FR2503145A1 - Peptides apparentes aux interferons humains, anticorps obtenus a partir de ces peptides et adsorbants obtenus a partir de ces anticorps - Google Patents

Peptides apparentes aux interferons humains, anticorps obtenus a partir de ces peptides et adsorbants obtenus a partir de ces anticorps Download PDF

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Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET DES PEPTIDES APPARENTES AUX INTERFERONS HUMAINS ET LEURS DERIVES, DES ANTIGENES, DES ANTICORPS OBTENUS A PARTIR D'EUX, DES ANTICORPS IMMOBILISES A UTILISER EN CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE, AINSI QU'UN NOUVEAU PROCEDE D'ESSAI DES INTERFERONS HUMAINS EN FAISANT APPEL A LADITE CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE.

Description

La présente invention est relative à des peptides et leurs dérivés,
apparentés aux interférons et humains, à n procédé de préparation d'antigènes et d'anticorps préparés en utilisant lesdits peptides, ainsi qu'à des formes immobilisées desdits anticorps, utilisées en chromatogra-
phie d'affinité, et un nouveau procédé de dosage de l'inter-
féron " et g humain.
Dans la présente description, les aminoacides, pepti-
des, groupes protecteurs, groupes actifs, etc.. sont repré-
sentés par des abréviations et symboles définis suivant IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) et IUB (International Union of Biochemistry), ou par des symboles couramment utilisés dans la technique. En ce qui concerne les isomères optiques des aminoacides, d'unefaçon générale on se réfère à la forme 1 (laevo ou gauche), sauf autre indication. Comme exemples de ces abréviations et symboles, on citera: Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ala: Alanine Gln: Glutamine Thr: Thréonine His: Histidine Ser: Sérine Gly: Glycine Asn: Asparagine Met: Méthionine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Glu: Acide glutamique Lys: Lysine Arg: Arginine Asp: Acide aspartique Pro: Proline OBzl: groupe benzyloxy NHS: groupe N-hydroxysuccinimido Z: groupe carbobenzoxy Su: groupe succinimido Tos: groupe p-toluènesulfonyle Boc: groupe tertbutoxycarbonyle Un interféron est une glycoprotéine ou une protéine ayant une activité antivirale, qui est libérée par les cellules en réponse à une infection virale, et on pense que les maladies provoquées par des infections virales peuvent
être empêchées et guéries par administration d'interféron.
C'est pourquoi l'attention s'est portée sur l'interféron
depuis quelques années.
Les interférons humains connus à ce jour sont classés en trois types, c'est-à-dire: l'interféron-,ú (interféron
leucocytaire, interféron lymphoblastoide), l'interfé-
ron-> (interféron fibroblastique) et l'interféron -ô (interféron immun). Toutefois, aucune technologie n'a été mise au point pour purifier l'interféron afin d'obtenir
les ingrédients respectifs sous la forme d'une seule gly-
coprotéine ou protéine.
Au dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple: - les Fig. 1 et 2 représentent des courbes indiquant la spécificité de l'anticorps d'interféron-t, humain obtenu suivant la présente invention; - les Fig.3 et 4 représentent des courbes indiquant la spécificité de l'anticorps d'interféron-i humain obtenu suivant la présente invention;
- la Fig.5 représente des courbes indiquant la rela-
tion entre la concentration de la lère à la 13ême chaine
peptidique de l'interféron-s humain ainsi que le pourcen-
tage fixé relatif (%) vis-à-vis de l'anticorps d'interfé-
ron- humain obtenu suivant la présente invention; - les Fig. 6 à 10 illustrent les courbes d'étalonnage dans le système d'essai immunologique par polarisation de
fluorescence suivant la présente invention.
La présente invention a pour buts: - de fournir de nouveaux anticorps utilisables dans la technologie de la purification et de la séparation de
l'interféron- humain, notamment l'interféron lymphoblas-
toide, ou de l'interféron-r- humain; -de fournir des antigènes pour la préparation de ces anticorps; - de fournir un procédé de préparation d'haptènes utilisables pour la préparation de ces antigènes; - de fournir un nouveau procédé de dosage de l'interféron-s et -. humain en utilisant lesdits antigènes
et anticorps.
Par suite de recherches poussées, la Demanderesse a découvert qu'on peut préparer de nouveaux antigènes de l'interféron-t ou -r humain en utilisant un nouveau peptide _ -terminal ou C-terminal de l'interféron lymphoblastolde humain, ou en utilisant un nouveau peptidE N-terminal de l'interféron- humain, les nouveaux peptideE N-terminal et C-terminal ayant été obtenus par synthèse
par la Demanderesse; qu'on peut préparer de nouveaux anti-
corps spécifiques vis-à-vis de l'interféron -A ou -
humain en utilisant lesdits antigènes; que l'interféron-s
ou -P humain visé peut être purifié par une chromatogra-
phie d'affinité en utilisant les nouveaux anticorps; et que le dosage de l'interféron-ç ou -t humain peut être effectué en utilisant les nouveaux antigènes et nouveaux anticorps.
C'est sur ces découvertes que repose la présente in-
vention. C'est ainsi que, suivant la présente invention, les anticorps présentant une spécificité vis-à-vis de l'ii
terféron-d ou -i humain, qui sont utilisables pour puri-
fier et titrer l'interféron, peuvent avantageusement être préparés à l'échelle industrielle en utilisant les peptidi synthétiques qui peuvent aisément être préparés à grande échelle. C'est ainsi que la présente invention établit une nouvelle technologie dans la purification et le système
de dosage de l'interféron- et -r humain.
Le nouveau peptide synthétique obtenu suivant la pré-
sente invention est un peptide synthétique choisi parmi les peptides répondant à la formule générale (1): R1-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (1)
(dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogène, un grou-
pe de formule H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, un
groupe de formule H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-
Gly-Asn-Arg-Arg-Ala- ou un groupe de formule H-Tyr-Ser-Asp-
Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-); les peptides répondant à la formule générale (2): R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-HO (2) (dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe de formule H-ThrAsn-Leu-Gln-, un groupe de formule H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-, un groupe de formule H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln); et les peptides répondant à la formule générale (3): R3-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (3)
(dans laquelle R3 représente un atome d'hydrogène, un grou-
pe de formule H-Phe-, un groupe de formule H-Leu-Gly-Phe-,
un groupe de formule H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe- ou un grou-
pe de formule H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe).
C'est ainsi que le nouveau peptide synthétique est un peptide correspondant au peptide N-terminal de l'interféron lymphoblastoide humain ou ses dérivés /_n peptide répondant à la formule générale (1)7, un peptide correspondant au peptide C-terminal de l'interféron lymphoblastolde humain ou ses dérivés /un peptide répondant à la formule générale (2)7 ou un peptide correspondant au peptide N-terminal de l'interféron- humain ou ses dérivés /un peptide répondant
à la formule générale (3)7.
L'un quelconque desdits peptides synthétiques peut
aisément être préparé en utilisant des aminoacides accessi-
bles sur le marché, et par un procédé simple. Le peptide
synthétique présente l'arrangement spécifique des amino-
acides,de sorte qu'à partir d'un peptide répondant à la formule générale (1) ou d'un peptide répondant à la formule
générale (2) on peut préparer à grande échelle un anti-
gène ayant un site permettant d'identifier l'interfé-
ron-e humain, et à partir d'un peptide répondant à la
formule générale (3) on peut préparer à grande échelle un anti-
gène ayant un site permettant d'identifier l'interféron-s
humain, ainsi qu'un anticorps très sélectif.
En outre, on peut obtenir de façon plus stable, à grande échelle, un anticorps hautement spécifique vis-à-vis de
l'interféron-t ou - humain, en utilisant l'antigène pré-
paré à partir du peptide synthétique précité comme
haptène, qu'en utilisant un interféron-O< ou un interfé-
ron- C naturel. i Le nouveau peptide synthétique suivant la présente
invention peut être préparé par un procédé couramment uti-
lisé pour la synthèse des peptides, notamment, par exemple, un procédé tel que décrit dans "The Peptide', Volume 1, (1966), par Schr6der et Luhke, Academic Press, New York, E.U.A., ou dans "PEPTIDE GOSEI"(Synthèse des peptides) par Izumiya et al, Maruzen & Co., Ltd.(1975). Comme exemples de ces procédés, on citera le procédé à l'azide, le procédé au chlorure, le procédé à l'anhydride d'acide, le procédé à l'anhydride mixte, le procédé au dicyclohexylcarbodiimide
(DCC), le procédé à l'ester actif (procédé à l'ester p-
nitrophénylique, procédé au N-hydroxysuccinimidoester, pro-
cédé à l'ester cyanométhylique, etc..), un procédé utili-
sant le réactif K de Woodward, le procédé au carbodiimida-
zole, le procédé d'oxydation-réduction, le procédé au DCC/additif /_Nhydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboxyimide
(HONB), 1-hydroxy-benzotriazole (HOBt), N-hydroxysuccinimi-
de (HOSu)7/, etc..
Lors de la mise en oeuvre des procédés précités, on
peut effectuer la synthèse en phase solide ou en phase li-
quide, la synthèse en phase liquide étant préférable.
Le nouveau peptide synthétique suivant la présente in-
vention est préparé par un mode courant de synthèse des polypeptides, comme indiqué ci-dessus, par exemple par un mode opératoire dit "à étapes" consistant ainsi à condenser successivement un aminoacide. avec l'aminoacide terminal du peptide, ou par couplage des peptides divisés en plusieurs fragments. Plus particulièrement, on prépare le peptide en condensant une substance de départ ayant un groupe carboxyle réactif correspondant à un fragment divisé en deux portions en la position souhaitée, avec une
autre substance de départ ayant un groupe amino correspon-
dant à un autre fragment, par un procédé couramment utilisé pour la synthèse des peptides. Lorsque le produit condensé ainsi obtenu a un groupe protecteur, on peut préparer le peptide souhaité en éliminant le groupe protecteur de façon courante. Lorsqu'on utilise l'acide aspartique, la lysine
ou l'arginine au stade réactionnel de préparation du pep-
tide suivant l'invention, il est préférable que l'aminoaci-
de soit protégé par un groupe protecteur; au stade final d'une façon générale la totalité des groupes protecteurs étant éliminés du peptide protégé dans lequel au moins un
reste aminoacide constitutif est protegé.
Lors des étapes réactionnelles de la synthèse de pepti-
des suivant la présente invention, tout groupe fonctionnel
devant rester étranger à la réaction de synthèse est géné-
ralement protégé à l'aide d'un groupe protecteur, et le groupe protecteur est éliminé du groupe protégé après la réaction. En outre, un groupe fonctionnel prenant part à la
réaction est généralement activé. Lesprocédés pour effec-
tuer ces réactions sont connus et peuvent être choisis par-
mi ceux connus dans la technique.
Comme exemples de groupes protecteurs pour le groupe
amino, on citera les groupes carbobenzoxy, tert-butyloxy-
carbonyle, tert-amyloxycarbonyle, isobornyloxycarbonyle, pméthoxybenzyloxycarbonyle, 2-chlorobenzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, trifluoroacétyle, phtalyle, formyle,
o-nitrophénylsulfényle, diphénylphosphinothioyle, etc..
Comme exemples de groupes protecteurs pour le groupe carboxyle, on citera les esters alcoyliques (méthylique, éthylique, propylique, butylique, tert-butylique, etc..), un ester benzylique, un ester p-nitrobenzylique, un ester p-méthoxybenzylique, un ester p-chlorobenzylique, un ester benzhydrylique, le carbobenzoxyhydrazide, le tertbutyloxycarbonylhydrazide, le tritylhydrazide, etc. Comme exemples de groupes protecteurs pour le groupe guanidino de l'arginine, on citera les groupes nitro,
tosyle, p-méthoxybenzènesulfonyle, carbobenzoxy, isobornyl-
oxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle, etc.. En outre, le groupe guanidino peut être protégé sous la forme d'un sel avec un acide approprié, comme l'acide benzènesulfonique, l'acide toluènesulfonique, l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique. Le groupe hydroxy de la thréonine et de la sérine peut
être protégé par exemple par estérification ou éthérifica-
tion, si nécessaire. Comme exemples de groupes protecteurs appropriés pour cette estérification, on citera un groupe alcanoyle inférieur comme le groupe acétyle, un groupe aroyle comme le groupe benzoyle, un groupe dérivant de l'acide carbonique comme le groupe benzoyloxycarbonyle, le groupe éthyloxycarbonyle, etc.. Comme exemple de groupe protecteur convenant à l'éthérification, on citera les
groupes benzyle, tétrahydropyranyle, tert-butyle, etc..
La méthionine peut être protégée sous forme de sulf-
oxyde. Comme groupe carDoxyle active, on peut utiliser un chlorure d'acide, anhydride d'acide ou
anhydride mixte correspondant, un. azide, un ester acti-
vé (un ester d'alcool méthylique, d'alcool éthylique,
d'alcool benzylique, de pentachlorophénol, de p-nitrophé-
nol, de N-hydroxysuccinimide, de 1-hydroxybenzotriazole,
de N-hydroxy-5-norbornène-2,3-dicarboxyimide, etc) etc..
La réaction de formation de la liaison peptide peut être effectuée en présence d'un agent de condensation, par
exemple un carbodiimide réactif comme le dicyclohexylcarbo-
diimide, le carbodiimidazole, etc.., ou du tétraéthylpyro-
phosphite, etc..
Le nouveau peptide synthétique suivant l'invention est spécifiquement préparé par l'un quelconque des procédés (A) a (C) suivants: Procédé A: Procédé de préparation d'un peptide répondant à la formule générale (1)
A-(I): Lorsque R1 représente un atome d'hydrogène.
A-Ala-B (2) H-Gln-OH (3) A-Ala-Gln-OH (4) H-Ala-Gln-OH (5) 1 A-Leu-B (6) A-Leu-Ala-Gln-OH (7) H-Leu-Ala-Gln-OH (8) V A-Leu-B (6) A-Leu-Leu-Ala-GlnOH (9) H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (10) 1I A-Ile-B (11) A-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (12) H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (13) 1 A-Leu-B (6) A-Leu-Ile-Leu-Leu-AlaGln-OH (14) H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (15) A-(II): Lorsque R1 représente un groupe de formule H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-. C A-Arg-B (16) 1 H-Ala-B (17) C A-Arg-Ala-B (18) C c H-Arg-Ala-B (19)
C
A-Arg-B (16) C C ! A-Arg-Arg-Ala-B (20) C C I; H-Arg-Arg-Ala-B (21) A-AsnB (22) I C
I (3
A-Asn-Arg-Arg-Ala-B (23) 4, A-Asn-Arg-Arg-Ala-B (24) 1 H-Leu-Ile-Leu-LeuAla-Gln-OH (15) A-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (25) H-AsnArg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (26) < - (36)
A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-
Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (27)
H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-
Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28) /_36) étant préparé comme suit: A-Leu-B (6) 1 H-Gly-B (29) A-Leu-Gly-B (30) H-Leu-Gly-B (31) A-Ser-B (32) A-Ser-LeuGly-B (33) H-Ser-Leu-Gly-B (34 t A-Thr-His-B (35) A-Thr-His-Ser-Leu-Gly-B (36) _7 A-(III): Lorsque R1 représente un groupe répondant à la formule:
H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-. A-Pro-B (37) 1 H-Gln-B (38) A-Pro-Gln-B (39 H-Pro-Gln-B (40) I A-Leu-B (6) A-Leu-Pro-Gln-B (41) & H-Leu-Pro-Gln-B (42) A-Asp-B (43) A-Asp-Leu-Pro-Gln-B (44) D A-Asp-Leu-Pro-Gln-B (45) H-Asp-Leu-ProGln-B (46) 1 A-Ser-B (32) A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (47)
H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-
Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28)
A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-
Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (48)
H-Skr-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-
Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (49) A-(IV): Lorsque R1 représente un groupe de formule:
H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-.
A-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (47) 4 ' H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (50) A-Tyr-B (51) A-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-B (52)
H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-
Il Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (28)
A-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (53)
H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (54) /Dans les procédés A-(I) à (IV) ci-dessus, A est un groupe protecteur pour le groupe amino, B est un groupe actif du
groupe hydroxy ou du groupe carboxyle, C est un groupe pro-
tecteur pour le groupe guanidino de l'arginine, et D est
un groupe protecteur pour l'acide aspartiquel.
Dans les procédés précités, comme groupe A, le groupe tertbutoxycarbonyle (Boc), le groupe carbobenzoyle (Z), le groupe pméthoxybenzyloxycarbonyle, ou analogue est préférable; comme groupe actif du groupe carboxyle représenté par B, un
ester actif comme un groupe N-hydroxysuccinimido, un anhy-
dride d'acide mixte comme un groupe isobutyloxycarbonyle, un grouLe azide, ou analogue est préférable; comme exemples préférables de C, on citera les groupes nitro, tosyle,ou analogue et, comme exemple préférable du groupe D on ci-
tera le groupe benzyloxy ou analogue.
Dans le procédé A-(I) ci-dessus, la réaction d'un aminoacide (2) avec un aminoacide (3) peut être effectuée en présence d'un solvant. On peut utiliser n'importe quel solvant utilisable dans une réaction de condensation de peptides, par exemple, sous forme hydratée ou contenant de l'eau: le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, la pyridine, le chloroforme, le dioxanne, le dichlorométhane,
le tétrahydrofuranne, l'acétate d'éthyle, la N-méthyl-
pyrrolidone, le triamide hexaméthylphosphorique ou un mé-
lange de ces solvants.
Le rapport quantitatif d'aminoacide (3) à aminoacide (2) n'est pas particulièrement limité et peut être choisi dans des limites étendues, généralement un rapport de 5 et,
de préférence, un rapport de 1,5.
La température de réaction peut être choisie dans les limites utilisées dans une réaction de formation de liaison peptide, d'une façon générale d'environ -40 à 60 C, de
préférence d'environ -20 à 40 C. La réaction est générale-
ment effectuée pendant un laps de temps de quelques minutes
à 30 heures environ.
Dans le procédé A-(I) ci-dessus, la réaction d'un
peptide (5) avec un aminoacide (6), la réaction d'un pepti-
de (8) avec un aminoacide (6), la réaction d'un peptide (10) avec un aminoacide (11), et la réaction d'un peptide
(13) avec un aminoacide (6) peut être effectuée par un pro-
cédé similaire à celui décrit pour la réaction d'un amino
acide (2) avec un aminoacide (3).
Dans le procédé A-(II) ci-dessus, la réaction d'un aminoacide (16) avec un aminoacide (17), la réaction d'un
peptide (19) avec un aminoacide (16), la réaction d'un pep-
tide (21) avec un aminoacide (22), la réaction d'un peptide (24) avec un peptide (15), la réaction d'un peptide (26) avec un peptide (36), la réaction d'un aminoacide (6) avec un aminoacide (29), la réaction d'un peptide (31) avec un aminoacide (32) et la réaction d'un peptide (34) avec un peptide (35) peut être effectuée par un procédé similaire
à celui décrit pour la réaction ci-dessus.
Dans le procédé A-(III) ci-dessus, la réaction d'un aminoacide (37) avec un aminoacide (38), la réaction d'un
peptide (40) avec un aminoacide (6), la réaction d'un pep-
tide (42) avec un aminoacide (43), la réaction d'un peptide (46) avec un aminoacide (32) et la réaction d'un peptide
(47) avec un peptide (28); et, dans le procédé A-(IV) ci-
dessus, la réaction d'un peptide (50) avec un aminoacide (51) et la réaction d'un peptide (52) avec un peptide (28) peut également être effectuée par un procédé similaire à
celui décrit plus haut.
La réaction d'élimination du groupe protecteur A fixé respectivement dans les peptides (4), (7), (9), (12), (14),
(18), (20), (25), (27), (30), (33), (39), (41), (45), (47),
(48) et (53) obtenus par les réactions précitées est effec-
tuée par tout mode opératoire couramment utilisé dans la technique. Comme exemples de réactions d'élimination, on
citera la réduction (hydrogénation en utilisant du palla-
dium, du noir de palladium, etc.. comme catalyseur; une
réduction utilisant du sodium métallique dans de l'ammo-
niac liquide), l'acidolyse (utilisant de l'acide trifluora-
cétique, de l'acide fluorhydrique, de l'acide méthanesul-
fonique, de l'acide bromhydrique, etc.. comme acide fort), etc.. La réaction d'hydrogénation catalytique ci-dessus peut être effectuée en utilisant de l'hydrogène à la pression atmosphérique, à une température de 0 à 40 C. Le catalyseur est généralement utilisé en une quantité de 100 mg à 1 g et la réaction est généralement terminée en un laps de
temps d'une à 48 heures.
L'acidolyse précitée est effectuée en l'absence de solvant, à une température de 0 à 30 C, de préférence de 0 à 20 C, et la réaction est généralement terminée en un las
de temps de 15 minutes à une heure. L'acide peut habituel-
lement être utilisé en une quantité représentant de 5 à
fois celle de la substance de départ.
Dans la réduction précitée, effectuée en utilisant du sodium métallique dans de l'ammoniac liquide, on utilise le sodium métallique en une quantité permettant de maintenir la couleur du mélange réactionnel de façon permanente au
bleu pendant un laps de temps de 30 secondes à 10 minutes.
La réduction est habituellement effectuée à une température
de -40 à--70 C.
Le groupe protecteur C fixé dans le peptide (23) et le
groupe protecteur D fixé dans le peptide (45) peuvent éga-
lement être éliminés par le mode de réduction précité.
Les aminoacides (2), (6), (11), (16), (22), (32), (37),
(43) et (51) utilisés dans les procédés A-(I) à A-(IV) ci-
dessus peuvent être des produits commerciaux connus. Les
peptides (18), (23), (35), (36), (44), (47) et (52) utili-
sés dans les procédés A-(I) à A-(IV) précités peuvent éga-
lement être des produits accessibles dans le commerce, ou des produits obtenus par les procédés à l'anhydride mixte ou le procédé de formation d'azide. Le procédé à l'anhydride mixte est effectué dans un solvant approprié, en présence d'un composé basique, en utilisant un acide
alcoylhalocarboxylique. Comme exemples d'acides alcoylhalo-
carboxyliques on citera le chloroformiate de méthyle, le bromoformiate de méthyle, le chloroformiate d'éthyle, le bromoformiate d'éthyle, le chloroformiate d'isobutyle, etc. Comme exemplesde composés basiques, on citera des composés
basiques organiques comme la triéthylamine, la triméthyl-
amine, la pyridine, la diméthylaniline, la N-méthylmorpho-
line, le 1,5-diazabicyclo/4,3,07nonène-5 (DBN), le 1,5-
diazabicyclo/5,4,0O/undécène-5 (DBU), le 1,4-diazabicyclo/2, 2,2/7octane (DABCO) etc..; des composés basiques minéraux comme le carbonate de potassium, le carbonate de sodium, l'hydrogénocarbonate de potassium, l'hydrogénocarbonate de sodium, etc..Le solvant utilisé dans cette réaction peut être choisi parmi n'importe quel solvant utilisable dans une réaction à l'anhydride mixte, par exemple: des hydrocarbures halogénés comme le chlorure de méthylène, le chloroforme, le dichloroéthane, etc..; des hydrocarbures aromatiques comme le benzène, le toluène, le xylène, etc.; des éthers comme l'éther diéthylique, le tétrahydrofuranne, le diméthoxyéthane, etc..; des esters comme l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, etc..; des solvants polaires aprotiques comme le N,N-diméthylformamide, le diméthyl sulfoxyde, le triamide hexaméthylphosphorique, etc. La réaction est effectuée à une température de -20 à 100 C, de préférence de -20 à 50 C, et est généralement terminée en un laps de temps de 5 minutes à 10 heures, de préférence
de 5 minutes à 2 heures.
Dans la réaction de formation d'azide, tout d'abord le groupe carboxylique est activé à l'aide d'un alcool comme l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool benzylique, etc.., puis on fait réagir le groupe carboxyle
activé avec de l'hydrate d'hydrazine, dans un solvant ap-
proprié. Comme exemples de solvants utilisables on citera le dioxanne, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde ou un mélange de ces solvants. L'hydrate d'hydrazine peut être utilisé en une quantité représentant de 5 à 20 fois et de
préférence de 5 à 10 fois la quantité molaire du groupe carboxyli-
que activé. La réaction est généralement effectuée à une
température inférieure à 50 C, de préférence à une tempéra-
tude de -20 à 30 C. C'est ainsi qu'on peut préparer un com-
posé dans lequel le groupe carboxyle de l'aminoacide termi-
nal est substitué par une hydrazine (dérivé d'hydrazine).
Un composé dans lequel le groupe carboxyle de l'aminoacide terminal est substitué par un azide est préparé en faisant réagir, dans un solvant approprié, en présence d'un acide,
le dérivé d'hydrazine précité avec un composé d'acide ni-
treux. Comme acide, on utilise généralement l'acide chlor-
hydrique. Comme solvant, on peut utiliser le dioxanne, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde ou un mélange de ces solvants. Comme composé d'acide nitreux, on peut utiliser
le nitrite de sodium, le nitrite d'isoamyle, le chlorure de nitro-
syle, etc.. Le composé d'acide nitreux est généralement utilisé en une quantité équimolaire à une quantité de 2 moles, de préférence en une quantité de 1 à 1,5 mole par mole de dérivé d'hydrazine. La réaction est généralement effectuée à une température de -20 à 0 C, de préférence de 20 à -10 C, et est menée à bonne fin en un laps de
temps d'environ 5 à 10 minutes.
Procédé B: Procédé de préparation d'un peptide répondant à la formule générale (2)
B-(I): Lorsque R2 représente un atome d'hydrogène.
E A-Lys-B (55) F H-Glu-G (56) F FF A-Lys-Glu-G (57) 4, E H-Lys-Glu-OH (58) A-Ser-B (59) E A-Ser-Ly s-Glu-OH (60) E H-Ser-Lys-Glu-OH (61)
C
A-Arg-B (62)
C E
I A-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (63) E H-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (64) A-Ser-Leu-B (65)À E j EI H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (67) 4,' F A-Glu-B (68)
F E
A-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (69) 4/ H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (70) /le peptide (65)0 étant préparé comme suit: A-Ser-B (59) t H-Leu-G (98) A-Ser-Leu-G (99)
A-Ser-Leu-B (65) _/.
B-(II): Lorsque R2 représente un groupe de formule H-Thr-Asn-Leu-Gln-. HGln-G (71) A-Leu-B (72) A-Leu-Gln-G (73) H-Leu-Gln-G (74) 1 A-Asn-B (75) A-Asn-Leu-Gln-G (76) H-Asn-Leu-Gln-G (77) , A-Thr-B (78) A-Thr-Asn-LeuGln-G (79) A-Thr-Asn-Leu-Gln-B (80) E H-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (81)
A-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-
E
Lys-Glu-OH (82)
H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-
Lys-Glu-OH (83) B-(III): Lorsque R2 représente un groupe de formule:
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-.
A-Leu-B (72) d H-Ser-G (84) A-Leu-Ser-G (85) I- H-Leu-Ser-G (86) 1 A-SerB (59) A-Ser-Leu-Ser-G (87) I A-Ser-Leu-Ser-B (88) | H-Thr-Asn-Leu-GlnGlu-Ser- Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (89) vE I
*A-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-L1s-Glu-OH (90)
E
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (91) B-(IV): Lorsque R2 représente un groupe de formule: H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-. A-Ser-Leu-Ser-G (87) H-Ser-Leu-Ser-G (92) | A-Tyr-B (93) A-Tyr-Ser-Leu-Ser-G (94) A-TyrSer-Leu-Ser-B (95)
H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-
Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (89) E
A-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (96) t
H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH (97) /_ans les procédés B-(I) à (IV) ci-dessus, E représente un groupe protecteur pour le groupei-amino de la lysine, F représente un groupe protecteur pour le grouper-carboxyle de l'acide glutamique, et G représente un groupe protecteur
pour le groupe carboxyle, et A, B et C ont les significa-
tions précitées7.
Dans les procéds ci-dessus, conroe groupe E le groupe tosyle ou analogue est préférable; comme groupe F un groupe benzyloxy ou analogue est préférable; comme groupe G un reste d'ester alcoylique, un tertbutoxycarbonylhydrazide ou analogue
est préférable.
Dans le procédé B(1) ci-dessus, la réaction d'un aminoacide (55) avec un amir.oacide (56), la réaction d'un peptide (58) avec un aminoacide (59), la réaction d'un
peptide (61) avec un aminoacide (62), la réaction d'un pep-
tide (67) avec un aminoacide (65), la réaction d'un peptide (67) avec un aminoacide (68) et la réaction d'un aminoacide
(59) avec un aminoacide (98); dans le procédé B-(II) ci-
dessus, la réaction d'un aminoacide (71) avec un aminoacide (72), la réaction d'un peptide (74) avec un aminoacide (75), la réaction d'un peptide (77) avec un aminoacide (78) et la réaction d'un peptide (80) avec un peptide (81); dans le procédé B-(III) ci-dessus, la réaction d'un aminoacide (72) avec un aminoacide (84), la réaction d'un peptide (86) avec un aminoacide (59) et la réaction d'un peptide (88)
avec un peptide (89); ainsi que dans le procédé B-(IV) ci-
dessus, la réaction d'un peptide (92) avec un aminoacide (93) et la réaction d'un peptide (95) avec un peptide (89) peuvent être effectuées par un mode opératoire similaire à celui utilisé pour la réaction d'un aminoacide (2) avec un
aminoacide (3) dans le procédé A précité.
La réaction d'élimination du groupe protecteur A ou C respectivement fixés sur des peptides compris parmi ceux obtenus dans les réactions précitées peut être effectuée par un mode opératoire similaire à celui décrit dans le procédé A précité. En outre, la réaction d'élimination des groupes protecteurs E, F et G peut être effectuée comme décrit pour la réaction d'élimination du groupe protecteur
C décrite ci-dessus.
Les aminoacides (55), (56), (59), (62), (68), (71),
(72), (75), (78), (84), (93) et (98) utilisés dans les pro-
cédés B-(I) 4 B-(IV) ci-dessus peuvent être des produits accessibles dans le commerce.- Les peptides (G5),(80),(8E) et
(95) utilisés dans les procédés B(I) à B (IV) peuvent éga-
lement être des produits du commerce ou des produits obte-
nus par le procédé à l'anhydride mixte ou le procédé à l'azi-
de. Ces proc5dgs ont déjà été décrits à propos du procédé A. Le peptide (81) utilisé dans le procédé B-(II) ci-dessus peut être obtenu en éliminant les groupes protecteurs A et
F du peptide (69), et le peptide (89) utilisé dans le pro-
cédé B-(III) ci-dessus peut être obtenu en éliminant le groupe protecteur A du peptide (82). La réaction d'élimi-
nation des groupes protecteurs peut être suivie des pro-
cédés précités.
Procédé C:Procédé de préparation d'un peptide répondant à la formule générale (3)
C-(I): Lorsque R3 représente un atome d'hydrogène.
A-Leu-Gln-B (101) c H-Arg-Ser-Ser-OH (102) C a / I A-Leu-Gln-Arg-Ser-SerOH (103) H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (104) /le peptide (101)e étant préparé comme suit: A-Ser-B (121) 1 H-Ser-OR4 (122) A-Ser-Ser-OR4 (123) H-Ser-SerOR4 (124) C A-Arg-B (125) C A-Arg-S r-Ser-OR4 (126) A-Arg-Ser-Ser-OH (127) CI
H-Arg-Ser-Ser-OH (101) _7.
C-(II): Lorsque R3 représente un groupe de formule H-Phe-.
C H-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (105) A-Phe-B (106) / IC A-Phe-Leu-Gln-Arg-SerSer-OH (107) H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (108) C-(III): Lorsque R3 représente un groupe de formule H-Leu-Gly-Phe-. C H-Phe-Leu-Gln-Arg-SerSer-OH (109) d A-Leu-Gly-B (110) A-e-lyP Ll, C A-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-ArgSer-Ser-OH (111) H-Leu-GIy-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (112) C-(IV): Lorsque R3 représente un groupe de formule
H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-.
