JPS5835158A - 螢光標識ペプチド及びそれを利用するヒトα型インタ−フエロンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な蛍光、標識ペプチド及びそれを利用す
る新規なヒトα型インターフェロンの測定法に関する。

本発明の蛍光標識ペプチドは、下記一般式で表わされる
。

Ｒ−８ａｒ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−ＧＪｎ　
−Ｔｈｒ　−１１，ｓ　−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｊ）’−
＾８ｎ−ムｒｆ−ムｒＩＩ−ムｊａ　−Ｌｅｕ−ＩＬｅ
　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−ＡＪａ　−Ｇｊｎ　−ＯＨ（１
）〔式中Ｒは蛍光色票を示す。〕 本発明者らは、上記一般式（１）Ｉｔ’表わされる蛍光
標識ペプチドがヒトα型インターフェロンの抗体と特異
的に免疫反応して免疫複合体を形成するという事実及び
、この蛍光標識ペプチドを蛍光免疫測定法に利用するこ
とにより、ヒトα型インターフェロンの測定が可能であ
るという事実を見い出した。本発明はこれらの新知見に
基づいて完成されたものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基その他に関し略号で表示する場合は、ＩＵＰＡＯｌＩ
ＵＢの規定、或いは当該公費における慣用記号に従うも
のとしその例を次に挙げる。

８ｅｒ　ｓセリン Ａｓｐ　＋アスパラギン酸 Ｌｅｕ　！ロイシン Ｐｒｏ　！プロリン Ｇｉｎ　！グルタミン Ｔｈｒ　！スレオニン Ｈｌｌｍ　＋ヒスチジン ＧｌｙＩグリシン ムＩＢｎＩアスパラギン Ａｒｇ　＊アルギニン ムｌａ！アラニン ＩＬｅ　ｌイソロイシン Ｚｉカルボベンゾキレ基 ８ｕ　　＋コハク酸イミド基 Ｔｏｓ＋Ｐ−）ルヱンスルホニル基 Ｂｏｏ　ｌ第８級ブトキシカルボニル基本発明の一般式
（１）で表わされる蛍光標識ペプチドは、下記一般式 ％式％ （） で示されるペプチドを蛍光色素で標識することにより製
造することができる。

上記において用いられ、一般式（２）のペプチドと結合
して本発明の蛍光標識ペプチド中にＲとして組み込まれ
る蛍光色素は、通常の蛍光標識試薬から選択される。そ
の具体例としては、例えばフルオレッセイン・イソチオ
シアナート（ＴＩ’Ｉ’Ｏ）、テトラメチルローダミン
・イソチオシアナート（’１’ＲＩＴＯ）　、置換ロー
ダミン・イソチオシアナート（ＸＲＩ’Ｊ’０）、ロー
ダミン１イソチオシアナート、レクロロトリアジンフル
オレツセイン（Ｄ’ｌ’ムり等が挙げられる。２等蛍光
色素の使用量は、特に制限はないが、一般式（釦のペプ
チドに対して通常１〜１０倍モル、好ましくは２〜４倍
モル程度とされるのかよい。

上記橡鯖反応は、例えば適当な緩衝液中でアルカリ性、
好ましくはｐＨ８〜１２にて行なわれる。

緩衝液としては、上記ｐＨを示す限り特に限定はなく広
い範囲から選択されるが、例えばホウ酸塩緩衝液、重炭
酸塩緩衝液、プリジン緩衝液、バルビタール緩衝液、ト
リス緩衝液１、アメジオール緩衝液、リンゲル氏緩衝液
等を使用できる。又、反応に供する一般式（２）のペプ
チド及ヘハ蛍光色素が上記緩衝液に溶解しない場合は、
例えばメタノール、エタノール、アセトン、ＤＭ？（ジ
メチルホルムアミド）等の通常の溶媒を反応系内に加え
て上記標−反応を行なうことができる。

上記標識反応は通常Ｏ″Ｃ〜４０°Ｃ１好ましくはＯ℃
〜２０℃にて進行し数分〜４８時間程度で終了する。

かくして本発明の一般式（１）で表わされる蛍光標識ペ
プチドが収得される。これは、通常の分離手段、例えば
抽出、分配、カラムクロマトグラフィー、ゲルー過法等
により単離精製される。

前記標識反応において原料として用いられる一般式（２
）で示されるペプチドは、新規化合物であり、例えば下
記反応行程式−１に示す方法によって製造することがで
きる。

