Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.

In der vorliegenden Erfindung werden Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen, aktive Gruppen, etc., durch Abkürzungen und Symbole nach den Regeln der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) und IUB (International Union of Biochemistry) bezeichnet oder durch Symbole, wie sie bekannt sind. Im Zusammenhang mit optischen Isomeren von Aminosäuren wird im allgemeinen die L-Form (Lävo-Form) dieser Isomeren erwähnt, wenn nicht anders angegeben. Beispiele für solche Abkürzungen und Symbole sind die folgenden:

Leu:Leucin Ile:Isoleucin Ala:Alanin Gln:Glutamin Thr:Threonin His:Histidin Ser:Serin Gly:Glycin Asn:Asparagin Met:Methionin Phe:Phenylalanin Tyr:Tyrosin Glu:Glutaminsäure Lys:Lysin Arg:Arginin Asp:Aspartinsäure Pro:Prolin OBzl:Benzyloxygruppe NHS:N-Hydroxysuccinimidogruppe Z:Carbobenzoxygruppe Su:Succinimidogruppe Tos:p-Toluensulfonylgruppe Boc:t-Butoxykarbonylgruppe

Interferon ist ein Glykoprotein oder ein Protein mit einer Antivirusaktivität, das von einer Zelle als Antwort auf eine Vireninfektion freigegeben wird und man nimmt an, daß man durch Virusinfektionen verursachte Krankheiten verhindern und heilen kann, indem man Interferon verabreicht. Interferon hat deshalb seit einigen Jahren großes Interesse gefunden.

Human-Interferone werden derzeit in drei Typen unterteilt, nämlich in Interferon-α (Leucozyten-Interferon, Lymphoplastoid-Interferon), Interferon-β (Fibroblast- Interferon) und Interferon-γ (Immun-Interferon). Man hat bisher jedoch noch keine Technik entwickelt, um Interferon zu reinigen und die jeweiligen Bestandteile in Form eines einzelnen Glykoproteins oder Proteins zu isolieren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die zur Verfügungstellung neuer Human-Interferon-Antikörper, die bei der Technologie zur Reinigung und Trennung von Human-Interferon-α, insbesondere von Lymphoblastoid-Interferon oder von Human-Interferon-β verwendet werden können.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch die zur Verfügungstellung von Human-Interferon-Antikörpern der eingangs genannten Art gelöst, welche gekennzeichnet sind durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids aus der Gruppe bestehend aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I)

R¹Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

worin R¹ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel

H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-,

eine Gruppe der Formel

H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg- Ala-

oder eine Gruppe der Formel

H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg- Arg-Ala-

bedeutet, einem Peptid der allgemeinen Formel II

R²-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

worin R² ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel

H-Thr-Asn-Leu-Gln-,

eine Gruppe der Formel

H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-

oder eine Gruppe der Formel

H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-

bedeutet, und einem Peptid der allgemeinen Formel (III)

R³-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

worin R³ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Phe, eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe-, oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe bedeutet, als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

Neue Antigene aus Human- Interferon-α oder -β lassen sich herstellen, unter Verwendung von neuem N-terminierten Peptid oder C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder unter Verwendung eines neuen N-terminierten Peptids von Human-Interferon-β. Es wurde gefunden, daß man neue Antikörper mit einer Spezifität gegenüber Human-Interferon-α oder -β unter Verwendung dieser Antigene herstellen kann. Weiterhin wurde gefunden, daß man das beabsichtigte Human-Interferon- α oder -β unter Verwendung der neuen Antikörper durch Affinitätschromatografie reinigen kann.

Die vorstehend genannten Peptide stellen synthetische Peptide dar, die in großem Maße hergestellt werden können. Diese neuen synthetischen Peptide stellen unter anderem ein Peptid entsprechend einem N-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid-Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (I)), ein Peptid entsprechend einem C-terminierten Peptid von Human-Lymphoblastoid- Interferon oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (II)), oder ein Peptid entsprechend einem N-terminierten Peptid von Human-Interferon-β oder ein Derivat davon (ein Peptid der allgemeinen Formel (III)), dar.

Das synthetische Peptid hat eine spezifische Aminosäureanordnung, so daß man aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I) oder aus einem Peptid der allgemeinen Formel (II) ein Antigen mit einer klaren Erkennungsstelle zur Identifizierung von Human-Interferon-α, und aus einem Peptid der allgemeinen Formel (III) ein Antigen mit einer klaren Erkennungsstelle zur Identifizierung von Human-Interferon-β, sowie einen Antikörper mit hoher Selektivität in großem Maßstab herstellen kann.

Man kann einen Antikörper hoher Spezifität gegen Interferon-α oder -β stabiler und in großem Maßstab unter Verwendung eines aus den vorerwähnten synthetischen Peptiden erhaltenen Antigens als ein Hapten gewinnen, als unter Verwendung von natürlichem Interferon-α oder -β.

Man kann die vorstehend genannten synthetischen Peptide nach einer allgemein zur Synthese von Peptiden angewendeten Methode herstellen, beispielsweise nach einem Verfahren, das in "The Peptides", Band 1 (1966) von Schröder und Luhke Press, New York, USA, oder in "Peptide Gosei" von Izumiya et al., Maruzen and Co., Ltd. (1975), beschrieben wird. Beispiele für solche Verfahren sind die Azidmethode, die Chloridmethode, die Säureanhydridmethode, die Mischanhydridmethode, die Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)-methode, Aktivestermethode (p- Nitrophenylestermethode, H-Hydroxysuccinimidestermethode, Cyanomethylestermethode und dergleichen), eine Methode unter Verwendung von Woodward-Reagenz K, die Carbodiimidazolmethode, Oxidations-Reduktions-Methode, DCC/Additiv [N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid (HONB), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxysuccinimid (HOSu)]-Methode und dergleichen.

Bei der Durchführung der vorerwähnten Methoden kann man entweder eine Festphasen-Synthesemethode oder eine Flüssigphasen-Synthesemethode anwenden, wobei die Synthesemethode in der Flüssigphase bevorzugt wird.

Die vorstehend genannten synthetischen Peptide erhält man nach einer der vorerwähnten Synthesemethoden für Polypeptide, z. B. durch eine "stufenweise" Methode, bei welcher man eine Aminosäure schrittweise mit der endständigen Aminosäure in dem Peptid kondensiert oder indem man Peptide, die in verschiedene Fragmente aufgeteilt sind, kuppelt. Insbesondere kann man solche Peptide herstellen, indem man ein Ausgangsmaterial mit reaktiven Carboxylgruppen, entsprechend dem einen Fragment, das man bei der Aufteilung in zwei Teile an der gewünschten Position erhält, mit einem anderen Ausgangsmaterial kondensiert, das reaktive Aminogruppen hat, die dem anderen Fragment entsprechen. Wenn dieses kondensierte Produkt Schutzgruppen aufweist, kann man das gewünschte Peptid herstellen, indem man die Schutzgruppen in üblicher Weise entfernt. Verwendet man Asparaginsäure, Lysin oder Arginin bei der Reaktionsstufe zur Herstellung eines Peptids der vorliegenden Erfindung, so kann die Aminosäure vorteilhaft durch Schutzgruppen bei der letzten Stufe geschützt werden, wobei die gesamten Schutzgruppen dann von dem geschützten Polypeptid, bei dem wenigstens eine konstitutionale Aminosäure- Restgruppe geschützt ist, entfernt werden.

Bei den Reaktionsschritten zur Synthese der Peptide kann man jede funktionelle Gruppe, die nicht an der Synthesereaktion teilnimmt, mit einer Schutzgruppe versehen und die Schutzgruppe wird von der geschützten Gruppe nach der Umsetzung entfernt. Weiterhin wird eine an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppe im allgemeinen aktiviert. Verfahren zur Durchführung dieser Reaktionen sind bekannt und ebenso sind aus Reagentien, die man für diese Reaktionen anwenden kann, bekannt.

Als Schutzgruppen für Aminosäuren kommen beispielsweise eine Carbobenzoxygruppe, eine t-Butyloxycarbonylgruppe, eine t-Amyloxycarbonylgruppe, eine Isobornyloxycarbonylgruppe, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine 2-Chlorobenzyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyloxycarbonylgruppe, eine Trifluoroacetylgruppe, eine Phthalylgruppe, eine Formylgruppe, eine o-Nitrophenylsulfenylgruppe, eine Diphenylphosphinothioylgruppe und dergleichen in Frage.

Als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe kommt beispielsweise ein Alkylester (z. B. eine Estergruppe von Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, t-Butyl oder dergleichen), ein Benzylester, ein p-Nitrobenzylester, ein p-Methoxybenzylester, ein p-Chlorobenzylester, ein Benzhydrylester, Carbobenzoxyhydrazid, t-Butyloxycarbonylhydrazid, Tritylhydrazid und dergleichen in Frage.

Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe von Arginin kommt beispielsweise eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe, eine p-Methoxybenzolsulfonylgruppe, eine Carbobenzoxygruppe, eine Isobornyloxycarbonylgruppe, eine Adamantyloxycarbonylgruppe und dergleichen in Frage. Weiterhin kann die Guanidinogruppe auch in Form eines Salzes mit einer geeigneten Säure geschützt werden, z. B. mit Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure.

Die Hydroxygruppe von Threonin und von Serin muß z. B. erforderlichenfalls durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen für eine Veresterung sind solche mit Niedrigalkanoylgruppen, wie eine Acetylgruppe, eine Aroylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Gruppe, die sich von einer Karbonsäure ableitet, wie eine Benzoyloxycarbonylgruppe, eine Ethyloxycarbonylgruppe und dergleichen. Als Schutzgruppe für eine Veretherung ist beispielsweise eine Benzylgruppe, eine t-Hydropyranylgruppe oder eine t-Butylgruppe geeignet.

Methionin kann in Form des Sulfoxids geschützt werden.

Als aktivierte Carboxylgruppe kommt beispielsweise ein entsprechendes Säurechlorid, Säureanhydrid oder Mischanhydrid oder ein Azid, ein aktivierter Ester (ein Ester von Methylalkohol, Ethylalkohol, Benzylalkohol, Pentachlorophenol, p-Nitrophenol, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen- 2,3-dicarboxyimid und dergleichen) in Frage.

Die Peptidbindungsbildungsreaktion kann durchgeführt werden in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, z. B. eines Carbodiimidreagenzes, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Carbodiimidazol oder dergleichen, oder von Tetraethylpyrophosphit.

Die gemäß der Erfindung verwendeten synthetischen Peptide können insbesondere nach einer der nachfolgenden Methoden A bis C hergestellt werden.

Methode A Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel (I)

A-(I): Wenn R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet.

A-(II): Wenn R¹ eine Gruppe der Formel H-Thr-His-Ser- Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- bedeutet.

[worin (36)* durch die folgende Stufe hergestellt wird

A-(III): Wenn R¹ eine Gruppe der Formel H-Ser-Asp-Leu- Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- bedeutet.

A-(IV): Wenn R¹ eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Asp- Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg- Ala- bedeutet.

Bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) ist A eine Schutzgruppe für die Aminogruppe, B eine aktive Gruppe für die Hydroxygruppe oder Carboxylgruppe, C eine Schutzgruppe für die Guanidinogruppe des Arginins und D eine Schutzgruppe für die Asparaginsäure.

Bei dem vorerwähnten Verfahren wird als Gruppe A eine t-Butoxycarbonylgruppe (Boc), eine Carbobenzoylgruppe (Z) oder eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe oder dergleichen bevorzugt. Als aktive Gruppe der Carbonylgruppe, dargestellt durch B wird beispielsweise ein aktiver Ester, wie eine N-Hydroxysuccinimidogruppe, ein Mischsäureanhydrid, wie eine Isobutyloxycarbonylgruppe, eine Azidgruppe und dergleichen, bevorzugt, und als Gruppe C wird eine Nitrogruppe, eine Tosylgruppe und dergleichen bevorzugt, während als Gruppe D eine Benzyloxygruppe bevorzugt wird.

Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Als Lösungsmittel kann jedes verwendet werden, das bei einer Peptidkondensationsreaktion verwendet werden kann, z. B. wasserfreies oder wasserhaltiges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlormethan, Tetrahydrofuran, Ethylacetat, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphotriamid oder Mischungen dieser Lösungsmittel.

Das Verhältnis, in dem die Aminosäure (3) mit einer Aminosäure (2) umgesetzt wird, ist nicht besonders begrenzt und kann in einem weiten Bereich liegen. Im allgemeinen verwendet man eine Äquivalente bis zur 5fachen Menge und vorzugsweise eine Äquivalente bis zur 1,5 fachen Menge.

Die Reaktionstemperatur wird so ausgewählt wie sie bei einer Peptidbindungsbildungsreaktion geeignet ist. Sie liegt im allgemeinen bei -40 bis etwa 60°C und vorzugsweise bei etwa -20 bis etwa 40°C. Die Umsetzung wird im allgemeinen einige Minuten bis etwa 30 Stunden durchgeführt.

Bei der vorerwähnten Methode A-(I) kann die Umsetzung eines Peptids (5) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Peptids (8) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Peptids (10) mit einer Aminosäure (11) und die Umsetzung eines Peptids (13) mit einer Aminosäure (6) in ähnlicher Weise wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) erfolgen.

Bei der vorerwähnten Methode A-(II) kann die Umsetzung einer Aminosäure (16) mit einer Aminosäure (17), die Umsetzung eines Peptids (19) mit einer Aminosäure (16), die Umsetzung eines Peptids (21) mit einer Aminosäure (22), die Umsetzung eines Peptids (24) mit einem Peptid (15), die Umsetzung eines Peptids (26) mit einem Peptid (36), die Umsetzung einer Aminosäure (6) mit einer Aminosäure (29), die Umsetzung eines Peptids (31) mit einer Aminosäure (32) und die Umsetzung eines Peptids (34) mit einem Peptid (35) in ähnlicher Weise wie die vorerwähnte Umsetzung erfolgen.

Bei der vorerwähnten Methode A-(III) kann die Umsetzung einer Aminosäure (37) mit einer Aminosäure (38), die Umsetzung eines Peptids (40) mit einer Aminosäure (6), die Umsetzung eines Peptids (42) mit einer Aminosäure (43), die Umsetzung eines Peptids (46) mit einer Aminosäure (32) und die Umsetzung eines Peptids (47) mit einem Peptid (28) sowie bei der vorerwähnten Methode A-(IV) die Umsetzung eines Peptids (50) mit einer Aminosäure (51), die Umsetzung eines Peptids (52) mit einem Peptid (28) in ähnlicher Weise durchgeführt werden wie bei der vorerwähnten Umsetzung.

Die Entfernung von Schutzgruppen von A bei den Peptiden (4), (7), (9), (12), (14), (18), (20), (25), (27), (30), (33), (39), (41), (45), (47), (48) und (53), wie sie nach den vorerwähnten Reaktionen erhalten werden, wird in bekannter Weise durchgeführt. Eine bekannte Entfernungsreaktion ist beispielsweise die reduktive Methode (eine Hydrierung unter Verwendung von Palladium, Palladiumschwarz und dergleichen als Katalysator; eine Reduktion unter Verwendung von metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak), eine Acidolyse (Acidolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Bromwasserstoff oder dergleichen als starke Säure) und dergleichen.

Die vorerwähnte Hydrierung unter Verwendung eines Katalysators kann unter 1 Atmosphäre Wasserstoff bei 0 bis 40°C durchgeführt werden. Der Katalysator wird im allgemeinen in einer Menge von 100 mg bis 1 g angewendet und die Umsetzung wird im allgemeinen in 1 bis 48 Stunden beendet.

Die vorerwähnte Acidolyse kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels bei 0 bis 30°C und vorzugsweise 0 bis 20°C durchgeführt werden und die Umsetzung ist im allgemeinen in 15 Minuten bis 1 Stunde beendet. Die Säure kann in einer 5- bis 10fachen Menge, bezogen auf die Menge des Ausgangsmaterials, verwendet werden.

Bei der vorerwähnten Reduktion unter Verwendung von metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak wird das metallische Natrium in einer solchen Menge angewendet, daß die Farbe des Reaktionsgemisches ständig während 30 Sekunden bis 10 Minuten blau bleibt. Die Reduktion wird im allgemeinen bei -40 bis -70°C durchgeführt.

Die Schutzgruppe von C bei einem Peptid (23) und die Schutzgruppe von D bei einem Peptid (45) kann auch nach der vorerwähnten reduktiven Methode entfernt werden.

Die Aminosäuren (2), (6), (11), (16), (22), (32), (37), (43) und (51), die für die vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein. Peptide (18), (23), (35), (36), (44), (47) und (52), wie sie bei den vorerwähnten Methoden A-(I) bis A-(IV) verwendet werden, können gleichfalls im Handel erhältliche Produkte sein oder solche, die man durch die Mischanhydridmethode oder durch die Azidbildungsmethode gewinnt. Die Mischanhydridmethode wird in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer basischen Verbindung unter Verwendung einer Alkylhalogenkarbonsäure durchgeführt. Geeignete Alkylhalogenkarbonsäuren sind beispielsweise Methylchloroformiat, Methylbromoformiat, Ethylchloroformiat, Ethylbromoformiat, Isobutylchloroformiat und dergleichen. Als basische Verbindung kommen beispielsweise organische Basen, wie Triethylamin, Trimethylamin, Pyridin, Dimethylanilin, N-Methylmorpholin, 1,5-Diazabicyclo [4,3,0]nonen-5 (DBN), 1,5-Diazabicyclo[5,4,0]- undecen-5 (DBU), 1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan (DABCO) und dergleichen in Frage, sowie auch anorganische basische Verbindungen, wie Kaliumkarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumhydrogenkarbonat, Natriumhydrogenkarbonat und dergleichen. Das bei dieser Umsetzung verwendete Lösungsmittel kann jedes Lösungsmittel sein, wie es bei einer Mischanhydridreaktion verwendet wird. Beispiele hierfür sind halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Chloroform, Dichlorethan und dergleichen; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen; Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan und dergleichen; Ester, wie Methylacetat, Ethylacetat und dergleichen; aprotische polare Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphortriamid und dergleichen. Die Umsetzung wird bei -20 bis 100°C und vorzugsweise -20 bis 50°C durchgeführt und ist im allgemeinen in 5 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise 5 Minuten bis 2 Stunden, beendet.

Bei der Azidbildungsreaktion wird zunächst eine Karbonsäure mit einem Alkohol, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Benzylalkohol und dergleichen, aktiviert und die aktivierte Carboxylgruppe wird dann mit Hydrazinhydrat in einem geeigneten Lösungsmittel umgesetzt. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Mischungen dieser Lösungsmittel. Hydrazinhydrat wird im allgemeinen in einer 5- bis 20fachen molaren Menge und vorzugsweise 5- bis 10fachen molaren Menge, bezogen auf die Menge der aktivierten Carboxylgruppe, angewendet. Die Umsetzung wird im allgemeinen unterhalb 50°C und vorzugsweise bei -20 bis 30°C durchgeführt. Auf diese Weise wird eine Verbindung erhalten, in welcher die Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure durch Hydrazin (Hydrazinderivat) substituiert ist. Eine Verbindung, bei welcher die Carboxylgruppe der endständigen Aminosäure durch ein Azid substituiert ist, erhält man, indem man in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure das vorerwähnte Hydrazinderivat mit einer Salpetrigsäureverbindung umsetzt. Als Säure wird im allgemeinen Salzsäure verwendet. Geeignete Lösungsmittel sind Dioxan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Mischungen dieser Lösungsmittel. Als Salpetrigsäureverbindung kommen Natriumnitrit, Isoamylnitrit, Nitrosylchlorid und dergleichen in Frage. Die Salpetrigsäureverbindung wird im allgemeinen in äquimolarer bis zur zweifachen molaren Menge und vorzugsweise in äquimolarer bis zur 1,5fachen molaren Menge, bezogen auf das Hydrazinderivat, angewendet. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei -20 bis 0°C und vorzugsweise bei -20 bis 10°C durchgeführt und ist in etwa 5 bis 10 Minuten beendet.

Methode B Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel (II)

B-(I): Wenn R² ein Wasserstoffatom ist.

[worin Peptid (65)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

B-(II): Wenn R² eine Gruppe der Formel H-Thr-Asn-Leu- Gln- bedeutet.

B-(III): Wenn R² eine Gruppe der Formel H-Ser-Leu-Ser- Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet.

B-(IV): Wenn R² eine Gruppe der Formel H-Tyr-Ser-Leu- Ser-Thr-Asn-Leu-Gln- bedeutet.

Bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) bedeutet E eine Schutzgruppe für eine ε-Aminogruppe des Lysins, F eine Schutzgruppe für eine γ-Carboxylgruppe der Glutaminsäure und G eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe und A, B und C haben die vorher angegebenen Bedeutungen.