C H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (113) A-Tyr-Asn-Leu-B (114) X! lC A-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH t1 (115) H-Tyr-Asn-LeuLeu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (116) /le peptide (114) étant préparé comme suit: A-Asn-B (128) 1 H-Leu-OR4 (129) A-Asn-Leu-OR4 (130) H-Asn-LeuOR (131) A-Tyr-B (132) A-Tyr-Asn-Leu-OR4 (133) A-Tyr-Asn-Leu-OH (134) ATyr-Asn-Leu-B (114) _ C-(V): Lorsque R3 représente un groupe de formule: H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-.
C
H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH A-Met-Ser-B (118) (117)
A-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-
Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (119) t C
H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-
Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (120) /Dans les procédés C-(I) à (V) ci-dessus, R4 représente un groupe alcoyle inférieur; A, B et C ont les significations précitées7. Dans ce qui précede: la réaction d'un peptide (100) avec un peptide (101), la réaction d'un peptide (105) avec un aminoacide (106), la réaction d'un peptide (109) avec un peptide (110), la réaction d'un peptide (113) avec un
peptide (114), la réaction d'un peptide (117) avec un pep-
tide (118), la réaction d'un aminoacide (121) avec un aminoacide (122), la réaction d'un peptide (124) avec un aminoacide (125), la réaction d'un aminoacide (128) avec un aminoacide (129) et la réaction d'un peptide (131) avec un aminoacide (132) peuvent être effectuées comme décrit à
propos de la réaction d'un aminoacide (2) avec un amino-
acide (3) dans le procédé A précité.
L'élimination du groupe protecteur A ou C fixé sur des peptides respectifs parmi ceux obtenus dans les réactions précitées peut être effectuée par un mode
opératoire similaire à celui décrit dans le procédé A pré-
cité. La réaction pour obtenir un peptide (127) ou (134)par hydrolyse d'un peptide (126) ou (133) peut être effectuée en présence d'un acide minéral comme l'acide chlorhydrique,
l'acide sulfurique, etc.. ou dans un alcali comme l'hydro-
xyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, etc.. dans un
solvant comme le méthanol, l'éthanol, le dioxanne, etc..
D'une façon générale, la réaction est effectuée à une tem-
pérature de 20 à 50 C pendant un laps de temps d'environ
minutes à 3 heures.
Le peptide (105) utilisé dans le procédé C-(II) précité peut être préparé en éliminant le groupe protecteur A du peptide (102). De façon similaire, le peptide (109) utilisé
dans le procédé C-(III) précité peut être préparé en élimi-
nant le groupe protecteur A du peptide (107);le peptide(113) utilisé dans le procédé C-(IV) précité peut être préparé en 25031t45 éliminant le groupe protecteur A du peptide (111); et le peptide (117) utilisé dans le procédé C-(V) précité peut être préparé en éliminant le groupe protecteur A du peptide (115). La réaction d'élimination des groupes protecteurs peut être effectuée dans les conditions des réactions
d'élimination précitées.
En ce qui concerne les procédés préférables pour obte-
nir le peptide (114) à partir du peptide (134), on citera, par exemple, le procédé à l'anhydride d'acide mixte, le procédé de formation d'azide, etc.. comme décrit plus haut à propos du procédé A. Les peptides suivant la présente invention, tels que préparés par les procédés décrits cidessus, sont isolés
du mélange réactionnel et purifiés par des modes opératoi-
res courants pour isoler les peptides, par exemple par
extraction, partage, chromatographie sur colonne, etc..
Comme précédemment décrit, on obtient ainsi les pepti-
des suivant la présente invention, à savoir: le peptide N-terminal de l'interféron lymphoblastoide humain, le peptide C-terminal de l'interféron lymphoblastoide humain, le peptide N-terminal de l'interféron-( humain et leurs dérivés. Les peptides synthétiques ainsi obtenus peuvent être
utilisés comme antigène marqués utilisés les dosages radio-
immunologiques (RIA) ou les dosages immunologiques par polarisation de fluorescence, en introduisant un agent de marquage courant, par emmple de l'iode radioactif comme 125I, 131I, etc, un fluorochrome
comme l'isothiocyanate de fluoresceine (FITC), l'isothio-
cyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC), un isothiocyanate
de rhodamine substituée (XRITC), l'isothiocyanate de rho-
damine B, la dichlorotriazinefluorescéine (DTAF), etc., ou
une enzyme, etc..
L'introduction d'iode radioactif est effectuée en traitant un peptide contenant un groupe tyrosyle choisi
parmi les peptides synthétiques précités par un mode d'io-
dation courant, par exemple un mode d'iodation par oxyda-
tion utilisant de la Chloramine T (cf. W.M.Hunter et F.C.
Greenwood: Nature, 194, page 495 (1962); Biochem. J., 89, page 114, 1963)) . Le mode d'iodation précité est effectué dans un solvant approprié, par exemple une solution 0,2M
de tampon de phosphate (pH = 7,4), en présence de Chlora-
mine T, à température ambiante, pendant de 10 à 30 secon-
des. L'iode radioactif peut être utilisé à raison d'envi-
ron 1 millicurie pour 1 nanomole de molécule de tyrosine contenue dans le peptide, en même temps que de 10 à 100
nanomoles de Chloramine T, lorsqu'un atome de l'iode radio-
actif doit être introduit dans la molécule de tyrosine.
De façon similaire, lorsqu'on veut introduire deux atomes d'iode radioactif dans la molécule de tyrosine, on peut utiliser 2 millicuries d'iode radioactif pour 1 nanomole de molécule de tyrosine contenue dans le peptide, ainsi que de 10 à 100 nanomoles de Chloramine T. Le peptide ainsi préparé, marqué à l'iode radioactif,
peut être isolé et purifié en utilisant un mode d'isole-
ment classique, par exemple par extraction, partage, chro-
matographie sur colonne, dialyse, etc.. Si nécessaire, le
peptide marqué peut être conservé à l'état lyophilisé.
Le peptide marqué au fluorochrome est préparé en in-
troduisant le fluorochrome dans le groupe N-terminal ou
amino de la molécule du peptide synthétique, dans une solu-
tion tampon appropriée, à l'état alcalin, de préférence à un pH de 8 à 12. La nature de la solution tampon n'est pas particulièrement limitée; on peut choisir parmi une gamme étendue, tant que le pH de la solution tampon est compris
dans les limites précitées.
Comme exemples de solutions tampon utilisables, on citera des solutions tampon de borate, de bicarbonate, de glycine, de Barbital, de tris, d'ammediol, de Ringer, etc. Lorsque le peptide et/ou le fluorochrome n'est pas
soluble dans la solution tampon, on peut effectuer la réac-
tion de marquage en additionnant le système réactionnel
d'un solvant commun comme par exemple le méthanol, l'étha-
nol, l'acétone, le diméthylformamide, etc..
La réaction de marquage s'effectue généralement à une température de 0 à 40'C, de préférence de 0 à 20C, et est terminée en un laps de temps de quelques minutes à 48 heu-
res environ.
La proportion de fluorochrome n'est aucunement limitée
et elle peut être choisie dans des limites étendues, repré-
sentant généralement de 1 à 10 fois la quantité molaire, et
de préférence de 2 à 4 fois la quantité molaire de fluoro-
chrome par groupe amino contenu dans le peptide. Le peptide
ainsi obtenu, marqué au fluorochrome, peut être isolé, pu-
rifié et conservé de la même manière que le peptide marqué
à l'iode radioactif.
A ce jour, les interférons sont dosés indirectement par des modes de mesure biologiques, sur la base de leurs activités physiologiques /Finter, N.B. dans Interferon and
Interferon Inducers (édité par Finter, N.B.), pages 135-
(North-Holland, Amsterdam, 1973)7. C'est ainsi que le mode de mesure biologique nécessite des cellules vivantes et des virus vivants capables d'infecter lesdites cellules, et la puissance des interférons est dosée en déterminant,
directement ou indirectement, le degré de mortalité cellu-
laire provoqué par l'infection virale. Toutefois, ce mode de mesure biologique donne des résultats instables et diffus, car les substances utilisées sont des organismes vivants. En outre, si l'échantillon testé contient une quelconque substance ayant une activité antivirale, autre que les interférons à tester, ce mode de mesure biologique de dosage des interférons perd toute signification. En outre, le dosage sélectif de l'interférons- humain ou de l'interféron-s humain ne peut être effectué à l'aide de ce
mode de mesure biologique. En outre, ce mode de mesure bio-
logique nécessite plusieurs jours pour obtenir les résultats avec des opérations trop compliquées et, par suite, ne peut
répondre aux exigences du monde médical.
A la différence de ce mode de mesure biologique, le
nouveau procédé suivant l'invention pour doser les inter-
férons humains, par dosage radio-imnunolorique ou un dosage
immunologique par polarisation de fluorescence, en uti-
lisant les antigènes marqués ( peptides marqués), permet
de titrer l'interféron - A humain ou l'interféron- A hu-
main sélectivement, simplement, rapidement, et avec une
haute précision.
On connaissait bien, à ce jour, les méthodes de do-
sage immunologique par polarisation de fluorescence, mais,
toutefois, on ne connaissait pas l'application de ce pro-
cédé à la détermination qualitative des interférons. La raison en est qu'il était très difficile de préparer un interféron purifié marqué à l'aide de fluorochrome
et que, même si on avait pu obtenir cet interféron puri-
fié marqué au fluorochrome, cette substance marquée ayant une masse moléculaire élevée ne peut que montrer moins de variations dans le degré de polarisation (valeur P) et c'est ainsi qu'on ne pouvait obtenir une sensibilité
adéquate dans la détermination qualitative.
Contrairement à ce qui précède, les peptides marqués au fluorochrome suivant la présente invention peuvent
montrer des variations importantes du degré de polarisa-
tion (valeur P) et sont des substances marquées utiles
pour doser l'interférons humain ou l'interférons a hu-
main avec une précision adéquate pour la détermination
qualitative. Par suite de la mise au point de ces pep-
tides marqués au fluorochrome, on peut maintenant ef-
fectuer la détermination de l'interférons i humain ou
de l'interféron- P humain en utilisant le dosage immu-
nologique par polarisation de fluorescence précité.
On décrira en détails ci-dessous une méthode de
dosage des interférons par dosage immunologique par po-
larisation de fluorescence.
La suite des processus et opérations de mesure
ne diffère pas fondamentalement des opérations effec-
tuées dans le mode courant de dosage immunologique par
polarisation de fluorescence.
On peut appliquer le mode de dosage des interférons sui-
vant la présente invention en utilisant l'antigène étalon, et l'anticorps agissant contre lui, ainsi que le peptide marqué au fluorochrome. On peut utiliser comme antigène étalon de l'interferon-il humain naturel lui-même ou de l'interféron-. humain naturel lui-même, ou un peptide répondant aux formules générales (1) à (3) dont le pouvoir antigéniqoe est équivalent à celui de l'interféron-1 ou
-j, humain. Lorsqu'on utilise ledit peptide, on peut aisé-
ment calculer la puissance de l'interféron de l'échantillon
inconnu si l'on connaît la réactivité croisée de l'in-
terféron-". ou -e humain et du peptide contre l'anticorps, avant le test. Si l'on considère cela, les efforts, les
coûts et les opérations nécessaires à l'obtention de l'an-
tigène étalon, l'utilisation du peptide est tout-à-fait avantageuse. En ce qui concerne l'anticorps d'interféron utilisé dans le mode de dbsage suivant la présente invention, on peut utiliser tout anticorps contre l'interféron-sK ou -ô humain ou un peptide répondant aux formules générales (1) à
(3), et, de préférence, comme expliqué ci-après, un anti-
corps hautement spécifique vis-à-vis de l'interféron-d ou -@ humain qui est préparé en utilisant comme haptène un
peptide répondant aux formules générales (1) à (3).
En ce qui concerne la suite des opérations nécessaires
aux mesures: on prépare tout d'abord une série d'échantil-
lons dilués de l'antigène étalon, en diluant l'antigène à l'aide d'une solution de dilution appropriée. La solution de dilution n'est nullement limitée et on peut utiliser toute solution convenant à ce type de procédé. Notamment, on peut utiliser une solution tampon ayant un pH de 5 à 10, de préférence, un pH de 7 à 8, par exemple une solution tampon de borate, une solution tampon tris-HC1, une solution tampon de phosphate, une solution tampon d'acide acétique, une solution tampon acide citrique- acide phosphorique, une solution tampon de glycine, etc.. En outre, pour inhiber l'adsorption, on peut additionner la solution de dilution de séruralbumine de bovin (BSA), d'azoture de sodium comme
conservateur, et d'un additif courant comme EDTA, le chlo-
rure de sodium, etc..
Ensuite, une quantité prédéterminée de l'anticorps et une quantité prédéterminée du peptide marqué au fluoro- chrome sont ajoutées aux échantillons respectifs de la série de dilutions de l'antigène étalon, ce qui fournit des échantillons qu'on laisse reposer à une température de
0 à 370C pendant un laps de temps de 30 minutes à 48 heu-
res, et on mesure, par un procédé courant, l'intensité de la fluorescence polarisée verticale (Ivs) et l'intensité de la fluorescence polarisée horizontale (IHS). On peut aisément mesurer la fluorescence polarisée en utilisant un
appareil courant pour la mesure de l'intensité de la lumiè-
re polarisée, par exemple un appareil "FS-501" accessible
dans le commerce (produit par Union-Giken-Sha, Co., Ltd.).
En procédant comme décrit ci-dessus pour la prépara-
tion de la série de dilutions de l'antigène étalon, on pré-
pare une série d'échantillons de référence ne contenant pas le peptide marqué au fluorochrome, et on mesure l'intensité de la fluorescence polarisée verticale (IVR) et l'intensité
de la fluorescence polarisée horizontale (IHR).
On obtient ensuite une courbe d'étalonnage du degré de polarisation (valeur P) en fonction de la concentration des
échantillons dans la série des dilutions de l'antigène éta-
lon. Le degré de polarisation (valeur P) est calculé d'après la formule suivante: (IVS - IHS) - (IHS HR x 100 (%) <Vs IVR) + (IHS IHR) En utilisant, à la place des échantillons d'antigène étalon, des échantillons contenant de l'interféron-'K ou -y humain de concentration inconnue, on peut doser d'après la
courbe étalon l'interféron-4 ou -y contenu dans les échan-
tillons, en calculant de façon similaire la valeur P obte-
nue.
Lorsqu'on utilise comme antigène étalon un interfé-
ron -o ou - P humain naturel, on peut obtenir le
titre de l'interféron de l'échantillon d'après la cour-
be d'étalonnage.
Lorsqu'on utilise comme antigène étalon un peptide répondant à l'une des formules générales (1) à (3), on
obtient avant le test la réactivité croisée de l'inter-
féron- c ou -,8 humain et du peptide contre l'anticorps,
puis on convertit le titre de l'interféron.
Les peptides synthétiques suivant la présente in-
vention peuvent être utilisées comme haptènes pour
préparer l'antigène d'interféron- d ou - f humain.
On décrira ci-dessous le mode de préparation de
l'antigène d'interféron- o( ou - P humain.
On prépare l'antigène d'interféron- od ou - a humain en faisant réagir un peptide synthétique utilisé comme
haptène avec un porteur, en présence d'un agent de fi-
xation du porteur sur l'haptène.
Comme véhicule ou porteur à fixer sur l'haptène utilisé dans le procédé précité, on peut utiliser une
protéine naturelle ou synthétique ayant une masse molé-
culaire élevée couramment utilisée dans la préparation des antigènes courants, par exemple des sérum-albumines
animales comme la sérum-albumine de cheval, la sérum-
albumine de bovin, la sérum- albumine de lapin, la sérum-
albumine humaine, la sérum-albumine d'ovin, etc; des sérum-globulines animales comme la sérum-globuline de
cheval, la sérum-globuline de bovin, la sérum-globuli-
ne de lapin, la sérum-globuline humaine, la sérum- glo-
buline d'ovin, etc; des thyroglobulines animales comme la tyroglobuline de cheval, la thyroglobuline de bovin, la thyroglobuline de lapin, la thyroglobuline humaine,
la thyroglobuline d'ovin, etc; des hémoglobulines ani-
males comme l'hémoglobuline de cheval, l'hémoglobuline de bovin, l'hémoglobuline de lapin, l'hémoglobuline humaine, l'hémoglobuline d'ovin, etc; des hémocyanines animales; des protéines extraites d'ascaris [ d'extraits d'ascaris eux-xrfxoes cornie décrit dans le brevet japonais (Kokai) Sn'Sho-16414/1981, J.Immun., 111, 260-268 (1973); J. Immun., 122,
302-308 (1979); J. Immun. 98, 893-900 (1967) et Am. J. Phy-
siol., 199, 575-578 (1960), ou des produits obtenus à par-
tir d'eux par purification plus poussée7; une polylysine, un acide polyglutaminique, un copolymère lysine-acide glutaminique, un copolymère contenant de la lysine ou de
l'ornithine, etc..
En ce qui concerne l'agent de fixation du porteur sur l'haptène, on peut choisir parmi la gamme étendue de ceux
classiquement utilisés pour préparer les antigènes cou-
rants, notamment: des dialdéhydes aliphatiques comme le glyoxal, le dialdéhyde malonique, le glutaraldéhyde, le succinaldéhyde, l'adipoaldéhyde, et autres similaires
pouvant créer une liaison de réticulation entre deux grou-
pes amino; des dimaléimides comme le N,N'-o-phénylènedi-
maléimide, le N,N'-m-phénylènedimaléimide, etc.. lesquels
peuvent créer une liaison de réticulation entre deux grou-
pes thiol; des malêimidocarboxyl-N-hydroxysuccinimidoesters comme le métamaléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidoester,
le 4-(maléimidométhyl)-cyclohexane-1-carboxyl-N'-hydroxy-
succinimidoester, etc.., lesquels peuvent former une liaison de réticulation entre un groupe amino et un groupe
thiol; des agents de déhydrocondensation comme le N,N-
dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le N-éthyl-N'-diméthylamino carbodiimide, le 1-éthyl-3-diisopropylaminocarbodiimide,
le 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-éthyl)carbodiimide etc..
lesquels sont utilisables pour une réaction de formation de liaison peptide courante, par exemple pour combiner un groupe amino avec un groupe carboxyle; en outre, des acides
diazonium arylcarboxyliques comme l'acide p-diazonium phé-
nylacétique, etc.. peuvent être utilisés en association avec un réactif courant de formation de liaison peptide,
par exemple l'agent de déhydrocondensation précité.
La réaction de préparation des antigènes suivant la
présente invention est effectuée par exemple dans une solu-
tion aqueuse ou une solution tampon courante ayant un pH de 7 à 10, de préférence de 8 à 9, à une température de 0 à 400C, de préférence à température ambiante, pendant un
laps de temps d'environ 1 à 24 heures, de préférence d'en-
viron 3 à 5 heures.
Comme exemples de solutions tampon représentatives utilisables dans la réaction, on citera: une solution tam-
pon hydroxyde de sodium 0,2N - acide borique 0,2M - chlo-
rure de potassium 0,2M; une solution tampon carbonate de sodium 0,2M acide borique 0,2M - chlorure de potassium
0,2M; une solution tampon tétraborate de sodium 0,05M -
* acide borique 0,2M - chlorure de sodium 0,05M; et une so-
lution tampon dihydrophosphate de potassium 0,1M - tétra-
borate de sodium 0,05M.
Dans la réaction précitée, les proportions quantitati-
ves d'haptêne, d'agent de fixation du porteur sur l'haptène et de porteur peuvent être déterminées de façon appropriée et, d'une façon générale, on utilise une proportion de porteur représentant de 2 à 6 fois et de préférence de 3 à 5 fois la quantité d'haptène, et on utilise de 5 à 10 moles de l'agent de fixation du porteur sur l'haptène par mile
d'haptène. La réaction précitée permet d'obtenir un anti-
gène d'interféron-& ou-P., humain constitué par un véhicule ou porteur et un haptène qui sont tous deux combinés à
l'aide d'un agent de fixation du porteursur l'haptène.
Une fois la réaction terminée, on peut aisément isoler et purifier l'antigène ainsi obtenu, de façon classique, par dialyse, filtration sur gel, précipitation fractionnée,
etc.. En outre on peut conserver l'antigène sous forme lyo-
philisée classique.
On obtient ainsi une composition d'antigène d'interfé-
ron-d& ou -( humain constituée par un des peptides synthéti-
ques suivant la présente invention et un véhicule. L'anti-
gène est une composition dans laquelle, d'une façon géné-
rale, sont combinées en moyenne de 5 à 20 moles du peptide par mole de la protéine, et on peut préparer à partir de cet antigène, de façon bien reproductible, un anticorps hautement spécifique vis-à-vis de l'interféron-$ ou -i humain. En particulier, parmi les compositions d'antigène, une composition présentant un taux de fixation protéine/ peptide de 1/8 à 1/5 présente une spécificité très élevée
et est très préférable, car on peut, à partir d'elle, obte-
nir un anticorps très puissant et très sensible.
La préparation de l'anticorps à l'aide de l'antigène
obtenu comme décrit ci-dessus est effectuée comme suit.
On administre l'antigène à un mammifère et on recueille
l'anticorps produit dans l'organisme de l'animal.
Le choix de l'animal à utiliser pour préparer l'anti-
corps n'est pas particulièrement limité et, d'une façon générale, il est préférable d'utiliser des lapins ou des
cobayes. Pour préparer l'anticorps, une quantité prédéter-
minée de l'antigène obtenu comme décrit ci-dessus est diluée à l'aide de sérum physiologique à une concentration appropriée, et cette solution diluée est ensuite diluée par mélange avec un adjuvant complet de Freund afin d'obtenir une suspension qu'on administre ensuite à un mammifère. Par exemple on administre la suspension par voie percutanée à un lapin, à raison de 0,5 à 5 mg d'antigène à chaque
administration, et on poursuit les administrations une se-
maine sur deux pendant 2 à 10 mois, de préférence pendant 4 à 6 mois afin de réaliser l'immunisation. Pour recueillir
l'anticorps, on prélève du sang sur l'animal immunisé lors-
qu'une grande quantité d'anticorps a été produite dans
l'organisme de l'animal après l'administration de la sus-
pension, d'une façon générale de 1 à 2 semaines après la dernière administration de la suspension. Le sang prélevé chez l'animal est traité par séparation centrifuge, afin de séparer le sérum et d'obtenir l'anticorps. Conformément au procédé suivant la présente invention, sur labase des propriétés spécifiques de l'antigène, on peut obtenir un anticorps ayant une excellente spécificité vis-à-vis de
l'interféron-z, ou -@ humain, très puissant et très sen-
sible.
L'anticorps suivant la présente invention ainsi obte-
nu a une excellente spécificité vis-à-vis de l'interféron-
t. ou î. humain et est précieux, car il peut permettre de doser l'interféron-t ou -,% humain par le procédé RIA de façon très précise. En outre, l'anticorps peut être utilisé dans un procédé de dosage immuno enzymatique (EIA),
un mode de dosage immunologique par fluorescence (FIA), etc..
en marquant l'anticorps à l'aide d'une enzyme ou d'un flu- orochrome. De plus, l'anticorps peut être utilisé comme substance de départ pour la préparation d'un adsorbant à utiliser en chromatographie d'affinité, en immobilisant
l'anticorps sur un support insoluble approprié.
En utilisant l'adsorbant pour cette chromatogra-
phie d'affinité, l'interféron-k ou -t humain peut être isolé et purifié à partir d'un produit brut d'interférons, par le choix du type d'anticorps à utiliser. C'est ainsi
que lorsqu'on utilise un adsorbant dans lequel l'anticorps de-I'in-
terfércn-. humain est immbilisê, l'interféron- humain est sélectivement adsorbé et, de même, lorsqu'on utilise un adsorbant dans lequel l'anticorps d'interféron-r humain
est immobilisé, c'est l'interféron-s humain qui est sélec-
tivement adsorbé.
Ensuite, à partir de l'adsorbant contenant l'interféron-d ou -ô humain adsorbé, on peut désorber l'interféron-s ou - humain, de façon douce, par une opération simple et,
ainsi, obtenir un interféron-s ou -4 humain très pur, qua-
litativement, et sans perte de son activité.
L'adsorbant pour chromatographie d'affinité peut être
préparé comme décrit ci-dessous.
Pour immobiliser l'anticorps d'interféron humain sur un support insoluble, on peut faire appel à tout mode d'immobilisation d'un matériau biologique et, parmi les procédés classiques, le procédé utilisant un polysaccharide
activé par du bromure de cyanogène est préférable. Le pro-
cédé utilisant un polysaccharide activé par du bromure de
cyanogène consiste tout d'abord à traiter le support in-
soluble par du bromure de cyanogène, puis à coupler le sup-
port activé ainsi obtenu avec une substance biologique,dans
des conditions douces, afin d'immobiliser la bio-substance.
Pour traiter le support insoluble par du bromure de cyano-
gène, on peut opérer à un pH de 11 à 12 en utilisant un
composé basique comme l'hydroxyde de sodium, l'hydrogéno-
carbonate de sodium, etc., à température ambiante et dans un solvant comme l'eau, l'acétonitrile, etc.. pendant un laps de temps d'environ 1 à 12 minutes. Le rapport pondé- ral de bromure de cyanogène à support insoluble peut,d'une façon générale, être équivalent. En ce qui concerne le support insoluble, on peut utiliser n'importe quel support insoluble connu présentant une faible absorbabilité
non spécifique vis-à-vis des substances biologiques en gé-
néral, très poreux, contenant des groupes fonctionnels per-
mettant d'immobiliser la substance biologique dans des
conditions douces, et étant suffisamment stable chimique-
ment et physiquement. Par exemple, on peut utiliser un support de type cellulosique comme l'aminoéthyl cellulose,
la carboxyméthylcellulose, la bromoacétylcellulose, la p-
anilinocellulose, etc.; un véhicule de type dextrane réticu-
lé comme Sephadex, CM-Sephadex (fournis par Pharmacia Fine Chemicals, Inc. ), etc..; un véhicule de type agarose comme
Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B (fournis par Phar-
macia Fine Chemicals, Inc.), etc..
Lors du couplage du support activé au bromure de cya-
nogène ainsi obtenu avec l'anticorps d'interféron humain, on peut faire réagir de 30 à 80 fois la quantité en poids
de support activé au bromure de cyanogène avec un anti-
corps d'interféron humain dans un solvant approprié, comme une solution aqueuse 0,1M d'hydrogénocarbonate de sodium (contenant 0,5M de chlorure de sodium, pH = 8,4), à une
température généralement comprise entre 0 et 40'C, de pré-
férence à une température de 2 à 80C, pendant d'environ 10
à 20 heures. On obtient ainsi un absorbant pour chromato-
graphie d'affinité suivant la présente invention. On peut
conserver l'adsorbant dans un solvant approprié, par exem-
ple dans du sérum physiologique.
Les exemples non limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention et, notamment à titre
d'illustration de la préparation de peptides suivant l'in-
vention ainsi que des antigènes et anticorps obtenus à
partir d'eux.
Dans les exemples de préparation suivants, le Rf déterminé en utilisant les solvants mixtes suivants sur chromatographie en couche mince (CCM) sur gel de silice. RfI... 1-butanol - acide acétique - eau (4/1/5) RfII... 1-butanol - pyridine - acide acétique - eau
(15/10/3/12)
Syn=thèse de peptides Exemple de préparation A-1 1. Préparation de Z-AlaGln-OH A une solution de 4,80 g de Z-Ala-Osu dans 60 ml de tétrahydrofuranne on ajoute une solution de 2,19 g de H-Gln-OH dans 40 ml d'eau et 2,10 ml de triéthylamine, et
on agite le mélange à température ambiante pendant 20 heu-
res. On élimine le tétrahydrofuranne et l'eau par distil-
lation et on extrait le résidu ainsi obtenu à l'aide de n-
butanol. On lave l'extrait butanolique à l'acide acétique
à 2% et on élimine le butanol par distillation. On re-
cueille par filtration le précipité résultant et on repré-
cipite à l'aide d'un mélange méthanol-acétate d'éthyle,
obtenant ainsi 3,87 g de Z-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,41 RfII: 0,56 Analyse élémentaire: pour C16H21N306 C H N Calculé %: 54,69 6,02 11,96 Trouvé %: 54,50 6,31 11,62 2(a). Préparation de H-AlaGln-OH On dissout 3,50 g de Z-Ala-Gln-OH dans 50 ml d'eau et 30 ml de méthanol, et on soumet le mélange à une réduction catalytique en utilisant du palladium comme catalyseur,
afin d'obtenir H-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,04.
2(b). Preparation de Z-Leu-Ala-Gln-OH On dissout 3,97 g de Z-Leu-OSu, le H-Ala-Gln-OH obtenu en 2(a) ci-dessus et 1,39 ml de triéthylamine dans 50 ml de diméthylformamide et on agite le mélange à température ambiante pendant 20 heures. On élimine le diméthylformamide
par distillation et on extrait le résidu résultant à l'acé-
tate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique iN, trois fois, et 5 fois à l'eau. On élimine l'acétate d'éthyle par distillation, on additionne le résidu d'éther, on recueille le précipité résultant par filtration, on sèche et on reprécipite à l'aide de méthanol-acétate d'éthyle,
obtenant ainsi 2,15 g de Z-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,49 RfII: 0,62 Analyse élémentaire: pour C22H32N407 C H N Calculé %: 56,88 6,94 12,06 Trouvé %: 56,41 6,80 12,18 3(a). PrêEaration de H-LeuAla-Gln-OH A 2,10 g de Z-Leu-Ala-Gln-OH on ajoute 20 ml d'une
solution d'acide acétique contenant 25% de bromure d'hydro-
gène, puis on abandonne le mélange à température ambiante
pendant une heure. Une fois la réaction terminée, on addi-
tionne le mélange réactionnel d'éther sec afin d'obtenir
H-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,10.
3(b). Préparation de H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH
On dissout 1,96 g de Z-Leu-OSu, 0,63 ml de triéthyl-
amine et le H-Leu-Ala-Gln-OH obtenu ci-dessus dans 50 ml de diméthylformamide, et on agite à température ambiante pendant 20 heures. Après élimination du diméthylformamide par distillation, on additionne le résidu d'acide citrique
1M et on recueille le précipité cristallin par filtration.
On lave les cristaux à l'eau jusqu'à neutralité du filtrat, puis on sèche. On lave les cristaux séchés à l'aide de méthanol-acétate d'éthyle, obtenant ainsi 1,63 g de Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH. RfI: 0,58 RfII: 0,64 Analyse élémentaire: pour C28H43N508 C H N Calculé % 58,22 7,50 12,12 Trouvé % 57,85 7,90 11,96 4(a). Préparation de H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH
A 1,50 g de Z-Leu-Leu-Ala-Gln-OH on ajoute 20 mld'aci-
de acétique contenant 25% de bromure d'hydrogène, puis on
agite le mélange à température ambiante pendant une heure.
On additionne le mélange réactionnel d'éther sec et on recueille le précipité solide par filtration, obtenant
ainsi H-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,19.
4(b). PrEéaration de Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH
On dissout 1,41 g de Z-Ile-OSu, le H-Leu-Leu-Ala-Gln-
OH obtenu ci-dessus et 0,36 ml de triéthylamine dans 50 ml
de diméthylformamide, puis on agite le mélange à tempéra-
ture ambiante pendant 20 heures. Apres élimination du diméthylformamide par distillation, on additionne le résidu
d'acide citrique 1N, on recueille par filtration le préci-
pité cristallin qu'on lave au méthanol chaud, obtenant ain-
si 1,17 g de Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,61 RfII: 0,71 Analyse élémentaire: pour C34H54N6C9: C H N Calculé % 59,11 7,87 12,16 Trouvé % 59,23 7,80 12,02 (a). Préparation de H-IleLeu-Leu-Ala-Gln-OH A 1,10 g de Z-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH on ajoute 15 ml d'une solution d'acide acétique contenant 25% de bromure
d'hydrogène, puis on agite le mélange à température ambi-
ante pendant une heure. Une fois la réaction terminée, on
additionne le mélange réactionnel d'éther sec, afin d'obte-
nir H-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,25 (b). Préparation de Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH
On dissout 0,69 g de Z-Leu-OSu, le H-Ile-Leu-Leu-Ala-
Gln-OH obtenu ci-dessus et 0,22 ml de triéthylamine dans
ml de diméthylformamide et on agite le mélange à tempé-
rature ambiante pendant 20 heures. Apres élimination du diméthylformamide par distillation, on additionne le résidu
d'acide succinique 1N, on recueille le précipité par fil-
tration et on lave à l'eau jusqu'à neutralité du filtrat, puis on sèche. On lave le produit séché au méthanol chaud,
obtenant ainsi 1,10 g de Z-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.