〈反応行程式−１〉 ↓ Ｈ−ムｊａ　−Ｇｊｎ−ＯＲ（６） Ａ　−Ａｒｙ　−ＡＪａ　−Ｂ　　　　Ｑ嗜１゜ −Ｌｅｕ−Ａｊａ−Ｇｊｎ−ＯＨ％ Ｈ−Ａｓｎ　−Ａｒｐ　−Ａｒｇ　−Ａｌｈ−Ｌｅｕ　
−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ムｊａ　−Ｇｊｎ　−ＯＨ
＠Ａ　−Ｌｅｕ　−ｏ４ｙ　−Ｂ　　　　　　＠Ａ　−
８ｅｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｂ　　　　　輪■ Ａ−〒ｈｒ　−Ｈｌｓ　−８ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇａｙ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−ムｒｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−ＩＬｅ
　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−ＡＪａ　−（Ｍｎ　−ＯＲ曽
■ Ｈ−〒ｈｒ　−Ｈｌｓ　−８ｅｒ　−Ｌｅｕ　−ＧＪｙ
　−Ａｓｎ　−Ａｒｐ　−Ａｒｙ　−Ａｌａ−Ｌｅｕ−
ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−０４’ｎ　
−ＯＨＣ＠〔４〕　ム−Ｐｒｏ　−Ｂ　　　　　＠↓ Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｂ　　　　　　　ＵＡ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−ＧＪｎ−Ｂ　　　　　　−し Ａ−ムｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ　−Ｂ　　
　　　＠ａ瓦 Ａ−８ｅｒ−ムｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ　
−Ｔｈｒ　−Ｈｌｓ　−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ムａ
ｎ−Ａｒｙ−ムｒｇ　−Ａｊａ　−Ｌｅｕ−ＩＬｅ　−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ム１ａ−Ｇｌｎ−ＯＨｇＨ−８ｅｒ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−８
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ムｒｙ−ムｒｌ　−Ａ
ｊａ　−Ｌｅｕ−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ムｊａ　
−Ｇｊｎ−ＯＨ（ｆｆｉ〔上記各式において、Ａはアミ
ノ基の保護基、Ｂは水酸基又はカルボキシル基の活性基
、Ｃはアルギニンのグアニジノ基の保護基、Ｄはアスパ
ラギン酸の保護基をそれぞれ示す。〕 ムの好ましいものとしては、Ｂｏｏ、ｚ％Ｐ−メト・キ
レベンジルオキシカルボニル基等が、Ｂの好ましいもの
としては、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド等の活性エス
テル、イソブチルオキシカルボニル基等の混合酸無水物
、アジド等が、０の好ましいものとしでは、ニトロ基、
Ｔｏｓ等が又、Ｄの好ましいものとしてはベンジルオキ
シ基等が夫々挙げられる。

アミノ酸（３）とアミノ酸（４）との反応は、ペプチド
縮合反応に使用し得ることが知られている、例えば無水
または含水のジメチルホルムアミド、ジメチルスル小キ
シド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロル
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチル
ピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド或いはこれ
らの混合溶媒等の存在下に行ない得る。アミノ酸（４）
とアミノｔ！ｋ（３）との使用割合は、特に限定されな
いが通常前書に対して後者を等Ｊｔ−５ｔ−５好嵐しく
は等鳳〜１．５倍量使用するのがよい。反応温度はペプ
チド結合形成反応に使用される通常の範囲から適宜選択
され、通常約−４０〜約６０℃、好ましくは約−２０〜
約４０℃の範囲とされる。反応時間は一般に数分〜３０
時間程度である。

ペプチド（６）とアミノ酸（７）、ペプチド（９）とア
ミノ酸（７）、ペプチド０ρとアミノ酸（６）、ペプチ
ドα◆とアミノ酸（７）、アミノ酸ａカとアミノ酸（ト
）、ペプチド（ホ）とアミノ酸ａ″ｔ）、ペプチド（２
）とアミノ酸翰、ペプチド（２）とペプチドα時、アミ
ノ酸（７）とアミノ酸に）、ペプチド（７）とアミノ酸
Ｃ１ｌ、ペプチド（２）とペプチド（至）、ペプチド（
至）とペプチド翰、アミノ酸（至）とアミノ酸（至）、
ペプチド＠υとアミノ酸（７）、ペプチド−とアミノ酸
−、ペプチド勤とアミノ酸（ロ）、及びペプチド−とペ
プチド（ロ）の反応は、いずれも上記ペプチド（３）と
ペプチド（４）との反応と同様にして行な−い得る。