Bei den vorerwähnten Methoden wird als Gruppe E eine Tosylgruppe oder dergleichen bevorzugt, als Gruppe F eine Benzyloxygruppe oder dergleichen und als Gruppe G bevorzugt man eine Alkylester-Restgruppe, t-Butoxycarbonyl und dergleichen. Bei der vorerwähnten Methode B-(I) erfolgt die Umsetzung der Aminosäure (55) mit einer Aminosäure (56), die Umsetzung eines Peptids (58) mit einer Aminosäure (59), die Umsetzung eines Peptids (61) mit einer Aminosäure (62), die Umsetzung des Peptids (64) mit einer Aminosäure (65), die Umsetzung eines Peptids (67) mit einer Aminosäure (68) und die Umsetzung einer Aminosäure (59) mit einer Aminosäure (98), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(II) die Umsetzung einer Aminosäure (71) mit einer Aminosäure (72), die Umsetzung eines Peptids (74) mit einer Aminosäure (75), die Umsetzung eines Peptids (77) mit einer Aminosäure (78) und die Umsetzung eines Peptids (80) mit einem Peptid (81), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(III) die Umsetzung einer Aminosäure (72) mit einer Aminosäure (84), die Umsetzung eines Peptids (86) mit einer Aminosäure (59) und die Umsetzung eines Peptids (88) mit einem Peptid (89), sowie bei der vorerwähnten Methode B-(IV) die Umsetzung eines Peptids (92) mit einer Aminosäure (93) und die Umsetzung eines Peptids (95) mit einem Peptid (89) in ähnlicher Weise wie bei der Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A.

Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppe A oder C von den Peptiden, die man nach den vorerwähnten Reaktionen erhält, wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie dies für die vorerwähnte Methode A erklärt wurde. Weiterhin kann man die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen E, F und G in ähnlicher Weise durchführen, wie dies für die Entfernung der Schutzgruppe C vorher erläutert wurde.

Aminosäuren (55), (56), (59), (62), (68), (71), (72), (75), (78), (84), (93) und (98), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein. Peptide (65), (80), (88) und (95), wie sie bei den vorerwähnten Methoden B-(I) bis B-(IV) verwendet werden, können ebenfalls bekannte, im Handel erhältliche Produkte sein oder solche, die man nach der Mischanhydridmethode oder der Azidmethode erhält. Solche Methoden sind bereits in der vorerwähnten Methode A erläutert worden.

Peptid (81), das bei der vorerwähnten Methode B-(II) erwähnt wird, kann man erhalten, indem man die Schutzgruppen A und F von Peptid (69) entfernt, und das Peptid (89), das bei der vorerwähnten Methode B-(III) verwendet wird, erhält man durch Entfernen der Schutzgruppe A vom Peptid (82). Die Entfernungsreaktionen für die Schutzgruppen können nach den vorerwähnten Methoden erfolgen.

Methode C Verfahren zur Herstellung eines Peptids der allgemeinen Formel (III)

C-(I): Wenn R³ ein Wasserstoffatom bedeutet.

[worin das Peptid (101)* durch die folgende Stufe hergestellt wird:

C-(II): Wenn R³ eine Gruppe der Formel H-Phe- bedeutet.

C-(III): Wenn R³ eine Gruppe der Formel H-Leu-Gly-Phe- bedeutet.

C-(IV): Wenn R³ eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu- Leu-Gly-Phe- bedeutet.

[worin das Peptid (114)* durch folgende Stufe hergestellt wird:

Bei den vorerwähnten Methoden C-(I) bis C-(IV) bedeutet R⁴ eine Niedrigalkylgruppe und A, B und C haben die vorher angegebenen Bedeutungen.

Die Umsetzung eines Peptids (100) mit einem Peptid (101), eines Peptids (105) mit einer Aminosäure (106), eines Peptids (109) mit einem Peptid (110), eines Peptids (113) mit einem Peptid (114), einer Aminosäure (121) mit einer Aminosäure (122), eines Peptids (124) mit einer Aminosäure (125), einer Aminosäure (128) mit einer Aminosäure (129), und eines Peptids (131) mit einer Aminosäure (132) kann in ähnlicher Weise erfolgen wie die Umsetzung einer Aminosäure (2) mit einer Aminosäure (3) bei der vorerwähnten Methode A.

Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen A oder C von den jeweiligen Peptiden, wie man sie bei den vorerwähnten Reaktionen erhält, kann in ähnlicher Weise erfolgen, wie dies für die Methode A schon erläutert wurde.

Die Hydrolyse eines Peptids (126) oder (133) zur Herstellung der Peptide (127) oder (134) kann in Gegenwart einer Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, oder von Alkali, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in einem Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Dioxan, erfolgen. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei 20 bis 50°C während 30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt.

Das bei der vorerwähnten Methode C-(II) verwendete Peptid (105) erhält man, indem man die Schutzgruppe A vom Peptid (102) entfernt. In gleicher Weise kann man das bei der Methode C-(III) verwendete Peptid (109) durch Entfernen der Schutzgruppe A vom Peptid (107) und das Peptid (113), wie es bei der Methode C-(IV) verwendet wird, durch Entfernen der Schutzgruppe A von dem Peptid (111) herstellen. Die Entfernungsreaktion der Schutzgruppen wird in ähnlicher Weise durchgeführt, wie schon vorher dargelegt.

Bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Peptids (114) aus dem Peptid (134) sind beispielsweise die Mischsäureanhydridmethode, die Azidbildungsmethode, wie dies auch für die Methode A schon erwähnt wurde.

Die nach den vorerwähnten Methoden erhaltenen Peptide können in üblicher Weise aus den Reaktionsgemisch isoliert und gereinigt werden, z. B. durch Extraktion, Teilung und Säulenchromatografie.

Wie erwähnt, erhält man nach den vorstehenden Methoden synthetische Peptide, nämlich N-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-Interferon, C-terminierte Peptide von Human-Lymphoblastoid-Interferon, N-terminierte Peptide von Human-Interferon-β- und Derivate davon.

Die Einführung von radioaktivem Jod in die vorstehenden Peptide erfolgt, indem man ein Peptid mit einer Tyrosylgruppe unter den synthetischen Peptiden, die vorher erwähnt wurden, mit einer üblichen Jodierungsmethode behandelt, z. B. durch eine oxidative Jodierung unter Verwendung von Chloramin T (cf. W. M. Hunter und F. C. Greenwood: Nature, 194, Seite 495 (1962); Biochem. J., 89, Seite 114 (1963)). Diese Jodierungsmethode wird in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) in Gegenwart von Chloramin T bei Raumtemperatur während 10 bis 30 Sekunden durchgeführt. Das radioaktive Jod kann in einer Menge von etwa 1 Millicurie pro 1 Nanomol Tyrosinmolekül, das in dem Peptid enthalten ist, zusammen mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T verwendet werden, wenn ein Atom des radioaktiven Jods in das Tyrosinmolekül eingeführt wird. Werden zwei Atome an radioaktivem Jod in das Tyrosinmolekül eingeführt, dann kann man 2 Millicurie radioaktives Jod pro 1 Nanomol des in dem Peptid enthaltenen Tyrosinmoleküls einführen, zusammen mit 10 bis 100 Nanomolen Chloramin T.

Das mit dem radioaktiven Jod markierte Peptid kann in üblicher Weise isoliert und gereinigt werden, z. B. durch Extraktion, Teilung, Säulenchromatografie oder Dialyse etc. Erforderlichenfalls kann man das markierte Peptid im lyophilisierten Zustand aufbewahren.

Die vorstehend genannten synthetischen Peptide werden als Haptene zur Herstellung von Human-Interferon-α- oder -b-Antigen verwendet.

Verfahren zur Herstellung von Human-Interferon-α- oder -β-Antigen werden nachfolgend erläutert.

Human-Interferon-α- oder -β-Antigen erhält man, indem man ein als Hapten verwendetes synthetisches Peptid mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Trägergebundenen Reagenzes umsetzt.

Als an das Hapten zu bindenden Träger, wie er für die vorerwähnte Methode verwendet wird, kommt ein natürliches oder synthetisches Protein mit hohem Molekulargewicht, wie es üblicherweise zur Herstellung von üblichen Antigenen verwendet wird, in Frage, z. B. tierisches Serumalbumin, wie Pferdeserumalbumin, Rinderserumalbumin, Rattenserumalbumin, Schafserumalbumin oder auch Humanserumalbumin, sowie auch animale Serumglobuline, wie Pferdeserumglobulin, Rinderserumglobulin, Rattenserumglobulin, Schafserumglobulin und Humanserumglobulin. Fernerhin auch animalische Thyroglobuline, wie Meerschweinchenthyroglobulin, Rinderthyroglobulin, Rattenthyroglobulin, Schafthyroglobulin oder Humanthyroglobulin oder animalische Hämoglobuline, wie Pferdehämoglobulin, Rinderhämoglobulin, Rattenhämoglobulin, Schafhämoglobulin und Humanhämoglobulin; animalische Hämocyanine; Proteine, extrahiert von Ascarisen (Ascarisenextrakte selbst, wie sie in JA-OS 16 414/1981, J. Immun., 111, 260-268 (1973); J. Immun., 122, 302-308 (1979); J. Immun., 98, 893-900 (1967) und Am. J. Physiol., 199, 575-578 (1960) beschrieben werden, oder Produkte, die man daraus durch weitere Reinigung erhält); Polylysin, eine Polyglutaminsäure, ein Lysin-Glutaminsäure-Copolymer, ein Copolymer enthaltend Lysin oder Ornitin.

Als Hapten-Träger-Bindungsmittel kommen die üblicherweise bei der Herstellung von Antigenen verwendeten in Frage, insbesondere aliphatische Dialdehyde, wie Glyoxal, Malondialdehyd, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, Adipoaldehyd usw., die Vernetzungsbindungen zwischen zwei Aminogruppen bilden können; Dimaleimidverbindungen, wie N,N′-o-Phenylendimaleimid, N,N′-m-Phenylendimaleimid und dergleichen, und solche, die Vernetzungsbindungen zwischen zwei Thiolgruppen bilden können; Maleimidocarboxyl- N-hydroxysuccinimidoester-Verbindungen, wie Metamaleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidoester, 4-(Maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyl-N′-hydroxysuccinimidoester- und dergleichen , d. h. solche, die Vernetzungsbindungen zwischen Aminogruppen und Thiolgruppen herstellen können; Dehydrokondensierungsmittel, wie N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Ethyl-N′- dimethylaminocarbodiimid, 1-Ethyl-3-diisopropylaminocarbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)- carbodiimid und dergleichen, solche, die für eine gemeinsame Peptidbindungsbildungsreaktion, wie sie beispielsweise beim Kombinieren einer Aminogruppe mit einer Carboxylgruppe vorliegt, verwendet werden und weiterhin auch Diazoniumarylcarboxylsäuren, wie p-Diazoniumphenylessigsäure und dergleichen. Diese werden in Kombination mit einem üblichen Peptidbindungsbildungsmittel, z. B. dem vorerwähnten Dehydrokondensierungsmittel, verwendet.

Die Umsetzung zur Herstellung eines Antigens wird beispielsweise in einer wäßrigen Lösung oder in einer üblichen Pufferlösung mit einem pH von 7 bis 10 und vorzugsweise 8 bis 9 bei 0 bis 40°C und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Umsetzung erfolgt während 1 bis 24, vorzugsweise 3 bis 5 Stunden.

0,2 M Natriumhydroxid - 0,2 M Borsäure - 0,2 M Kaliumchloridpufferlösung,
0,2 M Natriumkarbonat - 0,2 M Borsäure - 0,2 M Kaliumchloridpufferlösung,
0,05 M Natriumtetraborat - 0,2 M Borsäure - 0,05 M Natriumchloridpufferlösung, und
0,1 M Kaliumhydrophosphat - 0,05 M Natriumtetraboratpufferlösung.

Bei der vorerwähnten Umsetzung kann das Verhältnis der Mengen eines Haptens zu einem Haptenträgerbindungsmittel und einem Träger in geeigneter Weise bestimmt werden, wobei im allgemeinen die 2- bis 6fache Gewichtsmenge und vorzugsweise 3- bis 5fache Gewichtsmenge des Trägers, bezogen aus das Hapten, verwendet wird und die 5- bis 10fache molare Gewichtsmenge des Hapten- Träger-Bindungsmittels, bezogen auf das Hapten, verwendet wird. Gemäß der vorerwähnten Reaktion kann man ein Human-Interferon-α- oder -β-Antigen aus einem Träger und einem Hapten, die beide durch ein Hapten-Träger- Bindungsmittel vereint sind, erhalten.

Nach Beendigung der Umsetzung kann man das so erhaltene Antigen in einfacher Weise isolieren und reinigen, indem man eine übliche Dialyse oder Gelfiltration oder fraktionierte Fällung durchführt. Gewünschtenfalls kann man das Antigen in üblicher Weise in lyophilisierter Form aufbewahren.

Auf diese Weise erhält man Human-Interferon-α- oder -β-Antigen-Zusammensetzungen aus einem der synthetischen Peptide und dem Träger. Das Antigen ist eine Zusammensetzung, bei der im allgemeinen durchschnittlich 5 bis 20 Mole des Peptids mit 1 Mol des Proteins kombiniert sind und von dem Antigen kann man einen Antikörper mit einer hohen Spezifität gegenüber Human-Interferon-α- oder -β mit guter Wiederholbarkeit herstellen. Von den Antigenzusammensetzungen ist insbesondere ein solches mit einem Bindungsverhältnis von Protein zu Peptid von 1 : 8 bis 1 : 15 mit einer hohen Spezifität bevorzugt, weil man daraus einen Antikörper mit hoher Wirksamkeit und hoher Empfindlichkeit herstellen kann.

Zubereitungen von Antikörpern unter Verwendung eines wie oben erhaltenen Antigens, kann man wie folgt herstellen. Hierzu wird das Antigen einem Säugetier verabreicht und der in dem Säugetier erzeugte Antikörper wird dann gesammelt.

Es besteht keine besondere Beschränkung bei der Auswahl des Säugetiers für die Herstellung des Antikörpers, wobei man im allgemeinen jedoch Kaninchen oder Meerschweinchen bevorzugt. Bei der Bildung des Antikörpers wird eine vorbestimmte Menge des wie oben erhaltenen Antigens mit einer physiologischen Kochsalzlösung auf eine geeignete Konzentration verdünnt und diese verdünnte Lösung wird dann weiter verdünnt, indem man komplettes Freund's Adjuvant unter Herstellung einer Suspension abmischt und die Suspension dann dem Säugetier verabreicht. Beispielsweise kann man eine solche Suspension intrakutan einem Kaninchen in einer Menge von 0,5 bis 5 mg des Antigens pro Verabreichung verabreichen und die Verabreichungen werden jede zweite Woche während 2 bis 10 Monaten und vorzugsweise 4 bis 6 Monaten durchgeführt, um eine Immunisierung zu bewirken. Zum Sammeln des Antikörpers nimmt man von dem immunisierten Tier zu dem Zeitpunkt, bei dem eine große Menge des Antikörpers nach der Verabreichung der Suspension in dem Tier gebildet wurde, im allgemeinen 1 bis 2 Wochen nach der letzten Verabreichung der Suspension, Blut ab. Das dem Tier entnommene Blut wird mit einer Zentrifuge behandelt und das Serum zum Erhalt des Antikörpers abgetrennt. Erfindungsgemäß kann man aufgrund der besonderen Eigenschaften des Antigens einen Antikörper mit einer ausgezeichneten Spezifität gegenüber Human-Interferon-α- oder -β mit hoher Wirksamkeit und hoher Empfindlichkeit erhalten.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Antikörper weisen eine ausgezeichnete Spezifität gegenüber Human-Interferon-α- oder -β auf. Diese Antikörper können als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines Adsorbens, das für die Affinitätschromatografie verwendet wird, angewendet werden, indem man die Antikörper auf einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert.

Unter Verwendung eines Adsorbens für die Affinitätschromatografie kann man Human-Interferon-α- oder -β aus einem Rohprodukt des Interferons isolieren und reinigen, indem man die Art des verwendeten Antikörpers gezielt auswählt. Verwendet man ein Adsorbens, an dem Human-Interferon-α -Antikörper immobilisiert ist, dann wird Human-Interferon-α selektiv daran adsorbiert und in gleicher Weise wird dann, wenn man Human-Interferon- β-Antikörper auf einem Adsorbens immobilisiert das Human-Interferon-β selektiv daran adsorbiert. Dann wird von dem Adsorbens das Human-Interferon-α- oder -β adsorbiert enthält, das Human-Interferon-α- oder -β unter milden Bedingungen in einfacher Weise desorbiert und auf diese Weise kann man ein hochreines Human- Interferon-α- oder -b qualitativ ohne Aktivitätsverlust gewinnen.

Das Adsorbens für die Affinitätschromatografie kann in der nachfolgend beschriebenen Weise erhalten werden.

Beim Immobilisieren von Human-Interferon-Antikörper auf einem unlöslichen Träger können übliche Methoden zum Immobilisieren eines Biomaterials angewendet werden. Eine bevorzugte Methode ist dabei die cyanogenbromidaktivierte Polysaccharidmethode. Bei der cyanogenbromidaktivierten Polysaccharidmethode wird zunächst ein unlöslicher Träger mit Cyanogenbromid behandelt und der so erhaltene aktivierte Träger wird dann mit einer Biosubstanz unter milden Bedingungen zum Immobilisieren der Biosubstanz behandelt. Bei der Behandlung des unlöslichen Trägers mit Cyanogenbromid kann die Behandlung bei einem pH von 11 bis 12 unter Verwendung einer basischen Verbindung, z. B. von Natriumhydroxid oder Natriumhydrogenkarbonat, bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel, z. B. Wasser, Acetonitril und dergleichen, während etwa 1 bis 12 Minuten durchgeführt werden. Das Mengenverhältnis von Cyanogenbromid zur Menge des unlöslichen Trägers liegt im allgemeinen bei gleichen Gewichtsmengen. Als unlöslicher Träger kann jeder unlösliche Träger verwendet werden, der eine niedrige nicht-spezifische Adsorptionsfähigkeit gegenüber Biosubstanzen aufweist, der eine hohe Porosität hat und der funktionelle Gruppen aufweist, die in der Lage sind, die Biosubstanz unter milden Bedingungen zu immobilisieren und dabei auch ausreichend chemisch und physikalisch stabil ist. Beispielsweise kann man einen zelluloseartigen Träger, wie Aminoethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Bromoacetylzellulose, Paraanilinozellulose und dergleichen, oder einen Träger vom Typ eines vernetzten Dextrans, wie Sephadex®, CM-Sephadex® und dergleichen verwenden oder auch einen agaroseartigen Träger, wie Sepharose® 2B, Sepharose® 4B, Sepharose® 6B.

Beim Kuppeln des so erhaltenen cyanogenbromidaktivierten Trägers mit Human-Interferon-Antikörper kann die 30- bis 80fache Gewichtsmenge des cyanogenbromidaktivierten Trägers mit dem Human-Interferon-Antikörper in einem geeigneten Lösungsmittel, wie einer wäßrigen 0,1 M Natriumhydrogenkarbonatlösung (enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, pH = 8,4), bei im allgemeinen 0 bis 40°C und vorzugsweise bei 2 bis 8°C während 10 bis 20 Stunden angewendet werden. Auf diese Weise erhält man ein Adsorbens für eine Affinitätschromatografie. Dieses Adsorbens kann in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. in einer physiologischen Kochsalzlösung, aufbewahrt werden.

Zur näheren Erklärung der Erfindung und der Peptide werden Beispiele von Zubereitungen für Peptide, Antigene und Antikörper gezeigt, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.

In den nachfolgenden Herstellungsbeispielen wird der Rf-Wert unter Verwendung der folgenden Mischlösungsmittel mittels einer Dünnschichtchromatografie auf Kieselgel bestimmt

Rf^I: 1-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 5)
Rf^II: 1-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15 : 10 : 3 : 12)

In den Zeichnungen zeigen

Fig. 1 und 2 Kurven, welche die Spezifität des Interferon- α-Antikörpers, der nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, angeben,

Fig. 3 und 4 Kurven, die die Spezifität eines gemäß der Erfindung erhaltenen Human-Interferon- β-Antikörpers anzeigen,

Fig. 5 eine Kurve, in welcher die Beziehung zwischen der Konzentration der ersten bis zur dreizehnten Peptidkette von Human-Interferon-β- und dem relativ gebundenen Prozentsatz (%) hinsichtlich eines erfindungsgemäß erhaltenen Human-Interferon-β-Antikörpers dargestellt ist.