RfI: 0,58 Rf II: 0,71 Analyse élémentaire: pour C40H65N7C10: C H N Calculé %: 59,75 8,15 12,19 Trouvé %: 59,60 8,02 11,92 6. Préparation de H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH On dissout 0,50 g de Z-Leu-Ile-Leu-Leu-AlaGln-OH dans ml de méthanol et i0 ml d'acide acétique à 10% et on soumet le mélange à une réduction catalytique en utilisant
du palladium comme catalyseur, afin d'obtenir H-Leu-Ile-
Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Ce produit est désigné ci-après "Pepti-
de A".
RfI: 0,23 RfII: 0,61 Analyse élémentaire pour C32H59N708.2H20
C H N
Calculé %: 54,45 8,99 13,89 Trouvé %: 54,30 8,81 13,98 Exemple de préparation A-2 1. Préparation de Boc-Ala-NHNHZ On dissout 4,99 g de BocAla-OH, 4,36 g de NH2-NH-Z et
5,44 g de dicyclohexylcarbodiimide dans 150 ml de tétrahy-
drofuranne, et on agite le mélange à 4 C pendant 20 heures.
On retire par filtration la substance solide qui s'est formée dans le mélange réactionnel, on distille le filtrat restant, on additionne le résidu résultant d'éther, ce qui
fournit un précipité. On recueille le précipité par filtra-
tion, on reprécipite dans de l'éther et de l'éther de pé-
trole, obtenant ainsi 7,03 g de Boc-Ala-NHNHZ.
RfI: 0,79 RfII: 0,81 Analyse élémentaire: pour C16H23N305 C H N Calculé %: 56,96 6,87 12,45 Trouvé %: 56,81 6,49 12,34
2503 1 45
2(a). Préparation de H-Ala-NHNHZ On dissout 3,00 g de Boc-Ala-NHNHZ dans 10 ml d'acide
trifluoracétique et on laisse reposer à température ambian-
te pendant 15 minutes, puis on élimine l'acide trifluora-
cétique par distillation et on sèche, afin d'obtenir H-Ala-NHNHZ. RfII: 0, 51 2(b). Préparation de Boc-Arg (NO2) -Ala-NHNHZ On dissout 2,84 g de BocArg(NO2)-OH dans 40 ml d'une solution tétrahydrofurannique contenant 0,91 ml de N-méthyl morpholine, et on refroidit le mélange à -15 C,, on ajoute 1,17 ml de chloroformiate d'isobutyle et on agite fortement pendant 30 secondes. On additionne le mélange réactionnel
d'une solution de H-Ala-NHNHZ dans 20 ml de diméthylforma-
mide et 1,24 ml de triéthylamine, et on agite pendant une minute. On laisse le mélange réactionnel reposer à 0 C pendant 5 minutes, puis on porte à 40 C pendant 2 minutes,
après quoi on agite à température ambiante pendant 15 minu-
tes. Après élimination du tétrahydrofuranne et du diméthyl formamide par distillation, on extrait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique
1N, puis à l'aide d'une solution saturée d'hydrogénocarbo-
nate de sodium et, enfin, à l'aide d'une solution saturée de chlorure de sodium. Après élimination de l'acétate d'éthyle par distillation, on reprécipite dans un mélange
acétate d'éthyle-éther, obtenant ainsi 3,70 g de Boc-
Arg(NO2)-Ala-NHNHZ. RfI: 0,68 RfII: 0,79 Analyse élémentaire: pour C22H34N808 C H N
224N88: C H N
Calculé %: 49,06 6,36 20,80 Trouvé %: 49,40 6,72 20,43 3(a). Préparation de H-Ar (NO2)-Ala-NHNHZ On dissout 3,67 g de Boc-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ dans 15ml d'acide trifluoracétique et on laisse reposer à température ambiante pendant 15 minutes, puis on cristallise en ajoiant de l'éther sec et on recueille les cristaux par filtration,
obtenant ainsi H-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ.
RfI: 0,20 3(b). Préparation de Boc-Arqg(NO2-ArNO2)-Ala-NHNHZ On dissout 2, 17 g de Boc-Arg(NO2)-OH dans une solution
de 50 ml de tétrahydrofuranne contenant 0,69 ml de N-
méthylmorpholine et on refroidit le mélange à -15 C, puis on ajoute 0,89 ml de chloroformiate d'isobutyle et on agite fortement le mélange pendant 30 minutes. On additionne le
mélange d'une solution du H-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ obtenu ci-
dessus dans 30 ml de diméthylformamide et 0,95 ml de tri-
éthylamine, et on agite pendant une minute. On porte le mélange réactionnel à 0 C pendant 5 minutes, puis à 40 C
pendant 2 minutes, et on agite à température ambiante pen-
dans 15 minutes. Après élimination du tétrahydrofuranne et du diméthylformamide par distillation, on extrait le résidu à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique
1N et à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogéno-
carbonate de sodium, dans cet ordre, puis on élimine l'acé-
tate d'éthyle par distillation. On reprécipite dans un mé-
lange acétate d'éthyle-éther, obtenant ainsi 3,70 g de Boc-Arg(NO2)Arg(NO2)-Ala-NHNHZ. RfI: 0,58 RfII: 0,75 Analyse élémentaire: pour C28H45N13Ol C H N Calculé %: 45,46 6,13 24,61 Trouvé %: 45,13 5,71 24,51 4(a). Preéparation deH-_Arg!(N92):Arg!Q(NO2)!-Ala-NHNHZ On dissout 3,00 g de Boc-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ dans 20 ml d'acide trifluoracétique, on laisse la solution reposer à température ambiante pendant 15 minutes, puis on cristallise dans de l'éther sec. On recueille les cristaux par filtration, obtenant ainsi H-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ
RfI: 0,11.
4(b). Préparation de Boc-Asn-Arq(NO2) -Ar(NO2) -Ala-NHNHZ On dissout HArg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-NHNHZ dans 50 ml de diméthylformamide, on additionne la solution de 0,56 ml de triéthylamine et 2,17 g de Boc-Asn- ONHS et on abandonne le mélange à la température ambiante pendant 20 heures. On élimine le diméthylformamide par distillation et on extrait le résidu résultant au butanol. On lave l'extrait, deux fois, avec 2% d'acide acétique, on précipite dans l'éther et on recueille les cristaux par filtration, puis on les
reprécipite dans un mélange méthanol-acide-acétique, obte-
nant ainsi 2,64 g de Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Arg-NHNHZ.
RfI: 0,40 RfII: 0,72 Analyse élémentaire pour C32H51N15013 C H N Calculé %: 45,01 6,02 24,60 Trouvé %: 44,80 5,85 24,12 4(c). Préparation de BocAsnr-Arg-AAla-NHNH2
On dissout 2,50 g de Boc-Asn-Arg(NO2)-Arg(NO2)-Ala-
NHNHZ dans un mélange de 30 ml de méthanol avec 30% d'acide
acétique, et on soumet la solution à une réduction cataly-
tique en utilisant du palladium comme catalyseur, obtenant
ainsi 2,20 g de Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH2.
RfI: 0,06 -
RfII; 0,40 Analyse élémentaire: pour C24H47N1307 H. H23 2 2
C H N
Calculé %: 43,80 7,48 23,71 Trouvé %: 43,51 7,62 23,45 5. Préparation de Z-Leu-Gly-OC H On dissout 1,86 ml de N-méthylmorpholine dans 60 ml de tétrahydrofuranne et on additionne cette solution de 4,85 g de Z-Leu-OH. On refroidit le mélange à -15 C et on ajoute
2,41 ml de chloroformiate d'isobutyle, puis on agite forte-
ment pendant 30 secondes. On additionne le mélange réac-
tionnel de 40 ml d'une solution diméthylformamidique conte-
nant 2,54 g de H-Gly-OC2H5, et 2,56 ml de triéthylamine,et on agite pendant une minute. Ensuite, on porte le mélange réactionnel à 0 C pendant 5 minutes, puis à 40 C pendant 2
minutes, et on agite à température ambiante pendant 15 mi-
nutes. On élimine le tétrahydrofuranne et le diméthylforma-
mide par distillation, on additionne le résidu résultant d'acide citrique 1M et on recueille les cristaux ainsi
obtenus par filtration. On lave les cristaux à l'eau jus-
qu'à neutralité du filtrat, puis on sèche les cristaux qu'on reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-éther,
obtenant ainsi 4,68 g de Z-Leu-Gly-OC2H5.
RfI: 0,80 RfII: 0,77 Analyse élémentaire pour C18H26N205: C H N Calculé % 61,70 7,48 7,99 Trouvé % 61,51 7,32 7,80 6(a). Préparation de H-Leu-GlYOC2H5 On dissout 3,12 g de Z-Leu-Gly-OC2H5 dans 50 ml de méthanol et 8,90 ml d'acide chlorhydrique 1N et on soumet la solution à une réduction catalytique en utilisant du
palladium comme catalyseur, obtenant ainsi H-Leu-Gly-OC2H5.
Rfl: 0,41 6(b). Préparation de Z-Ser-Leu-Gly.-C2H5
On dissout 2,48 g de Z-Ser-NHNH2 dans 20 ml de dimé-
thylformamide et 4,89 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne puis on refroidit le mélange réactionnel à -15 C, on ajoute
1,31 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minu-
tes. On additionne le mélange réactionnel de 4,11 ml de triéthylamine afin de le neutraliser. On ajoute le mélange réactionnel à 10 ml d'une solution diméthylformamidique
contenant le H-Leu-Gly-OC2H5 précité et 1,24 ml de tri-
éthylamine, et on agite à 4 C pendant 20 heures. Apres
élimination du diméthylformamide par distillation on ex-
trait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle, on lave l'extrait à l'acide citrique 1N et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, et on sèche l'extrait sur sulfate de magnésium anhydre. Apres élimination de l'acétate d'éthyle, on reprécipite dans
l'acétate d'éthyle, obtenant ainsi 2,64 g de Z-Ser-Leu-Gly-
OC2H5.
RfI: 0,78
RfII: 0,85.
O Analyse élémentaire pour C21H31N307 C H N Calculé % 57,65 7,14 9,60 Trouvé % 57,60 6,88 9,63 7(a). Préparation de H-Ser-Leu-Gly-:OC2H5 On dissout 2,50 g de Z-Ser-Leu-Gly-OC2H5 dans 10 ml d'acide acétique à 10% et 50 ml de méthanol et on soumet le mélange à une réduction catalytique en utilisant du
palladium comme catalyseur, obtenant ainsi H-Ser-Leu-Gly-
OC2H5 2 S. RfI: 0,31 7(b). Préparation de Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-OC2H5 On dissout 2,54 g de Z-Thr-His-NHNH2 dans 20 ml de diméthyl formamide et 4, 19 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, puis on refroidit le mélange à 15 C, on ajoute 0,84 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minutes. On ajoute ensuite 3,51 ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel. On verse le mélange réactionnel sur ml d'une solution diméthylformamidique contenant le H-Ser-Leu-Gly-OC2H5 obtenu ci- dessus et 0,79 ml de triéthyl
amine, et on agite à 4 C pendant 20 heures. Après élimina-
tion du diméthylformamide par distillation, on extrait le
résidu résultant au butanol, et on lave l'extrait à l'eau.
On élimine le solvant par distillation et on recristallise dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle, obtenant ainsi 4,31 g de Z-Thr-His-SerLeu-Gly-OC2H5; 2 5; RfI: 0,35 RfII: 0,71 Analyse élémentaire pour C31H45N703.H2 C H N Calculé % 64,00 8,11 16,85 Trouvé % 64,48 8,10 16,54 8(a). Préparation de Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2 On dissout 4,30 g de ZThr-His-Ser-Leu-Gly-OC2H5 dans ml de méthanol, on additionne la solution de 3,18 ml d'hydrazine monohydratée, puis on laisse le mélange reposer à température ambiante pendant 20 heures. Une fois la réaction terminée, on additionne le mélange réactionnel d'éther, on recueille le précipité cristallin par filtration et on sèche. On lave les cristaux au méthanol chaud, obtenant ainsi
2,55 g de Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-NHNH2.
RfI: 0,17 RfII: 0,57 Analyse élémentaire pour C29H43N909 C H N Calculé % 52,64 6,55 19,05 Trouvé % 52,55 6,44 19,09 8(b). Préparation de H-AsnArsAi-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH On dissout 0,78 g de Boc-Asn-Arg-ArgAla-NHNH2 dans 8 ml de diméthylformamide et 1,03 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne et, après avoir refroidi la solution à -15 C, on ajoute 0,16 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant minutes. Puis on ajoute 0,87 ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel. On ajoute ce mélange
réactionnel à un mélange constitué par du Peptide A, c'est-
à-dire H-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, 0,87 ml de triéthyl
amine, 20 ml de diméthylformamide et 10 ml de bexaméthyl-
phosphorotriamide et on agite le mélange résultant à
4 C pendant 24 heures. On additionne le mélange d'un pro-
duit de conversion de 0,39 g de Boc-Asn-Arg-Arg-Ala-NHNH2 en azide, et on agite pendant 48 heures. On élimine le diméthylformamide par distillation, on extrait le résidu résultant au butanol, on lave l'extrait à l'eau et on élimine le butanol par distillation. On recristallise le résidu ainsi obtenu dans l'éther, on recueille le précipité cristallin par filtration, on lave à l'eau et sèche sur
pentoxyde de phosphore. On obtient ainsi Boc-Asn-Arg-Arg-
Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH qu'on dissout dans 3 ml d'acide trifluoracétique et on laisse reposer à température ambiante pendant 15 minutes, après quoi on sèche, on ajoute
de l'éther afin de faire précipiter des cristaux qu'on re-
cueille par filtration. Après séchage des cristaux, on les purifie à l'aide de Sephadex G-25 (solvant d'élution: acide
acétique à 50%), obtenant ainsi 120 mg de H-Asn-Arg-Arg-
Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH RfI: 0,01 RfII: 0,35 Analyse élémentaire: pour C51H94N18013 2CH3COOH. 5H 20
C H N
* Calculé % 47,95 8,19 18,30 -25Trouvé % 47,66 8,41 18,62 - -25 /_ /D = 185,44 (C = 0,57, acide acétique 1M)
9. Préparation de H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-ArA-
Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH On dissout 125 mg de Z-Thr-His-Ser-Leu-GlyNHNH2 dans
10 ml de diméthylformamide et 0,125 ml d'acide chlorhydri-
que 6N/dioxanne puis on refroidit à -15 C et on ajoute
0,025 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minu-
tes. On ajoute ensuite 0,105 ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel. On ajoute le mélange à
un mélange constitué par 10 ml d'une solution diméthylfor-
mamidique contenant 110.mg de H-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-
Leu-Leu-Ala-Gln-OH avec 0,013 ml de triéthylamine; et 6 ml de hexaméthylphosphorotriamide, et on agite le tout à 4 C pendant 24 heures. On additionne ensuite le mélange
réactionnel de l'azide produit par 125 mg de Z-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-NHNH2, et on agite pendant 48 heures. On élimine le diméthylformamide par distillation et on extrait le résidu résultant au butanol. On lave l'extrait à l'eau et on élimine le butanol par distillation, et on reprécipite le résidu ainsi obtenu dans un mélange méthanol-acétate
d'éthyle. On obtient ainsi Z-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-
Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH qu'on dissout dans 50ml de méthanol et 10 ml d'acide acétique à 10% et on soumet
à une réduction catalytique en utilisant du palladium com-
me catalyseur. On élimine le catalyseur par filtration; puis on élimine le méthanol par distillation et on purifie le résidu résultant sur Sephadex G-25 (solvant d'élution:
acide acétique à 50%), obtenant ainsi 125 mg de H-Thr-His-
Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Ce
produit est désigné ci-après"Peptide B".
RfI: 0,01 RfII: 0,38 Analyse élémentaire pour C72 H127N250202CH3COOH.4H2O
C H N
Calculé % 49,21 7,77 18,87 Trouvé % 49,60 7,92 18,54 /-:L7 =5= -66,76 (C = 0,42, acide acétique 1M) Exemple de Préparation A-3 l(a). Pré2aration de H-Gln-NHNHBoc
On dissout 7,00 g de Z-Gln-NHNHBoc dans 50 ml de mé-
thanol et on soumet à une réduction catalytique en utilisant du palladium comme catalyseur, obtenant ainsi H-Gln-NHNHBoc RfI: 0,37 1(b). Préparation de Z-Pro-Gln-NHNHBoc On dissout 4,41 g de Z-Pro-OH dans 50 ml de tétrahydro furanne et 1,80 ml de N-méthylmorpholine, on refroidit la solution à -15 C, puis on ajoute 2,34 ml de chloroformiate
d'isobutyle et on agite fortement pendant 30 secondes.
On additionne le mélange réactionnel de 30 ml d'une solu-
tion diméthylformamidique du H-Gln-NHNHBoc obtenu au stade 1(a) ci-dessus, et on agite pendant une minute. On porte ensuite la totalité du mélange réactionnel à 0 C pendant 5
minutes, puis à 40 C pendant 2 minutes, et on agite à tem-
pérature-ambiante pendant 15 minutes. On élimine le tétra-
hydrofuranne et le diméthylformamide par distillation, on extrait le résidu résultant à l'aide d'acétate d'éthyle contenant une petite quantité de butanol. On lave l'extrait à l'acide citrique IN, à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre; on lave ensuite à l'acétate d'éthyle chaud, obtenant
ainsi 5,67 g de Z-Pro-Gln-NHNHBoc.
RfI: 0,60 RfII: 0,76 Analyse élémentaire: pour C 23H 33N507 C H N Calculé % 56,20 6,77 14,25 Trouvé % 55,97 6,68 14,15 2(a). Préparation de H-ProGln-NHNHBoc On dissout 5,50 g de Z-Pro-Gln-NHNHBoc dans 50 ml de
méthanol et on soumet à une réduction catalytique en uti-
lisant du palladium comme catalyseur, obtenant ainsi H-Pro-Gln-NHNHBoc. RfI: 0,09 2(b). Préparation de Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc On ajoute 4,05 g de Z-Leu-ONHS à 100 ml d'une solution diméthylformamidique du H-Pro-GlnNHNHBoc obtenu au stade 2(a) ci-dessus, et 1,56 ml de triéthylamine, puis on laisse
le mélange reposer à température ambiante pendant 20 heu-
res. On élimine le diméthylformamide par distillation et on extrait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique 1N et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet
ordre, et on reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-
éther, obtenant ainsi 3,72 g de Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.
RfI: 0,68 RfII: 0,80 Analyse élémentaire pour C29H44N608 C H N Calculé % 57,60 7,33 13,90 Trouvé.% 57,21 7,08 13,58 3(a). Préparation de H-Leu-ProGln-NHNHBoc On dissout 3,50 g de Z-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc dans 50 ml de méthanol et on soumet à une réduction catalytique en utilisant du palladium comme catalyseur, obtenant ainsi
H-Leu-Pro-Glb-NHNHBoc.
RfII: 0,14 3(b). PréparationdeZ-Asp(0CH2-C6H5)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc On dissout 2,27 g de Z-Asp(OCH2-C6H5)-OH dans 30 ml de tétrahydrofuranne avec0,65 ml de N-méthylmorpholine et, après refroidissement de la solution à -15 C, on ajoute 0,84 ml de chloroformiate d'isobutyle et on agite fortement pendant 30 secondes. On additionne le mélange réactionnel
de 20 ml d'une solution diméthylformamidique du H-Leu-Pro-
Gln-NHNHBoc obtenu au stade 3(a) ci-dessus, avec 0,81 ml
de triéthylamine, et on agite le tout pendant 1 minute.
On porte ensuite le mélange réactionnel à 0 C pendant 5 minutes, puis à 40 C pendant 2 minutes, et on agite à la température ambiante pendant 15 minutes. On élimine 'le tétrahydrofuranne et le diméthylformamide par distillation
et on extrait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle.
On lave l'extrait à l'acide citrique 1N, à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de
sodium, dans cet ordre, et on élimine le solvant par dis-
tillation. Par reprécipitation dans un mélange acétate
d'éthyle-éther de pétrole on obtient 4,00 g de Z-Asp(OCH2-
C6H5)-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc RfI: 0,68 RfII: 0,77 Analyse élémentaire pour C40H55N7Oll: C H N Calculé % 59,32 6,84 12,11 Trouvé % 58,88 6,65 11,72 4(a). Préparation de H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc
On dissout 2,00 g de Z-Asp-(OCH2-C6H5)-Leu-Pro-Gln-
NHNHBoc dans 50 ml de méthanol avec 10 ml d'acide acétique à 10% et on soumet à une réduction catalytique en utilisant du palladium comme catalyseur, obtenant ainsi H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc. RfI: 0,68 4(b). Préparation de Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc
On dissout 0,75 g de Z-Ser-NHNH2 dans 15 ml de dimé-
thylformamide avec 1,48 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne et, après refroidissement de la solution à -15 C, on ajoute 0,39 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minutes après quoi on ajoute 1,24 ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel. On ajoute le mélange réactionnel à un mélange constitué par 10 ml d'une solution diméthylformamidique du H-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc obtenu au stade 4(a) cidessus et 0,34 ml de triméthylamine, et on
agite le tout à 4 C pendant 20 heures. On élimine le dimé-
thylformamide par distillation et on extrait le résidu au
butanol. On lave l'extrait à l'eau, puis on élimine le bu-
tanol par distillation. Par recristallisation dans un mé-
lange méthanol-acétate d'éthyle, on obtient 1,52 g de Z-Ser-Asp-Leu-ProGln-NHNHBoc. RfI: 0,45 RfII: 0,67
5. Préparation de H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-
Leu-Gln-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH On traite 116 mg de ZSer-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc
à l'aide de 2 ml d'acide trifluoracétique (TFA) afin d'éli-
miner le groupe tert-butoxycarbonyle, et on ajoute de l'éther anhydre au mélange réactionnel afin d'obtenir un précipité. On recueille le précipité par filtration, on sèche, et on dissout dans 5 ml de diméthylformamide avec
0,072 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne. Après refroi-
dissement du mélange réactionnel à -15 C, on ajoute 0,019 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minutes,
puis on ajoute 0,081 ml de triéthylamine afin de neutra-
liser le mélange réactionnel.
On ajoute ce mélange réactionnel à un mélange consti-
tué par 80 mg de Peptide B (c'est-à-dire H-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Il.e-Leu-Leu-Ala-Gln-OH), 5 ml
de diméthylformamide et 6 ml de triamide hexaméthylphos-
phorique, et on agite à 4 C pendant 20 heures. On addi-
tionne ensuite le mélange réactionnel de 116 mg de l'azide produit par ZSer-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, puis on agite pendant 28 heures. On élimine le diméthylformamide par
distillation et on extrait le résidu résultant au butanol.
On lave l'extrait à l'eau et on élimine le butanol par
distillation. On cristallise le résidu dans l'éther de pé-
trole, on recueille le précipité cristallin par filtration, puis on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate
d'éthyle. On obtient ainsi Z-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-
Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH qu'on dissout dans 30 ml de méthanol avec 30 ml d'acide acétique à 10% et on soumet à une réduction catalytique en utilisant du palladium comme catalyseur. On élimine le
catalyseur par filtration et on élimine le solvant par dis-
tillation. On obtient un résidu qu'on purifie sur Sephadex
G-25 suivi de LH-20 (solvant d'élution:on utilise respecti-
2503 1 45
vement de l'acide chlorhydrique 1/1000 N), ce qui donne
58 mg de H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-
Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH. Ce produit est
désigné ci-après "Peptide C".
RfI: 0,01 II RfII: 0,37 Analyse élémentaire pour C95H163N31029 2CH3COOH. 7H2
C H N
Calculé % 48,54 7,61 17,72 Trouvé % 48,14 7,50 17,48 -/725= -85,70 (C = 0, 23, acide acétique 1M) Exemple de préparation A-4 1(a). Préparation de HSer-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc On dissout 1,03 g de Z-Ser-Asp-Leu-Pro-GlnNHNHBoc
dans 50 ml de méthanol et on soumet à une réduction cata-
lytique en utilisant du palladium comme catalyseur, obte-
nant ainsi H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc.
Rf: 0,06 1(b). Préparation de Z-Tyr-ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc On ajoute 0,79 g de Z-Tyr-ONHS à 20 ml d'une solution diméthylformamidique du H-SerAsp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc obtenu au stade 1(a) ci-dessus, et on laisse le mélange
reposer pendant 20 heures à température ambiante. On élimi-
ne le diméthylformamide par distillation, obtenant ainsi
un résidu qu'on extrait à l'acétate d'éthyle. On lave l'ex-
trait à l'acide citrique 1N, puis à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre,
après quoi on élimine l'acétate d'éthyle par distillation.
Par reprécipitation dans un mélange méthanol-acétate
d'éthyle, on obtient 588 mg de Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-
NHNHBoc. Rf: 0,51 Rf: 0,69 Analyse élémentaire pour C52H69N9015 C H N Calculé % 58,91 6,56 11,89 Trouvé % 58,53 6,22 12,28
2. Préparation de H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-Asn-Arg- A-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH On dissout 40 mg de ZTyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-NHNHBoc dans 3 ml de diméthylformamide avec 0, 0225 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne et, après refroidissement du mélange à -15 C, on ajoute 0,0060 ml de nitrite d'isoamyle et on agite pendant 5 minutes, après quoi on ajoute 0,0252
ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange.
On ajoute ce mélange réactionnel à une solution cons-
tituéepar 5 ml d'une solution diméthylformamidique conte-
nant 25 mg de Peptide B (c'est-à-dire H-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH) et 2 ml de triamide hexaméthylphosphorique, puis on agite le tout à 4 C pendant 20 heures. On additionne ensuite le mélange
réactionnel de l'azide produit par 44 mg de Z-Tyr-Ser-Asp-
Leu-Pro-Gln-NHNHBoc, et on agite pendant 24 heures. On éli-
mine le solvant par distillation et on extrait le résidu
résultant à l'aide d'un mélange méthanol-eau, on cristal-
lise dans l'éther et on recueille les cristaux par filtra-
tion. On obtient ainsi Z-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH qu'on dissout dans 30 ml de méthanol et réduit catalytiquement en utilisant du palladium comme catalyseur. On élimine le catalyseur par filtration et on élimine le méthanol par
distillation, puis on purifie le résidu à l'aide de Sepha-
dex G-25 (solvant d'élution: acide acétique à 50%) et à l'aide de LH-20 (solvant d'élution: acide chlorhydrique
1/1000N), obtenant ainsi 18 mg de H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-
Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-
Ala-Gln-OH. On désigne ce produit ci-après "Peptide D".
RfI: 0,01 Rf I: 0,38 Analyse élémentaire pour C104H169N32031 2CH3COOH. 5H20
C H N
Calculé % 50,40 7,32 17,41 Trouvé % 50,72 7,67 17,03
_ 5= - 77,88 (C = 0,22, acide actique 1M).
7= -77,88 <C = 0,22, acide acétique 1M).
Exemple de préparation B 1. Préparation de Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-OBzl On dissout 4,18 g de H-Glu(OBzl)-OBzl.Tos dans 30 ml
de diméthylformamide (DMF), puis on ajoute 1,21 ml de tri-
éthylamine (TEA) et on agite le mélange tout en refroidis- sant. D'autre part, on dissout 4,35 g de Z-Lys-(Tos)-OH dans 30 ml de tétrahydrofuranne (THF), puis on ajoute 0,98 ml de N-méthylmorpholine, on refroidit le mélange à -15 C et, tout en agitant, on ajoute goutte à goutte 1,27 ml de chloroformiate d'isobutyle. 30 secondes après la fin de l'addition, on ajoute la solution de DMF refroidie précitée et on agite ce mélange à 0 C pendant 5 minutes, puis à C sur un bain-marie pendant 1 minutes, et ensuite à 15 C
pendant 30 minutes. On élimine THF et DMF du mélange réac-
tionnel sous pression réduite, et on extrait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique 1N, à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium puis à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, après quoi on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle par distillation. On obtient un
résidu huileux qu'on solidifie par addition d'éther éthyli-
que et reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-éther,
ce qui donne 5,37 g du produit cherché.
RfI: 0,96 Rf: 0,90 Analyse élémentaire pour C40H45N309S C H N Calculé % 64,59 6,10 5,65 Trouvé % 64,13 5,95 5,63 2(a). Préparation de H-Lys(Tos)Glu-OH On dissout 5,21 g de Z-Lys(Tos)-Glu(OBzl)-OBzl dans un mélange de 80 ml de méthanol et 20 ml d'acide acétique à %, on ajoute une petite quantité de noir de palladium et
on agite pendant une nuit tout en introduisant de l'hydro-
gène gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par filtration sous vide et on distille le 4M filtrat sous pression réduite. On obtient ainsi un résidu
sur lequel on verse de l'eau, et on lyophilise afin d'ob-
tenir le produit cherché.
RfI: 0,29 RfII 0,52 2(b). Préparation de Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH On dissout 2,13 g de Z-Ser-NHNH2 dans 20 ml de DMF et on ajoute 4,20 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, puis on refroidit le mélange à -15 C et on ajoute 1,13 ml de nitrite d'isoamyle tout en agitant. Après que le mélange réactionnel présente une réaction négative au test de l'hydrazide, on ajoute goutte à goutte une solution froide
de 3,53 ml de triéthylamine et 1,20 ml de DMF afin de neu-
traliser le mélange réactionnel. On ajoute ce mélange con-
tenant l'azide à une solution froide dans du DMF du H-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 2(a) précité avec 1,96
ml de triéthylamine, puis on agite ce mélange à une tempé-
rature de -10 à -15 C pendant 2 heures, et à 4 C pendant
heures. On élimine le diméthylformamide par distilla-
tion, on extrait le résidu ainsi obtenu à l'acétate d'éthyle
puis on lave la couche d'acétate d'éthyle à l'acide citri-
que iN et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlo-
rure de sodium, après quoi on sèche sur sulfate de sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle par distillation sous pression réduite. On obtient ainsi un résidu qu'on solidifie par addition d'éther éthylique et reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-éther, obtenant ainsi
4,14 g du produit cherché.
RfI: 0,64 RfII: 0,65 Analyse élémentaire pour C29H38N4OllS.1/2 H20
C H N
Calculé % 52,80 5,96 8,49 Trouvé % 52,87 5,69 8,46 3(a). Préparation de HSer-Lys(Tos)-Glu-OH On dissout 4,03 g de Z-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH dans un mélange de 60 ml de méthanol et 40 ml d'acide acétique à %, on ajoute une petite quantité de noir de palladium
et on agite pendant une nuit tout en introduisant de l'hy-
drogène gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par filtration sous vide, on distille le filtrat sous pression réduite, puis on verse le résidu sur de l'eau et on lyophilise, obtenant ainsi le produit cherché. RfI: 0,23 RfII: 0,48 3(b). Pré2aration de Z-Ar (NO92)Ser-Lys(Tos)-Glu-OH On dissout le H-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 3(a) précité dans 20 ml de diméthylformamide et on ajoute
1,74 ml de triéthylamine, puis on agite tout en refroidis-
sant. D'autre part, on dissout 2,41 g de Z-Arg(N02)-OH
dans 20 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute 0,70 ml de N-
méthylmorpholine, on refroidit le mélange à -15 C et, tout
en agitant, on ajoute goutte à goutte 0,86 ml de chloro-
formiate d'isobutyle. Trente secondes après la fin de l'ad-
dition on ajoute la solution diméthylformamidique froide précitée, puis on agite le tout à 0 C pendant 5 minutes et
ensuite à 15 C pendant 30 minutes. On élimine le tétrahy-
drofuranne et le diméthylformamide par distillation sous pression réduite, obtenant ainsi un résidu qu'on extrait au butanol saturé avec de l'acide acétique à 2%. On lave l'extrait, 5 fois, à l'aide d'acide acétique à 2% saturé de n-butanol, et on distille sous pression réduite afin d'éliminer l'acide acétique qui est remplacé par de l'eau, et ensuite afin d'éliminer l'eau qui est remplacée par du méthanol. On obtient ainsi un résidu solide qu'on solidifie en ajoutant de l'éther éthylique et reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-méthanol, obtenant ainsi
4,09 g du produit cherché.