上記縮合反応終了後、得られるペプチド（６）、（８）
、Ｑ時、（至）、（ト）、四、ｃｌ！◇、（ホ）、四、
（２）、（至）、輪、輪、−及び−の保護基Ａは常法に
より脱離できる。斯かる方法としては、例えば還元的方
法（例、／マラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる
水素添加、液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
）、アシドリシス（例トリフルオロ酢酸、弗化水素、メ
タンスルホン酸、具化水累酸等の強酸によるアシドリシ
ス）等を例示できる。触媒を用いる水素添加の場合は、
水素圧１気圧、０〜４０℃にて行なわれ、触媒の使用量
は通常１００１１Ｆ〜１ｆｌｉ度でよく、一般に１〜４
８時間程度で反応は終了する。またアシドリシスの場合
は、無溶媒下通常Ｏ〜８０℃程度、好ましくは０〜２０
℃にて行なわれ、一般に１５分〜１時間程度で反応は終
了する。

酸の使用量は原料化合物に対し通常６〜１０倍量程度と
するのがよい。また液体アンモニア中金属ナトリウムに
よる還元において、金属ナトリウムは、反応溶液がパー
マネントブルーに８０秒〜１０分間程度呈色しているよ
うな麓で用いられる。この還元は通常−４０〜−７０℃
程度にて行なわれる。

ペプチド（財）の保護基Ｃ及びペプチド−の保護基りは
、上記還元的方法を用いる仁とにより脱離することがで
きる。

また上記において、アミノ酸（３）、（４）、（７）、
Ｑ罎、ａ″ｉ）、（至）、（至）、（２）、（２）、（
至）、ＯＩＩ日社及び軸とペプチド−は、市販の物又は
、例えば混合酸無水物法、アジド法等により得る仁とが
できる。混合酸無水物法は、適当な溶媒中塩基性化合物
の存在下、アルキルハロカルボン酸を用いて行なわれる
。アルキルハロカルボン酸としては例えばクロロ蟻酸メ
チル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻
酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等を使用できる。塩基
性化合物としては例えばトリエチルアミン、トリメチル
アミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモル
ホリン、１，６−ジアザビシクロ（４，８，’０　）ノ
ネン−５（ＤＢＮ）、ｌ、５−ジアザビシクロ（６，４
，０）ウンデ竜ンー６（ＤＢＵχ１．４−ジアザビシク
ロ（２，２，２）オクタン（ＤＡＢｏｏ）等の有機塩基
、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、
炭酸水素ナトリウム等の無機塩基を使用できる。溶媒と
しては混合酸無水物法に慣用の溶媒具体的には塩化メチ
レン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン４Ｊ
ｌ水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭
化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジ
メトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢飯エチ
ル等のエステル類、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等
の非プロトン性極性溶媒等を使用できる。反応は通常−
２０〜１００℃好ましくは一２０〜６０℃下に約６分〜
１０時間好ましくは５分〜２時間を要して行なわれる。

アジド化法は、まず活性化されたカルボキシル基、例え
ばメチルアルコール、エチルアルコール、ベンジルアル
コール等のアルコールで活性化すしたカルボキシル基に
、ヒドラジン水和物を適当な溶媒中にて反応させて行な
われる。溶媒としては例えばジオキサン、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド又はこれらの混合溶媒
等を使用できる。ヒドラジン水和物の使用態は、活性化
されたカルボキシル基に対して通常６〜２０倍モル量、
好ましくは５〜１０倍モル量とするのがよい。

反応は通常−１０℃以下、好ましくは−２０〜−１０℃
にて行なわれる。かくして末端アミノ酸のカルボキシル
基部分がヒドラジンで置換された化合物（ヒドラジン誘
導体）を製造し得る。末端アミノ酸のカルボキシル基部
分がアジドで置換さ−れた化合物は、酸の存在下適当な
溶媒中、上記で得られるヒドラジン誘導体と亜硝酸化合
物とを反応させることにより製造される。酸としては通
常塩酸が用いられる。溶媒としては例えばジオキサン、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又はこれ
らの混合溶媒等が用いられる。また亜硝酸化合物として
は例えば亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イソアミル、塩化ニ
トロシル等を使用できる。骸亜硝酸化合物は、ヒドラジ
ン誘導体に対して通常等チル〜２倍モル量、好ましくは
等モル−１，５チルル量用いるのがよい。反応は通常−
２０〜Ｏ℃、好ましくは−２０〜−１０℃にて約６〜１
０分程度で終了する。