Als Erläuterung der Erfindung gelten nur diejenigen Teile der Beschreibung, welche unter die Ansprüche fallen.

Synthese von Peptiden Herstellungsbeispiel A-1 (1) Herstellung von Z-Ala-Gln-OH

Zu einer Lösung von 4,80 g Z-Ala-OSu in 60 ml Tetrahydrofuran wurde eine Lösung aus 2,19 g H-Gln-OH in 40 ml Wasser und 2,10 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Wasser wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit n-Butanol extrahiert. Das n-Butanolextrakt wurde mit 2%iger Essigsäure gewaschen und dann wurde das Butanol abdestilliert. Die ausgefallene Substanz wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Methylen- Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,87 g Z-Ala- Gln-OH erhielt

Rf^I: 0,41
Rf^II: 0,56

Elementaranalyse für C₁₆H₂₁N₃O₆

Berechnet (%):C 54,69, H 6,02, N 11,96 Gefunden (%):C 54,50, H 6,31, N 11,62

(2a) Herstellung von H-Ala-Gln-OH

3,50 g Z-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Wasser und 30 ml Methanol gelöst und die Mischung wurde katalytisch unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man H-Ala-Gln-OH erhielt.
Rf^I: 0,04

(2b) Herstellung von Z-Leu-Ala-Gln-OH

3,97 g Z-Leu-OSu, das gemäß (2a) erhaltene H-Ala-Gln-OH und 1,39 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure dreimal und mit Wasser fünfmal gewaschen. Ethylacetat wurde abdestilliert und zu dem Rückstand wurde Ether gegeben und der ausgefallene Niederschlag wurde filtriert und getrocknet und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,15 g Z-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,49
Rf^II: 0,62

Elementaranalyse für C₂₂H₃₂N₄O₇

Berechnet (%):C 56,88, H 6,94, N 12,06 Gefunden (%):C 65,41, H 6,80, N 12,18

(3a) Herstellung von H-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 2,10 g Z-Leu-Ala-Gln-OH wurden 20 ml einer 25% Bromwasserstoff enthaltenden Essigsäurelösung gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde zum Reaktionsgemisch trockener Ether gegeben, wobei man H-Leu- Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,10

(3b) Herstellung von H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

196 g Z-Leu-OSu, 0,63 ml Triethylamin und das vorstehend erhaltene H-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand 1M Zitronensäure gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden bis zum Erhalt eines neutralen Filtrats gewaschen und dann getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden mit Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,63 g Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,58
Rf^II: 0,64

Elementaranalyse für C₂₈H₄₃N₅O₈

Berechnet (%):C 58,22, H 7,50, N 12,12 Gefunden (%):C 57,85, H 7,90, N 11,96

(4a) Herstellung von Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 1,50 g Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 20 ml 25% Bromwasserstoff enthaltende Essigsäure gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde trockener Ether gegeben und der ausgefallene Feststoff wurde durch Filtrieren gesammelt, wobei man Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.
Rf^I: 0,19

(4b) Herstellung von Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

1,41 g Z-Ile-OSu, das vorstehend erhaltene Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH und 0,36 ml Triethylamin in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde 1N Zitronensäure zum Rückstand gegeben und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heißem Methanol gewaschen, wobei man 1,17 g Z-Leu-Leu- Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,61
Rf^II: 0,71

Elementaranalyse für C₃₄H₅₄N₆O₉

Berechnet (%):C 59,11, H 7,87, N 12,16 Gefunden (%):C 59,23, H 7,80, N 12,02

(5a) Herstellung von H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

Zu 1,10 g Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden 15 ml Essigsäure, enthaltend 25% Bromwasserstoff, gegeben und die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde trockener Ether zum Reaktionsgemisch gegeben, wobei man H-Ile-Leu-Leu- Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,25

(5b) Herstellung von Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,69 g Z-Leu-OSu, das oben erhaltene H-Ile-Leu-Leu-Ala- Gln-OH und 0,22 ml Triethylamin wurden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zum Rückstand 1N Bernsteinsäure gegeben und der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral war, und dann getrocknet. Das trockene Material wurde mit heißem Methanol gewaschen, wobei man 1,10 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,58
Rf^II: 0,71

Elementaranalyse für C₄₀H₆₅N₇O₁₀

Berechnet (%):C 59,75, H 8,15, N 12,19 Gefunden (%):C 59,60, H 8,02, N 11,92

(6) Herstellung von H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

0,50 g Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%iger Essigsäure gelöst und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala- Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid A bezeichnet.

Rf^I: 0,23
Rf^II: 0,61

Elementaranalyse für C₃₂H₅₉N₇O₈ · 2 H₂O

Berechnet (%):C 54,45, H 8,99, N 13,89 Gefunden (%):C 54,30, H 8,81, N 13,98

Herstellungsbeispiel A-2 (1) Herstellung von Boc-Ala-NHNHZ

4,99 g Boc-Ala-OH, 4,36 g NH₂-NH-Z und 5,44 g Dicyclohexylcarbodiimid wurden in 150 ml Tetrahydrofuran gelöst und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Die im Reaktionsgemisch gebildete feste Masse wurde abfiltriert und das Filtrat wurde destilliert und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ether gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und aus Ether und Petrolether umkristallisiert, wobei man 7,03 g Boc-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf^I: 0,79
Rf^II: 0,81

Elementaranalyse für C₁₆H₂₃N₃O₅

Berechnet (%):C 56,96, H 6,87, N 12,45 Gefunden (%):C 56,81, H 6,49, N 12,34

Herstellung von (2a)-Ala-NHNHZ

3,00 g Boc-Ala-NHNHZ wurden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Trifluoressigsäure abdestilliert und getrocknet, wobei man H-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf^II: 0,51

(2b) Herstellung von Boc-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ

2,84 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in 40 ml einer 0,91 ml N-Methylmorpholin enthaltenden Tetrahydrofuranlösung gelöst und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 1,17 ml Isobutylchloroformiat gegeben. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine Lösung von H-Ala-NHNHZ in 20 ml Dimethylformamid gegeben sowie 1,24 ml Triethylamin und dann wurde 1 Minute gerührt. Man ließ das Reaktionsgemisch 5 Minuten bei 0°C stehen und erwärmte dann 2 Minuten auf 40°C und rührte anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure gewaschen und anschließend mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und im Anschluß daran mit einer gesättigten Kochsalzlösung. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,70 g Boc-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf^I: 0,68
Rf^II: 0,79

Elementaranalyse für C₂₂H₃₄N₈O₈

Berechnet (%):C 49,06, H 6,36, N 20,80 Gefunden (%):C 49,40, H 6,72, N 20,43

(3a)Herstellung von H-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ

3,67 g Boc-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ wurden in 15 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde trockener Ether zugegeben und die auskristallisierten Kristalle wurden abfiltriert, wobei man H-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ erhielt.

Rf^I: 0,20

(3b) Herstellung von Boc-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ

2,17 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in einer Lösung von 50 ml Tetrahydrofuran, enthaltend 0,69 ml N-Methylmorpholin, gelöst und auf -15°C gekühlt und dazu wurden 0,89 ml Isobutylchloroformiat gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten kräftig gerührt. Zu der Mischung wurde das vorerwähnte H-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ in 30 ml Dimethylformamid sowie 0,95 ml Triethylamin gegeben und dann rührte man 1 Minute. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten auf 0°C und dann 2 Minuten auf 40°C erwärmt und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und einer wäßrigen gesättigten Natriumhydrogenkarbonatlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann wurde Ethylacetat abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Ether erhielt man 3,70 g Boc-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ.

Rf^I: 0,58
Rf^II: 0,75

Elementaranalyse für C₂₈H₄₅N₁₃O₁₁

Berechnet (%):C 45,46, H 6,13, N 24,61 Gefunden (%):C 45,13, H 5,71, N 24,51

(4a) Herstellung von H-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ

3,00 g Boc-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ wurden in 20 ml Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann aus trockenem Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, wobei man H-Arg-(NO₂)-Arg(NO₂)- Ala-NHNHZ erhielt.

Rf^I: 0,11

(4b) Herstellung von Boc-Asn-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)- Ala-NHNHZ

H-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ wurde in 50 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,56 ml Triethylamin und 2,17 g Boc-Asn-ONHS gegeben und die Mischung ließ man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit 2%iger Essigsäure zweimal gewaschen und dann mit Ether ausgefällt und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Essigsäure umkristallisiert, wobei man 2,64 g Boc-Asn-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Arg- NHNHZ erhielt.

Rf^I: 0,40
Rf^II: 0,72

Elementaranalyse für C₃₂H₅₁N₁₅O₁₃

Berechnet (%):C 45,01, H 6,02, N 24,60 Gefunden (%):C 44,80, H 5,85, N 24,12

(4c) Herstellung von Boc-Asn-Arg-Ala-NHNHZ₂

2,50 g Boc-Asn-Arg(NO₂)-Arg(NO₂)-Ala-NHNHZ wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde katalytisch unter Verwendung von Palladium als Katalysator reduziert, wobei man 2,20 g Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH₂ erhielt.

Rf^I: 0,06
Rf^II: 0,40

Elementaranalyse für C₂₄H₄₇N₁₃O₇ · 2CH₃CO₂H · H₂O

Berechnet (%):C 43,80, H 7,48, N 23,71 Gefunden (%):C 43,51, H 7,62, N 23,45

(5) Herstellung von Z-Leu-Gly-OC₂H₅

1,86 ml N-Methylmorpholin wurden in 60 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung wurden 4,85 g Z-Leu-OH gegeben. Die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dann wurden während 30 Sekunden unter kräftigem Rühren 2,41 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. Zu dieser Reaktionsmischung wurden 40 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 2,54 g H-Gly-OC₂H₅ und 2,56 ml Triethylamin gegeben und 1 Minute gerührt. Nach dem Erwärmen des Reaktionsgemisches während 5 Minuten auf 0°C und 2 Minuten auf 40°C wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und zu dem Rückstand wurde 1M Zitronensäure gegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden mit Wasser gewaschen bis das Filtrat neutral war und dann getrocknet und aus Ethylacetat- Ether umkristallisiert, wobei man 4,68 g Z-Leu-Gly-OC₂H₅ erhielt.

Rf^I: 0,80
Rf^II: 0,77

Elementaranalyse für C₁₈H₂₆N₂O₅

Berechnet (%):C 61,70, H 7,48, N 7,99 Gefunden (%):C 61,51, H 7,32, N 7,80

(6a) Herstellung von H-Leu-Gly-OC₂H₅

3,12 g Z-Leu-Gly-OC₂H₅ wurden in 50 ml Methanol und 8,90 ml 1N Salzsäure gelöst und die Lösung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Leu-Gly-OC₂H₅ erhielt.

Rf^I: 0,41

(6b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅

2,48 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,89 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf -15°C wurden 1,31 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Dann wurde durch Zugabe von 4,11 ml Triethylamin zum Reaktionsgemisch die Mischung neutralisiert. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 10 ml einer das oben erwähnte H-Leu-Gly- OC₂H₅ enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 1,24 ml Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und anschließend mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und das Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen von Ethylacetat erhielt man nach dem Umkristallisieren aus Ethylacetat 2,64 g Z-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅.

Rf^I: 0,78
Rf^II: 0,85

Elementaranalyse für C₂₁H₃₁N₃O₇

Berechnet (%):C 57,65, H 7,14, N 9,60 Gefunden (%):C 57,60, H 6,88, N 9,63

(7a) Herstellung von H-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅

2,50 g Z-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅ wurden in 10 ml Essigsäure und 50 ml Methanol gelöst und die Mischung wurde unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅ erhielt.

Rf^I: 0,31

(7b) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅

2,54 g Z-Thr-His-NHNH₂ wurden in 20 ml Dimethylformamid und 4,19 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Mischung auf -15°C wurden 0,84 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 3,51 ml Triethylamin zugegeben. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer das vorher erhaltene H-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅ enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 0,79 ml Triethylamin gegeben und dann wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 4,31 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly- OC₂H₅ erhielt.

Rf^I: 0,35
Rf^II: 0,71

Elementaranalyse für C₃₁H₄₅N₃O₃ · H₂O

Berechnet (%):C 64,00, H 8,11, N 16,85 Gefunden (%):C 64,48, H 8,10, N 16,54

(8a) Herstellung von Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH₂

4,30 g Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC₂H₅ wurden in 20 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 3,18 ml Hydrazinmonohydrat gegeben und die Mischung ließ man 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Nach Beendigung der Umsetzung gab man zum Reaktionsgemisch Ether und dann wurden die ausgefallenen Kristalle durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Die Kristalle wurden mit heißem Methanol gewaschen, wobei man 2,55 g Z-Thr-His-Ser- Leu-Gly-NHNH₂ erhielt.

Rf^I: 0,17
Rf^II: 0,57

Elementaranalyse für C₂₉H₄₃N₉C₉

Berechnet (%):C 52,64, H 6,55, N 19,05 Gefunden (%):C 52,55, H 6,44, N 19,09

(8b) Herstellung von H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu- Leu-Ala-Gln-OH

0,78 g Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH₂ wurden in 8 ml Dimethylformamid und 1,03 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Lösung auf -15°C wurden 0,16 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches wurden 0,87 ml Triethylamin zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus dem Peptid A, d. h. aus H-Leu-Ile-Leu-Leu- Ala-Gln-OH, 0,87 ml Triethylamin, 20 ml Dimethylformamid und 10 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurden 0,39 g von Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH₂, das in das Azid überführt worden war, zu der Mischung gegeben und 48 Stunden gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Ether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Das so erhaltene Boc-Asn-Arg- Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 3 ml Trifluoressigsäure gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde zum Ausfällen der Kristalle Ether zugegeben und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Nach dem Trocknen der Kristalle wurden diese unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluierungsmittel: 50%ige Essigsäure) gereinigt, wobei man 120 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,35

Elementaranalyse für C₅₁H₉₄N₁₈O₁₃ · 2 CH₃COOH · 5 H₂O

Berechnet (%):C 47,95, H 8,19, N 18,30 Gefunden (%):C 47,66, H 8,41, N 18,62

[α]: -185,44 (C = 0,57, 1M Essigsäure

(9) Herstellung von H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn- Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH

125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH₂ wurden in 10 ml Dimethylformamid und 0,125 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und auf -15°C gekühlt und dann wurden 0,025 ml Isoamylnitrit zugegeben und 5 Minuten gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 0,105 ml Triethylamin gegeben. Diese Mischung wurde dann zu einer Mischung aus 10 ml Dimethylformamidlösung, enthaltend 110 mg H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH sowie 0,013 ml Triethylamin gegeben und dazu gab man außerdem 6 ml Hexamethylphosphortriamid und die ganze Mischung wurde dann 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurde das Azidprodukt aus 125 mg Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH₂ zu der Reaktionsmischung gegeben und 48 h gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol- Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Thr- His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH wurde in 50 ml Methanol und 10 ml 10%iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abdestilliert und der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50%ige Essigsäure) gereinigt unter Erhalt von 125 mg H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile- Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid B bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,38

Elementaranalyse für C₇₂H₁₂₇N₂₅O₂₀ · 2 CH₃COOH · 4 H₂O

Berechnet (%):C 49,21, H 7,77, N 18,87 Gefunden (%):C 49,60, H 7,92, N 18,54

[α]: -66,76 (C = 0,42, 1M Essigsäure

Herstellungsbeispiel A-3 (1a) Herstellung von H-Gln-NHNHBoc

7,00 g Z-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf^I: 0,37

(1b) Herstellung von Z-Pro-Gln-NHNHBoc

4,41 g Z-Pro-OH wurden in 50 ml Tetrahydrofuran und 1,80 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Lösung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 2,34 ml Isobutylchloroformiat gegeben und dann wurde 30 Sekunden kräftig gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 30 ml einer Dimethylformamidlösung, die H-Gln-NHNHBoc, das gemäß Stufe (1a) erhalten worden war, enthielt, zugegeben und 1 Minute gerührt. Die gesamte Mischung wurde 5 Minuten auf 0°C erwärmt und weitere 2 Minuten auf 40°C und dann wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat, enthaltend eine kleine Menge an Butanol, extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und dann nochmals mit heißem Ethylacetat gewaschen, wobei man 5,67 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf^I: 0,60
Rf^II: 0,76

Elementaranalyse für C₂₃H₃₃N₅O₇

Berechnet (%):C 56,20, H 6,77, N 14,25 Gefunden (%):C 55,97, H 6,68, N 14,15

(2a) Herstellung von H-Pro-Gln-NHNHBoc

5,50 g Z-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf^I: 0,09

(2b) Herstellung von Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

4,05 g Z-Leu-ONHS wurden zu 100 ml Dimethylformamidlösung von H-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (2a), gegeben und dann wurden 1,56 ml Triethylamin zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden stehen gelassen. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und anschließend mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,72 g Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf^I: 0,68
Rf^II: 0,80

Elementaranalyse für C₂₉H₄₄N₆O₈

Berechnet (%):C 57,60, H 7,33, N 13,90 Gefunden (%):C 57,21, H 7,08, N 13,58

(3a) Herstellung von H-Leu-Gln-NHNHBoc

3,50 g Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Leu-Pro-Gln- NZNHBoc erhielt.

Rf^II: 0,14

(3b) Herstellung von Z-Asp(OCH₂-C₆H₅)-Leu-Pro-Gln- NHNHBoc

2,27 g Z-Asp(OCH₂-C₆H₅)-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,65 ml N-Methylmorpholin gelöst und nach Kühlen der Lösung auf -15°C wurden unter kräftigem Rühren während 30 sek. 0,84 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. Zum Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer H-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach der obigen Stufe (3a), enthaltenden Dimethylformamidlösung sowie 0,81 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 1 Minute gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung 5 Minuten auf 0°C und 2 Minuten auf 40°C erwärmt und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und dann mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Ethylacetat-Petrolether erhielt man 4,00 g Z-Asp-(OCH₂- C₆H₅)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf^I: 0,68
Rf^II: 0,77

Elementaranalyse für C₄₀H₅₅N₇O₁₁

Berechnet (%):C 59,32, H 6,84, N 12,11 Gefunden (%):C 58,88, H 6,65, N 11,72

(4a) Herstellung von H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

2,00 g Z-Asp-(OCH₂-C₆H₅)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc erhielt.

Rf^I: 0,08

(4b) Herstellung von Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

0,75 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 15 ml Dimethylformamid mit 1,48 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und nach dem Kühlen der Lösung auf -15°C wurden 0,39 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann 5 Minuten gerührt und anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit 1,24 ml Triethylamin neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus 10 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Asp- Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten gemäß Stufe (4a), und 0,34 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol- Ethylacetat erhielt man 1,52 g Z-Ser-Asp-Leu- Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf^I: 0,45
Rf^II: 0,67

(5) Herstellung von H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr- His-Ser-Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu- Leu-Ala-Gln-OH

116 mg Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) zur Entfernung der Butoxycarbonylgruppe behandelt, und dann wurde wasserfreier Ether zum Reaktionsgemisch gegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, getrocknet und in 5 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,072 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst. Nach dem Kühlen der Reaktionsmischung auf -15°C wurden 0,019 ml Isoamylnitrit zur Mischung gegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschließend wurde die Mischung durch Zugabe von 0,081 ml Triethylamin neutralisiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung aus 80 mg Peptid B, d. h. H-Thr-His-Ser- Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 5 ml Dimethylformamid und 6 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurden zu dem Reaktionsgemisch 116 mg eines Azidproduktes von Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc gegeben und anschließend rührte man 28 Stunden. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und Butanol wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Petrolether umkristallisiert und die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert. Das so erhaltene Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Le-u- Leu-Ala-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol mit 30 ml 10%iger Essigsäure gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 und anschließend LH-20 (Eluierlösungsmittel: 1/1000 N Salzsäure) gereinigt, wobei man 58 mg H-Ser-Asp-Leu- Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile- Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid C bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,37

Elementaranalyse für C₉₅H₁₆₃N₃₁O₂₉ · 2 CH₃COOH · 7 H₂O

Berechnet (%):C 48,54, H 7,61, N 17,72 Gefunden (%):C 48,14, H 7,50, N 17,48

[α]: -85,70 (C = 0,23, 1M Essigsäure)

Herstellungsbeispiel A-4 (1a) Herstellung von H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc

1,03 g Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 50 ml Methanol gelöst und dann unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert, wobei man H-Ser- Asp-Leu-Pro-Gln-MHMHBoc erhielt.

Rf^I: 0,06

(1b) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln- NHNHBoc

0,79 g Z-Tyr-ONHS wurden zu 20 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, erhalten nach Stufe (1a), gegeben und die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure und danach mit einer wäßrigen gesättigten Lösung von Natriumchlorid gewaschen und Ethylacetat wurde abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 588 mg Z-Tyr-Ser-Asp- Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.