Rf: 0,42 RfII 0,65 Analyse élémentaire pour C35H49014S. 1/2 H20
49 14S H2
C H N
Calculé %: 48,83 5,85 14,64 Trouvé %: 49,22 6,05 14,11 4. Préparation de Z-Ser-Leu-NHNH
On dissout 2,54 g de Z-Ser-NHNH2 dans 20 ml de dimé-
thylformamide, on ajoute 5,00 ml d'acide chlorhydrique 6N/
dioxanne et on refroidit le mélange à -15 C, puis on ajou-
te 1,34 ml de nitrite d'isoamyle, tout en agitant. Lorsque le mélange réactionnel présente une réaction négative au
test à l'hydrazine, on ajoute goutte à goutte une solu-
tion froide de 1,40 ml de diméthylformamide et 4,20 ml de
triéthylamine, afin de neutraliser le mélange réactionnel.
On ajoute ce mélange réactionnel contenant l'azide à 15 ml d'une solution diméthylformamidique froide contenant 1,96 g de H-Leu-OC2H5.HCl et 1,40 ml de triéthylamine, puis on agite le tout à une température de -10 à - 15 C pendant 2 heures et à 4 C pendant 20 heures. On élimine le diméthyl formamide par distillation sous pression réduite, on extrait le résidu résultant à l'acétate d'éthyle, puis on lave la couche d'acétate d'éthyle à l'acide citrique 1N, à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium,
à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbo-
nate de sodium et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, on sèche sur sulfate
de sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle par dis-
tillation sous pression réduite. On additionne le résidu
résultant d'éther de pétrole, et on lave par décantation.
On obtient une substance huileuse qu'on sèche dans un des-
siccateur sous pression réduite, on dissout le produit
séché dans 50 ml de méthanol, on ajoute 2,50 ml de mono-
hydrate d'hydrazine à 100% en refroidissant sur de la glace,
après quoi on abandonne le produit de réaction à la tempé-
rature ambiante pendant 20 heures, puis on élimine le mé-
thanol par distillation sous pression réduite. On solidifie le résidu ainsi obtenu en ajoutant de l'éther éthylique et on sèche dans un dessiccateur. On lave le produit séché à l'eau afin d'éliminer l'excès de monohydrate d'hydrazine et on reprécipite dans un mélange méthanolacétate d'éthyle
obtenant ainsi 2,68 g du produit cherché.
RfI: 0,73 RfII: 0,76 Analyse élémentaire pour C17H26N405: C H - N Calculé % 55,73 7,15 15,29 Trouvé % 55,72 7,01 15,42 (a) Préparation de H-ArS-SerLys(Tos)-Glu-OH On met 2,00 g de Z-Arg(NO2)-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH en suspension dans un mélange de 30 ml de méthanol et 30 ml d'acide acétique à 50%, on ajoute une petite quantité de noir de palladium et on agite le mélange pendant 36 heures tout en introduisant de l'hydrogène gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par filtration
sous vide, et on distille le filtrat sous pression réduite.
On obtient ainsi un résidu qu'on verse sur de l'eau et lyophilise. 18 heures après la lyophilisation, on dissout le produit lyophilisé dans de l'eau, et on lyophilise à
nouveau la solution afin d'obtenir le produit cherché.
Rf: 0,05 Rf 0,41 (b). Préparation de Z-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos) -Glu-OH On dissout 1,03 g de Z-Ser-Leu-NHNH2 dans 15 ml de diméthylformamide, on ajoute 1,41 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, on refroidit le mélange à -15 C, puis on
ajoute 0,38 ml de nitrite d'isoamyle tout en agitant. Lors-
que le mélange réactionnel présente une réaction négative au test à l'hydrazide, on ajoute goutte à goutte une solution froide de 0,40 ml de diméthylformamide et 1,18 ml
de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel.
On ajoute ce mélange réactionnel contenant l'azide à 10 ml d'une solution diméthylformamidique froide contenant le H-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 5(a) ci-dessus et
0,66 ml de triéthylamine, puis on agite le tout à une tem-
pérature de -10 à -15 C pendant 2 heures, et à 4 C pendant heures. On élimine le diméthylformamide par distillation
2503 1 45
sous pression réduite, on extrait le résidu ainsi obtenu à l'aide de nbutanol saturé d'eau et on lave la couche butanolique, 5 fois, à l'aide d'eau saturée de n-butanol, et on élimine le solvant par distillation. On solidifie le résidu en ajoutant de l'éther éthylique, et on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle, obtenant ainsi
1,92 g du produit cherché.
RfI: 0,33 Rf 0,69 Analyse élémentaire pour C44H66N1005S. 2H2 O
C44H66N10015S 2
C H N
Calculé % 50,66 6,76 13,43 Trouvé % 50,57 6,51 13,34 6(a). Préparation de H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys (Tos)-Glu-OH On met 1,84 g de Z-Ser-Leu-Arg-SerLys(Tos)-Glu-OH en suspension dans un mélange de 30 ml de méthanol et 30 ml d'acide acétique à 10%, on additionne la suspension d'une petite quantité de noir de palladium et on agite pendant 13 heures tout en introduisant de l'hydrogène gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par essorage. On obtient ainsi un filtrat qu'on distille sous pression réduite, ce qui donne un résidu qu'on verse sur de l'eau et lyophilise, afin d'obtenir le produit cherché. RfI: 0,09 RfII: 0, 53
6(b). Préparation de Boc-Glu(OBzll-Ser-Leu-Arqg-Ser-
LyXT2s.:Glu-OH On dissout le H-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 6(a) ci-dessus dans 20 ml de diméthylformamide,
puis on ajoute 0,51 ml de triéthylamine tout en refroidis-
sant sur de la glace, après quoi on ajoute 0,95 g de
Boc-Glu(OBzl)-ONHS et on agite le tout à température ambi-
ante pendant 24 heures. On élimine le diméthylformamide
par distillation sous pression réduite. On extrait le rési-
du à l'aide de n-butanol saturé à l'eau, puis on lave la
couche butanolique, 5 fois, à l'eau saturée de n-butanol.
On distille la couche butanolique sous pression réduite.
On obtient un résidu qu'on solidifie en ajoutant de l'éther
éthylique, puis on reprécipite dans un mélange méthanol-
acetate d'éthyle, obtenant ainsi 1,70 g du produit cherché Rf: 0,42 Rf: 0, 60 Analyse élémentaire: pour C53H81NllC18S.2H20
C H N
Calculé % 51,82 6,97 12,55 Trouvé % 51,27 6,58 12,47
7(a). Préparation de Boc-Glu-Ser-Leu-Arq-Ser-Lys(Tos)-Glu-
OH _ _
On dissout 150 mg de Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-
Lys(Tos)-Glu-OH dans un mélange de 30 ml de méthanol et 30 ml d'acide acétique à 10%, on additionne cette solution d'une petite quantité de noir de palladium et on agite pendant 18 heures tout en introduisant de l'hydrogène
gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le cata-
lyseur par essorage, on distille le filtrat sous pression réduite et on obtient un résidu qu'on additionne d'eau et
lyophilise afin d'obtenir le produit cherché.
7(b). Préparation de H-Glu-Ser-Leu-Arq-Ser-Lys(Tos)-
Glu-OH On dissout le Boc-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 7(a) ci-dessus dans du tétrahydrofuranne et on abandonne la solution à température ambiante pendant 15
minutes. On additionne la solution de 30 ml d'éther anhy-
dre, on recueille le précipité résultant par filtration, on lave à l'éther anhydre, puis on sèche le précipité sous pression réduite dans un dessiccateur contenant un mélange hydroxyde de potassium-pentoxyde de phosphore comme agent
de dessiccation, afin d'obtenir le produit cherché.
7(c) Preparation de H-Glu-Ser-Leu2Ar2Ser-Lys-Glu-OH On dissout le H-GluSer-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 7(b) ci-dessus dans de l'ammoniac liquide préalablement séché à l'aide de sodium métallique, puis on ajoute de petits morceaux de sodium métallique à la solution, tout en agitant, jusqu'à ce que la coloration du m-lance
réactionnel vire au bleu et conserve cette coloration pen-
dant un laps de temps de 30 secondes à une minute. On addi-
tionne le mélange réactionnel de cristaux de NH4C1, on neutralise l'excès de sodium métallique, après élimination
complète de l'ammoniac par distillation.à température am-
biante, on soumet le produit de la réaction à une filtra-
tion sur gel sur Sephadex G-25 en utilisant de l'acide acé-
tique à 50% comme solvant d'élution, obtenant ainsi 58 mg du produit cherché. On désigne ci-après ce produit comme
"Peptide E".
* RfI: 0,04 RfII: 0, 34 Analyse élémentaire pour C34H61Nll014. C2H402. 3 H20
C H N
Calculé % 44,95 7,44 16,02 Trouvé % 45,05 7,11 15,84 8(a). Préparation de H-Gln-NHNHBoc On met 16,00 g de Z-Gln-NHNHBoc en suspension dans 100 ml de méthanol, on ajoute une petite quantité de noir
de palladium et on agite pendant 18 heures tout en intro-
duisant de l'hydrogène gazeux. Une fois la réaction termi-
née, on élimine le catalyseur par essorage, on distille le filtrat sous pression réduite; on sèche le résidu ainsi obtenu, sous pression réduite, dans un dessiccateur, afin
d'obtenir le produit cherché.
RfI: 0,37 RfII: 0,58 8(b). Préparation de Z-Leu-Gln-NHNHBoc
On dissout le H-Gln-NHNHBoc obtenu au stade 8(a) ci-
dessus dans 50 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute 5,51 g de Z-Leu-ONHS tout en refroidissant sur de la glace, puis on agite le mélange réactionnel à la température ambiante
pendant 18 heures. On élimine le tétrahydrofuranne par dis-
tillation sous pression réduite, on extrait le résidu à l'acétate d'éthyle, on lave la couche d'acétate d'éthyle à
l'acide citrique 1N, à l'aide d'une solution aqueuse satu-
rée de chlorure de sodium, à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre; on sèche la couche d'acétate d'éthyle lavée, sur sulfate de sodium anhydre, puis on élimine l'acétate d'éthyle par distillation. On obtient un résidu huileux qu'on solidifie par addition d'éther éthylique et on
reprécipite la substance solide dans un mélange méthanol-
éther éthylique, obtenant ainsi 6,04 g du produit cherché.
RfI: O,81 RfI: 0,86 Analyse élémentaire pour C24H37N507: C H N Calculé % 56,79 7,35 13,80 Trouvé % 56,67 7,15 13,75 9(a). Préparation de H-Leu-GlnNHNHBoc On met2,79 g de Z-Leu-Gln-NHNHBoc en suspension dans 80 ml de méthanol, on additionne la suspension d'une petite quantité de noir de palladium et on agite la suspension pendant 32 heures tout en introduisant de l'hydrogène
gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le cata-
lyseur par essorage, on distille le filtrat sous pression réduite; on sèche le résidu obtenu sous pression réduite
dans un dessiccateur, afin d'obtenir le produit cherché.
RfI: 0,33 Rf I: 0,66 9(b). Préparation de Z-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc On dissout le H-Leu-Gln-NHNHBoc obtenu au stade 9(a) ci-dessus dans 30 ml de diméthylformamide et on refroidit
la solution en agitant.
D'autre part, on dissout 1,61 g de Z-Asn-OH dans 30 ml de tétrahydrofuranne, on additionne la solution de 0,62 ml de Nméthylmorpholine, puis on refroidit à -15 C, après
quoi on ajoute 0,80 ml de chloroformiate d'isobutyle, gout-
te à goutte, tout en agitant. 30 secondes après l'addition
du chloroformiate d'isobutyle on ajoute la solution dimé-
thylformamidique de H-Leu-Gln-NHNHBoc précédemment prépa-
rée, puis on agite le tout à 0 C pendant 5 minutes, ensuite à 40 C pendant une minute sur un bain-marie, et à 15 C pendant 30 minutes. On débarrasse le mélange réactionnel
du tétrahydrofuranne et du diméthylformamide par distilla-
tion sous pression réduite et on extrait le résidu à l'acé-
tate d'éthyle. On lave l'extrait à l'acide citrique 1N, à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium,
à l'aide d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbona-
te de sodium et à l'aide d'une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium, dans cet ordre, on sèche sur sulfate de
sodium anhydre et on élimine l'acétate d'éthyle par dis-
tillation. On obtient un résidu huileux qu'on solidifie en
ajoutant de l'éther éthylique,Etonreprécipite dans un mé-
lange méthanol-acétate d'éthyle, ce qui fournit 2,55 g du
produit cherché.
RfI: 0,63 RfII: 0,77 Analyse élémentaire: pour C28H43N709: C H N
28479 C H N
Calculé % 53,10 6,97 15,77 Trouvé % 53,67 6,63 15,68 10(a). Préparation de Z-Thr-ONHS
On dissout 1,28 g de Z-Thr-OH dans 30 ml de tétrahy-
drofuranne; on additionne la solution de 0,58 g de N-hydro-
xysuccinimide (NHS), on refroidit le mélange sur de la
glace, puis on ajoute 1,05 g de N,N-dicyclohexylcarbodiimi-
de (DCC). On agite le tout à 4 C pendant 24 heures, on sépare le précipité par filtration, on distille le filtrat sous pression réduite, on additionne lé résidu résultant d'éther éthylique et on lave par décantation. On obtient une substance huileuse qu'on sèche sous pression réduite
dans un dessiccateur, obtenant ainsi le produit cherché.
(b). Préparation de H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc On met 2,43 g de Z-Asn-Leu-GlnNHNHBoc en suspension dans 80 ml de méthanol, on additionne la suspension d'une
petite quantité de noir de palladium et on agite la suspen-
sion pendant 18 heures tout en introduisant de l'hydrogène
gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le cata-
lyseur par essorage, on distille le filtrat sous pression réduite afin d'éliminer le solvant, on sèche le résidu résultant sous pression réduite dans un dessiccateur, ce
qui fournit le produit cherché.
Rf: 0,31 RfII: 0,64 (c). Préparation de Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc
On dissout le H-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc obtenu en 10(b) ci-
dessus dans 30 ml de diméthylformamide; on additionne la solution de 20 ml de la solution diméthylformamidique de
Z-Thr-ONHS obtenue au stade 10(a) ci-dessus, tout en re-
froidissant sur de la glace, et on agite le tout à tempé ture ambiante pendant 18 heures. On élimine le diméthylfor-
mamide par distillation sous pression réduite, on obtient un résidu qu'on solidifie par addition d'acide citrique 1N et on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle,
obtenant ainsi 2,12 g du produit cherché.
RfI: 0,82 Rf: 0,79 Analyse élémentaire pour C32H50N8Cll: C H N Calculé % 53,18 6,97 15,50 Trouvé % 52,85 6,95 15,28 il(a). Préparation de Z-ThrAsn-Leu-Gln-NHNH2 On dissout 0,91 g de Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNHBoc dans 8
ml de TFA et on laisse reposer à température ambiante pen-
dant 15 minutes. On ajoute 80 ml d'éther anhydre à la solu-
tion, on recueille rapidement le précipité par filtration,
on lave à l'éther anhydre, puis on sèche sous pression ré-
duite dans un dessiccateur contenant un mélange hydroxyde
de potassium-pentoxyde de phosphore comme agent de dessic-
cation, obtenant ainsi le produit cherché.
Rf: 0,34.
11(b). Préparation de H-Glu(OBzl)-Ser-Leu-ArÂ-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH
On dissout 1,00 g de Boc-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-Ser-
Lys(Tos)-Glu-OH dans 8 ml de TFA et on laisse reposer à température ambiante pendant 15 minutes. On ajoute 80 ml d'éther anhydre à la solution; on recueille rapidement le précipité formé par filtration, on lave à l'éther anhydre, puis on sèche sous pression réduite dans un dessiccateur contenant un mélange hydroxyde de potassiur-pentoxyde de phosphore comme agent de dessiccation, obtenant ainsi le produit cherché. Rf: 0,24 RfI: 0,44
11(c). Préparation de Z-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu(OBzl)-
Ser-Leu-Arq-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH On dissout le Z-Thr-Asn-Leu-Gln-NHNH2 obtenu en 11(a) ci-dessus dans 10 ml de diméthylformamide, on ajoute 0,63
ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, on refroidit le mé-
lange à -15 C et on ajoute 0,17 ml de nitrite d'isoamyle en agitant. Lorsque le mélange réactionnel présente une réaction négative au test à l'hydrazine, on ajoute goutte à goutte 0,53 ml de triéthylamine avec 0,40 ml de solution diméthylformamidique froide afin de neutraliser le mélange réactionnel. On ajoute cette solution contenant l'azide à ml d'une solution diméthylformamidique froide contenant le H-Glu(OBzl)-Ser-Leu-ArgSer-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu en 11(b) ci-dessus et 0,24 ml de triéthylamine, puis on fait réagir le tout à une température de -10 à -15Cpendant 2
heures et ensuite à 4 C pendant 18 heures en agitant.
Puis, en opérant comme décrit en 11(a) ci-dessus, on ajoute
le produit obtenu en traitant 1,16 g de Z-Thr-Asn-Leu-Gln-
NHNHBoc avec TFA au produit de réaction ci-dessus et on fait réagir à la même température pendant 24 heures, tout
en agitant. On élimine le diméthylformamide par distilla-
tion sous pression réduite, on extrait le résidu obtenu au n-butanol saturé d'eau, on lave 5 fois à l'eau saturée de
n-butanol, puis on distille l'extrait sous pression réduite.
On obtient un résidu qu'on solidifie en ajoutant de l'éther éthylique, reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle, puis lave au méthanol chaud, ce qui donne le
produit cherché.
11(d). Préeparation de H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Ar-Ser-Lvs(Tos)-GluOH
On met le Z-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu(OBzl)-Ser-Leu-Arg-
Ser-Lys(Tos)-Glu-OH obtenu au stade 11(c) ci-dessus en suspension dans un mélange de 50 ml de méthanol et 50 ml d'acide acétique à 30%, on ajoute une petite quantité de noir de palladium à la suspension et on agite pendant 18 heures tout en introduisant de l'hydrogène gazeux. Une fois
la réaction terminée, on élimine le catalyseur par essora-
ge, on distille le filtrat sous pression réduite, après complète élimination du méthanol par distillation on soumet la liqueur concentrée obtenue à une filtration sur gel (Sephadex G-25) en utilisant de l'acide acétique à 50%
comme solvant d'élution permettant de recueillir la frac-
tion cherchée, obtenant ainsi 740 mg du produit cherché.
RfI: 0,17 -
RfII: 0,35 Analyse élémentaire pour C66H99N17023 C2H402. 2H20
C H N
Calculé % 48,91 7,08 15,64 Trouvé % 48,82 6,63 15,74 12. Préparation de HThr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arq-Ser-Lys-Glu-OH
On dissout 51,0 mg de H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-
Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH dans de l'ammoniac liquide préala-
blement séché à l'aide de sodium métallique, on ajoute de petits morceaux de sodium métallique à la solution tout en agitant jusqu'à ce que la coloration du mélange réactionnel vire au bleu et conserve cette coloration pendant un laps de temps de 30 secondes à une minute. On ajoute ensuite des cristaux de NH4Cl au mélange réactionnel, on neutralise l'excès de sodium métallique et, après complète élimination de l'ammoniac par distillation à température ambiante on soumet le produit de réaction à une filtration sur gel (Sephadex G-25) en utilisant de l'acide acétique à 50%
comme solvant d'élution permettant de recueillir la frac-
tion cherchée, et on lyophilise la fraction en ajoutant de l'eau après concentration, obtenant ainsi 32 mg du produit
cherché (peptide suivant la présente invention) dit ci-
après "Peptide F".
RfI: 0,01 Rf: 0,37 Analyse élémentaire pour C53H93N17021 C2H4O. 3 H20O
C H N
Calculé % 46,57 7,32 16,79 Trouvé % 46,10 6,98 16,82 13. Préparation de ZLeu-Ser-OCH3
On dissout 1,81 g de H-Ser-OCH3.HCl dans 25 ml de di-
méthylformamide. On ajoute 1,62 ml de triéthylamine à la solution et on refroidit le mélange à -10 C. On additionne
le mélange de 4,21 g de Z-Leu-ONHS, en agitant, et on pour-
suit la réaction pendant 18 heures en agitant. On élimine
le diméthylformamide par distillation, on extrait le rési-
du résultant à l'acétate d'éthyle, on lave la couche d'acétate d'éthyle à l'eau, on sèche sur sulfate de sodium
anhydre, puis on élimine l'acétate d'éthyle par distilla-
tion sous pression réduite. On obtient un résidu qu'on solidifie par addition d'éther éthylique, on reprécipite dans un mélange acétate d'éthyle-éther, obtenant ainsi
2,68 g du produit cherché.
Rf: 0,81 Rf: 0,82 Analyse élementaire pour C18H26N206: C H N Calculé % 59, 00 7,15 7,65 Trouvé % 58,62 7,03 7,65 14(a). Préparation de H-Leu-Ser-OCH. HC1 On met 4,20 g de Z-Leu-Ser-OCH3 en suspension dans un
mélange de 40 ml de méthanol et 11,46 ml d'acide chlorhy-
drique 1N, puis on additionne la suspension d'une petite quantité de noir de palladium et on agite pendant 18 heures tout en introduisant de l'hydrogène gazeux. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par essorage,on distille le filtrat sous pression réduite, on ajoute de l'eau au résidu obtenu et on distille 3 fois sous pression
réduite. On obtient ainsi un résidu qu'on sèche sous pres-
sion réduite dans un dessiccateur contenant du pentoxyde de phosphore comme agent de dessiccation, obtenant ainsi le
produit cherché.
RfI: 0,38 14(b). Préparation de Z-Ser-Leu-Ser-OCH On dissout 3,19 g de ZSer-NHNH2 dans 25 ml de dimé- thylformamide et on additionne la solution de 6,30 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, on refroidit à -15 C et on ajoute 1,69 ml de nitrite d'isoamyle. Lorsque le mélange réactionnel présente une réaction négative au test à l'hydrazine, on ajoute goutte à goutte 1,76 ml d'une
solution diméthylformamidique froide avec 5,29 ml de tri-
éthylamine, afin de neutraliser le mélange réactionnel.
On ajoute ce mélange réactionnel contenant un azide à 20 ml d'une solution diméthylformamidique froide contenant le H-Leu-Ser-OCH3.HCl obtenu en 14(a) ci-dessus et 1,60 ml de triéthylamine, on agite le tout à une température de -10
à -15 C pendant 2 heures, puis à 4 C pendant 18 heures.
On élimine le diméthylformamide par distillation sous pres-
sion réduite, on solidifie le résidu obtenu par addition d'eau, on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate
d'éthyle, obtenant ainsi 4,11 g du produit cherché.
RfI: 0,76 Rf I: 0,79 Analyse élémentaire pour C21H31N308: C H N Calculé % 55,62 6,89 9,27 Trouvé % 55,48 6,92 9,18 15. Préparation de Z-Ser-Leu-SerNHNH On dissout 2,00 g de Z-Ser-Leu-Ser-OCH3 dans 40 ml de méthanol, on additionne la solution de 1,10 ml de NH2NH2.H2O à 100% tout en refroidissant sur de la glace, et
on abandonne le mélange réactionnel à la température ambi-
ante pendant 18 heures. Une fois la réaction terminée,
on élimine le solvant par distillation sous pression rédui-
te, on solidifie le résidu obtenu en l'additionnant d'éther, puis on élimine l'excès de NH2NH2.H2O en ajoutant de l'eau, et on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle,
obtenant ainsi 1,91 g du produit cherché.
Rf: 0,43 I Rf: 0,73 Analyse élémentaire pour C20 H31N507: C H N Calculé % 52,97 6,89 15,44 Trouvé % 52,85 6,70 15,44
16(a). Préparation de Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH On dissout 70,42 mg de Z-Ser-Leu-SerNHNH dans 5 ml de diméthylformamide; on additionne la solution de 0,78 ml d'une solution diméthylformamidique diluée 10 fois d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne, puis on refroidit le mélange à
-15 C et on ajoute 0,20 ml d'une solution diméthylformami-
dique diluée 10 fois de nitrite d'isoamyle, tout en agi-
tant. Lorsque le mélange réactionnel présente une réaction négative au test de l'hydrazide, on ajoute goutte à goutte 0,65 ml d'une solution diméthylformamidique diluée 10 fois
de triéthylamine, afin de neutraliser le mélange réaction-
nel. On ajoute ce mélange réactionnel contenant l'azide produit à 5 ml d'une solution diméthylformamidique froide
contenant 151 mg de H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-
Lys(Tos)-Glu-OH et 0,29 ml d'une solution diméthylformami-
dique diluée 10 fois de triéthylamine, et on agite le tout à une température de -10 à -15 C pendant 2 heures, puis à 4 C pendant 18 heures. On ajoute ensuite 117,36 mg de
Z-Ser-Leu-Ser-NHNH2 et on fait réagir pendant 24 heures.
On élimine le diméthylformamide par distillation sous pression réduite. On extrait le résidu obtenu au n-butanol
saturé d'eau, puis on lave l'extrait 10 fois à l'eau satu-
rée de n-butanol, 5 fois à l'acide acétique à 2% saturé de n-butanol et on distille l'extrait sous pression réduite On obtient un résidu qu'on additionne d'eau et distille
sous pression réduite; après complète élimination du n-bu-
tanol par distillation, on lyophilise le produit et on re précipite le produit lyophilisé dans un mélange acétate
d'éthyle-éther, obtenant ainsi le produit cherché.
16(b). Préparation de H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-irg- Ser-Lys-Glu-OH
On dissout 150 mg de Z-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-
Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH dans de l'ammoniac li-
quide préalablement séché à l'aide de sodium métallique.
On additionne la solution de petits morceaux de sodium mé-
tallique, tout en agitant, jusqu'à ce que la coloration du mélange réactionnel vire au bleu et conserve cette nuance pendant un laps de temps de 30 secondes à une minute. On additionne le mélange réactionnel de cristaux de NH4Cl, on neutralise l'excès de sodium métallique, après complète élimination de l'ammoniac par distillation à température ambiante on filtre le produit de réaction sur gel (Sephadex G-25) en utilisant de l'acide acétique à 50% comme solvant
d'élution, on recueille la fraction cherchée qu'on lyophi-
lise en ajoutant de l'eau après concentration, obtenant ainsi 94 mg du produit cherché (peptide suivant la présente
invention) dit ci-après "Peptide G".
Rf: 0,02 RfII: 0,39 Analyse élémentaire pour C65H120N20 026 C2H402 H20:
C H N
Calculé % 48,19 7,24 16,78 Trouvé % 47,93 6,93 16,49 17(a). Préaration de Z-Tyr-OSu
On dissout 1,04 g de Z-Tyr-OH dans 30 ml de tétrahy-
drofuranne. On additionne la solution de 0,38 g de N-hydro-
xysuccinimide. On refroidit le mélange réactionnel sur de la glace, on ajoute 0,68 g de dicyclohexylcarbodiimide en refroidissant sur de la glace et on agite le tout à 40C pendant 18 heures. On élimine le précipité résultant par essorage. On distille le filtrat sous pression réduite. On additionne le résidu résultant d'éther éthylique et d'éther de pétrole et on décante, puis on sèche afin d'obtenir le
produit cherché.
17(b). Préparation de H-Ser-Leu-Ser-OCH3 On met 1,00 g de Z-Ser-Leu-SerOCH3 obtenu en 14(b) ci-dessus en suspension dans 20 ml de méthanol et 20 ml d'acide acétique à 10%, on ajoute une petite quantité de
noir de palladium à la suspension qu'on agite ensuite pen-
dant 14 heures tout en introduisant de l'hydrogène gazeux.
Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par essorage, on distille le filtrat sous pression réduite, on ajoute de l'eau au résidu et on lyophilise afin d'obte-
nir le produit cherché.
RfI: 0,35 Rf: 0,65 17(c). Préparation de Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH
On dissout le H-Ser-Leu-Ser-OCH3 obtenu en 17(b) ci-
dessus dans 10 ml de diméthylformamide. On ajoute 0,31 ml de triéthylamine tout en refroidissant sur de la glace. On additionne le mélange d'une solution diméthylformamidique
froide de Z-Tyr-OSu obtenu en 17(a) ci-dessus, tout en agi-
tant. On agite ensuite le tout à température ambiante pen-
dant 18 heures, puis on élimine le diméthylformamide par distillation sous pression réduite, on solidifie le résidu par addition d'eau, on reprécipite dans un mélange méthanol -éther, puis dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle,
obtenant ainsi 1,08 g du produit cherché.
Rf: 0,78 Rf: 0,82 Analyse élémentaire: pour C30H40N4010 C H N Calculé % 58,43 6,54 9,09 Trouvé % 58,14 6,58 9,16 17(d). Préparation de Z-Tyr-SerLeu-Ser-NHNH2 On dissout 1,00 g de Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-OCH3 dans du méthanol puis, en refroidissant sur de la glace, on ajoute 0,82 ml de NH2NH2.H2O à 100% et on abandonne le mélange à la température ambiante pendant 18 heures. On élimine le
méthanol par distillation sous pression réduite, on solidi-
fie le résidu par addition d'éther éthylique, puis on lave
à l'eau afin d'éliminer l'excès de NH2NH2.H20, on repréci-
pite dans un mélange méthanol-éther, on lave au méthanol
chaud, obtenant ainsi 0,81 g du produit cherché.
RfI: 0,45 RfII: 0,76 Analyse élémentaire pour C29H40N609: C H N Calculé % 56,48 6,54 13,63 Trouvé % 56,12 6,57 13,58
18(a). Préparation de Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-
Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-LSy(Tos)-Glu-OH On dissout 42,3 mg de Z-Tyr-SerLeu-Ser-NHNH2 dans
4 ml de diméthylformamide; on ajoute 0,34 ml d'une solu-
tion diméthylformamidique diluée 10 fois d'acide chlorhydri-
que 6N/dioxanne; on refroidit le mélange à -15 C et on
ajoute, en agitant, 0,09 ml d'une solution diméthylforma-
midique diluée 10 fois de nitrite d'isoamyle. Lorsque le mélange réactionnel présente une réaction négative au test à l'hydrazine, on ajoute goutte à goutte 0,29 ml d'une
solution diméthylformamidique diluée 10 fois de triéthyl-
amine afin de neutraliser le mélange réactionnel. Ce mé-
lange réactionnel contenant l'azide produit est ajouté à 4 ml d'une solution diméthylformamidique froide contenant
,0 mg de H-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-
Glu-OH et 0,10 ml d'une solution diméthylformamidique de triéthylamine diluée 10 fois, puis on agite le tout à une température de -10 à -15 C pendant 2 heures et, ensuite,
à 4 C pendant 18 heures. On ajoute ensuite 42,3 mg du pro-
duit de conversion de Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-NHNH2 en azide et on fait réagir pendant 24 heures. On élimine le diméthyl formamide par distillation sous pression réduite, on extrait le résidu résultant à l'aide de 30 ml de nbutanol saturé
d'eau, on lave l'extrait 10 fois à l'eau saturée de n-buta-
nol, puis 5 fois à l'aide d'acide acétique à 2% saturé de
n-butanol. On recueille les couches organiques qu'on dis-
tille sous pression réduite afin d'éliminer le n-butanol,
puis on lyohpilise le résidu, on reprécipite dans un mélan-
ge acetate d!éthyle-éther, obtenant ainsi le produit cher-
ché.
18(b). Préparation de H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-
Gln-Glu-Ser-Leu-Ar-SeEr-Lys-Glu-OH
On dissout Z-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-
Leu-Arg-Ser-Lys(Tos)-Glu-OH dans de l'ammoniac liquide préalablement séché à l'aide de sodium métallique, puis on
additionne la solution de petits morceaux de sodium. métal-
lique, en agitant, jusqu'à ce que la coloration du mélange réactionnel vire au bleu et conserve cette nuance pendant un laps de temps de 30 secondes à une minute. On additionne
le mélange réactionnel de cristaux de NH4C1 afin de neutra-
liser l'excès de sodium métallique, après élimination com-
plete de l'ammoniac par distillation à température ambian-
te, on soumet le produit de réaction à une filtration sur gel (Sephadex G25) en utilisant de l'acide acétique à 50% comme solvant d'élution, obtenant ainsi 33 mg du produit
cherché, dit ci-après "Peptide H".