上記のようにして製造される一般式（２）のペプチドは
、反応混合物からペプチドの通常の分離手段例えば抽出
、分配、カラムクロマトグラフィー等により単離精製さ
れる。

本発明の一般式（１）で表わされる蛍光標識ペプチドは
、ヒトα型インターフェロンのハブテンとしての機能を
有し、ヒトα型インターフェロンの抗体と免疫複合体を
形成する特長を有する。従って該蛍光標−ペプチドは、
これを利用して蛍光免疫測定法によりヒトα型インター
フェロンの測定を可能とするものであり、本発明は、こ
のとトｇＩＩＩＩインターフェロンの測定法をも提供す
るものである。

従来、インターフェロンは、その生理活性に基づいた間
接的な生物学的測定法により、測定されている（　Ｆｉ
ｎｔｅｒ　、　Ｎ、　Ｂ、　ｉｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎ　ａｎｄＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｒｓ　
（ｅａ、　Ｆｉｎｔｅｒ、　Ｎ、　Ｂ、　）　１８５−
１７０　（Ｎｏｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ、ムｍｓｔｅｒａ
ａｍ＋　１９７８　）　）。

すなわち、生きた細胞及びそれに感染する生きたウィル
スを要して、ウィルスによる細胞死誠の程度を直接ある
いは間接に定量することによってその力価が定量されて
いる。しかしながらこの生物学的測定法は、測定に使う
材料が生物である為、安定性がなく測定値間のバラツキ
が大きくなることは避けられない。又、被検試料にイン
ターフェロン以外の抗ウイルス性作用を有する物質が記
入している場合、該方法によるインターフェロンの定量
は全く意味をなさなくなる。更に該方法に依れば、当然
にヒトａ型インターフ′エロンを選択的に測定する仁と
は不可能である。加えて該方法は測定のために数日を要
しこれは複雑な操作と相まって医学界の要請に合致しな
いものである。

本発明方法は、上記従来方法とは異なってヒトα型イン
ターフェロンを簡便に、速やかにしかも高精度で測定で
きるものである。

また蛍光偏光解消法は、従来よりよく知られているが、
この方法が従来インターフェロンの定量に利用された例
は皆無である。これはＭＭされた蛍光標識インターフェ
ロンの製造が困難な為と、たとえそれが可能であっても
その様な大きな分子鰍の標識物質を用いた場合は偏光度
（Ｐ値）の変化が少なく、十分な定量感度を得ることが
できない為である。これに対し本発明の蛍光標識ペプチ
ドは、上記偏光＆（Ｐ値）の変化を大きくして十分な定
量感度でヒトα型インターフェロンを定量できる標識物
質として有効なものであり、この蛍光線繊ペプチドの開
発により、始めて上記蛍光解消法によるヒトα型インタ
ーフェロンの定ｔが可能となるのである。

以下本発明のヒトａ型インター　フェリンの定態測定法
につき詳述する。

本発明方法は、そ２の測定手順及び操作において、通常
の蛍光−光解消法と基本的に＾なるものではない。該方
法は、標準抗原としてのヒトα型インターフェロン、そ
れに対する抗体及び本発明の蛍光標識ペプチドを用いて
実施される。ここで標準抗原とし２ては、生（Ｎａｔｉ
ｖｅ　）のヒトα型インターフェロン自体又はそれと抗
原性の等しい前記一般式（りのペプチドを使用すること
ができる。一般式（２）のペプチドを使用する場合は、
抗体に対するヒトα型インターフェロンと一般式（２）
のペプチドとの交差反応性を求めておくことにより容易
に、未知試料のインターフェロン力価を算定することが
できる。該一般式（２）のペプチドの使用は、特に標準
抗原としての精製品を得るための労力、費用、操作等を
考慮すれば好ましいものである。