Rf^I: 0,51
Rf^II: 0,69

Elementaranalyse für C₅₂H₆₉N₉O₁₅

Berechnet (%):C 58,91, H 6,56, N 11,89 Gefunden (%):C 58,53, H 6,22, N 12,28

(2) Herstellung von H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln- Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile- Leu-Leu-Ala-Gln-OH

44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc wurden in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,0225 ml 6N Salzsäure/ Dioxan gelöst und nach Kühlen der Mischung auf -15°C wurden 0,0060 ml Isoamylnitrit zugegeben und dann wurde 5 Minuten gerührt und anschließend wurde die Mischung mit 0,0252 ml Triethylamin neutralisiert.

Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung, die aus 5 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 25 ml Peptid B, d. h. H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu- Ala-Gln-OH, und 2 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Anschließend wurde das Azidprodukt von 44 mg Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc zum Reaktionsgemisch gegeben und 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit einer Mischung aus Butanol-Wasser extrahiert und dann aus Ether umkristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt. Das so erhaltene Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro- Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu- Ala-Gln-OH wurde in 30 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von Palladium als Katalysator katalytisch reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und Methanol wurde abdestilliert und der Rückstand wurde unter Verwendung von Sephadex G-25 (Eluiermittel: 50%ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (Eluiermittel: 1/1000 N Salzsäure) gereinigt, wobei man 18 mg H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg- Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid D bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,38

Elementaranalyse für C₁₀₄H₁₆₉N₃₂O₃₁ · 2 CH₃COOH · 5 H₂O

Berechnet (%):C 50,40, H 7,32, N 17,41 Gefunden (%):C 50,72, H 7,67, N 17,03

[a]: -77,88 (C = 0,22, 1M Essigsäure)

Herstellungsbeispiel B (1) Herstellung von Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-OBzl

4,18 g H-Glu(OBzl)-OBzl-Tos wurden in 30 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und dazu wurden 1,21 ml Triethylamin (TEA) gegeben und die Mischung wurde unter Kühlen gerührt. Weiterhin wurden 4,35 g Z-LysTos)-OH in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,98 ml N-Methylmorpholin zugegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und unter Rühren wurden tropfenweise 1,27 ml Isobutylchloroformiat zugegeben. 30 Sekunden nach der Zugabe wurde die oben hergestellte gekühlte DMF-Lösung zugegeben und diese Mischung wurde 5 Minuten bei 0°C, 1 Minute auf einem 40°C warmem Wasserbad und 30 Minuten bei 15°C gerührt. THF und DMF wurden unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer ungesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und dann einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 5,37 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,96
Rf^II: 0,90

Elementaranalyse für C₄₀H₄₅N₃O₉S

Berechnet (%):C 64,59, H 6,10, N 5,65 Gefunden (%):C 64,13, H 5,95, N 5,63

(2a) Herstellung von H-Lys(Tos)-Glu-OH

5,21 g Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-Obzl wurden in einer Mischung aus 80 ml Methanol mit 20 ml einer 10%igen Essigsäure gelöst und eine geringe Menge an Palladiumschwarz wurde dazugegeben und dann wurde über Nacht unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert, wobei einen Rückstand erhielt. Zu diesem Rückstand wurde Wasser gegeben und dann wurde lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,29
Rf^II: 0,52

(2b) Herstellung von Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

2,13 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 20 ml DMF gelöst und dazu wurden 4,20 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu werden unter Rühren 1,13 ml Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurde zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches tropfenweise eine Lösung aus 3,53 ml Triethylamin in 1,20 ml DMF gegeben. Die das Azid enthaltende Mischung wurde zu einer kalten DMF-Lösung von H-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten gemäß Stufe (2a), zusammen mit 1,96 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde bei -10 bis -15°C 2 Stunden und dann 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit 1N Zitronensäure und mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Ethylacetat wurde unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umrkristallisiert, wobei man 4,14 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,64
Rf^II: 0,65

Elementaranalyse für C₂₉H₃₈N₄O₁₁S · 1/2 H₂O

Berechnet (%):C 52,80, H 5,96, N 8,49 Gefunden (%):C 52,87, H 5,69, N 8,46

(3a) Herstellung von H-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

4,03 g Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 60 ml Methanol mit 40 ml 10%iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde über Nacht und unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Vakuumfiltration entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,23
Rf^II: 0,48

(3b) Herstellung von Z-Arg(NO₂)-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Das gemäß voriger Stufe (3a) erhaltene H-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden unter Rühren und Kühlen 1,74 ml Triethylamin gegeben. Weiterhin wurden 2,41 g Z-Arg(NO₂)-OH in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden 0,70 ml N-Methylmorpholin gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dann gab man unter Rühren 0,86 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 30 Sekunden nach der Zugabe wurde die oben erwähnte Kaliumdimethylformamidlösung zugegeben und die ganze Mischung wurde 5 Minuten bei 0°C und dann 30 Minuten bei 15°C gerührt. Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurden unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 2% Essigsäure enthaltendem Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde fünfmal mit 2% Essigsäure enthaltendem n-Butanol extrahiert und dann unter vermindertem Druck destilliert, wobei die Essigsäure entfernt und durch Wasser ersetzt wurde und anschließend wurde Wasser durch Methanol ersetzt. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat- Methanol umkristallisiert, wobei man 4,09 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,42
Rf^II: 0,65

Elementaranalyse für C₃₅H₄₉N₉O₁₄S · 1/2 H₂O)

Berechnet (%):C 48,83, H 5,85, N 14,64 Gefunden (%):C 49,22, H 6,05, N 14,11

(4) Herstellung von Z-Ser-Leu-NHNH₂

2,54 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 5,00 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 1,34 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurde tropfenweise eine kalte Lösung von 1,40 ml Dimethylformamid mit 4,20 ml Triethylamin in geringen Mengen zugegeben, um die Reaktionsmischung zu neutralisieren. Das Reaktionsgemisch, enthaltend das Azid, wurde zu 15 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 1,96 g H-Leu-OC₂ · H₅ · HCl und 1,40 ml Triethylamin, gegeben und die ganze Mischung wurde bei -10 bis -15°C während 2 Stunden und dann bei 4°C während 20 Stunden gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid, einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumhydrogenkarbonat und einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann wurde Ethylacetat durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Petrolether gewaschen und dekantiert. Die ölige Substanz wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet und das trockene Produkt wurde in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurde unter Eiskühlung 100%iges Hydrazinmonohydrat gegeben und das Reaktionsprodukt ließ man dann 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und in einem Exikator getrocknet. Das trockene Produkt wurde mit Wasser zur Entfernung des Überschusses an Hydrazinmonohydrat und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,68 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,73
Rf^II: 0,76

Elementaranalyse für C₁₇H₂₆N₄O₅

Berechnet (%):C 55,73, H 7,15, N 15,29 Gefunden (%):C 55,72, H 7,01, N 15,42

(5a) Herstellung von H-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

2,00 g Z-Arg(NO₂)-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml einer 50%igen Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine geringe Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde die Mischung 36 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Filtrieren im Vakuum entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert. 18 Stunden nach der Lyophilisierung wurde das lyophilisierte Produkt in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung wurde nochmals unter Erhalt des gewünschten Produktes lyophilisiert.

Rf^I: 0,05
Rf^II: 0,41

(5b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

1,03 g Z-Ser-Leu-NHNH₂ wurden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 1,41 mg 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden 0,38 ml Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurde eine kalte Lösung aus 0,40 ml Dimethylformamid mit 1,18 ml Triethylamin tropfenweise zugegeben, um das Reaktionsgemisch zu neutralisieren. Das das Azid enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 10 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (5a), sowie 0,66 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und dann 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und die Methanolschicht wurde fünfmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,92 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,33
Rf^II: 0,69

Elementaranalyse für C₄₄H₆₆N₁₀O₁₅S · 2 H₂O

Berechnet (%):C 50,66, H 6,76, N 13,43 Gefunden (%):C 50,57, H 6,51, N 13,34

(6a) Herstellung von H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH

1,84 g Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol und 30 ml 10%iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 13 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,09
Rf^II: 0,53

(6b) Herstellung von Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg- Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

H-Ser-Seu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (6a), wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden unter Eiskühlung 0,51 ml Triethylamin gegeben. Anschließend gab man 0,95 g Boc-Glu(OBzl)-ONHS hinzu und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert und die Butanolschicht wurde fünfmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser gewaschen. Die Butanolschicht wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,70 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,42
Rf^II: 0,60

Elementaranalyse für C₅₃H₈₁N₁₁O₁₈S · 2 H₂O

Berechnet (%):C 51,82, H 6,97, N 12,55 Gefunden (%):C 51,27, H 6,58, N 12,47

(7a) Herstellung von Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser- Lys(Tos)-Glu-OH

150 mg Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in einer Mischung aus 30 ml Methanol mit 30 ml 10%iger Essigsäure gelöst und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und dann wurde unter Einleitung von Wasserstoffgas 18 Stunden gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(7b) Herstellung von H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH

Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten in Stufe (7a), wurde in Tetrahydrofuran gelöst und die Lösung ließ man 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann wurden 30 ml wasserfreier Ether zugegeben und der gebildete Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann wurde der Niederschlag unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Kaliumhydroxid-Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(7c) Herstellung von H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys- Glu-OH

Das in Stufe (7b) erhaltene H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser- Lys(Tos)-Glu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dann wurden zu der Lösung unter Rühren kleine Stücke an metallischem Natrium gegeben, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und diese Bedingungen wurden 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten. Zum Reaktionsgemisch wurden Kristalle von NH₄Cl gegeben und der Überschuß an metallischem Natrium wurde neutralisiert, nachdem man das 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002003211263 00004 99880Ammoniak vollständig durch Destillation bei Raumtemperatur entfernt hatte. Das Reaktionsprodukt wurde mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 50%iger Essigsäure als Eluiermittel gelfiltriert, wobei man 58 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid E bezeichnet.

Rf^I: 0,04
Rf^II: 0,34

Elementaranalyse für C₃₄H₆₁N₁₁O₁₄ · C₂H₄O₂ · 3 H₂O

Berechnet (%):C 44,95, H 7,44, N 16,02 Gefunden (%):C 45,05, H 7,11, N 15,84

(8a) Herstellung von H-Gln-NHNHBoc

16,00 g Z-Gln-NHNHBoc wurden in 100 ml Methanol suspendiert und eine kleine Menge an Palladiumschwarz wurde dazugegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,37
Rf^II: 0,58

(8b) Herstellung von Z-Leu-Gln-NHNHBoc

Das in Stufe (8a) erhaltene H-Gln-NHNHBoc wurde in 50 ml Tetrahydrofuran gelöst und dazu wurden unter Eiskühlung 5,51 g Z-Leu-ONHS gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und dann wieder mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde durch Destillieren entfernt. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und die erhaltene Festsubstanz wurde aus Methanol-Ethylether umkristallisiert, wobei man 6,04 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,81
Rf^II: 0,86

Elementaranalyse für C₂₄H₃₇N₅O₇

Berechnet (%):C 56,79, H 7,35, N 13,80 Gefunden (%):C 56,67, H 7,15, N 13,75

(9a) Herstellung von H-Leu-Gln-NHNHBoc

2,79 g Z-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge an Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 32 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

Rf^I: 0,33
Rf^II: 0,64

(9b) Herstellung von Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

H-Leu-Gln-NHNHBoc, erhalten in der obigen Stufe (9a), wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung wurde unter Rühren gekühlt. Weiterhin wurden 1,61 g Z-Asn-OH in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,62 ml N-Methylmorpholin gegeben und dann kühlte man auf -15°C und gab unter Rühren 0,80 ml Isobutylchloroformiat tropfenweise zu. 30 Sekunden nach Zugabe von Isobutylchloroformiat wurde die zuvor hergestellte Lösung von H-Leu-Gln-NHNHBoc zugegeben und die gesamte Mischung wurde dann 5 Minuten bei 0°C, 1 Minute bei 40°C auf dem Wasserbad und weitere 30 Minuten bei 15°C gerührt. Vom Reaktionsgemisch wurde Tetrahydrofuran und Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert. Das Extrakt wurde mit 1N Zitronensäure, einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung und wieder mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung in der genannten Reihenfolge gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der ölige Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Methanol- Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,55 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,63
Rf^II: 0,77

Elementaranalyse für C₂₈H₄₃N₇O₉

Berechnet (%):C 53,10, H 6,97, N 15,77 Gefunden (%):C 53,67, H 6,63, N 15,68

(10a) Herstellung von Z-Thr-ONHS

1,28 g Z-Thr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,58 g N-Hydroxysuccinimid (NHS) gegeben und die Mischung wurde eisgekühlt und dazu wurden 1,05 g N,N-Dicyclohexylcarboddimid (DCC) gegeben. Die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt und der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert, und zu dem dabei erhaltenen Rückstand wurde Ethylether gegeben und dann wurde durch Dekantieren gewaschen. Die erhaltene ölige Substanz wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator unter Erhalt des gewünschten Produktes getrocknet.

(10b) Herstellung von H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

2,43 g Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 80 ml Methanol suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,31
Rf^II: 0,64

(10c) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc

Das in Stufe (10b) erhaltene H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurde in 30 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 20 ml einer Dimethylformamidlösung von Z-Thr-ONHS, erhalten in Stufe (10a) unter Eiskühlung gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von 1N Zitronensäure verfestigt und dann aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,12 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,82
Rf^II: 0,79

Elementaranalyse für C₃₂H₅₀N₈O₁₁

Berechnet (%):C 53,18, H 6,97, N 15,50 Gefunden (%):C 52,85, H 6,95, N 15,28

(11a) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNH₂

0,91 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc wurden in 8 ml TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch Filtrieren gesammelt und mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydroxid- Phosphorpentoxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,34

(11b) Herstellung von H-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser- Lys(Tos)-Glu-OH

1,00 g Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in 8 ml TFA gelöst und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 80 ml wasserfreier Ether gegeben und der gebildete Niederschlag wurde schnell durch Filtrieren gesammelt, mit wasserfreiem Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck in einem Kaliumhydroxid-Phosphorpentoxid enthaltenden Exikator getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,24
Rf^II: 0,44

(11c) Herstellung von Z-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu(OBzl)- Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Das in Stufe (11a) erhaltene Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNH₂ wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und dazu wurden 0,63 ml 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurde unter Rühren Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest ergab, wurden 0,53 ml Triethylamin mit 0,40 ml einer kalten Dimethylformamidlösung tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die die Azidverbindung enthaltende Lösung wurde zu 10 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Glu(OBzl)-Ser-Leu- Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH, erhalten gemäß Stufe (11b) und 0,24 ml Triethylamin gegeben und die gesamte Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und dann 18 Stunden bei 4°C unter Rühren umgesetzt. Dann wurde ähnlich wie beim Verfahren in der Stufe (11a) das Produkt das erhalten worden war durch Behandeln von 1,16 g Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc mit TFA, zu dem vorerwähnten Reaktionsprodukt gegeben und unter Rühren bei den gleichen Temperaturbedingungen 24 Stunden umgesetzt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol fünfmal gewaschen und dann wurde das Extrakt unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert und der Niederschlag wurde mit heißem Methanol unter Erhalt des gewünschten Produktes gewaschen.

(11d) Herstellung von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

Z-Thr-As-Leu-Gln-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH, erhalten in Stufe (11c), wurde in einer Mischung aus 50 ml Methanol und 50 ml 30%iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann rührte man 18 Stunden unter Einleitung von Wasserstoffgas. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und nachdem das Methanol vollständig abdestilliert war, wurde die konzentrierte Flüssigkeit einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 und von 50%iger Essigsäure als Eluierungsmittel behandelt, wobei man durch Sammeln der gewünschten Fraktion 740 mg der obigen Verbindung erhielt.

Rf^I: 0,17
Rf^II: 0,35

Elementaranalyse für C₆₆H₉₉N₁₇O₂₃ · C₂H₂O₂ · 2 H₂O

Berechnet (%):C 48,91, H 7,08, N 15,64 Gefunden (%):C 48,82, H 6,63, N 15,74

(12) Herstellung von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

51,0 mg H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor über metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu werden kleine Stücke an metallischem Natrium unter Rühren gegeben, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und diese Farbe 30 Sekunden bis 1 Minute beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH₄Cl zum Reaktionsgemisch gegeben und der Überschuß an metallischem Natrium neutralisiert. Nachdem der Ammoniak vollständig bei Raumtemperatur abdestilliert worden war, wurde das Reaktionsprodukt über Sephadex G-25-Gel einer Gelfiltration unterworfen, unter Verwendung von 50%iger Essigsäure als Eluiermittel und die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und dann wurde die Fraktion durch Zugabe von Wasser nach dem Konzentrieren lyophilisiert, wobei man 32 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemäßes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid F bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,37

Elementaranalyse für C₅₃H₉₃N₁₇O₂₁ · C₂H₄O · 3 H₂O

Berechnet (%):C 46,57, H 7,32, N 16,79 Gefunden (%):C 46,10, H 6,98, N 16,82

(13) Herstellung von Z-Leu-Ser-OCH₃

1,81 g H-Ser-OCH₃ · HCl wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 1,62 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde auf -10°C gekühlt. Zu dem Gemisch wurden unter Rühren 4,21 g Z-Leu-ONHS gegeben und dann wurde die Mischung 18 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend wurde Ethylacetat unter vermindertem Druck abdestilliert.

Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 2,68 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,81
Rf^II: 0,82

Elementaranalyse für C₁₈H₂₆N₂O₆

Berechnet (%):C 59,00, H 7,15, N 7,65 Gefunden (%):C 58,62, H 7,03, N 7,65

(14a) Herstellung von H-Leu-Ser-OCH₃ · HCl

4,20 g Z-Leu-Ser-OCH₃ wurden in einer Mischung aus 40 ml Methanol mit 11,46 ml 1N Salzsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und dann wurde 18 Stunden unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und abermals unter vermindertem Druck destilliert und dies wurde dreimal wiederholt. Der erhaltene Rückstand wurde unter vermindertem Druck in einem Exikator, enthaltend Phosphorpentoxid als Trocknungsmittel, getrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,38

(14b) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-OCH₃

3,19 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung wurden 6,30 ml 6N Salzsäure/ Dioxan gegeben und es wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 1,69 ml Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazintest anzeigte, wurden 1,76 ml einer kalten Dimethylformamidlösung mit 5,29 ml Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben. Das das Azidprodukt enthaltende Reaktionsgemisch wurde zu 20 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend H-Leu-Ser-OCH₃ · HCl, erhalten in der obigen Stufe (14a), und 1,60 ml Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und dann weitere 18 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und aus Methanol- Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 4,11 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,76
Rf^II: 0,79

Elementaranalyse für C₂₁H₃₁N₃O₈

Berechnet (%):C 55,62, H 6,89, N 9,27 Gefunden (%):C 55,48, H 6,92, N 9,18

(15) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-NHNH₂

2,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCH₂ wurden in 40 ml Methanol gelöst und dazu wurden 1,10 ml 100%-NH₂NH₂ · H₂O unter Eiskühlung gegeben und die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether verfestigt und der Überschuß an NH₂NH₂ · H₂O wurde entfernt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Wasser verfestigt und dann aus Methanol- Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 1,91 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,43
Rf^II: 0,73

Elementaranalyse für C₂₀H₃₁N₅O₇

Berechnet (%):C 52,97, H 6,89, N 15,44 Gefunden (%):C 52,85, H 6,70, N 15,44

(16a) Herstellung von Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu- Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

70,42 mg Z-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,78 ml einer 10fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N Salzsäure/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden 0,20 ml einer 10fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit unter Rühren gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest ergab, wurden 0,65 ml einer 10fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in geringen Mengen zum Neutralisieren der Reaktionsmischung zugegeben. Die das Azidprodukt enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 5 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 151 mg von H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)- Glu-OH und 0,29 ml einer 10fach verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde dann 2 Stunden bei -10 bis -15°C und weitere 18 Stunden bei 4°C gerührt. Dann wurden 117,36 mg Z-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ zugegeben und 24 Stunden umgesetzt.

Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der erhaltene Rückstand wurde mit mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit mit n-Butanol gesättigtem Wasser und weitere fünfmal mit 2%iger Essigsäure, die mit n-Butanol gesättigt war, gewaschen und das Extrakt wurde unter vermindertem Druck destilliert und der erhaltene Rückstand wurde zu Wasser gegeben und unter vermindertem Druck destilliert. Nachdem n-Butanol vollständig abdestilliert war, wurde das Produkt lyophilisiert und das lyophilisierte Produkt wurde aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(16b) Herstellung von H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu- Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

150 mg Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg- Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurden in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Stücke von metallischem Natrium gegeben und die Lösung wurde gerührt, bis sich die Farbe der Reaktionsmischung nach blau verfärbte und die Färbung 30 Sekunden bis 1 Minute beibehalten wurde. Dann wurden Kristalle von NH₄Cl zu der Reaktionsmischung gegeben und das überschüssige metallische Natrium wurde neutralisiert. Nachdem man den Ammoniak vollständig durch Abdestillieren bei Raumtemperatur entfernt hatte, wurde das Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 25%iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen und die gewünschte Fraktion wurde gesammelt und nach Zugabe von Wasser konzentriert und lyophilisiert, wobei man 94 mg des gewünschten Produktes (erfindungsgemäßes Peptid) erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid G bezeichnet.

Rf^I: 0,02
Rf^II: 0,39

Elementaranalyse für C₆₅H₁₂₀N₂₀O₂₆ · C₂H₄O₂ · H₂O

Berechnet (%):C 48,19, H 7,24, N 16,78 Gefunden (%):C 47,93, H 6,93, N 16,49

(17a) Herstellung von Z-Tyr-OSu

1,04 g Z-Tyr-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,38 g N-Hydroxysuccinimid gegeben und die Reaktionsmischung wurde ausgekühlt. Dazu wurden unter Eiskühlung 0,68 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei 4°C gerührt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Absaugen entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck destilliert und zu dem Rückstand wurde Ethylether und Petrolether gegeben und dann dekantiert und das erhaltene Produkt wurde dann getrocknet.

(17b) Herstellung von H-Ser-Leu-Ser-OCH₃

1,00 g Z-Ser-Leu-Ser-OCH₃, erhalten in der obigen Stufe (14b), wurde in 20 ml Methanol mit 20 ml 10%iger Essigsäure suspendiert und dazu wurde eine kleine Menge Palladiumschwarz gegeben und die Suspension wurde 15 Stunden unter Einleiten von Wasserstoffgas gerührt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abgesaugt und das Filtrat unter vermindertem Druck destilliert und zum Rückstand wurde Wasser gegeben und lyophilisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

Rf^I: 0,35
Rf^II: 0,65

(17c) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH₃

H-Ser-Leu-Ser-OCH₃, das gemäß der vorhergehenden Stufe (17b) erhalten worden war, wurde in 10 ml Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,31 ml Triethylamin zugegeben. Zu dieser Mischung wurde eine kalte Dimethylformamidlösung von Z-Tyr-OSu, erhalten gemäß Stufe (17a), unter Rühren gegeben. Die gesamte Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde Dimethylformamid unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zugabe von Wasser verfestigt, aus Methanol-Ester umkristallisiert, nochmals aus Methanol-Ethylacetat, wobei man 1,08 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,78
Rf^II: 0,82

Elementaranalyse für C₃₀H₄₀N₄O₁₀

Berechnet (%):C 58,43, H 6,54, N 9,09 Gefunden (%):C 58,14, H 6,58, N 9,16

(17d) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH₂

1,00 g Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH₃ wurden in Methanol gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,82 ml 100%iges NH₂NH₂ · H₂O dazugegeben und die Mischung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Methanol wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Ethylether verfestigt und dann mit Wasser gewaschen um den Überschuß an NH₂NH₂ · H₂O zu entfernen und aus Methanol-Ether umkristallisiert und mit heißem Methanol gewaschen, wobei man 0,81 g des gewünschten Produktes erhielt.

Rf^I: 0,45
Rf^II: 0,76

Elementaranalyse für C₂₉H₄₀N₆O₉

Berechnet (%):C 56,48, H 6,54, N 13,63 Gefunden (%):C 56,12, H 6,57, N 13,58

(18a) Herstellung von Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn- Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH

42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Dazu wurden 0,34 ml einer 10fach verdünnten Dimethylformamidlösung von 6N HCl/Dioxan gegeben und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und unter Rühren wurden dazu 0,09 ml einer auf das 10fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Isoamylnitrit gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung einen negativen Hydrazidtest zeigte, wurden 0,29 ml einer auf das 10fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin tropfenweise in kleinen Mengen zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches zugegeben. Die das Azidprodukt enthaltende Reaktionsmischung wurde zu 4 ml einer kalten Dimethylformamidlösung, enthaltend 50,0 mg H-Thr- Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH sowie 0,10 ml einer um das 10fache verdünnten Dimethylformamidlösung von Triethylamin gegeben und die ganze Mischung wurde 2 Stunden bei -10 bis -15°C und anschließend 18 Stunden bei 4°C gerührt. Dazu wurden 42,3 mg Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH₂ in Form des Azides gegeben und die Umsetzung wurde 24 h durchgeführt. Dimethylformamid wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde mit 30 ml n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, extrahiert und das Extrakt wurde zehnmal mit Wasser, das mit n-Butanol gesättigt war, gewaschen und anschließend fünfmal mit 2%iger Essigsäure die mit n-Butanol gesättigt war. Die organischen Schichten wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Entfernung von n-Butanol destilliert und der Rückstand wurde lyophilisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt erhielt.

(18b) Herstellung von H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn- Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH

Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg- Ser-Lys(Tos)-Glu-OH wurde in flüssigem Ammoniak, der zuvor mit metallischem Natrium getrocknet worden war, gelöst und dazu wurden kleine Natriummetallstücke unter Rühren gegeben, bis die Farbe der Reaktionsmischung sich nach blau veränderte und 30 Sekunden bis 1 Minute diese Farbe beibehielt. Dann wurden Kristalle von NH₄Cl zum Reaktionsgemisch gegeben und das überschüssige metallische Natrium neutralisiert und nachdem der Ammoniak vollständig bei Raumtemperatur abdestilliert worden war, wurde das erhaltene Reaktionsprodukt einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-Gel unter Verwendung von 50%iger Essigsäure als Eluiermittel unterworfen, wobei man 33 mg des gewünschten Produktes erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid H bezeichnet.

Rf^I: 0,02
Rf^II: 0,35

Elementaranalyse für C₇₄H₁₂₃N₂₁O₂₈ · C₂H₄O₂ · 4H₂O

Berechnet (%):C 47,71, H 7,30, N 15,79 Gefunden (%):C 47,32, H 7,24, N 15,82

Herstellungsbeispiel C Referenzbeispiel 1 Herstellung von Z-Ser-Ser-OMe

5,06 g Z-Ser-NHNH₂ wurden in 50 ml Dimethylformamid zusammen mit 6,66 ml 6N Salzsäure/Dioxan gelöst und die Lösung wurde auf -15°C gekühlt. Dazu wurden 2,68 ml Isoamylnitrit gegeben und die Mischung wurde 5 Minuten gerührt. Anschließend wurden zum Neutralisieren des Reaktionsgemisches 5,60 ml Triethylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zu 30 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 3,11 g H-Ser-OMe · HCl und 2,80 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Ethylacetats wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Ethylacetat-Ether umkristallisiert, wobei man 3,75 g Z-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf^I: 0,64
Rf^II: 0,77

Elementaranalyse für C₁₅H₂₀N₂O₇

Berechnet (%):C 52,94, H 5,92, N 8,23 Gefunden (%):C 52,67, H 5,89, N 8,35

Referenzbeispiel 2 Herstellung von Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe

2,5 g Z-Ser-Ser-OMe wurden in 50 ml Methanol zusammen mit 7,34 ml 1N Salzsäure gelöst und dann wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck bei 20°C eine katalytische Reduktion durchgeführt, unter Erhalt von H-Ser-Ser-OMe · HCl.

Rf^I: 0,08

3,39 g Z-Arg(Tos)-OH wurden in 40 ml Tetrahydrofuran und 0,75 ml N-Methylmorpholin gelöst und die Mischung wurde auf -15°C gekühlt und dazu wurden unter kräftigem Rühren während 30 Sekunden 0,97 ml Isobutylchloroformiat gegeben.

Das wie oben erhaltene H-Ser-Ser-OMe · HCl, 20 ml Dimethylformamid und 1,03 ml Triethylamin wurden zugegeben und gerührt, dann wurde 5 Minuten bei 0°C und weitere 2 Minuten bei 40°C und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Ethylacetat extrahiert und das Extrakt wurde dreimal mit 1N Zitronensäure und anschließend fünfmal mit Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,65 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe erhielt.

Rf^I: 0,51
Rf^II: 0,73

Elementaranalyse für C₂₈H₃₈N₆O₁₀S

Berechnet (%):C 51,68, H 5,88, N 12,91 Gefunden (%):C 51,62, H 5,82, N 12,73

Referenzbeispiel 3 Herstellung von Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

3,5 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe wurden in 50 ml Methanol gelöst und dazu wurden 10 ml Wasser und 8,06 ml 1N Natriumhydroxid gegeben und die Mischung wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Zum Neutralisieren der Reaktionsmischung wurden 7,24 ml 1N HCl zugegeben und dann wurde Methanol abdestilliert und der Rückstand mit n-Butanol extrahiert. Das Extrakt wurde mit Wasser gewaschen und nach dem Abdestillieren von n-Butanol und Wasser wurde der Rückstand durch Zugabe von Ether kristallisiert und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 2,60 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,28
Rf^II: 0,57

Elementaranalyse für C₂₇H₃₆N₆O₁₀S · 1/2H₂O

Berechnet (%):C 50,22, H 5,77, N 13,02 Gefunden (%):C 50,24, H 5,62, N 13,20

Referenzbeispiel 4 Herstellung von H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

1,35 g Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in 50 ml Methanol und 10 ml 10%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde katalytisch in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz unter 1 Atm Wasserstoffdruck reduziert, wobei man H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,034

Referenzbeispiel 5 Herstellung von Z-Asn-Leu-OEt

5,32 g Z-Asn-OH wurden in 60 ml Tetrahydrofuran, 10 ml Dimethylformamid und 2,04 ml N-Methylmorpholin gelöst und dazu wurden 40 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 2,64 ml Isobutylchloroformiat, 3,91 g H-Leu- OEt · HCl und 2,80 ml Triethylamin gegeben und die Mischung wurde in ähnlicher Weise, wie dies in Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde zu dem Rückstand 1M Zitronensäure gegeben und der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet und aus Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 6,1 g Z-Asn-Leu-OEt erhielt.

Rf^I: 0,71
Rf^II: 0,80

Elementaranalyse für C₂₀H₂₉N₃O₆

Berechnet (%):C 58,95, H 7,17, N 10,31 Gefunden (%):C 58,99, H 7,23, N 10,26

Referenzbeispiel 6 Herstellung von Z-Tyr-Asn-Leu-OEt

3,01 g Z-Asn-Leu-OEt wurden in 50 ml Methanol und 7,4 ml 1N HCl gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladiumschwarz bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck reduziert, wobei man H-Asn-Leu-OEt · HCl erhielt.

Rf^I: 0,26

Das so erhaltene H-Asn-Leu-OEt · HCl wurde in 50 ml Dimethylformamid und 1,03 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 3,35 g Z-Tyr-ONHS gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde zu dem Rückstand eine wäßrige 1M Zitronensäurelösung gegeben und der Niederschlag wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und aus Methanol-Ethylacetat umkristallisiert, wobei man 3,58 g Z-Tyr-Asn-Leu-OEt erhielt.

Rf^I: 0,73
Rf^II: 0,82

Elementaranalyse für C₂₉H₃₈N₄O₈

Berechnet (%):C 61,04, H 6,71, N 9,82 Gefunden (%):C 60,84, H 6,70, N 9,39

Referenzbeispiel 7 Herstellung von Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH₂

2,78 g Z-Tyr-Asn-Leu-OEt wurden in 30 ml Methanol gelöst und dazu wurden 1,21 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert und mit einer kleinen Menge Methanol gewaschen, wobei man 3,10 g Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH₂ erhielt.

Rf^I: 0,56
Rf^II: 0,75

Elementaranalyse für C₂₇H₃₆N₆O₇

Berechnet (%):C 58,26, H 6,52, N 15,10 Gefunden (%):C 57,91, H 6,65, N 15,12

Beispiel 1 (a) Herstellung von Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser- Ser-OH

0,84 g Boc-Leu-Gln-OH wurden in 30 ml Tetrahydrofuran und 0,24 ml N-Methylmorpholin gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,31 ml Isobutylchloroformiat und H-Arg(Tos)- Ser-Ser-OH, erhalten gemäß Referenzbeispiel 4, gegeben und die Mischung wurde dann in ähnlicher Weise wie dies beim Referenzbeispiel 2 beschrieben wurde, umgesetzt. Nach dem Abdestillieren von Tetrahydrofuran und Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wurde mit 20%iger Essigsäure gewaschen und dann wurde Butanol abdestilliert. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Ethylacetat erhielt man 1,54 g Boc-Leu-Glb-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.

Rf^I: 0,18
Rf^II: 0,57

Elementaranalyse für C₃₅H₅₇N₉O₁₃S · H₂O

Berechnet (%):C 48,77, H 6,90, N 14,62 Gefunden (%):C 48,76, H 6,61, N 14,78

(b) Herstellung von H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

1,50 g Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur zur Entfernung der t-Butoxycarbonylgruppe behandelt und trockener Ether wurde zum Reaktionsgemisch zum Kristallisieren des Produktes zugegeben, wobei man H-Leu-Gln-Arg(Tos)- Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,04

H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten wie oben, wurde in 25 ml flüssigem Ammoniak gelöst und dazu wurden kleine metallische Natriumstücke gegeben. Dabei veränderte sich die Farbe der Mischung nach blau. Zu dieser Mischung wurde 1 g trockenes Ammoniumchlorid gegeben und dann wurde der Ammoniak abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50%iger Essigsäure gelöst und diese Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-10 (2,2 × 85 cm, Eluiermittel: 50%ige Essigsäure) und weiter mit LH-20 (2,2 × 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man ein reines H-Leu-Gln-Arg- Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid I bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,34

[ α ]: -42,5° (C = 0,230, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für C₂₃H₄₃N₉O₉ · 4H₂O · CH₃COOH

Berechnet (%):C 41,60, H 7,68, N 17,46 Gefunden (%):C 41,20, H 7,93, N 17,91

Beispiel 2 (a) Herstellung von Z-Phe-Le-Gln-Arg(Tos)-Ser- Ser-OH

H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäß Beispiel 1, wurde in 30 ml Dimethylformamid und 0,24 ml Triethylamin gelöst und dazu wurden 0,77 g Z-Phe-ONHS gegeben und die Mischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abdestillieren von Dimethylformamid wurde der Rückstand mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%iger Essigsäure extrahiert. Die Butanolschicht wurde konzentriert und das Konzentrat wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert und die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heißem Ethanol gewaschen, wobei man 1,40 g Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,22
Rf^II: 0,59

Elementaranalyse für C₄₇H₆₄N₁₀O₁₄S · H₂O

Berechnet (%):C 54,12, H 6,28, N 13,43 Gefunden (%):C 54,42, H 6,38, N 13,84

(b) Herstellung von H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

20 mg Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak zur Entfernung einer Gruppe der Formel Z und einer Gruppe der Formel (Tos) in ähnlicher Weise, wie dies in Beispiel 1 (b) beschrieben wurde, behandelt und die Reaktionsmischung wurde dann einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 × 85 cm, Eluiermittel: 10%ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 × 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 12 mg eines gereinigten Produktes von H-Phe-Leu-Gln- Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid J bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,35

[ α ]: -37,3° (C = 0,249, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für C₃₂H₅₂N₁₀O₁₀ · 7H₂O · CH₃COOH

Berechnet (%):C 44,24, H 7,64, N 15,17 Gefunden (%):C 44,27, H 7,10, N 15,60

Beispiel 3 (a) Herstellung von Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)- Ser-Ser-OH

0,39 g Z-Leu-Gly-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,58 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 eine Umsetzung durchgeführt, unter Verwendung von 10 ml einer Dimethylformamidlösung, enthaltend 0,15 ml Isoamylnitrit, 0,49 ml Triethylamin und 1,00 g H-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser- OH. Dann wurde zu dem Reaktionsgemisch eine äquivalente Menge von Z-Leu-GlyN₃ gegeben und die Umsetzung wurde 20 Stunden bei 4°C durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit Methanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%iger Essigsäure und dann mit Butanol gewaschen und die Essigsäure wurde abdestilliert und der Rückstand wurde aus Ether kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit heißem Methanol gewaschen, wobei man 0,65 g Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)- Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,19
Rf^II: 0,60

Elementaranalyse für C₅₅H₇₈N₁₂O₁₆S · H₂O

Berechnet (%):C 54,44, H 6,64, N 13,85 Gefunden (%):C 54,74, H 6,66, N 13,98

(b) Herstellung von H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg- Ser-Ser-OH

20 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben zur Entfernung einer Gruppe der Formel Z und einer Gruppe der Formel Tos behandelt und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 × 85 cm, Eluiermittel: 10%ige Essigsäure) und dann unter Verwendung von LH-20 (2,2 × 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 11 mg H-Leu- Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid K bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,40

[ a ]: -27,6° (C = 0,228, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für C₄₀H₆₆N₁₂O₁₂ · 6H₂O · CH₃COOH

Berechnet (%):C 46,92, H 7,68, N 15,63 Gefunden (%):C 46,89, H 7,25, N 15,51

Beispiel 4 (a) Herstellung von H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

600 mg Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurden in 50 mg Methanol und 10 mg 10%iger Essigsäure gelöst und die Mischung wurde in Gegenwart von 500 mg Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck reduziert, wobei man H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser- Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,18

420 mg Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,37 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,10 ml Isoamylnitrit und 0,31 ml Triethylamin ein Azidprodukt in ähnlicher Weise hergestellt wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Mischung von 10 ml Hexamethylphosphortriamid und H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln- Arg(Tos)-Ser-Ser-OH in 10 ml Dimethylformamid gegeben und die gesamte Mischung wurde 20 Stunden bei 4°C gerührt. Dimethylformamid wurde abdestilliert und der Rückstand wurde mit Butanol extrahiert und das Extrakt wurde mit 2%iger Essigsäure gewaschen und Butanol abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Ether kristallisiert. Das so erhaltene Z-Tyr-Asn-Leu- Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH wurde in 30 ml Methanol und 10 ml 10%iger Essigsäure gelöst und die Lösung wurde in Gegenwart von Palladium bei Raumtemperatur unter Atmosphärendruck einer katalytischen Reduktion unterworfen und das Reaktionsgemisch dann unter Verwendung von Sephadex G-25 (3 × 120 cm, Eluiermittel: 50%ige Essigsäure) einer Gelfiltration unterworfen, wobei man 650 mg H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln- Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

Rf^I: 0,05
Rf^II: 0,53

Elementaranalyse für C₆₆H₉₈N₁₆O₁₉S · 2H₂O

Berechnet (%):C 53,28, H 6,91, N 15,06 Gefunden (%):C 53,10, H 6,43, N 14,84

(b) Herstellung von H-Tyr-Asn-Leu-Gly-Phe-Leu- Gln-Arg-Ser-Ser-OH

H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, erhalten gemäß Beispiel 4 (a), wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 (2,2 × 85 cm, Eluiermittel: 10%ige Essigsäure) und unter Verwendung von LH-20 (2,2 × 80 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) unterworfen, wobei man 9 mg des gereinigten Produktes von H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid L bezeichnet.

Rf^I: 0,41
Rf^II: 0,42

[ α ]: -24,3° (C = 0,078, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für C₅₉H₉₂N₁₀O₁₇ · 15H₂O · CH₃COOH

Berechnet (%):C 45,01, H 7,80, N 13,77 Gefunden (%):C 45,21, H 7,31, N 14,22

Beispiel 5 (a) Herstellung von Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu- Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH

159 mg Z-Met-Ser-NHNH₂ wurden in 5 ml Dimethylformamid und 0,21 ml 6N HCl/Dioxan gelöst und dann wurde unter Verwendung von 0,055 ml Isoamylnitrit und 0,17 ml Triethylamin in ähnlicher Weise wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, das Azidprodukt hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde zu einer Mischung aus 300 mg H-Tyr- Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, 5 ml Dimethylformamid und 5 ml Hexamethylphosphortriamid gegeben und die ganze Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt. Dazu wurden 318 mg Z-Met-Ser-NHNH₂ gegeben und dann wurde 72 Stunden bei 4°C gerührt. In ähnlicher Weise wie in Beispiel 4 (a) beschrieben, erfolgte dann die Reinigung, wobei man Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu- Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH erhielt.

(b) Herstellung von H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu- Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH

Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)- Ser-Ser-OH wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (b) beschrieben behandelt, um eine Gruppe der Formel Z und eine Gruppe der Formel Tos zu entfernen und dann wurde das Reaktionsgemisch unter Verwendung von Sephadex G-25 (3 × 120 cm, Eluiermittel: 50%ige Essigsäure) und weiterhin unter Verwendung von LH-20 (2 × 85 cm, Eluiermittel: 0,001N HCl) gereinigt, wobei man 119 mg H-Met- Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Peptid M bezeichnet.