RfI: 0,02 Rf: 0,35 Analyse élémentaire pour C74H123N21 028 2H402 4H20
C H N
Calculé % 47,71 7,30 15,79 Trouvé % 47,32 7,24 15,82 Exemple de préparation C Exemple de référence 1 Préparation de-Z-Ser-Ser-OMe
On dissout 5,06 g de Z-Ser-NHNH2 dans 50 ml de dimé-
thylformamide et 6,66 ml d'acide chlorhydrique 6N/dioxanne et on refroidit la solution à -15 C, on ajoute 2,68 ml de
nitrite d'isoamyle et on agite le mélange pendant 5 minutes.
Puis on ajoute 5,60 ml de triéthylamine afin de neutraliser le mélange réactionnel. On ajoute ce mélange réactionnel à ml d'une solution diméthylformamidique contenant 3,11 g de H-Ser-OMe.HCl et 2,80 ml de triéthylamine, puis on agite le mélange à 4 C pendant 20 heures. On élimine le diméthyl formamide par distillation, on extrait le résidu obtenu à l'acétate d'éthyle, on lave l'extrait à l'eau et on sèche
sur sulfate de sodium anhydre. Apres élimination de l'acé-
tate d'éthyle par distillation on cristallise le résidu en ajoutant de l'éther, on reprécipite dans un mélange acétate
d'éthyle-éther, obtenant ainsi 3,75 g de Z-Ser-Ser-ClMe.
Rf: 0,64 RfII: 0,77 Analyse élémentaire pour C 15H20N207 C H N Calculé % 52,94 5,92 8,23 Trouvé % 52,67 5,89 8,35 Exemple de référence 2 Préparation de Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OMe
On dissout 2,5 g de Z-Ser-Ser-OMe dans 50 ml de métha-
nol et 7,34 ml d'acide chlorhydrique IN, puis, en présence de 500 mg de noir de palladium, on procède à une réduction
catalytique à 20 C, à l'aide d'hydrogène gazeux à la pres-
sion atmosphérique, afin d'obtenir H-Ser-Ser-OMe.HCl.
RI: 0,08
On dissout 3,39 g de Z-Arg(Tos)-OH dans 40 ml de tétra-
hydrofuranne et 0,75 ml de N-méthylmorpholine, puis on
refroidit le mélange à -15 C, on ajoute 0,97 ml de chloro-
formiate d'isobutyle et on agite fortement pendant 30 secondes. On ajoute le H-Ser-Ser-OMe.HCl obtenu ci-dessus, 20 ml
de diméthylformamide et 1,03 ml de triéthylamine et on agi-
te pendant une minute, puis on agite à 0 C pendant 5 minu-
tes, à 40C pendant 2 minutes et à température ambiante pendant 15 minutes. Après élimination du tétrahydrofuranne et du diméthylformamide par distillation, on extrait le résidu à l'acétate d'éthyle, on lave l'extrait 3 fois à l'acide citrique IN, puis 5 fois à l'eau, et on sèche sur
sulfate de sodium anhydre. On élimine le solvant par distil-
lation, on reprécipite le résidu dans un mélange méthanol-
* acétate d'éthyle et on obtient 3,65 g de Z-Arg(Tos)-Ser-
Ser-OMe. Rf: 0,51 Rf 0,73 Analyse élémentaire pour C 28H38N6010 S: C H N Calculé % 51,68 5,88 12,91 Trouvé % 51,62 5,82 12,73 Exemple de référence 3 Preparation de Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH On dissout 3,5 g de Z-Arg(Tos)-SerSer-OMe dans 50 ml de méthanol et 10 ml d'eau, on ajoute 8,06 ml d'hydroxyde de sodium 1N, on agite le mélange à température ambiante pendant 45 minutes, puis on ajoute 7,24 ml de HC1 1N afin
de neutraliser le mélange réactionnel, après quoi on éli-
mine le méthanol par distillation, on extrait le résidu
à l'aide de n-butanol. On lave l'extrait à l'eau; on élimi-
ne le n-butanol et l'eau par distillation; on cristallise le résidu par addition d'éther et on reprécipite dans un mélange méthanol-acétate d'éthyle, obtenant ainsi 2,60 g
de Z-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
RfI: 0,28 Rf: 0,57 Analyse élémentaire pour C27H36N6010S. 1/2 H20
C H N
Calculé % 50,22 5,77 13,02 Trouvé % 50,24 5,62 13,20 Exemple de référence 4 Préparation de H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH On dissout 1,35 g de Z-Arg(Tos)Ser-Ser-OH dans 50 ml de méthanol et 10 ml d'acide acétique à 10%. On soumet la solution à une réduction catalytique en présence de 500 mg de noir de palladium à 20 C à la pression atmosphérique,
afin d'obtenir H-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
RfI: 0,034 Exemple de référence 5
Préparation de Z-Asn-Leu-OEt.
On dissout 5,32 g de Z-Asn-OH dans 60 ml de tétrahydro-
furanne, 10 ml de diméthylformamide et 2,04 ml de N-méthyl
morpholine. On additionne ce mélange de 40 ml d'une solu-
tion diméthylformamidique contenant 2,64 ml de chlorofor-
miate d'isobutyle, 3,91 g de H-Leu-OEt.HCl et 2,80 ml de triéthylamine et on fait réagir suivant un mode opératoire similaire à celui décrit à l'exemple de référence 2. Après élimination du solvant par distillation, on additionne le
résidu obtenu d'acide citrique 1M, on recueille le précipi-
té résultant par filtration, on lave à l'eau, on sèche sous pression réduite, puis on recristallise dans l'acétate
d'éthyle, obtenant ainsi 6,1 g de Z-Asn-Leu-
Rf: 0,71 Rfi: 0,80 Analyse élémentaire pour C20H29N306: C H N Calculé % 58,95 7,17 10,31 Trouvé % 58,99 7,23 10,26 Exel ed référence 6
Préparation de Z-Tyr-Asn-Leu-OEt.
On dissout 3,01 g de Z-Asn-Leu-OEt. dans 50 ml de mé-
thanol et 7,4 ml de HC1 1N, on soumet la solution à une réduction catalytique en présence de 500 mg de noir de
palladium à température ambiante, à la pression atmosphé-
rique, afin d'obtenir H-Asn-Leu-Oet.HCl.
RfI: 0,26 On dissout le H-Asn-Leu-CEt.. HCl ainsi obtenu dans 50 ml de diméthylformamide et 1,03 ml de triéthylamine, puis on ajoute 3,35 g de ZTyr-ONHS et on abandonne le mélange
à la température ambiante pendant 20 heures. Apres élimina-
tion du diméthylformamide par distillation, on additionne
le résidu ainsi obtenu d'une solution aqueuse d'acide ci-
trique 1M, on recueille le précipité par filtration, on
lave à l'eau et on reprécipite dans un mélange méthanol-
acétate d'éthyle, obtenant ainsi 3,58 g de Z-Tyr-Asn-
Leu-OEt. RfI: 0,73 Rf: 0,82 Analyse élémentaire pour C29H38N408 C H N Calculé % 61,04 6,71 9,82 Trouvé % 60,84 6,70 9,39 Exemple de référence 7 On dissout 2,78 g de Z-Tyr-Asn-Leu-OEt.dans 30 ml de méthanol, on additionne la solution de 1,21 ml d'hydrate d'hydrazine et on laisse le mélange reposer pendant une nuit. On recueille les cristaux formés, par filtration; puis on lave à l'aide d'une petite quantité de méthanol,
obtenant ainsi 3,10 g de Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH2.
Analyse élémentaire pour C H N O7 C H N
27 36 6 7 -_-
Calculé % 58,26 6,52 15,10 Trouvé % 57,91 6,56 15,12
Exemple 1
(a) Préparation de Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH On dissout 0,84 g de Boc-Leu-Gln-OH dans 30 ml de
tétrahydrofuranne et 0,24 ml de N-méthylmorpholine, on ad-
ditionne la solution de 0,31 ml de chloroformiate d'isobutyle et de HArg(Tos)-Ser-Ser-OH obtenu à l'exemple de référence 4, et on effectue la réaction en opérant comme décrit dans
l'exemple de référence 2. Après élimination du tétrahydro-
furanne et du diméthylformamide par distillation, on ex-
trait le résidu obtenu à l'aide de butanol. On lave la cou-
che butanolique à l'acide acétique à 20%, puis on élimine le butanol par distillation, on reprécipite dans un mélange
méthanol-acétate d'éthyle et on obtient 1,54 g de Boc-Leu-
Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH. RfI: 0,18 Rf 0,57 Analyse élémentaire pour C37H57N9013S. H20O
C H N
Calculé % 48,77 6,90 14,62 Trouvé % 48,76 6,61 14,78 (b) Préparation de HLeu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH On traite 1,50 g de Boc-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-SerOH avec 10 ml d'acide trifluoracétique à température ambiante
afin d'éliminer le groupe tert-butoxycarbonyle, on addi-
tionne le mélange réactionnel d'éther sec afin de faire
cristalliser le produit cherché, obtenant ainsi H-Leu-Gln-
Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
Rf: 0,04 On dissout le H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH obtenu comme décrit ci-dessus dans 25 ml d'ammoniac liquide et on
additionne la solution de petits morceaux de sodium métal-
lique. Lorsque le mélange réactionnel vire au bleu, on ajoute 1 g de chlorure d'ammonium sec, puis on élimine l'ammoniac par distillation. On dissout le résidu obtenu
dans de l'acide acétique à 50%, puis on filtre cette solu-
tion sur gel Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm, solvant d'éluti: acide acétique à 50%), puis sur LH-20 (2,2 x 80 cm, solvant
d'élution: HC1 0,001N), obtenant ainsi H-Leu-Gln-Arg-Ser-
Ser-OH sous la forme d'un produit purifié. On désigne ci-
après ce produit "Peptide I".
Rf: 0,01 RfII: 0,34 - -20 =-I42,5 (C = 0,230, HCl 0,001N) Analyse élémentaire pour C23H43N909.4H2O.CH3COOH
C H N
Calculé % 41,60 7,68 17,46 Trouvé % 41,20 7,93 17,91
Exemple 2
(a) Préparation de Z-Phe-Leu-Gln-Arg Tos2-Ser-Ser-OH
On dissout H-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH obtenu à l'ex-
emple 1(b) dans 30 ml de diméthylformamide et 0,24 ml de triéthylamine, puis on ajoute 0,77 g de Z-Phe-ONHS et on
abandonne le mélange à température ambiante pendant 20 heu-
res. Apres élimination du diméthylformamide par distilla-
tion, on extrait le résidu au butanol et on lave l'extrait
à l'acide acétique à 2%. On concentre la couche butanoli-
que, on cristallise le concentré obtenu en ajoutant de l'éther, on recueille les cristaux par filtration et on
lave à l'éthanol chaud, obtenant ainsi 1,40 g de Z-Phe-
Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH Rf: 0,22 Rf: 0,59 Analyse élémentaire pour C47H64N10014S. H20O
C H N
Calculé % 54,12 6,28 13,43 Trouvé % 54,42 6,38 13,84 (b) Préparation de HPhe-Leu-Gln-Ars-Ser-Ser-OH On traite 20 mg de Z-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-SerSer-OH par du sodium métallique dans de l'ammoniac liquide afin
d'éliminer le groupe Z et le groupe Tos par un procédé si-
milaire à celui décrit à l'exemple 1(b), puis on soumet le mélange réactionnel à une filtration sur gel en utilisant Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm; éluant: acide acétique à 10%), puis en utilisant LH-20 (2,2 x 80 cm; solvant d'élution: HC1 0,001N), obtenant ainsi, sous forme purifiée, 12 mg de H-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH, désigné ci-après "Peptide J". RfI: 0, 01 RfII: 0,35 Ak 720=.37,3 (C = 0,249, HCl 0,001N) Analyse élémentaire pour C32H52N10010.7H2O.CH3COOH
C H N
Calculé % 44,24 7,64 15,17 Trouvé % 44,27 7,10 15,60
Exemple 3
(a) PrEparation de Z-Leu-Gl -Phe-Leu-Gln-Arg(Tos>-Ser-
Ser-OH On dissout 0,39 g de Z-Leu-Gly-NHNH2 dans 5 ml de diméthylformamidet 0,58 ml de HCl 6N/dioxanne, puis on fait réagir comme décrit à l'exemple de référence 1 en
utilisant 10 ml d'une solution diméthylformamidique conte-
tant 0,15 ml de nitrite d'isoamyle, 0,49 ml de triéthylami-
ne et 1,00 g de H-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, puis.on
additionne le mélange réactionnel d'une quantité équivalen-
te de Z-Leu-GlyN3 et on fait réagir à 4 C pendant 20 heures.
On extrait le mélange réactionnel au butanol, on lave l'ex-
trait à l'acide acétique à 2%, puis on élimine le butanol et l'acide acétique par distillation, et on cristallise le
résidu dans l'éther. On recueille les cristaux par filtra-
tion et on lave au méthanol chaud, obtenant ainsi 0,65 g
de Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
Rf: 0,19 Rf: 0,60 Analyse élémentaire pour C55H78N1206S.H2 O
78N12016S 2
C H N
Calculé % 54,44 6,64 13,85 Trouvé % 54,74 6,66 13,98 (b) Préparation de HLeu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arq-Ser-Ser-OH
On traite 20 mg de Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-
Ser-Ser-OH comme décrit à l'exemple l(b) afin d'éliminer un groupe de formule Z et d'éliminer un groupe de formule Tos, puis on soumet le mélange réactionnel à une filtra- tion sur gel en utilisant Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm; solvant d'élution: acide acétique à 10%), et en utilisant LH-20 (2,2 x 80 cm; solvant d'élution: HC1 0,001N) obtenant ainsi 11 mg de H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH
qu'on désignera ci-après "Peptide K".
Rf: 0,01 Rf: 0,40 /- 720 = -27,6 (C = 0,228, HCl 0,001N) Analyse élémentaire pour C40H66N12012. 6H2 O.CH3COOH
C H N
Calculé % 46,92 7,68 15,63 Trouvé % 46,89 7,25 15,51
Exemple 4
(a) Préparation de H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-
Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH
On dissout 600 mg de Z-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-
Ser-Ser-OH dans 50 ml de méthanol et 10 ml d'acide acétique
à 10%, puis on soumet le mélange à une réduction catalyti-
que en présence de 500 mg de noir de palladium, à tempéra-
ture ambiante et à la pression atmosphérique, obtenant ain-
si H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
Rf: 0,18.
On dissout 420 mg de Z-Tyr-Asn-Leu-NHNH2 dans 5 ml de diméthylformamide et 0,37 ml de HC1 6N/dioxanne puis, en
utilisant 0,10 ml de nitrite d'isoamyle et 0,31 ml de tri-
éthylamine, on prépare un azide par un procédé similaire à
celui décrit à l'exemple de référence 1; on ajoute le mé-
lange réactionnel à un mélange de 10 ml du triamide hexa-
méthylphosphorique de H-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-
Ser-OH et 10 ml de diméthylformamide, puis on agite le tout à 4 C pendant 20 heures. On élimine le diméthylformamide par distillation, on extrait le résidu au butanol, on lave l'extrait à l'acide acétique à 2%, on élimine le butanol par distillation et on cristallise le résidu en ajoutant
de l'éther. On obtient ainsi Z-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-
Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH qu'on dissout dans 30 ml de méthanol et 10 ml d'acide acétique à 10%, et on soumet la
solution à une réduction catalytique en présence de palla-
dium à la température ambiante et à la pression atmosphéri-
que. On soumet le mélange réactionnel à une filtration sur gel en utilisant Sephadex G-25 (3 x 120 cm; solvant d'élution: acide acétique à 50%), obtenant ainsi 650 mg
de H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
RfI: 0,05 Rf: 0,53 Analyse élémentaire pour C66H98N16019S. 2H20
C H N
Calculé % 53,28 6,91 15,06 Trouvé % 53,10 6,43 14,84
(b) Préparation de H-Tyr-Asn-Leu-Gl-Phe-
Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH
On traite H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-
Ser-Ser-OH obtenu à l'exemple 4(a) ci-dessus par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple l(b) pour éliminer le
groupe de formule Tos, puis on soumet le mélange réaction-
nel à une filtration sur gel en utilisant Sephadex G-10 (2,2 x 85 cm; solvant d'élution: acide acétique à 10%), puis en utilisant LH-20 (2,2 x 80 cm; solvant d'élution: HC1 0,001N), obtenant ainsi, sous forme purifiée, 9 mg de H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser)Ser-OH désigné
ci-après "Peptide L".
RfI: 0,01 Rfi: 0,42
/7 20= -24,3 (C = 0,078, HC1 0,001N)
Analyse élémentaire pour C59H92N10017. 15H2O.CH3COOH
C H N
Calculé % 45,01 7,80 13,77 Trouvé % 45,21 7,31 14,22
Exemple 5
(a) Préparation de Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-
G1y:PhezLeu-Gln-Ar_(Tos)-Ser-Ser-OH On dissout 159 mg de Z-Met-Ser-NHNH2 dans 5 ml de diméthylformamide et 0,21 ml de HC1 6N/dioxanne, puis, en utilisant 0,055 ml de nitrite d'isoamyle et 0,17 ml de triéthylamine, on prépare un azide par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple de référence 1. On ajoute ce
mélange réactionnel à un mélange de 300 mg de H-Tyr-Asn-
Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH, 5 ml de
diméthylformamide et 5 ml de triamide hexaméthylphosphori-
que, puis on agite le tout à 4 C pendant 24 heures. On ajoute ensuite 318 mg de Z-Met-Ser-NHNH2 et on agite à 4 C pendant 72 heures. Par un mode opératoire similaire à celui
décrit à l'exemple 4(a), on purifie et obtient ainsi Phe-
Leu-Gln-Arg(Tos)-Ser-Ser-OH.
(b) Préparation de H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-
Gly-Ph:e-Leu-Gln-Arq-Ser-Ser-OH
On traite Z-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-
Arg(Tos)-Ser-Ser-OH par un procédé similaire à celui décrit à l'exemple l(b) afin d'éliminer le groupe de formule Z et le groupe de formule Tos, puis on purifie le mélange réactionnel en utilisant Sephadex G-25 (3 x 120 cm; solvant d'élution: acide acétique à 50%), puis en utilisant LH-20 (2 x 85 cm; solvant d'élution: HCl 0,001N), obtenant ainsi
119 mg de H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-
Ser-Ser-OH, désigné ci-après "Peptide M".
Rf: 0,01 Rf: 0,45
-- --20
Lck/D = -15,7 (C = 0,254, HC1 0,001N) Analyse élémentaire pour C67H106N18020S.5 2.CH 3COOH
C H N
Calculé % 49,75 7,26 15,13 Trouvé % 49,80 6,92 14,91 Analyse des aminoacides: Asp: 0,95; Ser: 3,15; Gln: 1,03 Met: 0,92; Gly: 1,05; Leu: 3, 08 Tyr: 1,00; Phe: 0,98; Arg: 0,96 Pgrparation deepgt=idesma2rqués Exemple de préparation de peptide marqué 1
On marque H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-
Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH, c'est-à-
dire le peptide D, par un mode opératoire utilisant de la
Chloramine T, comme suit: -
A 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M (pH 7,0) contenant 5 microgrammes dupeptide D précité, on ajoute une solution tampon de phosphate 0,5M contenant 1 microcurie de Na/ 125I_/ (exempt de véhicule, New England Nuclear), puis on ajoute 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M contenant 70 mg/ml de Chloramine T. On
agite le mélange à température ambiante pendant 30 secon-
des, on met fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M contenant 60 mg/ml de métabisulfite de sodium (Na2S205). On additionne le mélange
réactionnel de 100 microlitres d'une solution aqueuse froi-
de d'iodure de sodium à 1%, on traite ce mélange réaction-
nel sur une coionne de Sephadex G-25 (1,0 x 30 cm) (solvant d'élution: tampon de phosphate 0,05M, pH 7,4, contenant 0,25% de BSA, 10 mM de EDTA et 0,02% de NaNH3). On obtient
le peptide D marqué dans lequel les 13ème et 14ème frac-
tions sont marquées avec 125I. On désigne ce produit ci-
après comme "Peptide D marqué avec 125I'.
Exemple de préparation de peptide marqué 2-1
On marque H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-
Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH, c'est-à-dire le peptide H, par un procédé utilisant de la Chloramine T, comme suit: A 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M (pH 7,0) contenant 5 microgrammes du peptide H ci-dessus on ajoute une solution tampon de phosphate 0,5M contenant 1 microcurie de Na/- 125I 7 (exempt de véhicule, N.E.N.), puis 20 microlitres d'une solution tampon de phosphate
0,5M contenant 70 mg/ml de Chloramine T. On agite le mélan-
ge à température ambiante pendant 30 secondes, on met fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M contenant 60 mg/ml de métabisulfite de
sodium (Na2S205). On additionne ensuite le mélange réac-
tionnel de 100 microlitres d'une solution aqueuse froide d'iodure de sodium à 1%, on traite le mélange réactionnel en utilisant une colonne de Sephadex G-25 (1,0 x 30 cm) (solvant d'élution: solution tampon de phosphate 0,05M; pH 7,4, contenant 0,25% de BSA, 10 mM de EDTA et 0,02% de NaN3). On obtient ainsi du peptide H marqué avec 125I,
désigné ci-après "Peptide H marqué avec 125I.
Exemple de préparation de peptide marqué 2-2 A 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M (pH 7,0) contenant 5 microgrammes de Peptide H on ajoute
une solution tampon de phosphate 0,5M contenant 1 millicu-
rie de Na/ 125I_/(exempt de véhicule, N.E.N.), puis on ajoute 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,5M contenant 70 mg/ml de Chloramine-T. On agite le mélange à température ambiante pendant 30 secondes et on met fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres de solution tampon de phosphate contenant 60 mg/ml de métabisulfite de sodium (Na2S205). Puis on additionne le mélange réactionnel de 100 microlitres d'une solution aqueuse froide d'iodure de
sodium à 1%, et on traite en utilisant une colonne de Se-
phadex G-25 (1,0 x 30 cm) (solvant d'élution: solution tam-
pon de phosphate 0,05M; pH 7,4; contenant 0,25% de BSA, 10 mM de EDTA et 0,02% de NaN3). On obtient ainsi du Peptide
H marqué avec 125I.
Exemple de préparation de peptide marqué - 3
(1) On marque H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-
Arg-Ser-Ser-OH, c'est-à-dire le Peptide M, par un procédé utilisant la Chloramine-T, comme suit: A 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,2M (pH 7,4) contenant 5 microgrammes du Peptide M ci-dessus, on ajoute une solution tampon de phosphate 0,2M contenant
1 microcurie de Na/- 125I-7(N.E.N.), puis on ajoute 20 micro-
litres de solution tampon de phosphate 0,2M contenant 3,5
mg/ml de Chloramine-T. On laisse le mélange reposer à tem-
pérature ambiante pendant 20 secondes, puis on met fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres de solution tampon de phosphate 0,2M contenant 2, 4 mg/ml de métabisulfite de sodium. On traite le mélange réactionnel sur colonne de
DEAE-Sephadex A-25 (1,0 x 30 cm) (solvant d'élution: solu-
tion tampon tris-acide chlorhydrique 0,1M, pH 8,6, conte-
nant 0,1% de BSA et 0,01% de NaN3). On purifie la première fraction du peptide par chromatographie d'échange d'ions, obtenant ainsi le peptide marqué avec 125I, produit
dit ci-après"Peptide M marqué avec 125I".
(2) On marque H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-
Arg-Ser-Ser-OH, c'est-à-dire le Peptide M, en faisant appel à un procédé utilisant la Chloramine-T, comme suit: A 20 microlitres de solution tampon de phosphate 0,2M (pH 7,4) contenant 5 microgrammes du Peptide M ci-dessus, on ajoute une solution tampon de phosphate 0,2M contenant
1 microcurie de Na/- 125I_7 (N.E.N.), puis on ajoute 20 mi-
crolitres de solution tampon de phosphate 0,2M contenant 3,5 mg/ml de Chloramine-T. On laisse ce mélange reposer à température ambiante pendant 20 secondes, puis on met fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres de solution tampon de phosphate 0,2M contenant 2,4 mg/ml de métabisulfite de sodium. On traite le mélange réactionnel sur colonne de SP-Sephadex C-25 (1,0 x 30 cm) (solvant d'élution: solution
tampon de phosphate 50 mM). On obtient le peptide M ci-des-
sus dans lequel la 4ème fraction est marquée avec 125I.
Ce produit est également dit ci-après "Peptide M marqué
avec 125I".
Exemple de préparation de peptide marqué 4 (1) On dissout 1 mg de peptide C et 1 mg d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans une solution tampon de borate de sodium 0,2M (pH 9,5). Au bout d'une heure de réaction à température ambiante, on soumet le mélange réactionnel à une chromatograpgie en couche mince (CCM) sur gel de silice (solvant d'élution: butanol/acide acétique/eau 4/1/5). On recueille les taches isolées obtenues à la CCM: on lave au
méthanol, puis à l'éthanol, et on élue à l'aide de la solu-
tion tampon ci-dessus (pH 7,8), obtenant ainsi 0,3 mg de peptide marqué avec FITC. On désigne ci-après ce produit "Peptide
C marqué avec FITC".
Rf: 0,11 RfII: 0,50 Analyse élémentaire pour C 116H174N32043 S.2CH3COOH. 7H 2
C H N
Calculé % 50,77 6,96 15,79 Trouvé % 49,99 6,85 15,50 (2) On dissout 1 mg de Peptide C dans 1 ml de solution tampon de bicarbonate de sodium 0,2M (pH 9,5). On dissout ensuite 1 mg d'isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC) dans la solution tampon ci-dessus et on réunit à la solution de peptide précitée, à 0 C. Une fois terminée la réaction poursuivie à température ambiante pendant une heure, on soumet le mélange réactionnel à une CCM sur gel de silice (solvant l'élution: butanol/acide acétique/eau 4/1/5). On recueille les taches isolées obtenues à la CCM et on les lave à l'aide de la solution tampon précitée, obtenant ainsi 0,2 mg de peptide marqué avec TRITC. Ce
produit est dit ci-après"Peptide C marqué avec TRITC".
RfI: 0,08 Analyse élémentaire: pour C120H184N34033 S.2CH3 COOH.7H20
C H N
Calculé % 51,19 7,14 16,37 Trouvé % 50,08 7,02 16,19 Exemple de préparation de peptide marqué 5 (1) On dissout 1 mg de Peptide G dans 1 ml de solution tampon de bicarbonate de sodium 0,2M (pH 9,5). Puis on ajoute 1 mg de FITC et on fait réagir à 25 C pendant une heure. Une fois la réaction terminée, on soumet le mélange réactionnel à une CCM sur gel de silice (solvant d'élution:
butanol/acide acétique/eau 4/1/5) afin de purifier le pro-
duit, et on obtient ainsi 0,1 mg de peptide marqué avec FITC. Ce produit est dit ci-après"Peptide G marqué avec
FITC".
Rf: 0,13 RfII: 0,49 (2) On dissout 1 mg de Peptide G dans 1 ml de solution tampon de bicarbonate de sodium 0,2M (pH 9,5). On ajoute 1 mg de dichlorotriazinefluorescéine et on fait réagir à
C pendant une heure. On soumet ensuite le mélange réac-
tionnel à une CCM sur gel de silice (solvant d'élution: butanol/acide acétique/eau 4/1/5). On obtient ainsi 0,1 mg de peptide purifié marqué avec DTAF. Ce produit est dit
ci-après "Peptide G marqué avec DTAF".
RfI: 0,12 Exemple de préparation de peptide marqué 6 (1) On dissout 1 mg de Peptide M et 1 mg de FITC dans une
solution méthanolique à 50% vol/vol de tampon de bicarbo-
nate de sodium 0,2M (pH 9,5). On fait réagir à température
ambiante pendant 2 heures, puis on soumet le mélange réac-
tionnel à une CCM sur gel de silice (solvant d'élution: butanol/acide acétique/eau 4/1/5). On recueille les taches isolées obtenues à la CCM, on élue au méthanol, et on obtient 0,3 mg de peptide marqué avec FITC. Ce produit est
dit ci-après "Peptide M marqué avec FITC".
I Rf: 0,16 Rf: 0,52 Analyse élémentaire pour C88H17N19025S2.5H20.CH3COOH
C H N
Calculé % 52,60 6,42 12,95 Trouvé % 52,65 6,22 12,74 (2) On dissout 1 mg de Peptide M dans 0,05 ml d'acide chlorhydrique 0,001N, on mélange cette solution avec une
solution méthanolique à 50% vol/vol de tampon de bicarbona-
te de sodium 0,2M (pH 9,5). D'autre part, on dissout 1 mg de TRITC dans une solution tampon de bicarbonate de sodium
0,2M (pH 9,5), puis on mélange cette solution avec la solu-
tion de peptide. On fait réagir à température ambiante pen-
dant 2 heures, puis on traite le mélange réactionnel par
CCM sur gel de silice (solvant d'élution: butanol/acide acé-
tique/eau 4/1/5). On recueille les taches isolées et on élue au méthanol, obtenant ainsi 0,1 mg de peptide marqué avec TRITC. Ce produit est dit ciaprès "Peptide M marqué
avec TRITC".
* I Rf: 0,12 Rfi: 0,42 Analyse élémentaire: pour C92H127N21024S2.5H20. CH3COOH
C H N
Calculé % 53,12 6,69 18,84 Trouvé % 53,20 6,51 13,80 Preparation d'antiqgène Exemple de préparation 1 mg de Peptide A préparé à l'exemple de préparation A-1 de la Synthèse des Peptides, et 15 mg de sérum-albumine
de bovin (dite ci-après BSA) sont dissous dans 2 ml de solu-
tion tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On addition-
ne cette solution de 0,11 ml de solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite le mélange à température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ensuite ce mélange réactionnel avec
1 litre d'eau à 4 C pendant 48 heures. Au cours de la dia-
lyse, on change l'eau 5 fois. On lyophilise la solution dialysée contenant une composition peptide-protéine, et on obtient 18 mg d'antigène d'interféron-k humain (ce produit
est dit ci-après "Antigène V-N-I".
Cet antigène t-N-I est un antigène dans lequel 12 moles en moyenne de Peptide A sont combinées avec une mole
de BSA.
Exemple de Préparation 2 On dissout 5 mg de Peptide B préparé à l'exemple de préparation A-2 de la Synthèse des Peptides, et 20 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M
(pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml de solu-
tion de glutaraldéhyde 0,1M, et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant 48 heures. Au cours de la dialyse, on change l'eau 5 fois. On lyophilise la solution dialysée contenant une composition
peptide-protéine, obtenant ainsi 23 mg d'antigène d'inter-
féron-t humain, dit ci-après "Antigène!-N-II".
Cet antigène U-N-II est un antigène dans lequel 9 moles
en moyenne de Peptide B sont combinées avec 1 mole de BSA.
Exemple de préparation 3 On dissout 4,5 mg de Peptide C préparé à l'exemple de préparation A-3 de la Synthèse des Peptides et 25 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 1,0 ml de solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite le mélange à
la température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ensui-
te ce mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant
48 heures. Au cours de la dialyse, on change l'eau 5 fois.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composi-
tion peptide-protéine, obtenant ainsi 27 mg d'antigène
d'interféron- humain (dit ci-après "Antigène V-N-III").
Cet Antigène -N-III est un antigène dans lequel 10 moles en moyenne du Peptide C sont combinées avec une mole
de BSA.
Exemple de préparation 4 On dissout 5 mg du Peptide D préparé à l'exemple de préparation A-4 de la Synthèse des Peptides et 25 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M
(pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml de solu-
tion de glutaraldéhyde 0,1M et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ensuite le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant
48 heures. On change l'eau 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialisée contenant une composition
peptide-protéine, obtenant ainsi 28 gm d'antigène d'inter-
féron- humain (dit ci-après "Antigène ç-N-IV").