又、本発明方法−ζおいて用いられるインターフェロン
抗体としては、ヒトα型インターフェロン及び一般式（
２）のペプチドに対する抗体を全て使用することかでき
るが、前記一般式（粉のペプチドをハブテンとして用い
て得られるヒトα型インターフェロンに対して特異性の
高い抗体を用いるのがよい。該抗体は、一般式（２）の
ペプチドをハブテンとして、ハブテン−担体結合試薬の
存在下に担体と反応させてペプチド−担体複合体からな
るヒトα型インターフェロン抗原を製造し、この抗原よ
り製造することができる。

上記において抗体製造のための抗原の製造に用いられる
担体としては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子
の天然若しくは合成の蛋白質を広く使用できる。例えば
馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、ウサギ血清アル
ブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン等の
動物の血清アルブミン類、馬血清グロブリン、牛血清グ
ロブリン、ウサギ血清グロブリン、大血清グロブリン、
ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グロブリン類、馬
チログロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン等の動
物のチログロブリン類、馬ヘモグロビン、牛ヘモグロブ
リン、ウサギヘモグロブリン、人ヘモグロブリン、ヒツ
ジヘモグロブリン等の動物のヘモグロブリン類、動物の
ヘモシアニン類、回虫より抽出された蛋白質（アスカ−
リス抽出物、特開昭５６−１６４１４号参照）、ポリリ
ジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン酸共重合
体、リジン又はオルニチンを含む共重合体等を挙げるこ
とができる。

ハブテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用でき、具体的にはアミ
ノ基とアミノ基とを架橋結合させる、例えばグリオキサ
ール、マロンジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、ス
クシンアルデヒド、アジボアルデヒド等の脂肪族ジアル
デヒド類、チオール基とチオール基とを架橋結合させる
、例えばＮ、Ｎ’　−Ｏｍ　７　工＝レンジマレイ【ド
、Ｎ、Ｎ−ｍ−フェニレンジマレイミド等のシマレイミ
ド化合物、アミノ基とチオール基とを架橋結合させる、
例えばメタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、４−（マレイミドメチル）−シク
ロヘキサンー１−カルボキシル−Ｉ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル化合物、アミノ基とカ
ルボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド結合
形成反応に−用いられる試薬、例えばＮ、Ｎ−ジシクロ
へキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｉ−ジメチルア
ミノカルボジイミド、ｌ−エチル−８−ジイソプロピル
ア菟ノカルボジイｔｒ、ｔ−シクロヘキシル−８−（２
−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカル
ボジイミド類等の脱水縮合剤を挙げることができるが、
さらにはｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジアゾニウ
ムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応
試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組み合わせたものも使
用可能である。

ヒトα型インターフェロンの抗原は、上記ハブチンと担
体とをへブテンー担体結合試薬の存在下に反応させるこ
とにより製造される。上記反応は、水溶液もしくは、ｎ
　７〜ｌＯの通常の緩ａ液中好ましくは、Ｈ８〜９の緩
衝液中で０−４０℃好ましくは室温付近で約１〜２４時
間、好ましくは８〜５時間を要して行なわれる。上記に
おいて用いられる代表的緩鈎液としては、次のものを例
示できる。

０．２Ｎ水酸化ナトリウム−０，２Ｍホウ酸−０，２Ｍ
塩化カリウム緩衝液、 ０．２Ｍ炭酸ナトリウム−０，１！　Ｍホウ酸−０，２
Ｍ塩化カリウム緩衝液、 ０．０５Ｍ四ホウ酸ナトリウムー０．２Ｍホウ酸−０，
０６Ｍ塩化力トリウム緩術液、 ０、１　Ｍリン酸二水素カリウム−０，０６Ｍ西ホウ酸
ナトリウム緩衝液 上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は適宜に決定できるが、通常ハプテンに対
して担体を２〜６倍重量好ましくは８〜６倍重量、及び
ハプテン−担体結合試薬５〜１０倍モルとするのがよい
。上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介させて
担体とハプテンとが結合したペプチド−担体複合体から
成るヒトα型インターフェロンの抗原が収得される。反
応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば透析法、ゲ
ル濾過法、分別沈澱法等により容易に単離精製できる。

かくして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに対しペプ
チドが平均６〜２０モル結チルたものであり、いずれも
引き続き再現性よく、ヒトα型インターフェロンに対す
る特異性の高い抗体の作成を可能とするものであるが、
特に上記蛋白質に対するペプチドの結合モル比が１＝８
〜１６のものは、特異性が一層高く高力価、高一度の抗
体を作成し得るものであり好ましい。