Rf^I: 0,01
Rf^II: 0,45

[ α ]: -15,7° (C = 0,254, 0,001N HCl)

Elementaranalyse für C₆₇H₁₀₆N₁₈O₂₀S · 5H₂O · CH₃COOH

Berechnet (%):C 49,75, H 7,26, N 15,13 Gefunden (%):C 49,80, H 6,92, N 14,91

Aminosäurenanalyse:
Asp: 0,95, Ser: 3,15, Gln: 1,03
Met: 0,92, Gly: 1,05, Leu: 3,08
Tyr: 1,00, Phe: 0,98, Arg: 0,96

Herstellung eines markierten Peptids Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 1

H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg- Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, d. h. Peptid D, wurde unter Verwendung von Chloramin T wie folgt markiert:

Zu 20 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids D, wurden 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Mikrocurie Na(¹²⁵J) und 20 Mikroliter einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T gegeben. Die Mischung wurde 30 Sekunden bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (Na₂S₂O₅) beendet. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter kalte wäßrige, 1%ige Natriumjodidlösung gegeben und die Mischung wurde mit einer Sephadex®G-25-Säule (1,0 × 30 cm, Eluiermittel: 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 0,25% BSA, 10 mM EDTA und 0,02% NaN₃) behandelt. Man erhielt ein markiertes Peptid D, in welchem die 13. und die 14. Fraktion mit ¹²⁵J markiert war. Dies Produkt wird nachfolgend als ¹²⁵J-markiertes Peptid D bezeichnet.

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 2-1

H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser- Lys-Glu-OH, d. h. Peptid H, wurde mittels der Chloramin T- Methode wie folgt markiert.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid H), wurden 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Mikrocurie Na(¹²⁵J) und dann 20 Mikroliter 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und die Umsetzung dann durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (Na₂S₂O₅) beendet. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter einer kalten wäßrigen, 1%igen Natriumjodidlösung gegeben und die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung einer Sephadex®G-25-Säule (1,0 × 30 cm, Eluiermittel: 0,05M Phosphatpufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,25% NSA, 10 mM EDTA und 0,02% NaN₃) behandelt. Man erhielt ein Peptid H, das mit ¹²⁵J markiert war. Dieses Produkt wird nachfolgend als ¹²⁵J- markiertes Peptid H bezeichnet.

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 2-2

Zu 20 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), enthaltend 5 Mikrogramm Peptid H, wurden 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Millicurie Na(¹²⁵J) und dann 20 Mikroliter 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 70 mg/ml Chloramin T, gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Sekunden gerührt und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern 0,5M Phosphatpufferlösung, enthaltend 60 mg/ml Natriummetabisulfit (Na₂S₂O₅) beendet. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 100 Mikroliter einer kalten wäßrigen 1%igen Natriumjodidlösung gegeben und dann erfolgte eine Behandlung mit einer Sephadex® G-25-Säule (1,0 × 30 cm, Eluiermittel: 0,05M Phosphatpufferlösung, pH 7,4, enthaltend 0,25% BSA, 10 mM EDTA und 0,02% NaN₃). Man erhielt ein ¹²⁵J-markiertes Peptid H.

Herstellungsbeispiel von markiertem Peptid 3

(1) H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln- Arg-Ser-Ser-OH, d. h. Peptid M, wurde nach der Chloramin T-Methode wie folgt markiert.

.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid M) wurde eine 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Mikrocurie Na(¹²⁵J) und dann 20 Mikroliter einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 3,5 mg/ml Chloramin T, gegeben. Die Mischung wurde 20 Sekunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 2,4 mg Natriummetabisulfit, beendet. Die Reaktionsmischung wurde mit einer DEAE-Sephadex®A-25-Säule (1,0 × 30 cm, Eluiermittel: 0,1M Tris-Salzsäurepufferlösung, pH 8,6, enthaltend 0,1% BSA und 0,01% NaN₃) behandelt. Die erste Peptidfraktion wurde durch Ionenaustauschchromatografie behandelt, wobei man ¹²⁵J-markiertes Peptid erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als ¹²⁵J-markiertes Peptid M bezeichnet.

(2) H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln- Arg-Ser-Ser-OH, d. h. Peptid M, wurde mit Chloramin T wie folgt markiert.

Zu 20 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 5 Mikrogramm des vorerwähnten Peptids (Peptid M), wurde eine 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 1 Mikrocurie Na(¹²⁵J) gegeben und anschließend 20 Mikroliter einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 3,5 mg/ml Chloramin T. Die Mischung wurde 20 Sekunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 Mikrolitern einer 0,2M Phosphatpufferlösung, enthaltend 2,4 mg/ml Natriummetabisulfit beendet. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer SP-Sephadex®C-25-Säule (1,0 × 30 cm, Eluiermittel: 50 mM Phosphatpufferlösung) behandelt. Man erhält das vorerwähnte Peptid M, dessen 4. Fraktion mit ¹²⁵J markiert war. Dieses Produkt wird nachfolgend als ¹²⁵J-markiertes Peptid M bezeichnet.

Herstellung von Antigen Herstellungsbeispiel 1

1 mg Peptid A, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel A-1 für die Synthese von Peptiden, und 15 mg Rinderserumalbumin (nachfolgend als BSA bezeichnet) wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu der Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 l Wasser bei 4°C 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 18 mg Human- Interferon-α-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-N-I bezeichnet) erhielt.

Bei diesem Antigen-α-N-I handelt es sich um ein Antigen, bei dem durchschnittlich 12 Mole des Peptids A mit einem Mol BSA kombiniert sind.

Herstellungsbeispiel 2

5 mg Peptid B, das gemäß Herstellungsbeispiel A-2 bei der Synthese von Peptiden hergestellt worden war und 20 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 23 mg Human- Interferon-α-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-N-II bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-α-N-II sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids B mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 3

4,5 mg Peptid C, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1,0 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 l Wasser während 48 Stunden bei 4°C dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 27 mg Human- Interferon-α-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-N-III bezeichnet) erhielt.

Bei diesem Antigen-α-N-III sind durchschnittlich 10 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 4

5 mg Peptid D, das gemäß Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 l Wasser während 48 Stunden bei 4°C dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-α-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-N-IV bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 5

4,5 mg Peptid C, das gemäß Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 27,5 mg Human-Interferon- α-Antigen (nachfolgend als Antigen-a-N-V bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen sind durchschnittlich 12 Mole des Peptids C mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 6

4,5 mg Peptid D, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel A-4 bei der Synthese der Peptide, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 l Wasser 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Dabei wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthaltende dialysierte Lösung wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Human-Interferon-a-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-N-VI bezeichnet) erhielt.

In dem Antigen-α-N-VI sind durchschnittlich 9 Mole des Peptids D mit 1 Mol BSA vereint.

Herstellungsbeispiel 7

5 mg Peptid E, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel B-7c bei der Synthese der Peptide und 15 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und dabei das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid- Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 15 mg Human-Interferon-α-Antigen (nachfolgend als Antigen-α-C-I bezeichnet) erhielt.

In diesem Antigen-a-C-I sind durchschnittlich 10 Mole des Peptids E mit 1 Mol BSA vereint.

Das Kombinationsverhältnis von Peptid E zu BSA im Antigen-α-C-I wurde wie folgt berechnet. Nachdem man festgestellt hatte, daß weder nicht-umgesetztes BSA noch nicht-umgesetztes Peptid E in dem Antigen-α-C-I vorhanden war, indem man eine weitere Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-50 vornahm (Eluiermittel: physiologische Kochsalzlösung; Bestimmung: OD 280 nm; Eluiergeschwindigkeit: 3 ml/h; abgetrennte Menge: jeweils 1 ml) wurden die Mengen eines Bruchteils von Peptid E, das sich mit BSA (einer Peptid-Protein- Zusammensetzung) vereint hat, bestimmt und eine Fraktion eines anderen Produktes (eines Dimeren von Peptid E) wurde gleichfalls bestimmt und auf diese Weise wurde eine Kalibrierungskurve der Standardkonzentration für das Dimere und für das Peptid E erstellt, um die Menge des Dimeren festzustellen. Dann wurde die Menge des Dimeren von der Menge des Peptids E, das als Ausgangsmaterial verwendet worden war, abgezogen und der abgezogene Wert der Menge des Peptids E ist dann die Menge an Peptid E, die mit BSA kombiniert ist.

Das Kombinationsverhältnis eines synthetischen Peptids zu BSA bei jedem der in den jeweiligen Beispielen verwendeten Antigene wurde in gleicher Weise berechnet.

Herstellungsbeispiel 8

5 mg Peptid F, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel B-12 bei der Synthese der Peptide, und 5 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 9 mg Human-Interferon-α-Antigen, nachfolgend als Antigen-α-C-II bezeichnet, erhielt.

Dieses Antigen-a-C-II enthält durchschnittlich 9 Mole des Peptids F kombiniert mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 9

5 mg Peptid G, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel B-16b bei der Synthese der Peptide und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung wurden 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 2 l Wasser von 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 28 mg Human-Interferon-α- Antigen, nachfolgend als Antigen-α-C-III bezeichnet, erhielt.

Bei diesem Antigen waren im Durchschnitt 12 Mole des Peptids G mit 1 Mol BSA kombiniert.

Herstellungsbeispiel 10

4 mg Peptid H, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel B-18b bei der Synthese der Peptide, und 20 mg BSA wurden in 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein- Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 22 mg Human-Interferon-α-Antigen, nachfolgend als Antigen-α- C-IV bezeichnet, erhielt.

Das Antigen-α-C-IV enthielt im Durchschnitt 9 Mole des Peptids H kombiniert mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 11

4 mg Peptid G, das gemäß Herstellungsbeispiel B-16b bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 20 mg BSA wurden in 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und dann wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 21 mg Human-Interferon-α-Antigen, nachfolgend als Antigen-α-C-V bezeichnet, erhielt.

Das Antigen-α-C-V enthielt im Durchschnitt 8 Mole Peptid G in Kombination mit 1 Mol BSA.

Herstellungsbeispiel 12

10 mg Peptid I, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel C-1b bei der Synthese der Peptide, und 50 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Lösung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 48 Stunden mit 1 l Wasser von 4°C dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein- Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 45 mg Human-Interferon-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-I bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 13

5 mg Peptid J, welches gemäß Herstellungsbeispiel C-2b bei der Synthese der Peptide hergestellt worden war, und 20 mg BSA wurden in 2 ml 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden mit 1 l Wasser von 4°C dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid- Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 23 mg Human-Interferon-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-II bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 14

4 mg Peptid K, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel C-3b bei der Synthese der Peptide, und 15 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 l Wasser von 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 17 mg Human-Inter-Feron-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-III bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 15

4 mg Peptid L, das gemäß Herstellungsbeispiel C-4b bei der Synthese der Peptide erhalten worden war, und 12 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung 48 Stunden bei 4°C dialysiert. Während der Dialyse wurde das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid-Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert wobei man 14 mg Human-Interferon-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-IV bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 16

8 mg Peptid M, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 mg BSA wurden in 2 ml einer 0,1M Ammoniumacetatpufferlösung (pH 7,0) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,11 ml einer 0,1M Glutaraldehydlösung gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktion gegen 1 l Wasser von 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, enthaltend die Peptid- Protein-Zusammensetzung, wurde lyophilisiert, wobei man 31 mg Human-Interferon-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-V bezeichnet, erhielt.

Herstellungsbeispiel 17

8 mg Peptid M, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel C-5b bei der Peptidsynthese, und 25 mg BSA wurden in 4 ml Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) gegeben und die Mischung wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 2 l Wasser bei 4°C während 48 Stunden dialysiert und während der Dialyse das Wasser fünfmal gewechselt. Die dialysierte Lösung, welche die Peptid-Protein-Zusammensetzung enthielt, wurde lyophilisiert, wobei man 29 mg Human-Interferon-β-Antigen, nachfolgend als Antigen-β-VI bezeichnet, erhielt.

Herstellung von Antikörpern Herstellungsbeispiel 1

100 Mikrogramm Antigen-α-N-I, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 1 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines "Complete Freund's Adjuvant" unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge wurde dem gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen dreimal monatlich verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man das Serum, enthaltend Human-Interferon-α-Antikörper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper- α-N-I bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 2

20 Mikrogramm Antigen-α-N-II, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 2 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines "Complete Freund's Adjuvant" unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Interferon-α-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-II bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 3

20 Mikrogramm Antigen-α-N-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 3 bei der Herstellung der Antigene, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Weiterhin wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen dreimal monatlich verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Blut wurde auf einer Zentrifuge getrennt, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-α-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 4

100 Mikrogramm Antigen-α-N-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 3 bei der Herstellung von Antigenen, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Versuchstieren Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon- α-Antikörper enthielt, nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-α-N-IV bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 5

20 Mikrogramm Antigen-α-N-IV, hergestellt gemäß Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dazu wurden 1,5 ml an Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan sieben Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum, enthaltend Human-Interferon- α-Antikörper, erhielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-V bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 6

100 Mikrogramm Antigen-α-N-IV, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung von Antigenen, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan drei Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und zwar wurde die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde das Blut von den Versuchstieren entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human- Interferon-α-Antikörper erhielt. Nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-α-N-VI bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 7

Unter Verwendung von 20 mg Antigen-α-N-V, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung von Antigenen, und nach dem gleichen Verfahren wie im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 5 erhält man ein Serum, welches Human-Interferon-α-Antikörper enthält. Nachfolgend wird dieses Produkt als Antikörper-α-N-VII bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 8

Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-α-N-V, das gemäß Herstellungsbeispiel 5 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und einem ähnlichen Verfahren wie es vorher beim Herstellungsverfahren 4 beschrieben wurde, erhält man ein Serum, welches Human- Interferon-α-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-VIII bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 9

Unter Verwendung von 20 Mikrogramm Antigen-α-N-VI, das gemäß Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und einem ähnlichen Verfahren, wie es vorher für Herstellungsbeispiel 3 beschrieben wurde, erhält man ein Serum, das Human-Interferon-α-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-IX bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 10

Unter Verwendung von 100 Mikrogramm Antigen-α-N-VI, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 6 bei der Herstellung von Antigen, und nach einem ähnlichen Verfahren wie zuvor im Herstellungsbereich 4 beschrieben, wurden drei Kaninchen immunisiert und von diesen Kaninchen wurde das Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen und dabei erhielt man ein Serum, das Human-Interferon-α-Antikörper enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-N-X bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 11

100 Mikrogramm Antigen-α-C-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigenen, wurde in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Suspension wurde subkutan 7 Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde Blut von den Kaninchen entnommen und einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-α-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper- α-C-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiele 12 bis 14

Unter Verwendung von Antigen-α-C-I, Antigen-α-C-II und Antigen-α-C-IV, die nach den Herstellungsbeispielen 7, 8 bzw. 10 bei der Herstellung der Antigene erhalten worden waren, und nach einem Verfahren, wie es zuvor im Herstellungsbeispiel 11 für die Herstellung von Antikörpern beschrieben wurde, erhielt man Seren, die jeweils die entsprechenden Human-Interferon-α- Antikörper enthielten. Diese Produkte werden nachfolgend als Antikörper-α-C-I, Antikörper-α-C-II bzw. Antikörper-α-C-IV bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 15

30 Mikrogramm Antigen-α-C-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan einem Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,7 kg verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde dem Kaninchen jede zweite Woche fünfmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich dem Kaninchen in einem Intervall von 3 Wochen fünfmal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde Blut von dem Kaninchen entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-α- Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-C-V bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 16

Unter Verwendung von 60 Mikrogramm Antigen-α-C-III, welches gemäß Herstellungsbeispiel 9 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden war, und nach einem gleichen Verfahren, wie es zuvor beim Herstellungsverfahren 15 bei der Herstellung von Antikörpern beschrieben wurde, erhält man ein Human-Interferon-α- Antikörper enthaltendes Serum. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-C-VI bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 17

Unter Verwendung von 30 Mikrogramm Antigen-α-C-V, die gemäß Herstellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von Antigenen erhalten worden waren, und nach einem Verfahren entsprechend dem vorstehend erwähnten Herstellungsbeispiel 15 für die Herstellung von Antikörpern, wurde unter Verwendung von zwei Kaninchen (mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) Serum erhalten, das Human- Interferon-α-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-α-C-VIII bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 18

Unter Verwendung von 60 Mikrogramm Antigen-α-C-V, das gemäß Herstellungsbeispiel 11 bei der Herstellung von Antigen erhalten worden war, und nach einem Verfahren entsprechend dem Herstellungsbeispiel 15 für die Zubereitung von Antikörpern, wurden fünf Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) immunisiert und den Kaninchen wurde Blut entnommen und dieses Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man Seren erhielt, die jeweils Human-Interferon-Antikörper enthielten. Diese Produkte werden nachfolgend als Antikörper-a-C-IX, Antikörper-α-C-X, Antikörper-α-C-XI, Antikörper-α-C-XII bzw. Antikörper-α-C-XIII bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 19

250 Mikrogramm Antigen-β-I, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 12 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde vier Kaninchen (jeweils mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, das Human-Interferon-β- Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-I bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 20

25 Mikrogramm Antigen-β-II, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 13 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) subkutan verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human- Interferon-β-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-II bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 21

25 Mikrogramm Antigen-β-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 14 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml eines Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen jeden Monat dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human- Interferon-b-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-III bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 22

25 Mikrogramm Antigen-β-IV, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antigen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Die Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jeweils mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht, wobei die gleiche Menge der Suspension den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht wurde. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human- Interferon-β-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-IV bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 23

25 Mikrogramm Antigen-β-V, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 16 bei der Herstellung von Antigenen, wurden in 1,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und zu dieser Lösung wurden 1,5 ml von Complete Freund's Adjuvant unter Ausbildung einer Suspension gegeben. Diese Suspension wurde subkutan vier Kaninchen (jedes mit einem Körpergewicht von 2,5 bis 3,0 kg) verabreicht und die gleiche Menge der Suspension wurde den gleichen Kaninchen jede zweite Woche sechsmal verabreicht. Außerdem wurde die gleiche Menge der Suspension zusätzlich den gleichen Kaninchen monatlich dreimal verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Verabreichung der Suspension wurde den Kaninchen Blut entnommen. Das Blut wurde einer Zentrifugentrennung unterworfen, wobei man ein Serum erhielt, welches Human-Interferon-β-Antikörper enthielt. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-V bezeichnet.

Herstellungsbeispiel 24

Unter Verwendung von Antigen-β-VI, das gemäß Herstellungsbeispiel 17 bei der Herstellung von Antigen erhalten worden war, und nach einem Verfahren, das dem vorher erwähnten Herstellungsbeispiel 15 bei der Herstellung von Antikörpern entspricht, erhält man ein Serum, das einen Antikörper mit hoher Wirksamkeit und hoher Spezifität gegenüber Human-Interferon-β enthält. Dieses Produkt wird nachfolgend als Antikörper-β-VI bezeichnet.

Bestimmung der Titer des Antikörpers (1)

Der Titer des Antikörper-α-N-I bis α-N-X wurde wie folgt bestimmt:

Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt unter Ausbildung von Serienverdünnungsproben mit einer 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵fach verdünnten Konzentration (Anfangskonzentration). Zu jeweils 100 Mikrolitern dieser verdünnten Proben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von ¹²⁵J-markiertem Peptid D (das erhalten wurde gemäß dem Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid 1 und das auf eine Verdünnung gebracht worden war, daß es eine Radioaktivität von etwa 9500 cpm aufwies) gegeben, sowie 0,2 ml einer 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25% BSA und 10 nM EDTA und 0,02% NaN₃) und diese Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Man erhielt ein Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit dem ¹²⁵J- markierten Peptid D in der inkubierten Mischung und dieses Produkt wurde von nicht-umgesetztem (nicht- kombiniertem) ¹²⁵J-markiertem Peptid D mittels einer dextranaktivierten Kohlenstoffmethode und durch Zentrifugentrennung (bei 4°C während 30 Minuten bei 3000 Upm) isoliert.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem ¹²⁵J-markierten Peptid D in dem gebildeten Produkt wurde durch Messung der Radioaktivität einer jeden Probe in der Serienverdünnung festgestellt. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%) aus den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungen wurden auf ein Schaubild aufgetragen, wobei die Ordinate das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem ¹²⁵J-markierten Peptid D zeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers angibt. Aus der aufgetragenen Kurve ergibt sich bei einer Verdünnungskonzentration des Antikörpers von 50% ein Kombinationsverhältnis entsprechend dem Titer des Antikörpers. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Test für die Spezifität des Antikörpers α-N-IV gegenüber Human-Lymphoblastoid-Interferon

Bei der Durchführung dieses Tests für die Spezifität wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet:

(1) Human-Interferon-β (spezifische Aktivität: 3 × 10⁶ U/mg Protein) in unterschiedlichen Konzentrationen.
(2) Peptid C, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel A-3 von der Synthese von Peptiden mit einer Peptidkette von Human-Lymphoblastoid-Interferon.
(3) Human-Interferon-α (Probe Nr. 1, lymphoblastoides Interferon).
(4) Human-Interferon-α (Probe 2).