Cet Antigène i-N-IV est un antigène dans lequel 9 moles en moyenne du Peptide D sont combinées avec une mole
de BSA.
Exemple de Préparation 5 On dissout 4,5 mg de Peptide C préparé à l'exemple de préparation A-3 de la Synthèse des peptides, et 25 mg de BSA dans 4 ml d'eau. On additionne cette solution de 200 mg de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ensuite le mélange réactionnel avec 2 litres d'eau à 4 C pendant48
heures. L'eau est changée 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composi-
tion peptide-protéine, obtenant ainsi 27,5 mg d'antigène
d'interféron-. humain (dit ci-après "Antigène a-N-V").
Cet Antigène d-N-V est un antigène dans lequel 12 mo- les en moyenne du Peptide C sont combinées avec une mole
de BSA.
Exemple de Préparation 6 On dissout 4,5 mg du Peptide D préparé à l'exemple de préparation A-4 de la Synthèse des Peptides, et 25 mg de BSA dans 4 ml d'eau. On additionne cette solution de 200 mg de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse
le mélange avec 2 litres d'eau à 4 C pendant 48 heures.
L'eau est changée 5 fois au cours de la dialyse. On lyophi-
lise la solution dialysée contenant une solution peptide-
protéine, obtenant ainsi 29 mg d'antigène d'interféron-
humain (dit ci-après "Antigène ç-N-VI").
L'antigène 0-N-VI ainsi obtenu est un antigène dans lequel 9 moles en moyenne du Peptide D sont combinées avec
une mole de BSA.
Exemple de Préparation 7 On dissout 5 mg de Peptide E préparé à l'exemple de préparation B-7(c) de la Synthèse des Peptides, et 15 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml de de solution de glutaraldéhyde O, 1M et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant
48 heures. L'eau est changée 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composition
peptide-protéine, obtenant ainsi 15 mg d'antigène d'inter-
féron-tj humain (dit ci-après "Antigène -C-I").
Cet Antigène ^-C-I est un antigène dans lequel 10 moles en moyenne du Peptide E sont combinées avec une mole
de BSA.
Le rapport de combinaison de Peptide E à BSA dans
l'Antigène r,-C-I est calculé comme suit: Après avoir cor.-
firmé l'absence de BSA ou de Peptide E n'ayant pas réaci dans l'Antigène i-C-I en effectuant encore une filtration
sur gel de Sephadex G-50 (solvant d'élution: sérum physio-
logique; détermination:DO 280 nm; vitesse d'élution: 3 ml/heure; quantité séparée: 1 ml chaque), on sépare et détermine la quantité de fraction de Peptide E combinée avec BSA (composition peptide-protéine) et la fraction d'autre produit (dimère de Peptide E), respectivement, on prépare une courbe d'étalonnage de la concentration standard du dimère et du Peptide E afin de déterminer la quantité de dimère, on soustrait la quantité de dimère de la quantité de Peptide E utilisée comme substance de départ, la quantité de Peptide E obtenue par soustraction étant considérée comme la quantité totale de Peptide E combinée
avec BSA.
Le rapport de combinaison de peptide synthétique à BSA dans chacun des antigènes obtenus dans les exemples de préparation respectifs suivant la présente invention est
calculé de façon similaire.
Exemple de Préparation 8 On dissout 5 mg de Peptide F préparé à l'exemple de préparation B-12 de la Synthèse des Peptides et 5 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M
(pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml de solu-
tion de glutaraldéhyde 0,1M, et on agite le mélange à la
température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ce mélan-
ge réactionnel avec 1 litre d'eau à 4 C pendant 48 heures,
en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse. On lyo-
philise la solution dialysée contenant une composition
peptide-protéine, obtenant ainsi 9 mg d'antigène d'inter-
féron- humain (dit ci-après "Antigène *-C-II".
Cet Antigène -C-II est un antigène dans lequel 9 moles
en moyenne du Peptide F sont combinées avec une mole de BSA.
Exemple de Préparation 9 On dissout 5 mg de Peptide G préparé à l'exemple de préparation B-16(b) de la Synthèse des Peptides et 25 mg de BSA dans 4 ml d'eau. On additionne la solution de 200 mg de dicyclohexylcarbodiimide (DCC) et on agite le mélange à température ambiante pendant 5 heures. On dialyse ensuite ce mélange réactionnel avec 2 litres d'eau à 4 C pendant 48 heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialy- se. On lyophilise la solution dialysée contenant une
composition peptide-protéine, obtenant ainsi 28 mg d'anti-
gène d'interféron-% humain (dit ci-après "Antigène t-C-III") L'Antigène %C-III obtenu est un antigène dans lequel 12 moles en moyenne du Peptide G sont combinées avec une
mole de BSA.
Exemple de Préparation 10 On dissout 4 mg de Peptide H préparé à l'exemple de préparation B-18(b) de la Synthèse des Peptides et 20 mg de BSA dans une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml d'une solution de glutaraldéhyde 0, 1% et on agite le mélange à température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec 1 litre d'eau à 4 C pendant 48
heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composition
peptide-protéine, obtenant ainsi 22 mg d'antigène d'inter-
féron-d. humain (dit ci-après "Antigène -C-IV").
L'Antigène $-C-IV est un antigène dans lequel 9 moles en moyenne de Peptide H sont combinées avec une mole de BSA. Exemple de Préparation 11 On dissout 4 mg du Peptide G préparé à l'exemple de préparation B-16(b) de la Synthèse des Peptides et 20 mg de BSA dans une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml d'une solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite à température
ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réac-
tionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant 48 heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse. On lyophilise
la solution dialysée contenant une composition peptide-
protéine, obtenant ainsi 21 mg d'antigène d'interféron-Q
humain (dit ci-aprês"Antigène -C-V").
L'Antigène A-C-V obtenu est un antigène dans lequel 8 moles en moyenne du Peptide G sont combinées avec une
mole de BSA.
Exemple de Préparation 12 On dissout 10 mg du Peptide I préparé à l'exemple de préparation C-l(b) de la Synthèse des Peptides et 50 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne la solution de 0,11 ml de solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite à température
ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réac-
tionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant 48 heures, en
changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse. On lyophili-
se la solution dialysée contenant une composition peptide-
protéine, obtenant ainsi 45 mg d'antigène d'interféron-<?
humain (dit ci-après "Antigène ( -I").
Exemple de Préparation 13 On dissout 5 mg du Peptide J préparé à l'exemple de préparation C-2(b) de la Synthèse des Peptides et 20 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml
d'une solution de glutaraldéhyde 0,1%, et on agite le mélarn-
ge à température ambiante pendant 5 heures. On dialyse le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant 48
heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composi-
tion peptide-protéine, obtenant ainsi 23 mg d'antigène
d'interféron-f humain (dit ci-après "Antigène -II"). Exemple de Préparation 14 On dissout 4 mg du Peptide K préparé à l'exemple
de préparation C-3(b) de la Synthèse des Peptides et 15 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne cette solution de 0,11 ml
d'une solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite le mélan-
ge à température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 4 C pendant 48 heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse
On lyophilise la solution dialysée contenant une composi-
tion peptide-protéine, obtenant ainsi 17 mg d'antigène
d'interféron-',l humain (dit ci-après "Antigène @^III").
Exemple de Préparation 15 On dissout 4 mg du Peptide L préparé à l'exemple de préparation C-4(b) de la Synthèse des Peptides et 12 mg de BSA dans 2 ml de solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne la solution de 0,11 ml d'une solution de glutaraldéhyde 0,1M et on agite le mélange à la
température ambiante pendant 5 heures. On dialyse le mélan-
ge réactionnel avec un litre d'eau à 40C pendant 48 heures,
en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse. On lyophi-
lise la solution dialysée contenant une composition peptide-
protéine, obtenant ainsi 14 mg d'antigène d'interféron-
humain (dit ci-après "Antigène -IV").
Exemple de Préparation 16 On dissout 8 mg du Peptide M préparé à l'exemple de préparation C-5(b) de la Synthèse des Peptides et 25 mg de BSA dans 2 ml d'une solution tampon d'acétate d'ammonium 0,1M (pH 7,0). On additionne la solution de 0,11 ml d'une solution de glutaraldéhyde O, 1M et on agite le mélange à la température ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec un litre d'eau à 40C pendant
48 heures, en changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse.
On lyophilise la solution dialysée contenant une composi-
tion peptide-protéine, obtenant ainsi 31 mg d'antigène
d'interféron-(, humain (dit ci-après "Antigène (-V").
Exemple de Préparation 17 On dissout 8 mg du Peptide M préparé à l'exemple de préparation C-5(b) de la Synthèse des Peptides et 25 mg de
BSA dans 4 ml d'eau. On additionne la solution de dicyclo-
hexylcarbodiimide (DCC) et on agite le mélange à températu-
re ambiante pendant 5 heures. Puis on dialyse le mélange réactionnel avec 2 litres d'eau à 40C pendant 48 heures, en
changeant l'eau 5 fois au cours de la dialyse. On lyophili-
se la solution dialysée contenant une composition peptide-
protéine, obtenant ainsi 29 mg d'antigène d'interféron-re
humain (dit ci-après "Antigène -VI").
Préeparation d'anticorps Exemple de Préparation 1
On dissout 100 microgrammes de l'Antigène z-N-1 obte-
nu à l'exemple de préparation 1 de la Préparation des Anti-
gènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on addition-
ne la solution de 1,5 ml d'un adjuvant complet de Freund
afin d'obtenir une suspension. On administre cette suspen-
sion par voie sous-cutanée à trois lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de la suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même quantité de la suspension à chaque lapin chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administration de la suspension, on prélève le sang dé l'animal. On s o u m e t le prélèvement sanguin à une séparation centrifuge, obtenant ainsi du sérum contenant un anticorps d'interféron-i humain (dit
ci-après"Anticorps d-N-I").
Exemple de Préparation 2 On dissout 20 microgrammes de l'Antigène &-N-II obtenu
à l'exemple de préparation 2 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on additionne la solution de 1,5 ml d' adjuvant complet de Freund afin d'obtenir une suspension. On administre cette suspension par voie sous-cutanée à 7 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de la suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6
fois. On administre en outre la même quantité de la suspen-
sion à chaque lapin chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administration de la suspension, on prélève le s a n g des animaux. On soumet le sang à une séparation centifuge, obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps
d'interféron-k humain (dit ci-après "Anticorps i-N-II ").
Exemple de Préparation 3
On dissout 20 microgrammes de l'Antigène x-N-III obte-
nu à l'exemple de préparation 3 de la Préparation des Anti-
gènes dans 1,5 ml de sérum physiologique et on additionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre la suspension par voie sous-cutanée à 7 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même quantité de la suspension
à chaque lapin chaque mois, 3 fois. 7 jours après la der-
nière administration de la suspension, on prélève le sang des a n i m a u x. On soumet le sang à une séparation
centrifuge, obtenant-ainsi un sérum contenant de l'anti-
corps d'interféron-s humain (dit ci-après "Anticorps ds-N-III"). Exemple de Préparation 4 On dissout 100 microgrammes de l'Antigène JL-N-III obtenu à l'exemple de préparation 3 de la Préparation des
Antigènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on addi-
tionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund
afin de préparer une suspension. On administre la suspen-
sion par voie sous-cutanée à 3 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin une semaine sur deux,
6 fois. On administre ensuite la même quantité de la sus-
pension à chaque lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après
la dernière administration, on prélève le sang des ani-
maux. On soumet le sang à une séparation centrifuge,
obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps d'interfé-
ron-e humain (dit ci-après "Anticorps It-N-IV").
Exemple de Préparation 5 On dissout 20 microgrammes de l'Antigène o'-N-IV obtenu à l'exemple de préparation 4 de la Préparation des Antigènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on additionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund, afin de préparer une
suspension. On administre la suspension par voie sous-cuta-
née à 7 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respective-
ment, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin, une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même quantité de la suspension à chaque lapin,
chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administra-
tion, on prélève le sang des animaux. On soumet le sang à une séparation centrifuge, obtenant ainsi du sérum
contenant de l'anticorps d'interféron-U humain (dit ci-
après "Anticorps d-N-V"). Exemple de Préparation 6 On dissout 100 microgrammes d'Antigène!-N-IV obtenu
à l'exemple de préparation 4 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 ml de sérum physiologique et on additionne la solution de 1, 5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre cette suspension par voie sous-cutanée à 3 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de
suspension à chaque lapin, une semaine sur deux, 6 fois.
Puis on administre la même quantité de suspension à chaque
lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière admi-
nistration, on prélève le sang des animaux. On s o u-
met le sang à une séparation centrifuge, obtenant ainsi du sérum contenant de l'anticorps d'interféron-u humain (dit
ci-après "Anticorps %-N-VI").
Exemple de Préparation 7 En utilisant 20 microgrammes de l'Antigène u-N-V obtenu à l'exemple de préparation 5 de la Préparation des
Antigènes, et en opérant comme décrit à l'exemple de prépa-
ration 5 ci-dessus, on obtient un sérum contenant de l'an-
ticorps d'interféron-i humain (dit ci-après"Anticorps t-
-N-VII").
Exemple de Préparation 8 En utilisant 20 microgrammes de l'Antigène "-N-V obtenu à l'exemple de préparation 5 de la Préparation des
Antigènes, et en opérant comme décrit à l'exemple de pré-
paration 4 ci-dessus, on obtient du sérum contenant de l'an-
ticorps d'interféron-L humain (dit ci-après "Anticorps
a -N-VIII").
Exemple de Préparation 9 En utilisant 20 microgrammes de l'Antigène r-NVI obtenu à l'exemple de préparation 6 de la Préparation des
Antigènes, et en opérant comme décrit à l'exemple de pré-
paration 3 ci-dessus, on obtient du sérum contenant de l'anticorps d'interféron-ç humain (dit ci-après "Anticorps
A -N-IX").
Exemple de Préparation 10 En utilisant 100 microgrammes de l'Antigène d-NVI obtenu à l'exemple de préparation 6 de la Préparation des
Antigènes, et en opérant comme décrit à l'exemple de pré-
paration 4 ci-dessus, on immunise trois lapins et on pré-
lève le sang des lapins, après quoi on soumet le sang à
une séparation centrifuge, obtenant ainsi un sérum conte-
nant de l'anticorps d'interféron-4 humain (dit ci-après
"Anticorps -N-X").
Exemple de Préparation 11 On dissout 100 microgrammes de l'antigène d-CIII obtenu à l'exemple de préparation 9 de la Préparation des
Antigènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on ad-
ditionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund
afin de préparer une suspension. On administre la suspen-
sion par voie sous-cutanée à 7 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de la suspension à chaque lapin, une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même quantité de suspension à chaque lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administration, on prélève le sang des lapins. On soumet le sang à une séparation centrifuge,
obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps d'inter-
féron- humain (dit ci-après "Anticorps z-C-III").
Exemples de Préparation 12 à 14 En utilisant l'Antigène d-C-I, l'Antigène d-C-II et l'Antigène I-C-IV obtenus respectivement aux exemples de préparation 7, 8 et 10 de la Préparation des Antigènes, et en opérant comme décrit dans l'exemple de préparation 11 ci-dessus de la Préparation des Anticorps, on obtient des sérums contenant les anticorps respectifs d'interféron-d humain (dits ci-après respectivement "Anticorps d-C-I",
"Anticorps c-C-II" et "Anticorps C-C-IV").
Exemple de Préparation 15
On dissout 30 microgrammes de l'Antigène t-C-III obte-
nu à l'exemple de préparation 9 de la Préparation des Anti-
gènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on addition-
ne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre cette suspension par voie sous-cutanée à un lapin (pesant 2,7 kg), et on administre la même quantité de suspension au lapin, une semaine sur deux, 5 fois. On administre ensuite la même quantité de suspension au lapin toutes les trois semaines, fois. 7 jours après la dernière administration de la sus- pension, on prélève le sang du lapin et on soumet le sang à
uneséparation centrifuge, obtenant ainsi un sérum conte-
nant de l'anticorps d'interféron-c humain (dit ci-après
"Anticorps d-C-V").
Exemple de Préparation 16 En utilisant 60 microgrammes de l'Antigène a-CIII obtenu à l'exemple de préparation 9 de la Préparation des
Antigènes, et en opérant comme décrit à l'exemple de pré-
paration 15 ci-dessus de la Préparation des Anticorps, on obtient un sérum contenant de l'anticorps d'interféron-ç
humain (dit ci-après "Anticorps d-C-VI").
Exemple de Préparation 17
En utilisant 30 microgrammes de l'Antigène d-C-V obte-
nu à l'exemple de préparation 11 de la Préparation des Antigènes et en opérant comme décrit dans l'exemple de préparation 15 ci-dessus de la Préparation des Anticorps, et en utilisant 2 lapins (pesant de 2,5 à 3,0 kg), on obtient un sérum contenant de l'anticorps d'interféron-o
humain (dit ci-après "Anticorps d-C-VïII").
Exemple de Préparation 18
En utilisant 60 microgrammes de l'Antigène %-C-V obte-
nu à l'exemple de préparation 11 de la Préparation des An-
tigènes et en opérant comme décrit à l'exemple de prépara-
tion 15 de la Préparation des Anticorps, on immunise 5 la-
pins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg); on prélève leur sang et on le centrifuge, obtenant ainsi des sérums contenant chacun l'anticorps d'interféron-ç, humain respectif (ces produits étant respectivement dits ci-après "Anticorps ç-C-IX", "Anticorps 4i-C-X", "Anticorps ck-C-XI", "Anticorps
a -C-XII" et "Anticorps ik-C-XIII").
S Exemple de Préparation 19 On dissout 250 microgrammes de l'Antigène FI obtenu
à l'exemple de préparation 12 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 ml de sérum physiologique et on additionne la solution de 1, 5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre cette suspension à
quatre lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respective-
ment, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même quantité de la suspension à chaque lapin,
chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administra-
tion, on prélève le sang des lapins. On soumet le sang à
une séparation centrifuge, obtenant ainsi du sérum conte-
nant de l'anticorps d'interféron-(, humain (dit ci-après
"Anticorps ^I").
Exemple de Préparation 20 On dissout 25 microgrammes de l'Antigène 0-II obtenu
* à l'exemple de préparation 13 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 ml de sérum physiologique et on additionne la solution de 1, 5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre la suspension à 4 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6 fois. On administre ensuite la même
quantité de suspension à chaque lapin, chaque mois, 3 fois.
7 jours après la dernière administration, on prélève le
sang des lapins. On soumet le sang à une séparation centri-
fuge, obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps
d'interféron-& humain (dit ci-après "Anticorps 0-II").
Exemple de Préparation 21 On dissout 25 microgrammes de l'Antigène &D-III obtenu
à l'exemple de préparation 14 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on additionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund, afin de préparer une suspension. On administre la suspension par voie sous-cutanée à 4 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de suspension à chaque lapin, une semaine sur deux, 6 fois.
On administre ensuite la même quantité de suspension à cha-
que lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administration de la suspension, on prélève le sang des lapins. On soumet le sang à une séparation centrifuge,
obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps d'inter-
féron-( humain (dit ci-après "Anticorpsr -III").
Exemple de Préparation 22 On dissout 25 microgrammes de l'Antigène %-IV obtenu
à l'exemple de préparation 15 de la Préparation des Anti-
gènes dans 1,5 ml de sérum physiologique, puis on addition-
ne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund,afin de préparer une suspension. On administre cette suspension par voie sous-cutanée à 4 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de la suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6
fois. On administre ensuite la même quantité de la suspen-
sion à chaque lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après la dernière administration de la suspension, on prélève le
sang des lapins. On soumet le sang à une séparation cen-
trifuge, obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps
d'interféron-( humain (ce produit est dit ci-après "Anti-
corps $-IV").
Exemple de Préparation 23 On dissout 25 microgrammes de l'Antigène '-V obtenu
à l'exemple de préparation 16 de la Préparation des Antigè-
nes dans 1,5 mi de sérum physiologique, puis on additionne la solution de 1,5 ml d'adjuvant complet de Freund afin de préparer une suspension. On administre cette suspension par voie sous-cutanée à 4 lapins (pesant chacun de 2,5 à 3,0 kg) respectivement, et on administre la même quantité de la
suspension à chaque lapin une semaine sur deux, 6 fois.
On administre ensuite la même quantité de la suspension à
chaque lapin, chaque mois, 3 fois. 7 jours après la der-
nière administration de la suspension, on prélève le sang des lapins. On soumet le sang à une séparation centrifuge,
obtenant ainsi un sérum contenant de l'anticorps d'inter-
féron-t humain (produit dit ci-après "Anticorps 0b-V"). Exemple de Préparation 24 En utilisant l'Antigène A-VI obtenu à l'exemple de
préparation 17 de la Préparation des Antigènes, et en opé-
rant comme décrit dans l'exemple de préparation 15 ci-des-
sus de la Préparation des Anticorps, on obtient un sérum
contenant un anticorps très puissant et spécifique vis-à-
vis de l'interféron-@ humain (ce produit est dit ci-après
"Anticorps -VI").
Détermination du titre des anticorps - (1) On détermine le titre des Anticorps cl-N-I à çi,-N-X comme suit:
On dilue chacun des anticorps à l'aide de sérum phy-
siologique afin de préparer des séries de dilutions pré-
sentant des concentrations diluées 10, 102, 103, 104, 105
fois par rapport à la concentration initiale. A 100 micro-
litres de chacun de ces échantillons dilués on ajoute 0,1 ml d'une solution diluée de Peptide D marqué avec 125I /obtenu à l'exemple de préparation des peptides marqués- 1, comme précédemment indiqué, et dilué de façon à obtenir une solution diluée ayant une radioactivité de 9.500 cpm_7 et 0,2 ml d'une solution de tampon de phosphate 0,05M (pH 7,4) /Uontenant 0,25% de BSA, 10 mM de EDTA et 0,02% de NaN37/ puis on fait incuber ce mélange à 40C pendant 24 heures. Le produit résultant d'anticorps combiné avec le Peptide D marqué avec 125I formé dans le mélange incubé est isolé du Peptide D marqué avec 1251 non combiné, par un mode opératoire utilisant du carbone activé - dextrane puis par séparation centrifuge (à 40C pendant 30 minutes,
3000 tours/minute).
Le rapport de combinaison (%) de l'anticorps au Pepti-
de D marqué avec 125I dans le produit résultant est déter-
miné en mesurant la radioactivité de chaque échantillon dans la série des concentrations diluées. Les résultats concernant le rapport de combinaison (%) obtenu à partir des échantillons respectifs des séries de dilutions sont portés sur un graphique, sur lequel l'ordonnée indique le rapport de combinaison (%) de l'anticorps au Peptide D
marqué avec 125I, tandis que l'abscisse indique la concen-
tration diluée de l'anticorps.
On obtient, d'après le graphique, la concentration diluée de l'anticorps présentant un rapport de combinaison de 50%, qui est le titre de l'anticorps. Les résultats
obtenus sont rapportés au tableau 1 ci-dessous.
TABLEAU 1
Anticorps Titre Anticorps Titre -N-I 10.000 u-N-V 150.000
:-N-II 12.000 &-N-VII 180.000
çà-N-III 120.000 d-N-VIII 42.000 -N-IV 200.000 d-N-X 28.000 Test de spécificité de l'Anticorps À-N-IV vis-à-vis de l'interféron lymphoblastolde humain Pour effectuer ce test de spécificité, on utilise les substances suivantes comme échantillons à tester:
(1) Interféron-(D humain (préparé par Tokyo Metropoli-
tan Institute of Medical Science, activité spécifique: 3 x 106 U/mg de protéine), à diverses concentrations (2) Peptide C obtenu à l'exemple de préparation A-3
de la Synthèse des Peptides, c'est-à-dire une chaîne pepti-
diaue d'interféron lymphoblastoïde humain
(3) Interféron-4 humain (préparé.par Hayashibara Bio-
chemical Research Laboratory, interféron lymphoblastoide Lot.no 800928)
(4) Interféron-& humain (fourni par le Dr Cantell,Cen-
tral Public Health Lab., Finlande).
D'autre part, comme agent de dilution standard, on utilise une solution tampon de phosphate 0,05M contenant
0,25% de BSA, 5 mM de EDTA et 0,02% de NaN3.
Dans chaque tube à essai on introduit 0,2 ml de l'agent de dilution standard, 0,1 ml de l'échantillon à tester, 0,1 ml d'Anticorps *-N-IV obtenu à l'exemple de préparation 4 de la Préparation des Anticorps (titre = 200.000) et 0,1 ml de Peptide D marqué avec 125I /obtenu à l'exemple de préparation d'un peptide marqué -1, comme
précédemment indiqué, et dilué de façon à obtenir une solu-
tion diluée ayant une radioactivité d'environ 2.800 cpm7.
On fait incuber chacun des tubes à essai contenant le mé-
lange précité à 4 C pendant 72 heures, puis on additionne le mélange de 0, 1 ml de sérum normal de porc, suivi de 0,5 ml d'une suspension de carbone activé enrobé de dextrane, et on laisse le tout reposer à 4 C pendant 30 minutes, puis
on soumet la totalité du mélange à une séparation centrifu-
ge à 4 C pendant 30 minutes, à 3000 tours/minute, afin d'isoler le produit résultant, c'est-à-dire l'anticorps combiné avec le Peptide D marqué avec 125I, du peptide marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné). On mesure la radioactivité de chaque peptide. On détermine le taux de
fixation (%) du peptide marqué avec 125I de chaque échan-
tillon à chaque concentration et chaque dilution en prenant comme 100% le taux de fixation (Bo) correspondant au titre
de l'anticorps utilisé.
Les résultats obtenus sont rapportés à la Fig.1 dans
laquelle on a indiqué en ordonnée le pourcentage fixé re-
latif /(%) = B/B x 1007 et en abscisse la concentration des échantillons à tester (Peptide C obtenu à l'exemple de préparation A-3 de la Synthèse des Peptides, c'est-à-dire une chaine peptidique d'interféron lymphoblastoide humain, d'interféron-t humain et d'interféron-& humain). Dans la Fig.1l, la courbe (a) concerne le Peptide C, c'est-à-dire une chaîne peptidique d'interféron lymphoblastolde humain, la courbe (b) concerne un interféron-s humain (fourni par Cantell), la courbe (c) concerne un interféron-t humain (préparé par Hayashibara Biochemical Research Laboratory) et la courbe (d) concerne un interféron-( humain. I1 découle des courbes de la Fig.1 que la réactivité de l'Anticorps -N-IV vis-à-vis de l'interféron-l humain est nettement
différente de la réactivité de l'Anticorps -N-IV vis-a-
vis de l'interféron- humain, ce qui signifie que l'Anti-
corps &-N-IV est un anticorps hautement spécifique et qui ne modifie pas l'activité de l'interféron-e humain avant
la concentration de 3,0 x 106 U/ml.
Détermination du titre des anticorps - (2) On détermine le titre des Anticorps d-C-I à *-C-XIII comme suit:
On dilue chacun des anticorps à l'aide de sérum phy-
siologique afin de préparer des séries de dilutions pré-
sentant des concentration dilues 10, 102, 103 104 105...
fois par rapport à la concentration initiale. A 100 micro-
litres de chacun de ces échantillons dilués on ajoute 0,1 ml d'une solution diluée de Peptide H marqué avec 125I /obtenu à l'exemple de préparation des peptides marqués
-2-1, comme précédemment indiqué, et dilué de façon à obte-
nir une solution diluée ayant une radioactivité de 9500 cpm environ7 et 0, 2 ml d'une solution tampon de phosphate 0,05 M (pH 7,4)/contenant 0,25% de BSA, 10 mM de EDTA et 0,02% de NaN3_/, puis on fait incuber le mélange à 4 C
pendant 24 heures. Le produit résultant d'anticorps com-
biné avec le Peptide H marqué avec 125I formé dans le mélan-
ge incubé est isolé du Peptide H marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné), par un mode opératoire utilisant
du carbone activé - dextrane puis par séparation centrifu-
ge (à 4 C pendant 4 minutes, 3000 tours/minute).
Le rapport de combinaison (%) de l'anticorps au Pepti-
de H marqué avec 125I dans le produit résultant est déter-
miné en mesurant la radioactivité de chaque échantillon dans la série des concentrations diluées. Les résultats concernant le rapport de combinaison (%) obtenu à partir des échantillons respectifs des séries de dilutions sont portés sur un graphique, sur lequel l'ordonnée indique le rapport de combinaison (%) de l'anticorps au Peptide H
marqué avec 125I, tandis que l'abscisse indique la concen-
tration diluée de l'anticorps On obtient, d'après le graphique, la concentration diluée de l'anticorps présentant un rapport de combinaison de 50%, qui est le titre de l'anticorps. Les résultats
obtenus sont rapportés au tableau 2.
TABLEAU 2
Anticorps Titre Anticorps Titre C-C-I 2.500 d-C-VIII 1.200 d-C-II 4.200 dC-IX 6.000
$-C-III 50.000 $-C-X 1.100
$-C-IV 1.200 d-C-XI 2.200
AL-C-V 10.400 A-C-XII 3.600
d-C-VI 2.600 d-C-XIII 1.000 d-C-VII 40.000 Il découle des résultats rapportés au tableau 2 que le peptide C-terminal de l'interféron-d humain répondant à la
formule générale (2) et ses dérivés ont une forte antigéni-
cité par comparaison avec celle d'autres peptides, par
exemple comme on peut le voir d'après le titre des Anti-
corps ç-C-IX à &-C-XIII, on peut obtenir des anticorps
utilisables chez la plupart des animaux auxquels on admi-
nistre l'antigène.
Test de spécificité de l'Anticorps t-C-III vis-à-vis de l'interféron-" humain (a) Pour effectuer ce test de spécificité, on utilise les substances suivantes comme échantillons à tester:
(1) Interféron-s humain (préparé par Tokyo Metropoli-
tan Institute of Medical Science; activité spécifique: 3 x 106 U/mg de protéine) à diverses concentrations (2) Peptide G obtenu à l'exemple de préparation B-16(b)
de la Synthèse des Peptides, c'est-à-dire une chaîne pepti-
dique d'interféron-r humain.
(3) Interféron-s humain (interféron lymphoblastoide
préparé par Hayashibara Biochemical Research Laboratory).
D'autre part, comme agent de dilution standard, on utilise une solution tampon de phosphate 0,05M (pH 7,4),
contenant 0,25% de BSA, 5 mM de EDTA et 0,02% de NaNH3.
Dans chacun des tubes à essai on introduit 0,2 ml de l'agent de dilution standard, 0,1 ml de l'échantillon à tester, 0,1 ml d'Anticorps A-C-III obtenu à l'exemple de préparation - 11 de la Préparation des Anticorps et 0,1 ml de Peptide H marqué.avec 125I /obtenu à l'exemple de prépa-
ration des peptides marqués 2-1, comme précédemment indi-
qué, et dilué de façon à obtenir une solution ayant une radioactivité d'environ 2800 cpm7. On fait incuber chacun
des tubes à essai contenant le mélange précité à 4 C pen-
dant 72 heures, puis on additionne le mélange incubé de 0,1 ml de sérumnormal de porc suivi de 0,5 ml d'une suspension de carbone activé enrobé de dextrane, et on abandonne le tout à 4 C pendant 30 minutes. On soumet la totalité du
mélange à une séparation centrifuge à 4 C pendant 30 minu-
tes, à 3000 tours/minute, afin d'isoler le produit résul-
tant d'anticorps combiné avec le peptide marqué avec 125I
du peptide marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné).
On mesure la radioactivité de chaque peptide. On détermine le taux de fixation (%) du peptide marqué avec 125I de
chaque échantillon à chaque concentration et chaque dilu-
tion en prenant comme 100% le taux de fixation (Bo) corres-
pondant au titre de l'anticorps utilisé. I1 découle des
résultats de ce test, que la réactivité de l'Anticorps v-C-
III vis-à-vis de l'interféron-t humain est nettement diffé-
rente de la réactivité de l'Anticorps i-C-III vis-à-vis de l'interféron-( humain, ce qui signifie que l'Anticorps &-C-III est un anticorps hautement spécifique ne modifiant
que faiblement l'activité de l'interféron-% humain.