上記で得られる抗原による抗体の作成に当っては、常法
に従い抗原を哺乳動物に投与し、生体内に産生される抗
体を採取する方法を採用できる。

抗体の製造に供せられる哺乳動物としては特に制限はな
いが、通常兎やモルモットを用いるのが望ましい。抗体
の産生に当っては、上記により得られる抗原の所定量を
生理食塩水で適当濃度に希釈し、フ四インドの補助液（
Ｏｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓムｄｊｕｖａｎｔ　
）と混合して懸濁液を調整し、之を哺乳動物体に投与す
ればよい。例えば兎に上記懸濁液を皮肉注射（抗原の量
として０．６〜ＦＩＩＩｆＩＺ回）し、以後２遍間毎に
２〜１０ケ月好ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させ
ればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体
が多量産出される時期、通常上記最終投与１〜２週間経
過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心分離後血
清を分離採取することにより行なわれる。

かくして得られた抗体は、後記試験例に示す通り殊に優
れたヒトのａ型インターフェロン特異性を有する。

本発明方法においては、まず標準抗原を適当な希釈液で
希釈して希釈系列を作成する。希釈液としては、特に限
定はなく、通常この種の測定法に使用される各種のもの
を使用できる。具体的には、例えば、ホウ酸緩衝液、ト
リス場酸Ｍ衝波、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸
リン酸緩衝液、グリシン緩衝液等の、Ｈ５〜１０好まし
くはｐＨ７〜８程度の緩衝液等が挙げられる。又、吸着
防止の為に牛血清アルブミン（Ｂ８ム）防腐剤としての
アジ化ナトリウム、１ｌＤＦＩＩム、塩化ナトリウム等
の通常の添加物を希釈液中化加えてもよい。

次いでこの標準抗原の希釈系列に一定誕の１１１記抗体
及び一定量の一般式（１）の電光Ｉｓ癲ペプチドを加え
たものを、サンプルとし０〜８７℃で８０分〜４８時間
程度放置後、通常手段により垂直蛍光偏光強度（ｌマ畠
）及び水平蛍光偏光強度（Ｉｎ２　）を測定する。該蛍
光偏光の測定は、通常の偏光強度測定装置例えば市販の
装置１−Ｆ８−６０１Ｊ　（＃ユニオン技研社製）等に
より容易に測定することができる。

また上記サンプルと同様にして、一般式（１）の蛍光標
識ペプチドを含まない以外は同一のレファレンスサンプ
ルを作成し、同様に垂直蛍光偏光強度（Ｉｖｍ　）及び
水平蛍光偏光強度（Ｉｉｍ　）を測定する。

かくして、標準抗原の希釈系列に対して偏光度（Ｐ値）
を下記式より求め標準曲線を得る。

（Ｉｖｓ−Ｉｖｍ　）　＋　（Ｉａｓ−ＩＨＩ　）標準
抗原の代りに、未知濃度のヒトα型インターフェロンを
含む検体を用いて、同様にしてＰ値を算出して、前記で
得た標準曲線より、該検体のヒトα型インターフェロン
を定量することができる。

標準抗原として生のヒトα型インターフェロンを用いた
場合は、標準曲線より、直ちに検体のインターフェロン
力価を求めることができる。

又標準抗原として、一般式（２）のペプチドを用いた場
合は、標準抗原として生のヒトａ型インターフェロンを
用いた場合との交差反応性を初めＩＣ求めておきインタ
ーフェロン力価に換算すればよい。

以下本発明を更に詳しく説明するための参考例及び実施
例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない
。

尚参考例におけるＲｆ値はシリカゲル上の薄層クロマト
グラフィーにて下記混合溶媒を用いて測定したもの′で
ある。

Ｒｆ’・・・１−ブタノール−酢酸−水（４：１：５）
Ｒｆｌ・・・１−ブタノール−ピリジン−酢酸−水（１
５：１０：８：１２） くペプチドの合成〉 参考例１ １、　２−　Ａｊａ　−０８ｕ　４．８０１のテトラヒ
ドロフラン（’Ｉ’Ｈ］Ｆ　）　６０　ｍｌ溶液にＨ−
Ｇｉｎ　−ＯＨ２，１９ｆの水４０ｄｌｌ！ｊ液とトリ
エチルアミン２．１０ｓ／を加え、室温で２０時間攪拌
する。ＴＨ？及び水を留去し、残渣をｎ−ブタノールで
抽出する。抽出液を２％酢酸で洗浄し、ブタノールを留
去する。析出物質を炉取し、メタノール−酢酸エチルで
再沈澱させて、８．８’ｌｌの２−ムＪａ　−（Ｍｎ−
ＯＨを得る。