Weiterhin wurden Standardverdünnungsmittel, wie eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 5 mM EDTA und 0,02% NaN₃, verwendet.

In Reagenzgläser werden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-α-N-IV, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 4 bei der Herstellung der Antikörper (Titer = 200 000) und 0,1 ml ¹²⁵J-markiertes Peptid D (das gemäß Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid-1 erhalten worden war, und das zu einer verdünnten Lösung mit etwa 2800 cpm Radioaktivität verdünnt worden war) gegeben. Jeder der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wird während 72 Stunden bei 4°C inkubiert und dann werden 0,1 ml normales Schweineserum dem Gemisch zugegeben und anschließend daran 0,5 ml einer Suspension aus Aktivkohle, welche mit Dextran beschichtet ist und die gesamte Mischung läßt man 30 Minuten bei 4°C stehen. Anschließend wird die gesamte Mischung 30 Minuten bei 3000 Upm bei 4°C auf der Zentrifuge getrennt, um das gebildete Produkt aus dem Antikörper in Kombination mit dem ¹²⁵J-markierten Peptid von dem nicht- umgesetzten (nicht-kombinierten) ¹²⁵J-markierten Peptid zu trennen. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵J- markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B₀) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativ gebundenen Menge (% = B/B₀ × 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (Peptid C, das gemäß Herstellungsbeispiel A-3 bei der Synthese der Peptide hergestellt wurde und eine Peptidkette aus Human-Lymphoblastoid-Interferon, Human-Interferon-b und Human-Interferon-α hat). In dieser Fig. 1 bedeutet die Kurve (a) Peptid C, d. h. eine Peptidkette mit Human- Lymphoblastoid-Interferon, Kurve (b) ein Human-Interferon-α (Probe 2), Kurve (c) ein Human-Interferon-α und Kurve (d) ein Human-Interferon-β. Aus den in Fig. 1 gezeigten Kurven wird ersichtlich, daß die Reaktivität von Antikörper-α-N-IV gegenüber Human- Interferon-α deutlich unterschiedlich ist von der Reaktivität von Antikörper-α-N-IV gegenüber Human-Interferon-b und dies bedeutet, daß der Antikörper-α-N-IV ein Antikörper hoher Spezifität ist und daß er bis zu einer Konzentration von 3,0 × 10⁶ U/ml mit Human- Interferon-β kreuzreagiert.

Bewertung der Titer von Antikörpern (2)

Der Titer der Antikörper-α-C-I bis Antikörper-α-C-XIII wurde wie folgt bewertet:

Jeder der Antikörper wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei man Serienverdünnungsproben mit einer 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, . . . -fachen Verdünnungskonzentration (bezogen auf die Anfangskonzentration) erhielt. Zu 100 Mikrolitern jeder dieser Verdünnungsproben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von ¹²⁵J- markiertem Peptid H zugegeben (diese verdünnte Probe wurde gemäß Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 hergestellt und wurde dann auf eine verdünnte Lösung mit einer Radioaktivität von etwa 9500 cpm verdünnt), sowie 0,2 ml 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,25% BSA, 10 nM EDTA und 0,02% NaN₃) und diese Mischung wurde 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Das gebildete Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit ¹²⁵J-markiertem Peptid H, wurde aus der Mischung von dem nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten) ¹²⁵J-markierten Peptid H durch die dextranaktivierte Kohlenstoffmethode und Zentrifugenabtrennung (bei 4°C während 30 Minuten, 3000 Upm) abgetrennt.

Das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem ¹²⁵J-markierten Peptid H in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität einer jeden Probe bei der Serienverdünnungskonzentration maß. Die Daten für das Kombinationsverhältnis (%), die man bei den jeweiligen Proben in den Serienverdünnungskonzentrationen erhielt, wurden zu einer Kurve aufgetragen, in welcher die Ordinate, das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu dem ¹²⁵J-markierten Peptid H anzeigt und die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers (Anfangskonzentration). Aus der Kurve kann man dann eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50% des Kombinationsverhältnisses zeigt und welche dem Titer des Antikörpers entspricht, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 geht hervor, daß C- terminierte Peptide von Human-Interferon-α der allgemeinen Formel (II) und deren Derivate eine starke Antigenität im Vergleich zu anderen Peptiden aufweisen, wie dies ersichtlich wird aus dem Titer von Antikörper-α- C-IX bis α-C-XIII und daß die brauchbaren Antikörper in den meisten Tieren, denen das Antigen verabreicht wurde, gebildet werden.

Test für die Spezifität von Antikörper-α-C-III gegenüber Human-Interferon-α

(a) Bei der Durchführung dieses Tests hinsichtlich der Spezifität wurden folgende als Proben verwendete Materialien untersucht:

(1) Human-Interferon-β (spezifische Aktivität: 3 × 10⁶ U/mg Protein) in unterschiedlichen Konzentrationen.
(2) Peptid G, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 16b bei der Synthese des Peptids, mit einer Peptidkette von Human-Interferon-α.
(3) Human-Interferon-α (lymphoblastoides Interferon).

Als Standardverdünnungsmittel wurde eine 0,05M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,25% BSA, 5 mM EDTA und 0,02 5 NaN₃, verwendet.

In eine Reihe von Reagenzgläsern wurden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-α-C-III, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 11 der Zubereitungen für Antikörper, und 0,1 ml ¹²⁵J-markiertes Peptid H vorgelegt (wobei das Peptid H gemäß Herstellungsbeispiel für das markierte Peptid 2-1 hergestellt worden war und zu einer Lösung verdünnt wurde, die etwa 2800 cpm Radioaktivität aufwies. Jedes der die obige Mischung enthaltenden Reagenzgläser wurde 72 Stunden bei 4°C inkubiert und dann wurden 0,1 ml eines normalen Schweineserums zu der inkubierten Mischung gegeben und daran anschließend 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet war. Man ließ die Mischung 30 Minuten bei 4°C stehen und führte dann eine Zentrifugentrennung bei 4°C während 30 Minuten mit 3000 Upm durch, wodurch das gebildete Produkt aus dem Antikörper, kombiniert mit dem ¹²⁵J-markierten Peptid, von dem nicht- umgesetzten (nicht-kombinierten) ¹²⁵J-markierten Peptid abgetrennt wurde. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B₀) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Aus den bei diesem Versuch ermittelten Ergebnissen geht hervor, daß die Reaktivität von Antikörper-α-C-III gegenüber Human-Interferon-α eindeutig verschieden ist von der Reaktivität des Antikörpers-α-C-III gegenüber Human-Interferon-β und das bedeutet, daß Antikörper- α-C-III ein Antikörper hoher Spezifität ist, der nur eine niedrige Kreuzprobe zu Human-Interferon-β aufweist.

Weiterhin wurden ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-α-C-I, Antikörper-α-C-II und Antikörper-α-C-IV bis Antikörper-α-C-VII und Antikörper- α-C-IX bis Antikörper-α-C-XIII gegenüber Human-Interferon-α durchgeführt und es wurde dabei bestätigt, daß diese Antikörper hochspezifisch gegenüber Human-Interferon-α sind.

(b) Ähnliche Versuche wurden mit Antikörper-α- C-VIII im obigen Versuch (a) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt, wo die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz (% = B/B₀ × 100) anzeigt, während die Abszisse die Konzentrationen der zu prüfenden Proben zeigt. Peptid G wurde gemäß Herstellungsbeispiel B-16b für die Synthese von Peptiden hergestellt, d. h. mit einer Peptidkette von Human-Interferon-α. Weiterhin wurde für die Untersuchungen verwendet Human- Interferon-α (lymphoblastoides Interferon, und Leukozyten-Interferon), sowie Human-Interferon-β (spezifische Aktivität: 3 × 10⁶ U/mg Protein). In Fig. 2 zeigt Kurve (a) Peptid G an, Kurve (b) Human-Interferon, Kurve (c) Human-Interferon-α und Kurve (d) Human-Interferon-β. Aus den Kurven in Fig. 2 wird ersichtlich, daß die Reaktivität von Antikörper-α-C-VIII zu Human-Interferon eindeutig unterschiedlich ist gegenüber der Reaktivität von Antikörper-α-C-VIII zu Human- Interferon-β und dies bedeutet, daß Antikörper-α-C-VIII ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und daß es keine Kreuzprobe mit Human-Interferon-β bis zu einer Konzentration von 1,0 × 10⁶ U/ml zeigt.

Untersuchung des Titers von Antikörper (3)

Der Titer von Antikörper-β-I bis Antikörper-β-VI wurde wie folgt bewertet:

Jeder der Antikörper wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt, unter Erhalt von Verdünnungsproben mit einer 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, . . . -fachen Verdünnungskonzentration. Zu 100 Mikrolitern einer jeden dieser verdünnten Proben wurden 0,1 ml einer verdünnten Lösung von ¹²⁵J-markiertem Peptid M gegeben (Peptid M wurde gemäß Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid-3 erhalten und dieses wurde verdünnt auf eine Radioaktivität von etwa 10 000 cpm), sowie 0,2 ml 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) (enthaltend 0,1% BSA, 0,15M Natriumchlorid und 0,01% NaN₃) und dann wurde die Mischung 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Das erhaltene Produkt aus Antikörpe 45336 00070 552 001000280000000200012000285914522500040 0002003211263 00004 45217r, kombiniert mit ¹²⁵J-markiertem Peptid M, das sich in der inkubierten Mischung gebildet hatte, wurde von nicht-umgesetztem (nicht-kombiniertem) ¹²⁵J-markiertem Peptid M durch die Dextran- Aktivkohle-Methode und Zentrifugentrennung (bei 4°C während 15 Minuten, 3000 Upm) isoliert.

Das Kombinationsverhältnis (%) von Antikörper zu ¹²⁵J- markiertem Peptid M in dem gebildeten Produkt wurde bestimmt, indem man die Radioaktivität der Proben in den Serienverdünnungskonzentrationen untersuchte. Die Daten des Kombinationsverhältnisses (%), erhalten mit den jeweiligen Proben bei den Serienverdünnungskonzentrationen (Anfangskonzentration) wurden in eine Kurve eingetragen, in welcher die Ordinate das Kombinationsverhältnis (%) des Antikörpers zu ¹²⁵J-markiertem Peptid M zeigt, während die Abszisse die Verdünnungskonzentration des Antikörpers zeigt. Von den aufgezeichneten Linien wird eine Verdünnungskonzentration des Antikörpers, die 50% des kombinierten Verhältnisses, entsprechend dem Titer des Antikörpers zeigt, erhalten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

AntikörperTiter β-V 52 000 β-VI100 000

Test für die Spezifität von Antikörper-β-V gegenüber Human-Interferon-β

Bei der Durchführung dieses Versuches wurden folgende Materialien als zu untersuchende Proben verwendet:

(1) Human-Interferon-β (spezifische Aktivität: 3 × 10⁶ U/mg Protein).
(2) Die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M wurde hergestellt gemäß Beispiel 5 von Herstellungsbeispiel C für die Peptidsynthese).
(3) Human-Interferon-α (lymphoblastoides Interferon).

Außerdem wurde als Standardverdünnungsmittel 0,1M Natriumphosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,1% BSA, 0,15M NaCl und 0,01% NaN₃, verwendet.

In Reagenzgläser wurden jeweils 0,2 ml des Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der zu untersuchenden Probe, 0,1 ml Antikörper-β-V, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörper (Radioaktivität 52 000) und 0,1 ml von ¹²⁵J-markiertem Peptid M vorgelegt (dieses markierte Peptid M wurde gemäß Herstellungsbeispiel für markierte Peptide-3 erhalten und auf eine Verdünnungskonzentration gebracht, bei der es eine Radioaktivität von etwa 10 000 cpm zeigte). Die Mischung wurde dann 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung wurden 0,1 ml normales Schafsserum gegeben und dann wurden zu der Mischung 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, beschichtet mit Dextran, gegeben und die ganze Mischung wurde 30 Minuten bei 4°C stehen gelassen und dann einer Zentrifugentrennung bei 4°C während 30 Minuten mit 3000 Upm unterworfen, wobei man aus dem Produkt den Antikörper, kombiniert mit ¹²⁵J- markiertem Peptid von dem nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten) ¹²⁵J-markierten Peptid abtrennte. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B₀) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen gebundenen Menge (% = B/B₀ × 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human- Interferon-β (Peptid M), Human-Interferon-β und Human- Interferon-α). In Fig. 3 bedeutet Kurve (a) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M), Kurve (b) Human-Interferon-β und Kurve (c) Human-Interferon-α. Aus den Kurven in Fig. 3 wird ersichtlich, daß die Reaktivität von Antikörper-β-V gegenüber Human-Interferon eindeutig unterschiedlich ist von der Reaktivität von Antikörper-β-V gegenüber Human-Interferon-β und daraus läßt sich entnehmen, daß Antikörper-β-V ein Antikörper mit hoher Spezifität ist und daß er keine Kreuzprobe mit Interferon-α bis zu einer Konzentration von 3,7 × 10⁶ U/ml zeigt.

Weitere, ähnliche Versuche hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-β-VI gegenüber Interferon-β wurden durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt, in welcher die Ordinate den Prozentsatz der relativen gebundenen Menge (% = B/B₀ × 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentration der zu prüfenden Proben zeigt (die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M), Human-Interferon-b und Human-Interferon-α).

In Fig. 4 bedeutet Kurve (d) die 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M), Kurve (e) ist Human-Interferon-β und Kurve (f) Human-Interferon-α.

Ähnliche Versuche wurden hinsichtlich der Spezifität von Antikörper-β-II, Antikörper-b-III und Antikörper-β-IV durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 0,2 ml des vorerwähnten Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der vorerwähnten zu prüfenden Proben, 0,1 ml Antikörper-β-II, Antikörper-β-III oder Antikörper-β-IV, sowie 0,1 ml ¹²⁵J-markiertes Peptid M eingefüllt und die Umsetzung wurde dann in gleicher Weise wie vorher angegeben durchgeführt. Nimmt man die Bindungsreaktivität zwischen Antikörper-β-V oder Antikörper-β-VI, erhalten von der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M) und das 1. bis 13. Peptid von Human-Interferon-β (Peptid) mit 100% an, so werden die relativ gebundenen Prozentsätze (%) für die jeweiligen Antikörper in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Bestimmung der Empfindlichkeitsgrenze

In Reagenzgläser werden jeweils 0,2 ml eines Standardverdünnungsmittels, 0,1 ml der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptid M), 0,1 ml Antikörper-β-V erhalten gemäß Beispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern oder Antikörper-β-VI, erhalten gemäß Beispiel 24 für die Herstellung von Antikörper, und 0,1 ml von ¹²⁵J-markiertem Peptid M vorgelegt (wobei das ¹²⁵J-markierte Peptid M gemäß Herstellungsbeispiel für markiertes Peptid-3 hergestellt wurde und so verdünnt wurde, daß es eine Radioaktivität von 10 000 cpm aufwies) und die Mischung wird 48 Stunden bei 4°C inkubiert. Zu der inkubierten Mischung gibt man 0,1 ml normales Schafsserum und anschließend daran gibt man 0,5 ml einer Suspension von Aktivkohle, die mit Dextran beschichtet ist, hinzu und läßt die Mischung dann 30 Minuten bei 4°C stehen, worauf man dann eine Zentrifugentrennung während 30 Minuten bei 40°C und mit 3000 Upm durchführt und das gebildete Produkt aus dem Antikörper, der mit dem ¹²⁵J-markierten Peptid kombiniert ist vom nicht-umgesetzten (nicht-kombinierten) ¹²⁵J-markierten Peptid abtrennt. Die Radioaktivität der einzelnen Peptide wurde gemessen. Das Bindungsverhältnis (%) von ¹²⁵J-markiertem Peptid und den einzelnen Proben bei den jeweiligen Konzentrationen und Verdünnungen wurde bestimmt, wobei man das Bindungsverhältnis (B₀) entsprechend dem Titer des verwendeten Antikörpers mit 100% einsetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt, in welcher die Ordinate den relativ gebundenen Prozentsatz (% = B/B₀ × 100) zeigt, während die Abszisse die Konzentrationen der 1. bis 13. Peptidkette von Human-Interferon-β (Peptin M), Kurve (g) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-β-V und Kurve (h) die Daten, die man unter Verwendung von Antikörper-β-VI erhält, zeigt. Aus diesen Kurven in Fig. 5 geht hervor, daß die Minimumsensitivitätsgrenze zur Bestimmung von Human-Interferon 13 Picogramm/ml bei Verwendung von Antikörper-β-V und 5 pg/ml bei Verwendung von Antikörper-β-VI beträgt.

Herstellung von immobilisierten Antikörpern Herstellungsbeispiel 1

(a) 0,74 ml Antikörper-β-V, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 23 für die Herstellung von Antikörpern, wurde in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten, wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Zu dem Gemisch wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann ließ man 3 Stunden bei 4°C stehen. Anschließend wurde die Mischung mit 3500 Upm 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,157) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschließend nochmals mit einer wäßrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml einer wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 0,923) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäurelösung und dann mit 30 ml einer 0,1M wäßrigen Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und 7 ml der zuvor dialysierten Antikörper-Lösung wurden zu der gewaschenen Sepharose®4B gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde durch ein Glasfilter filtriert und das Gel in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid gewaschen und anschließend viermal mit 0,1M Boratpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein immobilisiertes Produkt von Human-Interferon-β- Antikörper-Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des Abfiltrierten aus der Filtration auf dem Glasfilter eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 2

(a) 0,74 ml von Antikörper-β-I, erhalten im Herstellungsbeispiel 19 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wäßrige Lösung von 3 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann ließ man die Mischung 3 Stunden bei 4°C stehen. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4°C mit 3500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,154) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde mit destilliertem Wasser dreimal dialysiert und anschließend einmal mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml einer wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und dann wurde diese gewaschene Sepharose®4B zu 30 ml einer 0,1M wäßrigen Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid und 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 50 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung wurde im Kreislauf mit 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, und dann mit 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, viermal gewaschen. Beim Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhält man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon- β-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 3

(a) 0,74 ml Antikörper-β-II, erhalten in Herstellungsbeispiel 20 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine wäßrige, gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben und die erhaltene Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Dann gab man 3 ml Wasser zu dieser Mischung und ließ diese 3 Stunden bei 4°C stehen. Die Mischung wurde dann mit 3500 Upm 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,155) erhielt. Diese Lösung des Antikörpers wurde dann dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, dialysiert, wobei man 7 ml einer wäßrigen Antikörper- Lösung (OD₂₈₀ = 0,921) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäure gewaschen und zu der gewaschenen Sepharose®4B wurden 30 ml einer wäßrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 50 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer umlaufenden Lösung von 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschließend viermal mit 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-β-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des Filtrates, das man erhält, wenn man das adsorbierte Produkt über ein Glasfilter filtriert, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 4

(a) 0,74 ml Antikörper-β-III, erhalten in Herstellungsbeispiel 21 für die Herstellung von Antikörpern, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde dann 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Zu der Mischung wurden 3 ml destilliertes Wasser gegeben und dann ließ man die Mischung 3 Stunden bei 4°C stehen. Die Mischung wurde mit 3500 Upm bei 4°C 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde destilliert und in Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,156) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend gegen eine 0,1M wäßrige Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 0,922) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäure gewaschen und diese gewaschene Sepharose®4B wurde zu 30 ml einer wäßrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben und dazu wurden 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung gegeben und die Mischung wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer umlaufenden Lösung von 0,1M Acetatpuffer (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhält man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-b-Antikörper, der auf Sepharose®4B immobilisiert ist. Aus der Tatsache, daß 35 ml des beim Filtrieren des absorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigen, wird bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 5

(a) 0,74 ml Antikörper-β-IV, erhalten in Herstellungsbeispiel 22 für die Herstellung von Antikörper, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann mit 3500 Upm bei 4°C während 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser aufgelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,153) erhielt. Diese Lösung des Antikörpers wurde dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und weiter mit einer 0,1M wäßrigen Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 0,920) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und zu dieser gewaschenen Sepharose®4B wurden 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten, dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und bei Raumtemperatur 2 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschließend noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-β-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des Filtrats, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhielt, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 6

(a) 0,74 ml Antikörper-β-VI, erhalten in Herstellungsbeispiel 24 für die Herstellung von Antikörper, wurden in 2,26 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer wäßrigen gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und diese 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann mit 3500 Upm 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 8 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,158) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal gegen destilliertes Wasser dialysiert und anschließend mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 7 ml der wäßrigen Antikörperlösung (OD₂₈₀ = 0,924) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1 mM Salzsäurelösung gewaschen und dann wurden zu dieser gewaschenen Sepharose®4B 30 ml einer 0,1M Natriumbikarbinatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml einer 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde diese Lösung mit einer umlaufenden 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man das adsorbierte Produkt von Human-Interferon-β-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 7

Ein Filterpapier wurde in kleine Stücke von 0,5 × 0,5 cm mit einem Gewicht von jeweils etwa 1 g geschnitten. Diese kleinen Filterpapierstückchen (aus Zellulose) wurden in 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und der pH-Wert der Mischung wurde auf etwa 11,0 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt, um die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten zu aktivieren. Nach Beendigung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und dann wurde der gewaschene Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die wäßrige Antikörperlösung (OD₂₈₀ = 0,918), die in gleicher Weise erhalten wurde wie beim zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel 1 (a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie vorher im Herstellungsbeispiel 1 (b) beschrieben wurde, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-β, immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, daß das beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhaltene Filtrat eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Zellulose gebunden ist.