On effectue des tests similaires sur les spécificités de l'Anticorps I-CI, de l'Anticorps t'-C-II, des Anticorps J-C-IV à e-C-VII et des Anticorps d-C-Ix à 6-C-XIII, avec
confirmation de la haute spécificité de ces anticorps vis-
à-vis de l'interféron-dS humain.
(b) On effectue des tests similaires sur l'Anticorps &-C-
VIII, en opérant comme pour le test (a) ci-dessus. Les ré-
sultats obtenus sont illustrés à la Fig.2, dans laquelle l'ordonnée indique lespourcentagesfixs relatifs
_/%) = B/B x 100 7, tandis que l'abscisse indique la con-
centration des échantillons à tester (Peptide G obtenu à
l'exemple de préparation B-16(b) de la Synthèse des Pepti-
des, c'est-à-dire une chaîne peptidique d'interféron-
humain, d'interféron-' humain / interféron lymphoblastoide préparé par Hayashibara Biochemical Research Laboratory, et interféron leucocytique fourni par National Institute of Health7 et d'interféron-( humain (activité spécifique: 3 x 106 U/mg de protéine, préparé par Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science). Dans la Fig.2, la courbe
(a) concerne le Peptide G, la courbe (b) concerne l'inter-
féron-i humain (préparé par Hayashibara Biochemical Re-
search Laboratory), la courbe (c) concerne l'interféron-
humain (fourni par National Institute of Health) et la courbe (d) concerne l'interféron-f humain (préparé par Tokyo Institute of Medical Science). Il découle des courbes
de la Fig.2 que la réactivité de l'Anticorps U-C-vIII vis-
à-vis de l'interféron-4 humain est nettement différente de
la réactivité de l'Anticorps i-C-VIII vis-à-vis de l'in-
terféron-i humain, ce qui signifie que l'Anticorps 5-C-VIII est un anticorps ayant une haute spécificité et qui ne modifie pas l'activité de l'interféron-' humain avant la
concentration de 1,0 x 106 U/ml.
Détermination du titre des anticorps - (3) On détermine le titre des Anticorps 0-I à ^-VI comme suit:
On dilue chaque anticorps à l'aide de sérum physiolo-
gique afin de préparer une série de dilutions, présentant des concentrations diluées 10, 102, 103 104... fois par rapport à la concentration initiale. A 100 microlitres de chacun des échantillons dilués on ajoute 0,1 ml d'une solution diluée de Peptide M marqué avec 125I /obtenu à l'exemple de préparation des peptides marqués - 3, comme
précédemment indiqué, et dilué de façon à obtenir une solu-
tion diluée ayant une radioactivité d'environ 10.000 cpml et 0,2 ml d'une solution tampon de phosphate 0,1M (pH 7,4) /contenant 0,1% de BSA, 0,15 M de chlorure de sodium et 0,01% de NaN3 7, puis on fait incuber ce mélange à 4 C
pendant 24 heures. Le produit résultant, d'anticorps combi-
né avec le Peptide M marqué avec 125I, formé dans le mélan-
ge incubé est isolé du Peptide M marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné) par un procédé utilisant du car- bone activé à l'aide de dextrane et par une séparation
centrifuge (à 4 C pendant 15 minutes, à 3000 tours/minute).
Le rapport de combinaison (%) d'anticorps à peptide marqué avec 125I dans le produit résultant est déterminé en mesurant la radioactivité de chaque échantillon de la série des dilutions. Les résultats concernant le rapport de combinaison (%) fourni par les échantillons respectifs de la série des dilutions sont portés sur un graphique sur lequel l'ordonnée indique le rapport de combinaison (%) d'anticorps à Peptide M
marqué avec 125I, tandis que l'abscisse indique la concen-
tration diluée de l'anticorps. On obtient, d'après le gra-
phique, une concentration diluée de l'anticorps présentant
un rapport de combinaison de 50% qui est le titre de l'an-
ticorps. Les résultats obtenus sont rapportés au tableau 3.
TABLEAU 3
Anticorps Titre t -V 52.000
-VI 100.000
Test de spécificité de l'Anticorps -V vis-à-vis de l'in-
terféron-{ humain:
Pour effectuer ce test, on utilise les substances sui-
vantes comme échantillons à tester: (1) Interféron- humain (activité spécifique: 3 x 106 U/mg de protéine, préparé par Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) (2)Chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféron-[ humain (Peptide M obtenu à l'exemple 5 de l'exemple de préparation C de la Synthèse des Peptides (3) Interféron-v humain (interféron lymphoblastoide, Lot N 800928, préparé par Hayashibara Biochemical
Research Laboratory).
D'autre part, on utilise comme agent de dilution stan-
dard, une solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 7,4) contenant 0,1% de BSA, O,15M de NaCl et 0,01% de NaN3. Dans chacun des tubes à essai, on introduit 0,2 ml de l'agent de dilution standard, 0,1 ml de l'échantillon à
tester, 0,1 ml d'Anticorps 0-V obtenu à l'exemple de prépa-
ration 23 de la Préparation des Anticorps (titre: 52.000) et 0,1 ml de Peptide M marqué avec 125I /obtenu à l'exemple
de préparation des peptides marqués - 3, comme indiqué ci-
dessus, et dilué de façon à obtenir une solution diluée ayant une radioactivité d'environ 10.000 cpm7, puis on
fait incuber ce mélange à 4 C pendant 48 heures. On addi-
tionne le mélange incubé de 0,1 ml de sérum de mouton nor-
mal, puis on ajoute au mélange 0,5 ml d'une suspension de
carbone activé enrobé de dextrane, on laisse le tout repo-
ser à 4 C pendant 30 minutes, puis on soumet le tout à une séparation centrifuge à 4 C pendant 30 minutes, à 3000
tours/minutes, afin d'isoler le produit résultant, d'anti-
corps combiné avec le peptide marqué avec 125I, du peptide marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné). On mesure la radioactivité de chaque peptide. On détermine le taux de
fixation (%) du peptide marqué avec 125I de chaque échan-
tillon à chaque concentration et chaque dilution en prenant comme valeur 100% le taux de fixation (Bo) correspondant au titre de l'anticorps utilisé. Les résultats obtenus sont illustrés à la Fig.3 dans laquelle l'ordonnée indique le pourcentage fixé relatif /(%) = B/BO x 1007, tandis que l'abscisse indique la concentration des échantillons à tester (chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféron-humain
(Peptide M), interféron-r humain et interféron-tk humain7/.
A la Fig.3, la courbe (a) concerne les chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféron-n humain (Peptide M), la courbe (b) concerne l'interféron-4 humain, et la courbe (c) concerne concerne l'interféron-J humain. Il découle des courbes de la Fig.3 que la réactivité de l'Anticorps >-V visà-vis de
l'interféron-d humain est nettement différente de la réac-
tivité de l'Anticorps P-V vis-à-vis de l'interféron-e humain et que l'Anticorps 0-V est un anticorps hautement spécifique et ne modifie pas l'activité de l'interféron-c humain avant la concentration de 3,7 x 106 U/ml.
On effectue en outre des tests similaires sur la spé-
cificité de l'Anticorps ^-VI vis-à-vis de l'interféron-C humain. Les résultats obtenus sont illustrés à la Fig.4
dans laquelle l'ordonnée indique le pourcentage fixé rela-
tif /_%) = B/B0 x 1007, tandis que l'abscisse indique les concentrations des échantillons testés /chaines peptidiques 1 à 13 de l'interféron-3 humain (Peptide M), interféron-(_ humain et interférons humain7. A la Fig. 4, la courbe (d) concerne les chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféroni humain (Peptide M), la courbe (e) concerne l'interféron-P
humain et la courbe (f) concerne l'interféron- humain.
On effectue des tests similaires sur les spécificités de l'Anticorps 0-II, de l'Anticorps (-III et de l'Anticorps
0-IV. C'est ainsi que, dans chaque tube à essai, on intro-
duit 0,2 ml de l'agent de dilution standard précité, 0,1 ml de l'échantillon à tester précité, 0,1 ml d'Anticorps 0-II, -III ou P-IV et 0,1 ml de Peptide M marqué avec 125I, puis
on effectue la réaction dans les mêmes conditions que pré-
cédemment. Lorsqu'on prend comme valeur 100% la réactivité de fixation entre l'Anticorps 0-V ou l'Anticorps <-VI et les
chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféron-s humain (Pepti-
de M) et les chaînes peptidiques 1 à 13 de l'interféron-(
humain (Peptide), le pourcentage fixé relatif (%) des anti-
corps respectifs sont indiqués au tableau 4:
Tableau 4
Anticorps Pourcentage fixé Anticorps Pourcentage ____ relatif _fixâ relatif -V 100 0-Vi 100
^-II 25 -II 25
0-III 30 6-III 28
2-Iv 50 -IV 70 Détermination de la limite de sensibilité Dans des tubes à essais distincts on introduit, dans chaque tube, 0,2 ml de l'agent de dilution standard, 0,1 ml
des chaînes peptidiques 1 à 13 d'interféron-( humain (Pep-
tide M), 0,1 ml d'Anticorps -V obtenu à l'exemple 23 de la Préparation des Anticorps ou d'Anticorps (-VI obtenu à l'exemple 24 de la Préparation des Anticorps, et 0,1 ml de
Peptide M marqué avec 125I /obtenu à l'exemple de prépara-
tion de peptides marqués - 3, comme précédemment indiqué, dilué de façon à obtenir une solution diluée ayant une radioactivité d'environ 10.000 cpm7, puis on fait incuber
ce mélange à 4 C pendant 48 heures. On additionne le mélan-
ge incubé de 0,1 ml de sérum de mouton normal, puis 0,5 ml d'une suspension de carbone activé enrobé de dextrane, et on laisse le mélange résultant reposer à 4 C pendant minutes, puis on le soumet à une séparation centrifuge
à 4 C pendant 30 minutes, à 3000 tours/minute, afin d'iso-
ler le produit résultant (anticorps combiné avec le peptide marqué avec 125I) du peptide marqué avec 125I n'ayant pas réagi (non combiné). On mesure la radioactivité de chaque peptide. On détermine le taux de fixation (%) du peptide
marqué avec 125I de chaque échantillon à chaque concentra-
tion et chaque dilution, prenant comme valeur 100% le taux de fixation (%) correspondant au titre de l'anticorps utilisé. Les résultats obtenus sont illustrés à la Fig.5,
dans laquelle l'ordonnée indique le pourcentage fixé rela-
tif /(%) = B/B x 1007, tandis que l'abscisse indique la
concentration des chaînes peptidiques i à 13 de l'interfé-
ron-4 humain (Peptide M), la courbe (g) indiquant les résultats obtenus en utilisant l'Anticorps P-V et la courbe
(h) indiquant les résultats obtenus en utilisant l'Anti-
corps 0-VI. Il découle des courbes de la Fig.5 que lalimite de sensibilité minimale pour doser l'interféron humain est de 13 picogrammes/ml lorsqu'on utilise l'Anticorps 2-V
et de 5 picogrammes/ml lorsqu'on utilise l'Anticorpsp -VI.
Dosage de l'interféron-( humain pardosaae immunologique par polarisation de fluorescence - 1:
2503 145
(a) Préparation d'une solution de peptide marqué au fluorochrome On dissout du Peptide C marqué avec FITC /obtenu à l'exemple de préparation des peptides marqués -4(1)7/ dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 7) /contenant 0,9% pds/vol de NaCl et 0,05% pds/vol de BSA7 afin d'obtenir une solution ayant une concentration de
3 x 10 -9M de Peptide C marqué avec FITC (solution dite ci-
après "Solution A").
(b) Préparation d'une solution de référence de peptide margué_au fluorochrome, pour essai de référence On prépare une composition ayant la même composition
que la Solution A, mais ne contenant pas de peptide C mar-
* qué avec FITC (solution dite ci-après "Solution B").
(c) Préparation d'une solution d'anticorps On dilue 150 fois, à l'aide de sérum physiologique, de l'Anticorps -N-VII /obtenu à l'exemple de préparation -7 de la Préparation des Anticorps7/(titre= 180.000), la
solution étant dite ci-après "Solution C".
(d) Préparation d'une solution de dilution On prépare une solution de dilution (pH 7,8) contenant 9,89 g/litre de H3BO3, 4,32 g/litre de Na2B407.10H2O, 9 g/litre de NaCl, 0,005% pds/vol de NaN3 et 0,01% pds/vol
de BSA, dite ci-après "Solution D".
(e) Préparation d'une série de solutions diluées (1) On dissout du Peptide C /obtenu à l'exemple de préparation A-3-5 de la Préparation des Peptides7 dans une
solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 6,5) conte-
nant 0,9% pds/vol de NaC1, 0,05 % pds/vol de BSA afin
d'obtenir une solution ayant une concentration de 5 micro-
grammes/litre en Peptide C. Puis on dilue la solution à
l'aide de la Solution D afin de préparer une série de solu-
tions diluées ayant des concentrations en Peptide C de 500,
250, 125, 62,5, 31,25, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95, 0,925, 0,463
et 0 ng/ml.
(2) En utilisant un interféron-ti humain (Cantell) et en procédant comme décrit en (1) ci-dessus, on prépare une série de solutions diluées d'interféron-4 humain. Les
concentrations en interféron-4 humain de la série de dilu-
tions sont 1 x 106, 0,5 x 106, 0,25 x 106, 0,125 x 106, 0,063 x 106, 0, 031 x 106, 0,016 x 106 0,008 x 106 et 0 U/ml. (f) Détermination du degré de polarisation (valeur P) A 0,2 ml de chacune des solutions diluées préparées
en (e)-(1) on ajoute 0,05 ml de Solution A, 0,1 ml de Solu-
tion C et 0,65 ml de Solution D afin d'obtenir un échantil-
lon de solution de Peptide C. De même, on prépare un
échantillon de solution de référence de Peptide C en utili-
sant 0,05 ml de Solution B au lieu de la Solution A. En opérant comme décrit ci-dessus, on prépare une
série d'échantillons de solutions diluées d'interféron-
humain et une série de dilutions de référence correspondan-
tes à partie des séries de dilutions décrites en (e)(1).
On prépare ensuite une solution d'échantillon d'anti-
corps pour essai de référence en mélangeant 0,05 ml de Solution A avec 0, 95 ml de Solution D, et on prépare une solution de référence d'anticorps pour essai de référence
en mélangeant 0,05 ml de Solution B avec 0,95 ml de Solu-
tion D.
On fait incuber chacune de ces solutions d'échantil-
lons et de ces solutions de référence à 4 C pendant 12 heu-
res, puis on détermine la lumière polarisée dans la fluo-
rescence à l'aide d'un appareil de mesure de l'intensité de la polarisation de la fluorescence. On calcule le degré de polarisation (valeur P) de la série des solutions d'échantillons diluées d'après la formule suivante:
(I I) - (ISIR) (IHS - IHR)
P = x 100 (%)
(IVS- IVR) + (IHS -IHR)
dans laquelle: IVS = l'intensité de la fluorescence polari-
VS sée verticale de l'échantillon
IHS= l'intensité de la fluorescence polari-
H sée horizontale de l'échantillon IVR = l'intensité de la fluorescence polarisée verticale de l'échantillon de référence IHR = l'intensité de la fluorescence polarisée horizontale de l'échantillon de référence Les résultats obtenus sont rapportés aux Fig. 6 et 7. D'après les Fig.6 et 7 la concentration correspondant à la moitié de la variation de la valeur P est de 0,79 ng/Tube pour le Peptide C et de 7,2 X 104 U/Tube pour l'interféron-% humain, et le rapport entre ces valeurs est
de 91 U/pg.
De même, on détermine la valeur P dans une solution
d'échantillon d'interféron- humain de concentration incon-
nue et on obtient le titre d'après la Fig.6 ou la Fig.7.
Dosage de l'interféron-( humain dosage immunologique par polarisation de fluorescence (a) Préparation d'une solution de Deptide marqué au fluorochrome On dissout du Peptide G marqué avec DTAF /obtenu à l'exemple de préparation de peptides marqués -5(2)7 dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 7) /contenant 0,9% pds/vol de NaCl et 0,05% pds/vol de BSA7 de façon à obtenir une solution ayant une concentration de 1,5 x 10-9M en Peptide G marqué avec DTAF dite ci-après
"Solution A' ".
(b) Préparation d'une solution de référence de eptide margué au fluorochrome pour essai de référence On prépare une solution ayant la même composition que la Solution A' mais ne contenant pas de Peptide G marqué
avec DTAF, dite ci-après "Solution B' ".
(c) Préparation d'une solution d'anticorps On dilue de l'Anticorps \-CVIII (titre = 1200)/obtenu
à l'exemple de préparation - 17 de la Préparation des Anti-
corps_7 40 fois à l'aide de sérum physiologique, cette solu-
tion étant dite ci-après "Solution C' ".
(d) Préparation d'une solution de dilution On prépare une solution de dilution (pH 7,0) contenant 9,89 g/litre de H3B03, 4,32 g/litre de Na2B407.10H20, 9 g/ litre de NaCl, 0,005% pds/vol de NaN3 et 0,01% pds/vol de
BSA. La solution est dite ci-après "Solution D' ".
(e) Préparation d'une série de solutions diluées (1) On dissout du Peptide G /obtenu à l'exemple de préparation B-16(b) de la Préparation des Peptides7 dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 6, 5) contenant 0,9% pds/vol de NaCl et 0,05% pds/vol de BSA, afin d'obtenir une solution ayant une concentration de 5 microgrammes/litre en Peptide G. Puis on dilue la solution à l'aide de la Solution D' afin de préparer une série de solutions diluées ayant des concentrations de 200, 66,7, 22, 2, 7,4, 2,5, 0,8 et 0 nM en Peptide G. (2) En utilisant de l'interféron-ç humain (Cantell) et en opérant comme décrit en (1) ci-dessus, on prépare une
série de solutions diluées d'interféron-U humain. Les con-
centrations de la série de dilutions sont de 6,4x106,
6 6 6 6 6
3,2x106, 1,6x106, 0,8x106, 0,4x106, 0,2x106, 0,1x106,
0,05x106 et 0 U/ml en interféron-k humain.
(f) Détermination du degré de polarisation (valeur P) A 0,1 ml de chacune des solutions diluées préparées en
(e)-(l) on ajoute 0,2 ml de Solution A' et 0,2 ml de Solu-
tion C' afin d'obtenir une solution d'échantillon de Pepti-
de G. De façon similaire, on prépare une solution de réfé-
rence de Peptide G en utilisant 0,1 ml de Solution B' à la
place de la Solution A'.
En opérant comme ci-dessus, on prépare une série de solutions diluées d'échantillons d'interféron-t humain et
une série de solutions de référence correspondantes à l'ai-
de des solutions diluées décrites en (e)-(2).
On prépare ensuite une solution d'échantillon d'anti-
corps pour essai de référence, en mélangeant 0,2 ml de So-
lution A' avec 0,3 ml de Solution D', et on prépare une solution de référence d'anticorps pour essai de référence en mélangeant 0,2 ml de Solution B' avec 0,3 ml de
solution D'.
On fait incuber chacune de ces solutions d'échantillon et de référence à 4 C pendant 12 heures, puis on détermine la lumière polarisée dans la fluorescence à l'aide d'un appareil de mesure de l'intensité de la polarisation de
la fluorescence. On calcule le degré de polarisation (va-
leur P) de chacune des séries de dilutions d'après la for-
mule suivante: (Ivs - IVR ( IHS - IHR) P = x 100 (%) (Ivs - IVR) + (IHS IHR) dans laquelle: IVs: intensité de la fluorescence polarisée verticale de l'échantillon IHS: intensité de la fluorescence polarisée horizontale de l'échantillon IVR:intensité de la fluorescence polarisée verticale de l'échantillon de référence IHR: intensité de la fluorescence polarisée horizontale de l'échantillon de référence Les résultats obtenus sont illustrés à la Fig.7 dans laquelle le pourcentage fixé relatif /B/B (%)7 est calculé d'après la formule suivante: P -Pf B/B = x 100 (% o - P o f dans laquelle: P: degré de polarisation de l'échantillon P0: degré de polarisation de l'échantillon ayant une concentration zéro Pf: degré de polarisation obtenu à partir
de la solution d'échantillon de l'an-
ticorps pour essai de référence D'après la Fig.8, la concentration correspondant à la valeur 50% de B/B est de 36 nM pour le Peptide G. Et, en O
opérant comme décrit ci-dessus, la concentration correspon-
dant à la valeur 50% de B/B est obtenue comme étant de 1,0 x 10 U/ml. Le rapport entre ces valeurs est de
2,78 x 105 U/ml/nm.
On détermine de façon similaire la valeur P et la
valeur B/B dans une solution d'échantillon d'interféron-
humain de concentration inconnue et on détermine le titre
d'après la Fig.8.
Dosage d'interféron-5 humain par dosage immunologique par polarisation de fluorescence - 3 (a) Préparation d'une solution de _eptide marqué au fluorochrome On dissout du Peptide M marqué avec FITC /obtenu à l'exemple de préparation des peptides marqués - 6(1)7 dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 7) /- contenant 0,9% pds/vol de NaCl et 0, 05% pds/vol de BSA/ afin d'obtenir une solution ayant une concentration de 3 x 10-9M en Peptide M marqué avec FITC, cette solution
étant dite ci-après Solution A".
(b) PrEparation d'une solution de référence de ejtide nmargué au fluorochrome pour essai de référence On prépare une solution ayant la même composition que la Solution A" mais ne contenant pas de Peptide M marqué
avec FITC, appelée ci-après Solution B".
(c) Préparation d'une solution d'anticorps A l'aide de sérum physiologique, on dilue 800 fois de l'Anticorps ?-V (titre = 52.000) /obtenu à l'exemple de préparation - 23 de la Préparation des Anticorps/. Cette
solution est dite ci-après Solution C".
(d) Préparation d'une solution de dilution On prépare une solution de dilution (pH 7,8) contenant 9,89 g/litre de H3BO3, 4,32 g/litre de Na2B407.10H20, 9 g/litre de NaCl, 0,005% pds/vol de NaN3 et 0,01% pds/vol
de BSA. Cette solution est dite ci-après Solution D".
(e) Préparation d'une série de solutions diluées (1) On dissout du Peptide M /obtenu à l'exemple de préparation C-5 de la Préparation des Peptides/dans une
solution tampon de phosphate de sodium 0,1M (pH 6,5) conte-
nant 0,9% pds/vol de NaCl et 0,05% pds/vol de BSA, de façon
à obtenir une solution ayant une concentration de 5 micro-
grammes/litreen Peptide M. Puis on dilue la solution à l'ai-
de de la Solution D" ci-dessus, de façon à préparer une série de solutions diluées ayant des concentrations de 500,
250, 125, 62,5, 31,25, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95, 0,925,
0,463 et 0 mg/ml en Peptide M. (2) En utilisant un interféron-C humain, (préparé par
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) et en opé-
rant comme décrit en (1) ci-dessus, on prépare une série de dilutiornsd'interféron-(. humain. Les concentrations en interféron-n humain dans la série de dilutions sont de
6 6 6 6 6 6
2x106, lx106, 0,5x106, 0,25x106, O,125x106, O,063x106,
6 6
0,031x106, 0,016x106 et 0 U/ml.
(f) Détermination du deSré de polarisation (valeur P) A 0,2 ml de chacune des solutions diluées préparées
en (e)-(1) on ajoute 0,5 ml de Solution A", 0,1 ml de Solu-
tion C" et 0,65 ml de Solution D" afin de préparer une solution d'échantillon de Peptide M.
On prépare de même une solution de référence de Pep-
tide M en utilisant 0,05 ml de Solution B" à la place de
la Solution A".
En opérant comme décrit plus haut, on prépare une
série de solutions d'échantillon diluées d'interféron-
humain et une série de solutions de référence diluées correspondantes à partir des solutions diluées décrites
en (e)-(2).
On prépare ensuite une solution d'échantillon d'anti-
corps pour essai de référence en mélangeant 0,05 ml de Solution A" avec 0, 95 ml de Solution D", et une solution
de référence d'anticorps pour essai de référence en mélan-
geant 0,05 ml de Solution B" avec 0,95 ml de Solution D".
On fait incuber chacune de ces solutions d'échantillon et de référence à 4 C pendant 12 heures, puis on mesure la lumière polarisée dans la fluorescence en utilisant un appareil de mesure de l'intensité de la polarisation de la fluorescence. Le degré de polarisation (valeur P) de chacune des séries de solutions diluées est calculé d'après la formule:
(IVS - IVR) - (IHS I HR)
P = x 100 (%) (Ivs - VRV + HS -IHR) dans laquelle IVS intensité de la fluorescence polarisée verticale de l'échantillon I:intensité de la fluorescence polarisée HS horizontale de l'échantillon IVR: intensité de la fluorescence polarisée verticale de l'échantillon de référence IHR: intensité de la fluorescence polarisée horizontale de l'échantillon de référence
Les résultats obtenus sont illustrés aux Fig.9 et 10.
D'après les Fig.9 et 10, la concentration correspondant à la moitié de la variation de la valeur P est de 1 ng/Tube
pour le Peptide M et est de 2,1 x 105 U/Tube pour l'inter-
féron-P humain, et le rapport entre ces valeurs est de 210 U/pg De même, on détermine les valeurs P dans des solutions
d'échantillons d'interféron-f humain de concentration in-
connue, les titres des interférons étant déterminés d'après
les Fig.9 ou 10.
Préparation d'anticorms immobilisés Exemple de préparation 1 (a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps 0-V /obtenu à l'exemple de préparation 23 de la Préparation des Anticorps/ dans 2,26 ml d'eau distillée, on ajoute 3 ml d'une solution
aqueuse saturée de sulfate d'ainmonium et on laisse le mé-
lange reposer à 40C pendant 3 heures. On additionne ensuite le mélange de 3 ml d'eau distillée et on abandonne à 40C
pendant 3 heures. Puis on soumet le mélange à une sépara-
tion centrifuge à 3500 tours/minute à 40C pendant 15 minu-
tes, on dissout le précipité résultant dans de l'eau dis-
tillée, obtenant ainsi 8 ml d'une solution aqueuse de l'an-
ticorps (DO280 = 1,157). On dialyse la solution d'anticorps
avec de l'eau distillée en trois fois, puis avec une solu-
tion aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M), obtenant ainsi 7 ml de solution
aqueuse de l'anticorps (DO280 = 0,923).
(b) On lave 1 g de Sépharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, à l'aide de 200 ml d'une solution
2503 1 45
aqueuse d'acide chlorhydrique lml, puis 30 ml d'une solu-
tion aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M, contenant du
chlorure de sodium (0,5M), et on ajoute 7 ml de la solu-
tion d'anticorps dialysée précitée au Sépharose 4B lavé et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH = 8,36) et
on fait incuber à température ambiante pendant 2 heur On lave cette solution à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH
4,0) contenant du chlorure de sodium
(0,5M), 4 fois. On met en suspension dans du sérum physio-
logique, obtenant ainsi un produit immobilisé d'anticorps d'interféron-Q humain et de Sepharose 4B. D'après le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration sur filtre en verre présente une valeur de DO280 = 0,004, on obtient la confirmation que la majeure partie de l'anticorps est
immobiliséesur Sepharose 4B.
Exemple de préparation 2 (a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps 0-I /obtenu à l'exemple de préparation 19 de la Préparation des Anticorps/ dans 2,26 ml d'eau distillée, puis on ajoute 3 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on abandonne le
mélange à 40C pendant 3 heures. Puis on additionne le mélan-
ge de 3 ml d'eau distillée et on abandonne à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange à une séparation centrifuge à 3500 tours/minute à 40C pendant 15 minutes, on dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée, obtenant ainsi
8 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,154).
On dialyse la solution d'anticorps avec de l'eau distillée,
trois fois, puis à l'aide d'une solution aqueuse de bicar-
bonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M) obtenant ainsi 7 ml de solution aqueuse de
l'anticorps (DO280 = 0,921).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de
bromure de cyanogène, avec 200 ml d'une solution aqueu-
se d'acide chlorhydrique 1 me, puis on additionne le Sepha-
rose 4B lavé résultant de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M, contenant du chlorure de sodium
(0,5 M), et 7 ml de la solution d'anticorps dialysée ci-
dessus, puis on fait incuber ce mélange à température am-
biante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanolamineCl 1M (pH 8,36) et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On lave la solution à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium (5M), puis on lave à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M contenant du chlorure de sodium (0, 5M), 4 fois. Par mise en suspension dans du sérum physiologique, on obtient un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-I humain immobilisé sur Sepharose 4B. Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration sur un filtre en verre présentent une DO = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps est immobilisée sur
le Sepharose 4B.
Exemple de Préparation 3
(a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps 0-II /obtenu à l'exem-
ple de préparation 20 de la Préparation des Anticorps7 dans 2,26 ml d'eau distillée, puis on ajoute 3 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on laisse le mélange résultant reposer à 40C pendant 3 heures. On additionne le mélange de 3 ml d'eau distillée et on laisse
reposer à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange résul-
tant à une séparation centrifuge (3500 tours/minute) à 40C pendant 15 minutes, on dissout le précipité résultant dans de l'eau distillée, et on obtient 8 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO 280 = 1,155). On dialyse ensuite la solution d'anticorps avec de l'eau distillée, trois fois, puis à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium
(0,5M), obtenant ainsi 7 ml de solution aqueuse de l'anti-
corps (DO280 = 0,921).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 mM, puis on additionne le Sepharose 4B lavé de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M) et 7 ml de la solution d'anticorps dialysée précitée, puis on fait incuber le mélange résultant à la température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH 8,36) et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On lave cette solution à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium, puis à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M), 4 fois. Par mise en suspension dans du
sérum physiologique, on obtient un produit adsorbé d'anti-
corps d'interféron-( humain immobilisé sur Sepharose 4B. Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration du produit adsorbé sur un filtre en verre présentent une DO280 = 0,004
confirme que la majeure partie de l'anticorps est immobili-
sée sur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 4
(a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps 0-III /obtenu à l'exem-
ple de préparation 21 de la Préparation des Anticorps/
dans 2,26 ml d'eau distillée, puis on ajoute 3 ml de solu-
tion aqueuse de sulfate d'ammonium et on abandonne le mé-
lange résultant à 40C pendant 3 heures. On additionne le
mélange de 3 ml d'eau distillée, et on abandonne à 40C pen-
dant 3 heures. On soumet le mélange résultant à une sépara-
tion centrifuge (3500 tours/minute) à 40C pendant 15 minu-
tes, on dissout le précipité obtenu dans de l'eau distillée, obtenant ainsi 8 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,156). On dialyse ensuite la solution d'anticorps avec de l'eau distillée, trois fois, puis à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M), obtenant ainsi 7 ml
de solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 0,922).