Ｒｆｌ：０．４１ Ｒｆ、０．５６ 元系分析値（０１６Ｈ重ＩＮ、０・として）計算値（％
）０５４．６９　　Ｈ６，０２Ｎ１１．９６実測値（％
）０５４．６０　Ｈ６，８１Ｎ１１．６２２、　ａ）　
Ｚ　−ＡＪａ　−Ｇｌｎ　−ＯＨ８，５Ｏｆを水５０ｓ
／及びメタノール８０ｇ／に溶かし、ノでラジウムを用
も１て接触還元して、Ｈ−Ａｌｈ　−Ｇ４１ｎ−ＯＨを
得る。

Ｒｆ、０．０４ ｂ）　Ｚ　−Ｌｅｕ　−０８ｕ　８．９７　ｆｌ　、上
記（転）で得たＨ−ム１＆−Ｇｊｎ−ＯＨ及びトリエチ
ルアミン１．８９ｍ１をジメチルホルムアミド（ＤＭＩ
Ｆ）５０ｓ／に溶解し、室温で２０時間攪拌する。ＤＭ
Ｆを留去し、残液を酢酸エチルで抽出する。抽出液をＩ
Ｎ−クエン酸で８回、次いで水で６回洗浄する。酢酸エ
チルを留去しで、残渣にエーテルを加え、析出する沈澱
物を炉板乾燥後、メタノール−酢酸エチルより再沈澱さ
せて、Ｚ−Ｌｅｕ−ムｊａ　−Ｇｉｎ−ＯＨｌ　１６　
Ｆを得る。

Ｒｆｌ：０．４９ Ｒｆｌ：０．６１！ 計算値（％’）　　５６．８８　６．９４　１２．０６
実測値（％）　　５６．４１　６．８０　　１１１８８
、　　ａ）　Ｚ　−Ｌａｕ　−ＡＪａ　−Ｇｊｎ　−Ｏ
Ｈ２，１０１Ｆに２６％臭化水素含有酢酸溶液２０ｇ／
加え、室温で１時間放置Ｔる。反応液に乾燥エーテルを
加えてＨ−Ｌｅｕ−ムｊａ　−Ｇｊｎ−ＯＨを得る。

Ｒｆ、０．１０ ｂ）　Ｚ　−Ｌｅｕ　−０８ｕ　　１．９６　ｆ　、　
　）リエチルアミン０．６８ｓ／及び上記（ａ）で得た
Ｈ−Ｌｅｕ−ＡＪａ　−Ｇｊｎ　−ＯＲをＤＭＩＦ　６
　Ｇ−に溶かし、室温で２０時間攪拌する。

ＤＭＩＦを留去して、残渣に１Ｍクエン酸を加え、析出
する結晶を炉板し、結晶をＦ液が中性になるまで水洗し
、乾燥する。メタノール−酢酸エチルで洗浄して、ｔ、
ｓｓｔのＺ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｊｔ
ｎ−ＯＨを得る。

Ｒｆ’：０．６８ Ｒｆ、０．６４ 元素分析値（ＯｇａＨ４１Ｎ！１０１１として）ＯＨＮ 計算値（％）　　５８．２２　７．５０　１２．１２実
測値（％’）　　５７．８５　７．９０　１１．９６４
、　　ａ）　Ｚ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇ
ｉｎ　−ＯＨ１，！Ｓ　０１に２５％臭化水素含有酢酸
溶＆　２０　ｍ！を加え、室温で１時間攪拌する。反応
液に乾燥エーテルを加えて、析出する固体を戸取して、
Ｈ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ−Ｇｊｎ−ＯＨを得る
。

Ｒｆｌ：０．１９ ｂ）　Ｚ−ＩＬａ　　Ｏ８ｕ　　１．４１１　、上記（
ａ）で得たＨ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｊｎ
−ＯＨ及びトリエチルアミン０．８６ｄをＤＭＦ５０ｓ
＋Ｊに溶かし、室温で２０時間攪拌する。ＤＭＦを留去
して、残渣にＩＮクエン酸を加え、析出する結晶を戸取
し熱メタノールで洗浄して、ｔ、ｔｙｙのＺ　−ＩＬｅ
　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｊｎ　−ＯＨを
得る。