Herstellungsbeispiel 8

1 g vernetztes Dextran (Sephadex®G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wäßrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogenbromid (2 g/ml) wurde auf einmal zugegeben und dabei wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann wurde das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert und der Feststoff mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und die wäßrige Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 0,921), erhalten im oben erwähnten Herstellungsbeispiel 1 (a) wurde zugegeben und dann erfolgte die weitere Behandlung wie bei dem zuvor erwähnten Herstellungsbeispiel 1 (b), wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-β, immobilisiert auf vernetztem Dextran, erhielt. Das Filtrat, das man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt zeigte eine OD₂₈₀ = 0,004. Dadurch wird bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 9

(a) 1 ml Antikörper-α-N-IV, erhalten in Herstellungsbeispiel 4 für die Herstellung des Antikörpers, wurde in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurden 3 ml einer gesättigten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gegeben und das Gemisch ließ man 3 Stunden bei 4°C stehen. Dann wurden zu der Mischung 3 ml destilliertes Wasser gegeben und die Mischung 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Mischung wurde dann 15 Stunden bei 4°C mit 3500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer wäßrigen Lösung des Antikörpers (OD₂₈₀ = 1,538) erhielt. Anschließend wurde die Lösung des Antikörpers dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und anschließend noch mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 10 ml der wäßrigen Antikörperlösung (OD₂₈₀ = 1,501) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer wäßrigen 1mM Salzsäurelösung gewaschen. Die gewaschene Sepharose®4B wurde zu 30 ml einer wäßrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben und 7 ml der zuvor erwähnten dialysierten Antikörper-Lösung wurden dazu gegeben und die erhaltene Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und dann 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde durch eine umlaufende 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschließend noch viermal mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des beim Filtrieren auf dem Glasfilter erhaltenen Filtrats eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 10

(a) Unter Verwendung von Antikörper-α-N-I bis -α-N-III, von Antikörper-α-N-V bis Antikörper-α-N-X, erhalten in den Herstellungsbeispielen 1 bis 3 bis 5 bis 10 für die Herstellung der Antikörper, anstelle von Antikörper-α-N-IV, verwendet man dem oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9, wobei man sonst die gleiche Verfahrensweise wie im Herstellungsbeispiel 9 anwendete, wurden die nachfolgenden wäßrigen Antikörper-Lösungen erhalten.

(b) Unter Verwendung der wäßrigen in Stufe (a) erhaltenen Antikörper-Lösung und unter Anwendung eines grundsätzlich gleichen Verfahrens, wie es im oben erwähnten Herstellungsbeispiel 9 (b) beschrieben wird, wurden entsprechende adsorbierte Produkte von Human-Interferon-α, immobilisiert auf Sepharose®4B, erhalten. Alle die Filtrate, die man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt, zeigten eine OD₂₈₀ = 0,004 und das bestätigt, daß der größte Teil der Antikörper auf Sepharose®4B immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 11

Ein Filterpapier wurde in kleine Stücke einer Größe von 0,5 × 0,5 cm mit einem Gewicht von etwa 1 g geschnitten. Diese Filterpapierstücke aus Zellulose wurden zu 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 1 g Cyanogenbromid, gegeben und bei einem pH-Wert von 11 bis 11,5 durch Zugabe von Natriumhydroxid gehalten, dann wurde die Zellulose bei Raumtemperatur während 6 bis 8 Minuten aktiviert. Nach Beendigung der Aktivierung wurde die Reaktionsmischung zur Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert und der gebildete Feststoff wurde mehrere Male mit eiskalter 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und der gewaschene Feststoff wurde dann in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde eine wäßrige Antikörper- Lösung (OD₂₈₀ = 1,502), erhalten in gleicher Weise wie zuvor in Herstellungsbeispiel 9 (a) beschrieben, gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie zuvor in Herstellungsbeispiel 9 (b) beschrieben behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt aus Human-Interferon- α-Antikörper, immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, daß das Filtrat, das man beim Filtrieren des absorbierten Produktes durch ein Glasfilter erhielt, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Zellulose immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 12

1 g vernetztes Dextran (Sephadex®G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wäßrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und gründlich gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Acetonitrillösung von Cyanogenbromid (2 g/ml) wurden auf einmal zugegeben und dabei wurde während 1 bis 2 Minuten kräftig gerührt und das Reaktionsgemisch wurde dann auf einem Glasfilter unter Entfernung der Reaktionsflüssigkeit filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit einer 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und dazu wurde eine wäßrige Antikörperlösung (OD₂₈₀ = 1,511), erhalten gemäß obigem Herstellungsbeispiel 9 (a), gegeben und dann erfolgte die weitere Behandlung wie sie zuvor für das Herstellungsbeispiel 9 (b) beschrieben wurde und auf diese Weise erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon- α-Antikörper, immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus der Tatsache, daß das beim Filtrieren des Produktes erhaltene Filtrat eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, geht hervor, daß der größte Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert wurde.

Herstellungsbeispiel 13

(a) 1,0 ml Antikörper-α-C-VIII, erhalten in Herstellungsbeispiel 17 für die Herstellung von Antikörper, wurde in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst und dazu wurde eine gesättigte, wäßrige Ammoniumsulfatlösung gegeben und die Mischung ließ man dann bei 4°C 3 Stunden stehen. Dann wurden 3 ml destilliertes Wasser zu der Mischung gegeben und die Mischung wurde 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Anschließend wurde die Mischung 15 Minuten bei 4°C mit 3500 Upm zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst, wobei man 10 ml einer wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 1,526) erhielt. Die Lösung des Antikörpers wurde dreimal mit destilliertem Wasser dialysiert und dann nochmals mit einer 0,1M Natriumbikarbonatlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, wobei man 10 ml einer wäßrigen Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 1,511) erhielt.

(b) 1 g trockene Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose®4B wurde mit 200 ml einer 1 mM Salzsäure gewaschen und zu der so gewaschenen Sepharose®4B wurden 30 ml einer wäßrigen 0,1M Natriumbikarbonatlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gegeben, sowie 7 ml der vorerwähnten dialysierten Antikörper-Lösung. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde die Mischung auf einem Glasfilter filtriert und das erhaltene Gel wurde in 40 ml 1M Monoethanolamin-Cl (pH 8,36) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde mit einer umlaufenden 0,1M Acetatpufferlösung (pH 4,0), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und anschließend mit einer 0,1M Boratpufferlösung, enthaltend 0,5M Natriumchlorid. Durch Suspendieren in einer physiologischen Kochsalzlösung erhielt man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B. Aus der Tatsache, daß 35 ml des Filtrats, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes auf einem Glasfilter erhielt, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, wurde bestätigt, daß der größte Teil des Antikörpers auf Sepharose®4B immobilisiert war.

Herstellungsbeispiel 14

(a) Wendet man im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13 anstelle des Antikörpers-α-C-VIII Antikörper- α-C-I bis Antikörper-α-C-VII und Antikörper-α-C-IX bis Antikörper-α-C-XIII, erhalten gemäß Herstellungsbeispielen 11 bis 18 für die Herstellung der Antikörper, an, so erhält man die nachfolgenden wäßrigen Antikörper- Lösungen:

(b) Unter Verwendung der jeweils in Stufe (a) erhaltenen wäßrigen Antikörper-Lösungen und des gleichen Verfahrens, wie es zuvor in Herstellungsbeispiel 13 (b) beschrieben wird, wurden die entsprechenden adsorbierten Produkte von Human-Interferon-α, immobilisiert auf Sepharose®4B, erhalten. Aus der Tatsache, daß die Filtrate, die man beim Filtrieren durch ein Glasfilter erhielt, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigten, geht hervor, daß der größte Teil der Antikörper in den jeweiligen Produkten auf Sepharose®4B immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 15

Ein Filterpapier wurde in kleine Stücke einer Größe von 0,5 × 0,5 cm mit einem Gewicht von etwa 1 g geschnitten. Diese Filterpapierstückchen aus Zellulose wurden in 100 ml einer 1 g Cyanogenbromid enthaltenden wäßrigen Lösung gegeben und der pH der Mischung wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 11,0 bis 11,5 gehalten, wodurch die Zellulose innerhalb von 6 bis 8 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert wurde. Nach Beendigung der Aktivierung wurde das Reaktionsgemisch filtriert und die Reaktionsflüssigkeit entfernt und der Feststoff wurde mehrere Male mit einer eiskalten 0,5M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen und der gewaschene Feststoff wurde in der gleichen Pufferlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wurde die wäßrige Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 1,502), erhalten in gleicher Weise wie im zuvor beschriebenen Herstellungsbeispiel 13 (a), gegeben und die Mischung wurde dann in gleicher Weise wie im vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13 (b) beschrieben, behandelt, wobei man ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf Zellulose, erhielt. Aus der Tatsache, daß das Filtrat, das man beim Filtrieren des adsorbierten Produktes unter Verwendung eines Glasfilters, eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, geht hervor, daß der größte Teil des Antikörpers auf der Zellulose immobilisiert ist.

Herstellungsbeispiel 16

1 g vernetztes Dextran (Sephadex®G-25) wurde in 10 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml einer wäßrigen 2M Natriumbikarbonatlösung gegeben und dabei schwach gerührt. Dann wurde die Rührgeschwindigkeit erhöht und 500 Mikroliter einer Lösung von Cyanogenbromid in Acetonitril (2 g/ml) wurden auf einmal zugegeben und dabei wurde kräftig während 1 bis 2 Minuten gerührt und dann wurde die Reaktionsmischung auf einem Glasfilter filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde mehrere Male mit 0,1M Natriumbikarbonatpufferlösung (pH 8,4), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Feststoff in der gleichen Pufferlösung suspendiert und eine wäßrige Antikörper-Lösung (OD₂₈₀ = 1,505), erhalten in gleicher Weise wie beim vorhergehenden Herstellungsbeispiel 13 (a), wurde dazugegeben und dann wurde die in Herstellungsbeispiel 13 (b) beschriebene Verfahrensweise durchgeführt und man erhielt ein adsorbiertes Produkt von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf dem vernetzten Dextran. Aus der Tatsache, daß beim Filtrieren des adsorbierten Produktes durch ein Glasfilter das Filtrat eine OD₂₈₀ = 0,004 zeigte, geht hervor, daß der größte Teil des Antikörpers auf dem vernetzten Dextran immobilisiert ist.

Reinigung von Human-Interferonen

(1) 0,5 ml Human-Interferon-β, enthaltend 5,9 g Proteine, (OD₂₈₀ = 11,8), wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde einer Affinitätschromatografie unterworfen, unter Verwendung eines adsorbierten Produktes von Human- Interferon-β-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 1 (b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und wurde mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn das Eluat eine OD₂₈₀ = 0,0002 zeigte, wurde das adsorbierte Produkt mit 0,5M Acetatpufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, eluiert, wobei man ein gereinigtes Human-Interferon-β von dem adsorbierten Produkt isolierte.

Vor der Behandlung durch Affinitätschromatografie zeigte das Human-Interferon-β den veränderten OD-Wert von 5,9 (ein Wert, den man mit 1 mg Proteine bei einer OD₂₈₀ = 1 erhält) und eine Aktivität von 1,5 × 10⁶ U/ml und eine Konzentration von 13 240 pg/ml bei der Immunitätsreaktion des Human-Interferon-β, während nach der Behandlung durch Affiniätschromatografie der veränderte OD-Wert des Human-Interferon-β 0,059 betrug und die gezeigte Aktivität 1,37 × 10⁶ U/ml und die Konzentration 12 050 pg/ml bei der Immunitätsreaktion von Human- Interferon-b betrugen. Daher betrug die spezifische Aktivität vor der Behandlung durch Affinitätschromatografie 2,54 × 10⁵ U/mg, während die spezifische Aktivität nach der Behandlung durch Affinitätschromatografie 2,32 × 10⁷ U/mg betrug, was einen beachtlichen, 91,3mal so großen Wert hinsichtlich der spezifischen Aktivität bedeutet. Wie aus den Ergebnissen, die man bei Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierte Antikörper auf dem Träger) erhält, hervorgeht, kann Human-Interferon-β um das 91fache der Reinheit gereinigt werden und auch die Ausbeute davon wird erheblich verbessert.

Unter Verwendung der jeweiligen immobilisierten Antikörper, erhalten in den Herstellungsbeispielen 2 bis 8 zur Herstellung von immobilisierten Antikörpern, kann man gemäß der Erfindung hervorragende Ergebnisse beim Isolieren und Reinigen von Human-Interferonen erzielen, wie durch die Behandlung durch Affinitätschromatografie gezeigt wird.

(2) 0,5 ml (10,1 mg Proteine) von Human-Interferon-α (OD₂₈₀ = 20,2), wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde für eine Affinitätschromatografie verwendet unter Verwendung des adsorbierten Produktes von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 9 (b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und wurde dann mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn im Eluat die OD₂₈₀ = 0,002 oder weniger ist, wird das adsorbierte Produkt mit 0,5M Acetatpufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, eluiert und dadurch ein gereinigtes Human-Interferon-α von dem adsorbierten Produkt isoliert.

Vor der Behandlung durch die Affinitätschromatografie zeigte das Human-Interferon-α einen unveränderten OD-Wert von 10,1 (ein Wert, den man mit 1 mg Proteine bei OD₂₈₀ = 1 erhält), eine Aktivität von 1 × 10⁶ U/ml und eine Konzentration von 6900 pg/ml bei einer Immunitätsreaktion von Human-Interferon-α. Dagegen erzielt man nach der affinitätschromatografischen Behandlung einen PD-Wert des Human-Interferon-α von 0,080, die Aktivität ist 8 × 10⁵ U/ml und die Konzentration beträgt 55 000 pg/ml bei einer Immunitätsreaktion von Human-Interferon-α. Die spezifische Aktivität vor der affinitätschromatografischen Behandlung betrug 5,9 × 10⁴ U/mg, während die spezifische Aktivität nach der affinitätschromatografischen Behandlung 1 × 10⁷ U/mg betrug, was eine Verbesserung der spezifischen Aktivität um das 169fache bedeutet. Aus diesem Ergebnis wird ersichtlich, daß man bei Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierter Antikörper auf dem Träger) Human-Interferon-α um das 169fache reinigen kann, wobei die Ausbeute quantitativ ist.

Verwendet man jeweils die immobilisierten Antikörper die in den Herstellungsbeispielen 10 bis 12 für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern erhalten wurden, bei der vorliegenden Erfindung, dann kann man hervorragende Ergebnisse erzielen beim Isolieren und Reinigen von Human-Interferonen, wie durch die affinitätschromatografische Behandlung gezeigt wird.

(3) 0,5 ml (10,1 mg Proteine) Human-Interferon-α (OD₂₈₀ = 20,2), wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und dann wurde diese Lösung einer Affinitätschromatografie unterworfen unter Verwendung eines adsorbierten Produktes von Human-Interferon-α-Antikörper, immobilisiert auf Sepharose®4B, erhalten gemäß Herstellungsbeispiel 13 (b) für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern, und mit 0,1M Phosphatpufferlösung (pH 7,4), enthaltend 0,15M Natriumchlorid, eluiert. Wenn im Eluat die OD₂₈₀ = 0,002 oder weniger ist, dann wird das adsorbierte Produkt mit 0,5M Essigsäurepufferlösung (pH 2,5), enthaltend 0,5M Natriumchlorid, eluiert und dadurch wird gereinigtes Human-Interferon-α von dem adsorbierten Produkt isoliert.

Vor der Behandlung durch die Affinitätschromatografie zeigte das Human-Interferon-α den umgewandelten OD-Wert von 10,1 (ein Wert, erhalten mit 1 mg Proteine bei OD₂₈₀ = 1), eine Aktivität von 1 × 10⁶ U/ml und eine Konzentration von 23 000 pg/ml bei einer Immunitätsreaktion von Human-Interferon-α. Nach der Behandlung durch die Affinitätschromatografie betrug der umgewandelte OD- Wert des Human-Interferon-α 0,060, und zeigte eine Aktivität von 8,2 × 10⁵ U/ml und eine Konzentration von 19 792 pg/mg bei einer Immunitätsreaktion von Human- Interferon-α. Die spezifische Aktivität vor der Behandlung durch Affinitätschromatografie betrug 9,9 × 10⁴ U/mg und die spezifische Aktivität nach der Behandlung durch Affinitätschromatografie betrug 1,37 × 10⁷ U/mg und das bedeutet eine 138fache Steigerung der spezifischen Aktivität. Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß unter Verwendung des adsorbierten Produktes (immobilisierter Antikörper auf dem Träger) Human-Interferon-α um das 138fache gereinigt werden kann, wobei auch die Ausbeute quantitativ ist.

Verwendet man immobilisierte Antikörper, wie sie gemäß den Beispielen 14 bis 16 für die Herstellung von immobilisierten Antikörpern erhalten wurden, bei der vorliegenden Erfindung, so kann man hervorragende Ergebnisse beim Isolieren und Reinigen von Human-Interferonen erzielen, wie durch die Behandlung unter Anwendung von Affinitätschromatografie gezeigt wird.

Claims

1. Human-Interferon-Antikörper, erhalten durch Sammeln eines Antikörpers, der im Körper eines Säugers gebildet wurde, indem man dem Säuger ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das gekennzeichnet ist durch Umsetzen eines Human-Interferon verwandten Peptids aus der Gruppe bestehend aus einem Peptid der allgemeinen Formel (I) R¹Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OHworin R¹ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der FormelH-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-,eine Gruppe der Formel
H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg- Ala-oder eine Gruppe der Formel
H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg- Arg-Ala-bedeutet,einem Peptid der allgemeinen Formel IIR²-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OHworin R² ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel
H-Thr-Asn-Leu-Gln-,eine Gruppe der FormelH-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Gln-oder eine Gruppe der FormelH-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-bedeutet, und einem Peptid der allgemeinen Formel (III)R³-Leu-Gln-Arg-Ser-OHworin R³ ein Wasserstoffatom, eine Gruppe der Formel H-Phe, eine Gruppe der Formel H-Leu-gly-Phe-, oder eine Gruppe der Formel H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe bedeutet, als ein Hapten mit einem Träger in Gegenwart eines Hapten-Träger-Bindungsmittels.

2. Human-Interferon-Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in einem Säugetier gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde, indem man einem Kaninchen ein Human-Interferon-Antigen verabreichte, das unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu- Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OHals ein Hapten, Glutaraldehyd oder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BSA (Rinderserumalbumin) als Träger hergestellt worden ist.

3. Human-Interferon-Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in einem Säugetierkörper gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichung eines Human-Interferon-Antigens an ein Kaninchen, wobei das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OHals ein Hapten, Glutaraldehyd als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BAS als Träger.

4. Human-Interferon-Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in dem Säugetierkörper gebildete Human-Interferon-Antikörper erhalten wurde durch Verabreichen von Human-Interferon-Antigen an ein Kaninchen, wobei das Human-Interferon-Antigen hergestellt wurde unter Verwendung eines Peptids der allgemeinen Formel H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OHals Hapten, DCC als Hapten-Träger-Bindungsmittel und BSA als Träger.

5. Verwendung eines Human-Interferon-Antikörpers gemäß Ansprüchen 1 bis 4, in immobilisierter Form auf einem unlöslichen Träger als Adsorptionsmittel zur Affinitätschromatografie.