(b) On lave 1 g de Sepharose RB séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml de solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 mM, puis on additionne le Sepharose 4B lavé de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M, contenant du chlorure de sodium (0,5M), et 7 ml de la solution d'anticorps dialysée ci-dessus, et on fait incuber le mélange résultant à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH 8,36) et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On lave cette solution à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium (0,5M), puis à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M), 4 fois. Par mise en suspension dans du sérum physiologique on obtient un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-p humain immobilisé sur Sepharose 4B.Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration du produit adsorbé, à l'aide d'un filtre en verre, présentent
une DO280 = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anti-
corps a été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de Préparation 5
(a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps ^^ IV /obtenu à l'exem-
ple de préparation 22 de la Préparation des Anticorps7 dans 2,26 ml d'eau distillée, puis on ajoute 3 ml d'une
solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on aban-
donne le mélange résultant à 40C pendant 3 heures. On additionne ensuite le mélange de 3 ml d'eau distillée et on
abandonne à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange ré-
sultant à une séparation centrifuge (3500 tours/minute) à C pendant 15 minutes, on distille le précipité résultant dans de l'eau distillée et on obtient 8 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,153). On dialyse ensuite la solution aqueuse d'anticorps avec de l'eau distillée, 3 fois, puis à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0, 1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium
(0,5M), obtenant ainsi 7 ml de solution aqueuse de l'anti-
corps (DO 280 = 0,920).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 mM, puis on additionne le Sepharose 4B lavé de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1 M, contenant du chlorure de sodium (0,5M), et 7 ml de la solution d'anticorps dialysée précitée, puis on fait incuber le mélange résultant à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH 8,36), et on fait incuber à
température ambiante pendant 2 heures. On lave cette solu-
tion à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium (0,5M), puis à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M, contenant du chlorure de sodium (0,5M), 4 fois. Par mise en suspension dans du sérum physiologique, on obtient un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-r> humain immobilisé sur Sepharose 4B. Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration du produit adsorbé, sur un filtre en verre, présentent une DO280 = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps a
été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de Préparation 6
(a) On dissout 0,74 ml d'Anticorps 0-VI /obtenu à l'exem-
ple de préparation 24 de la Préparation des Anticorps/ dans 2,26 ml d'eau distillée, on ajoute 3 ml d'une solution
aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on laisse le mé-
lange résultant reposer à 40C pendant 4 heures. Puis on additionne le mélange de 3 mi d'eau distillée et on laisse
reposer à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange résul-
tant à une séparation centrifuge (3500 tours/minute) à 40C pendant 15 minutes, on dissout le précipité obtenu dans de l'eau distillée, obtenant ainsi 8 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,158). Puis on dialyse la solution d'anticorps à l'aide d'eau distillée, 4 fois, puis à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M), obtenant ainsi
7 ml de solution aqueuse de l'anticorps (DO280 = 0,924).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 mM contenant du chlorure de sodium
(0,5N), et 7 ml de la solution d'anticorps dialysée préci-
tée, et on fait incuber le mélange résultant à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obte- nu dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH 8,36) et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. Puis
on lave la solution à l'aide d'une solution tampon d'acé-
tate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium (0,5M),
puis à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M conte-
tant du chlorure de sodium (0,5M), 4 fois. Par mise en sus-
pension dans du sérum physiologique, on obtient un produit absorbé d'anticorps d'interféron-< humain immobilisé sur
Sepharose 4B. Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par fil-
tration sur filtre de verre du produit absorbé présentet une DO280 = 0, 004 confirme que la majeure partie de l'anticorps
a été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 7 On découpe une feuille de papier filtre (Toyo Filter
Paper n02, produit par Toyo Filter Paper Co., Ltd) en pe-
tits morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm et on pèse environ 1 g de ces petits morceaux de papier filtre. On introduit ces petits morceaux de papier filtre (cellulose) dans 100
ml d'une solution aqueuse contenant 1 g de bromure de cya-
nogène et on maintient le pH du mélange à une valeur d'en-
viron 11,0 à 11,5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium afin d'activer la cellulose, à température ambiante, pendant 6 à 8 minutes. Une fois l'activation terminée, on filtre le mélange réactionnel afin d'éliminer le liquide de réaction, on lave la matière solide résultante plusieurs fois à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de
sodium 0,5M refroidie sur de la glace, contenant du chloru-
re de sodium (0,5M), puis on met la substance solide lavée en suspension dans la même solution tampon. On additionne la suspension de la solution aqueuse d'anticorps (DO280 = 0,918) obtenue comme décrit dans l'exemple de préparation 1(a) ci-dessus, puis on traite le mélange résultant par un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple de préparation 1(b) ci-dessus, obtenant ainsi un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-( humain immobilisé sur de la cellulose. Le fait que le filtrat obtenu sur filtre en verre présente une DO 280 = 0,004 confirme que la majeure
partie de l'anticorps a été immobilisée sur la cellulose.
Exemple de préparation 8 On met 1 g de dextrane réticulé (Sephadex G-25) en suspension dans 10 ml d'eau afin d'obtenir une suspension
aqueuse de dextrane réticulé. On additionne cette suspen-
sion de 10 ml de solution aqueuse de bicarbonate de sodium 2M et on agite doucement. Puis on accélère la vitesse d'agitation et on ajoute en une fois 500 microlitres d'une solution de bromure de cyanogène dans l'acétonitrile (2 g/ml) et on agite fortement pendant 1 à 2 minutes, puis on filtre le mélange réactionnel sur filtre de verre, afin d'éliminer le liquide réactionnel. On obtient une matière solide qu'on lave plusieurs fois à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M). Après lavage, on met la matière solide en suspension dans la même solution tampon, on
l'additionne de la solution aqueuse d'anticorps (DO280 -
0,921)/ôbtenue à l'exemple de préparation 1(a) ci-dessus7 et on traite par un mode opératoire similaire à celuidécrit à l'exemple de préparation 1(b) ci-dessus, obtenant ainsi
un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-< humain immo-
bilisé sur dextrane réticulé. Le fait que le filtrat obtenu à l'aide d'un filtre en verre présente une Do280 = 0,004
confirme que la majeure partie de l'anticorps a été immo-
* bilisée sur le dextrane réticulé.
Exemple de préparation 9 On dissout 1 ml d'Anticorps ç-N-IV /obtenu à l'exemple de préparation 4 de la Préparation des Anticorps! dans 2,0 ml d'eau distillée, on ajoute 3 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on abandonne le mélange
résultant à 40C pendant 3 heures. Puis on additionne le mé-
lange de 3 ml d'eau distillée et on abandonne à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange résultant à une séparation centrifuge (3500 tours/minute) à 40C pendant 15 minutes, on dissout le précipité dans de l'eau distillée de façon à obtenir 10 ml d'une solution aqueuse de l'anticorps (DO: 1,538). Puis on dialyse la solution d'anticorps avec de l'eau distillée, 3 fois, et, ensuite, à l'aide d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M) , et on obtient 10 ml de solution aqueuse de l'anticorps (DO280 =
1,501).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique lmM, puis on additionne ce Sepharose 4B lavé de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M), et de 7 ml de la solution d'anticorps dialysée précitée, puis on fait incuber le mélange résultant à température ambiante pendant 2 heures. Après l'incubation, on filtre le mélange sur un filtre en verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanolamine-Cl 1M (pH 8,36) et on fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On lave la solution à l'aide d'une solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlorure de sodium (0,5M), puis 4 fois à l'aide d'une solution tampon de borate 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M). Par mise en suspension dans du
sérum physiologique, on obtient un produit adsorbé d'anti-
corps d'interféron-4d. humain immobilisé sur Sepharose 4B.
Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration du pro-
duit adsorbé, sur un filtre en verre, présentent une DO 280 = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps a
été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 10 (a) En utilisant l'Anticorps ur-N-I, les Anticorps ç4-N-V à L-N-X /obtenus aux exemples de préparation 1 à 3 et 5 à 10 de la Préparation des Anticorps/ à la place de l'Anticorps ç-N-IV utilisé dans l'exemple de préparation 9 ci-dessus, et en opérant comme décrit dans l'exemple de préparation 9, on obtient les solutions aqueuses d'anticorps suivantes: Solution Anticorps aqueuse utilisé DO 280 d'anticorps A w-N-I 1,501
B I-N-II 1,522
C d-N-III 1,512
D 4-N-V 1,532
E C-N-VI 1,515
F d-N-VII 1,526 G t-N-VII 1,513 H d-N-IX 1,527
I "-N-X 1,521
(b) En utilisant chacune des solutions aqueuses d'anticorps obtenues en (a) ci-dessus en en opérant comme décrit à
l'exemple de préparation 9(b) ci-dessus, on obtient res-
pectivement des produits adsorbés correspondantsd'anticorps d'interféron' humain immobilisés sur Sepharose 4B. Le fait que chacun des filtrats obtenus par filtration sur filtre en verre présente une DO280 = 0,004 environ filte e vere psene ue D280=0,4enio confirme que la majeure partie des anticorps des produits
respectifs a été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 11i On découpe un morceau de papier filtre (Toyo Filter
Paper n 2, produit par Toyo Filter Paper Co., Ltd.) en pe-
tits morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm, et on en pèse environ I g. On met ces petits morceaux de papier filtre(cellulose) dans 100 ml d'une solution aqueuse contenant 1 g de bromure de cyanogène et on maintient le pH du mélange à une valeur d'environ 11,0 à 11,5 en ajoutant une solution d'hydroxyde
de sodium, puis on active la cellulose à température ambi-
ante pendant 6 à 8 minutes. Une fois l'activation terminée, on filtre le mélange réactionnel afin d'éliminer le liquide
réactionnel. On lave plusieurs fois la matière solide ré-
sultante à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de sodium 0,5M refroidie sur de la glace (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M), puis on met la matière solide en suspension dans la même solution tampon. On additionne la solution de la solution aqueuse d'anticorps (DO280 = 1, 502) obtenue comme décrit dans l'exemple de préparation 9(a) ci-dessus, puis on traite le mélange résultant par un mode opératoire similaire à celui décrit à l'exemple de préparation 9(b) ci-dessus, obtenant ainsi un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-3 humain immobilisé sur la cellulose. Le fait que le filtrat obtenu par filtration sur filtre en verre du produit adsorbé présente une DO 280= 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps a été
immobilisée sur la cellulose.
Exemple de préparation 12 On met 1 g d'un dextrane réticulé (Sephadex G25) en suspension dans 10 ml d'eau afin de préparer une suspension aqueuse de dextrane réticulé. On additionne la suspension de 10 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 2M et on agite doucement. Puis on accélère la vitesse d'agitation et on ajoute d' un seul coup 500 microlitres d'une solution de bromure de cyanogène dans l'acétonitrile (2 g/ml) et on agite fortement pendant 1 à 2 minutes, et on
filtre le mélange réactionnel de façon à éliminer le liqui-
de réactionnel, sur un filtre en verre. On obtient une matière solide qu'on lave plusieurs fois à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M). Après lavage, on met la matière solide en suspension dans la même solution tampon, on ajoute la solution aqueuse d'anticorps (DO280 = 1,511)/ôbtenue à l'exemple de préparation 9(a) ci-dessus7 et on traite par un mode opératoire similaire à celui
décrit dans l'exemple de préparation 9(b) ci-dessus, obte-
nant ainsi un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-CL humain immobilisé sur le dextrane réticulé. Le fait que le
filtrat obtenu par filtration sur filtre en verre du pro-
duit adsorbé présente une DO280 = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps a été immobilisée sur la cellulose. Exemple de préparation 13 (a) On dissout 1,0 ml d'Anticorps ti-C-VIII /ofibtenu à l'exemple de préparation 17 de la Préparation des Anticorps/ dans 2,0 ml d'eau distillée, puis on ajoute 3 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium et on laisse le mélange résultant reposer à 40C pendant 3 heures. On additionne le mélange de 3 ml d'eau distillée et on laisse reposer à 40C pendant 3 heures. On soumet le mélange résultant à une séparation centrifuge (3500 tours/minute) à 40C pendant 15 minutes, on dissout le précipité obtenu
dans de l'eau distillée de façon à obtenir 10 ml de solu-
tion aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,526). Puis on dialy-
se trois fois la solution d'anticorps avec de l'eau distil-
lée, puis on dialyse à l'aide d'une solution aqueuse
de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlo-
rure de sodium (0,5M), obtenant ainsi 10 ml de solution
aqueuse de l'anticorps (DO280 = 1,151).
(b) On lave 1 g de Sepharose 4B séché, activé à l'aide de bromure de cyanogène, avec 200 ml d'acide chlorhydrique lmM, puis on additionne le Sepharose 4B lavé de 30 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium 0,1M
contenant du chlorure de sodium(0,5M) et de 7 ml de la so-
lution d'anticorps dialysée précitée, et on fait incuber
le mélange résultant à température ambiante pendant 2 heu-
res. Après l'incubation, on filtre le mélange sur filtre en
verre, on dissout le gel obtenu dans 40 ml de monoéthanol-
amine-Cl (pH 8,36) et on fait incuber à température ambi-
ante pendant 2 heures. On lave la solution à l'aide d'une
solution tampon d'acétate 0,1M (pH 4,0) contenant du chlo-
rure de sodium (0,5M), puis à l'aide d'une solution tampon
de borate 0,1M contenant du chlorure de sodium (0,5M).
Par mise en suspension dans du sérum physiologique on
obtient un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-
humain immobilisé sur Sepharose 4B. Le fait que 35 ml du filtrat obtenu par filtration sur filtre en verre du produit adsorbé présente une DO280 = 0,004 confirme que la majeure
partie de l'anticorps a été immobiliséesur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 14 (a) En utilisant les Anticorps g-C-I à d-C-VII et les Anticorps i-C-IX à q-C-XIII /obtenus aux exemples 11 à 18 de la Préparation des Anticorps/ à la place de l'Anticorps i -C-VIII utilisé dans l'exemple de préparation 13 ci- dessus, on obtient respectivement les solutions aqueuses d'anticorps suivantes: Solution aqueuse Anticorps DO280 d'anticorps utilisé
J "-C-III 1,511
K "-C-I 1,502
L d-C-II 1,512 M dV-C-IV 1,506 N d-C-V 1,513
O <-C-VI 1,507
P d-C-VII 1,513 Q d-C-IX 1,502
R -C-X 1,501
S b-C-XI 1,509
T <-C-XII 1,507
U d-C-XIII 1,506
(b) En utilisant les solutions aqueuses d'anticorps obte-
nues en (a) ci-dessus, et en opérant comme décrit à l'exem-
ple de préparation 13-(b) ci-dessus, on obtient respecti-
vement les produits adsorbés correspondants d'anticorps d'interféron-" humain immobilisés sur Sepharose 4B. Le fait que chacun des filtrats obtenus par filtration sur filtre de verre présente une DO280 = 0,004 environ confirme que la majeure partie des anticorps des produits respectifs
a été immobilisée sur le Sepharose 4B.
Exemple de préparation 15 On découpe un morceau de papier filtre (Toyo Filter Paper n 2, produit par Toyo Filter Paper Co., Ltd.)en petits morceaux de 0,5 cm x 0,5 cm, et on en pèse environ
1 g. On place ces petits morceaux de papier filtre (cellu-
lose) dans 100 ml d'une solution aqueuse contenant 1 g de bromure de cyanogène et on maintient le pH du mélange à une valeur d'environ 11,0 à 11,5 en ajoutant une solution
d'hydroxyde de sodium, et on active la cellulose à tem-
pérature ambiante pendant 6 à 8 minutes. Une fois l'acti-
vation terminée, on filtre le mélange réactionnel afin d'éliminer le liquide réactionnel, on lave plusieurs fois la matière solide résultante à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de sodium 0,5M refroidie sur de la glace (pH 8,4), contenant du chlorure de sodium (0,5M), puis on met la matière solide lavée en suspension dans la même
solution tampon. On additionne cette suspension d'une solu-
tion aqueuse d'anticorps (DO280 = 1,502) /obtenue par un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple de préparation 13(a) ci-dessus7, puis on traite le mélange
résultant comme décrit à l'exemple de préparation 13(b) ci-
dessus, obtenant ainsi un produit adsorbé d'anticorps d'interféron-ti. humain immobilisé sur la cellulose. Le fait que le filtrat obtenu par filtration du produit adsorbé, sur un filtre en verre, présente une DO 280 = 0,004 confirme que la majeure partie de l'anticorps a été immobilisée sur
la cellulose.
Exemple de préparation 16 On met 1 g d'un dextrane réticulé (Sephadex G25) en suspension dans 10 ml d'eau afin de préparer une suspension aqueuse de dextrane réticulé. On additionne la suspension de 10 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium
2M et on agite doucement. Puis on accélère la vitesse d'agi-
tation et on ajoute d'un seul coup 500 microlitres d'une solution de bromure de cyanogène dans l'acétonitrile (2 g/ ml) et on agite fortement pendant 1 à 2 minutes, puis on filtre le mélange réactionnel sur filtre en verre afin d'éliminer le liquide réactionnel. On obtient une matière solide qu'on lave plusieurs fois à l'aide d'une solution tampon de bicarbonate de sodium 0,1M (pH 8,4) contenant du chlorure de sodium (0,5M) . Après lavage, on met la matière solide en suspension dans la même solution tampon, on ajoute la solution aqueuse d'anticorps (DO280 = 1,505) /obtenue comme décrit ci-dessus à l'exemple de préparation 13(a)/ et
on traite comme décrit à l'exemple de préparation 13(b) ci-
dessus, obtenant ainsi un produit adsorbé d'anticorps
d'interféron-d humain immobilisé sur le dextrane réticulé.
Le fait que le filtrat obtenu par filtration du produit adsorbé,sur filtre en verre,présente une DO280 = 0,004
confirme que la majeure partie de l'anticorps a été immo-
bilisée sur le dextrane réticulé.
Purification des interférons humains (1) On dissout 0,5 ml (5,9 mg de protéines) d'interféron-(
humain (DO280 = 11,8, préparé par Tokyo Metropolitan Insti-
tute of Medical Science) dans du sérum physiologique et on utilise cette solution en chromatographie d'affinité en utilisant le produit adsorbé d'anticorps d'interféron-/ humain immobilisé sur Sepharose 4B Zobtenu à l'exemple de
préparation l(b) de la Préparation des Anticorps Immobili-
sés7 et on élue à l'aide d'une solution tampon de phosphate
0,1M (pH 7,4) contenant du chlorure de sodium (0,15M).
Lorsque l'éluat donne DO280 = 0,0002, on élue le produit adsorbé à l'aide d'une solution tampon d'acide acétique 0,5M (pH 2,5) contenant du chlorure de sodium (0,5M) afin
d'isoler l'interféron-s humain purifié du produit adsorbé.
Avant traitement par chromatographie d'affinité, l'inter-
féron-p humain présente une valeur de DO convertie de 5,9 /valeur obtenue à 1 mg de protéines lorsque DO280 = 1 7, et
présente une activité de 1,5 x 10 Unités/ml et une concen-
tration de 13.240 pg/ml dans la réaction immunitaire de l'interféron-s humain et, au contraire, après chromato-
graphie d'affinité, la valeur de DO convertie de l'interfé-
ron-' humain est de 0,059, avec une activité de 1,37 x 106 Unités/ml et une concentration de 12.050 pg/ml
dans la réaction immunitaire de l'interférons humain.
Il s'ensuit que l'activité spécifique avant traitement par
chromatographie d'affinité est de 2,54 x 105 Unités/mg tan-
dis que l'activité spécifique après traitement par chroma-
tographie d'affinité est de 2,32 x 107 Unités/mg, ce qui
est une valeur significative, représentant 91,3 fois l'ac-
tivité spécifique. Comme on peut le voir d'après les ré-
sultats obtenus en utilisant le produit adsorbé (anticorps immobilisé sur le véhicule) l'interféron-f humain peut
être purifié jusqu'à 91 fois sa pureté et on peut égale-
ment l'obtenir avec un rendement quantitatif.
En utilisant chacun des anticorps immobilisés /obte-
nus aux exemples de préparation 2 à 8 de la Preparation des Anticorps immobilisés7 suivant la présente invention, on obtient d'excellentes performances, du point de vue
de l'isolement et de la purification des interférons hu-
mains en faisant appel au traitement par chromatographie d'affinité.
(2) On dissout 0,5 ml (10,1 mg de protéines) d'interféron-
d humain (DO280 = 20,2, préparé par Hayashibara Biochemi-
cal Research Laboratory) dans du sérum physiologique, puis on utilise cette solution en chromatographie d'affinité en utilisant le produit adsorbé d'anticorps d'interféron-% humain immobilisé sur Sepharose 4B /obtenu à l'exemple de
préparation 9(b) de la Préparation des Anticorps Immobili-
sés7, et on élue à l'aide d'une solution tampon de phos-
phate O,1M (pH 7,4) contenant du chlorure de sodium (0,15n.
Lorsque l'éluat donne une DO280 égale ou inférieure à 0,002 on élue le produit adsorbé à l'aide d'une solution tampon d'acide acétique 0,5M (pH 2,5) contenant du chlorure de sodium (0,5M) afin d'isoler l'interféron-d humain purifié
du produit adsorbé.
Avant traitement par chromatographie d'affinité, l'interféron-t humain présente une valeur de DO convertie de 10,1 /valeur obtenue à lmg de protéines lorsque DO280 = 17 et présente également une activité-de lx10 unités/ml et une concentration de 69.000 pg/ml dans une réaction immunitaire d'interféron-% humain; au contraire, après traitement par chromatographie d'affinité, la valeur de DO convertie de l'interféron-s humain est de 0,080, l'activité est de 8 x 105 Unités/ml et la concentration est de 55.000
pg/ml dans une réaction immunitaire d'interféron- humain.
Il s'ensuit que l'activité spécifique avant traitement par chromatographie d'affinité est de 5,9 x 10 Unités/mg, tandis que l'activité spécifique après traitement par chromatographie d'affinité est de 1 x 10 Unités/mg, ce qui est une valeur significative représentant 169 fois l'activité spécifique. Comme on peut le voir d'après les
résultats obtenus en utilisant le produit adsorbé (anti-
corps immobilisé sur un véhicule) l'interféron- humain peut être purifié jusqu'à 169 fois sa pureté et on peut
également l'obtenir avec un rendement quantitatif.
En utilisant chacun des anticorps immobilisés obtenus aux exemples de préparation 10 à 12 de la Préparation des Anticorps Immobilisés suivant la présente invention, on obtient d'excellentes performances du point de vue de l'isolement et de la purification des interférons humains
par traitement par chromatographie d'affinité.
(3) On dissout 0,5 ml (10,1 mg de protéines) d'interféron-
ç. humain (DO280 = 20,2; préparé par National Institute of Health, Japon) dans du sérum physiologique, puis on utilise cette solution en chromatographie d'affinité en utilisant le produit adsorbé d'anticorps d'interféron-c" humain immobilisé sur Sepharose 4B /obtenu à l'exemple de
préparation 13(b) de la Préparation des Anticorps Immobi-
lisés/ et on élue à l'aide d'une solution tampon de phos-
phate (pH 7,4) contenant du chlorure de sodium (0,15M).
Lorsque l'éluat donne une D 280 égale ou inférieure à 0,002, on élue le produit adsorbé à l'aide d'une solution tampon d'acide acétique 0,5M (pH 2,5) contenant du chlorure de sodium (0,5M) afin d'isoler l'interféron-4 humain purifié
du produit adsorbé.
Avant le traitement par chromatographie d'affinité, l'interféron-d- humain présente une valeur de DO convertie de 10,1 /valeur obtenue à 1 mg de protéines lorsque DO280= 17 et présente également une activité de lxlO Unités/ml et une concentration de 28.000 pg/ml dans une réaction immunitaire d'interféron-ck humain; au contraire, après le traitement par chromatographie d'affinité, la valeur de DO convertie de l'interféron-s humain est de 0,060, l'activité est de 8,2x105 Unités/ml et la concentration
est de 19.792 pg/ml dans une réaction immunitaire d'inter-
féron-e humain. Il s'ensuit que l'activité spécifique avant le traitement par chromatographie d'affinité est de 9,9 x 104 Unités/mg, tandis que l'activité spécifique après le traitement par chromatographie d'affinité est de
1,37 x 107 Unités/mg, ce qui représente un valeur signifi-
cative 138 fois supérieure d'activité spécifique.
Comme on peut le voir d'après les résultats obtenus en utilisant le produit adsorbé (anticorps immobilisé sur un véhicule) l'interféron-" humain peut être purifié jusqu'à obtention d'une pureté 138 fois supérieure et on peut
également l'obtenir avec un rendement quantitatif.
En utilisant chacun des anticorps immobilisés obtenus aux exemples de préparation 14 à 16 de la Préparation des Anticorps Immobilisés, suivant la présente invention, on obtient d'excellentes performances des points de vue de l'isolement et de la purification des interférons humains
par traitement par chromatographie d'affinité.

Claims (28)

REVENDICATIONS
1. Un peptide apparenté aux interférons humains, choisi parmi un peptide de formule générale (1), R1-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (1) dans laquelle R1 est un atome d'hydrogène, un groupe de formule H-Thr-His-Ser-Leu-GlyAsn-Arg-Arg-Ala-, un
groupe de formule H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, ou un groupe de formule H-
Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-
Arg-Ala-; un peptide de formule générale (2), R -Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-LysGlu-OH (2) dans laquelle R2 est un atome d'hydrogène, un groupe
de formule H-Thr-Asn-Leu-Gln, un groupe de formule H-
Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-, ou un groupe de formule H-Tyr-Ser-Leu-SerThr-Asn-Leu-Gln-; et un peptide de formule générale (3), R3-Leu-Gln-ArgSer-Ser-OH (3) dans laquelle R est un atome d'hydrogène, un groupe de formule H-Phe-,un groupe de formule H-Leu-Gly-Phe-, un groupe de formule H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-, ou
un groupe de formule H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-
Phe-.
2. Un peptide apparenté aux interférons humains, selon la revendication 1, de formule générale (1), R1-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH (1) danslaquelle R1 est un atome d'hydrogène, un groupe de formule H-ThrHis-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, un
groupe de formule H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-
Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-, ou un groupe de formule H-
Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-
Arg-Ala-.
3. Un peptide apparenté aux interférons humains, selon la revendication 1, de formule générale (2), R2-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-GlyOH (2) dans laquelle R2 est un atome d'hydrogène, un groupe de formule HThr-Asn-Leu-Gln-, un groupe de formule
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-, ou un groupe de for-
mule H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-.
4. Un peptide apparenté aux interférons humains, de formule générale (3), R3-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH (3) dans laquelle R est un atome d'hydrogène, un groupe de formule H-Phe-, un groupe de formule H-Leu-Gly-Phe-, un groupe de formule H-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-, ou
un groupe de formule H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-
Phe-.
5. H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH.
6. H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-Ser-Leu-
Arg-Ser-Lys-Glu-OH.
7. H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-
Arg-Ser-Ser-OH.
8. Un anticorps d'interféron humain obtenu en recueillant un anticorps produit chez un mammifère après administration d'un antigène d'interféron humain,
préparé en faisant réagir un peptide selon la revendi-
cation 1, à titre d'haptène, avec un porteur en pré-
sence d'un agent de fixation du porteur sur l'haptène.
9. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 8, dans lequel l'antigène d'interféron
humain est préparé en faisant réagir un peptide de for-
mule générale (1), telle que définie à la revendication 1, à titre d'haptène, avec un porteur en présence d'un
agent de fixation du porteur sur l'haptène.
2503 1 45
10. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 8, dans lequel l'antigène d'interféron humain est préparé en faisant réagir un peptide de
formule générale (2), telle que définie à la revendi-
cation 1, à titre d'haptène, avec un porteur en pré-
sence d'un agent de fixation du porteur sur l'haptène.
11. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 8, dans lequel l'antigène d'interféron humain est préparé en faisant réagir un peptide de
formule générale (3), telle que définie à la revendi-
cation 1, à titre d'haptène, avec un porteur en pré-
sence d'un agent de fixation du porteur sur l'haptène.
12. Un anticorps d'interféron humain, selon
les revendications 9, 10 ou 11, dans lequel l'antigène
d'interféron humain est préparé en utilisant un porteur
choisi parmi une sérum-albumine animale, une sérum-
globuline animale, une thyroglobuline animale, une hémoglobuline animale, une hémocyanine animale, un
extrait d'ascaris, une polylysine, un acide polygluta-
mique, un copolymère lysine-acide glutamique, un copo-
lymère contenant de la lysine ou un copolymère conte-
nant de l'ornithine, et l'agent de fixation, est choisi parmi un dialdéhyde aliphatique, un composé dimaléimide, un maléimide-carboxyl-Nhydroxy succinimidoester ou
un carbodiimide.
13. Un anticorps d'interféron humain selon la revendication 12, dans lequel l'animal est un lapin ou
un cobaye.
14. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 13, dans lequel l'anticorps d'interféron
humain produit chez un animal est obtenu en adminis-
trant à l'animal un antigène d'interféron humain en
mélange avec un adjuvant de Freund.
15. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 14, dans lequel l'anticorps d'interféron
humain produit chez un animal est obtenu en adminis-
trant à un lapin un antigène d'interféron humain pré-
paré en utilisant un peptide de formule
H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH à titre d'haptène;du glutaraldéhyde ou du DCC à titre
d'agent de fixation et du BSA à titre de porteur.
16. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 14, dans lequel l'anticorps d'interféron
humain produit chez un animal est obtenu en adminis-
trant à un lapin un antigène d'interféron humain pré-
paré en utilisant un peptide de formule
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-
Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH à titre d'haptène;du glutaraldéhyde à titre d'agent
de fixation et du BSA à titre de porteur.
17. Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 14, dans lequel l'anticorps d'interféron humain produit chez un animal est obtenu en administrant à un lapin un antigène d'interféron humain préparé en utilisant un peptide de formule
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-
Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH à titre d'haptène;du DCC à titre d'agent de fixation
et du BSA à titre de porteur.
18.Un anticorps d'interféron humain, selon la revendication 14, dans lequel l'anticorps d'interféron
humain produit chez un animal est obtenu en adminis-
trant à un lapin un antigène d'interféron humain pré-
paré en utilisant un peptide de formule
H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-
Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH à titre d'haptène;du glutaraldéhyde Du du DCC à titre
d'agent de fixation et du BSA à titre de porteur.
19. Un procédé de préparation d'anticorps d'in-
terféron humain, consistant à recueillir un anticorps
produit chez un animal après administration à cet ani-
mal d'un antigène d'interféron humain préparé en fai-
sant réagir un peptide apparenté aux interférons hu- mains, tel que défini à la revendication 1, à titre d'haptène, avec un porteur en présence d'un agent de fixation.
20. Un adsorbant pour chromatographie d'affinité préparé en immobilisant sur un support insoluble un anticorps d'interféron humain selon la revendication 8.
21. Un adsorbant pour chromatographie d'affinité selon la revendication 20, dans lequel l'antigène
d'interféron humain est préparé par réaction d'un pep-
tide de formule
H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-
Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-
Ala-Gln-OH
à titre d'haptène, avec du BSA comme porteur en pré-
sence de glutaraldéhyde comme agent de fixation, l'an-
tigène d'interféron humain est administré à un lapin, un anticorps d'interféron produit chez le lapin est
recueilli à partir du lapin et l'anticorps d'interfé-
ron est immobilisé sur du Sépharose 4 B activé avec
Br CN.
22. Un adsorbant pour chromatographie d'affinité
selon la revendication 20, dans lequel l'antigène d'in-
terféron humain est préparé par réaction d'un peptide de formule
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-
Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH
à titre d'haptène, avec du BSA comme porteur en pré-
sence de glutaraldéhyde comme agent de fixation, l'an-
tigène d'interféron humain est administré à un lapin, un anticorps d'interféron produit chez le lapin est
recueilli à partir du lapin et l'anticorps d'interfé-
ron est immobilisé sur du Sépharose 4B activé avec BrCn.
23. Un adsorbant pour chromatographie d'affinité
selon la revendication 20, dans lequel l'antigène d'in-
terféron humain est préparé par réaction d'un peptide de formule
H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-
Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH
à titre d'haptène, avec du BSA comme porteur en pre-
sence de glutaraldéhyde comme agent de fixation, l'an-
tigène d'interféron humain est administré à un lapin, un anticorps d'interféron produit chez le lapin est
recueilli à partir du lapin et l'anticorps d'interfé-
ron est immobilisé sur du Sépharose 4B activé avec BrCn.
24. Un procédé de préparation d'un adsorbant
pour chromatographie d'affinité, consistant à immobi-
liser sur un support insoluble un anticorps d'inter-
féron humain, selon la revendication 8.
25. Un peptide marqué préparé par réaction d'un peptide selon la revendication 1 avec un agent de marquage.
26. Un peptide marqué selon la revendication 25
dans lequel le fragment tyrosyle dans un peptide ap-
parenté aux interférons humains, choisi parmi les peptides de formule
H-Tyr-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-
Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-
Gln-OH
H-Tyr-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-
Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-CH et
H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-
Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH est marqué avec I.
27. Un peptide marqué selon la revendication 25, dans lequel le groupe amino dans un peptide apparenté aux interférons humains choisi parmi
H-Ser-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-
Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-Ile-Leu-Leu-Ala-Gln-OH,
H-Ser-Leu-Ser-Thr-Asn-Leu-Gln-Glu-
Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu-OH, et
H-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-
Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-OH est marqué avec une substance fluorescente choisie parmi
FITC, TRITC et DTAF.
28. Un procédé de préparation d'un peptide marqué
consistant à faire réagir un peptide selon la revendica-
tion 1 avec un agent de marquage.
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