Ｒｆ、０．６１ Ｒｆｌ　：０．７１ 元素分析値（０，，４Ｈ番４Ｎ６０＠として）ＯＨＮ 計算値（％）　　５９．１１　７．８７　１２．１６実
測値（％）　　５９．２８　７．８０　１２．０２６、
　　ａ）　Ｚ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊ
ａ　−ＧＪｎ　−ＯＨ１，１０Ｉに２６％臭化水素含有
酢酸１５＋ｓ／を加え室温で１時間攪拌する。反応液に
乾燥エーテルを加えて、析出する固体を戸数して、Ｈ−
ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｊｎ−Ｏ
Ｈを得る。

Ｒｆ’：０．２５ ｂ）　Ｚ　−Ｌｅｕ−Ｏ８ｕ　０．６９　ｇ　、上記で
得たＨ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−ＡＪａ　−Ｇ
ｊｎ−ＯＲ及びトリエチルアミン０、２２　ｍｌをＤＭ
ＩＦ５０ｓＪにとかし室温で２０時間攪拌する。ＤＭＦ
を留去して、残渣にＩＮコハク酸を加え、析出物質を戸
取し、炉液が中性になるまで水洗乾燥する。熱メタノー
ルで洗浄して、１．１ＯｆのＺ　−Ｌｅｕ　−ＩＬｅ　
−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−ムｊａ　−（Ｍｎ　−ＯＨを得る
。

Ｒｆ、０．５８ Ｒｆｌ：０．７１ 元素分析値（０４０Ｈ＠ＩＮマ０１（ｌとして）ＯＨＮ 計算値（％）　　５９．７５　８．１６　１２．１９実
測値（％）　　６９．６０　８．０２　１１．９２８、
　　Ｚ　−Ｌｅｕ−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａ
ｊａ　−Ｇｊｎ　−ｏｎｏ、　５０１をメタノールＳｏ
ｕ！及び１０％酢酸１０ｄに溶かし、パラジウムを触媒
として接触還元して、Ｈ−Ｌｅｕ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ
　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−（Ｍｎ　−ＯＨを得る。

Ｒｆ’：０．２８ Ｒｆ、０．６１ 元素分析値（０１，Ｈ，９Ｎ７０ｍ　−２Ｈ，Ｏとして
）ＯＨＮ 計算値（％）　　６４．４５　８．９９　１８．８９実
測値（％）　　６４．８０　８．８１　１８．９８？、
　　　Ｂｏｏ−ＡｌｓＬ−ＯＨ４，９９１、ＮＨ＠−Ｎ
Ｈ−Ｚ　４．８６ｆ及びジシクロへキシルカルボジイミ
ド５．４４Ｆを’１’ＨＦ　１５０＋＋１／に溶解し、
４℃で２０時間攪拌する。析出する固体を炉去しＰ液を
留去し、エーテルより沈澱を戸取しエーテルと石油エー
テルから再沈澱させて、７．０８　ｆのＢｏｏ−ムｊａ
　−ＮＨＮＨ２を得る。

Ｒｆｌ：０．７９ Ｒｆｌ　：０．８１ 元素分析値（０１６Ｈ１１ＮＩＯ８として）実測値（％
）　　５６．８１　６．４９　　１２．８４８．　　ａ
）　Ｂｏｏ　−ＡＪａ　−ＮＨＮＨ２８，０Ｏｆをトリ
フルオロ酢酸１０ｓ？に溶解し、１６分間室温放置後、
トリフルオロ酢酸を留去し乾燥してＨ−ムｊａ　−ＮＨ
ＮＨ２を得る。

Ｒｆ、０．６１ ｂ）Ｂｏｏ−ムｒＩ（Ｎｏ、　）−ＯＨ２，８４１を’
Ｉ’ＨＦ　４０ｓ／およびＮ−メチルモルホリン０．９
１ｇ／ｌ液に解かし、−１６℃に冷却後イソブチルクロ
ロホルメイト１．１７−を加え８０秒間激しく攪拌する
。これに上ｆｆｉテ得りＥ　−Ａｊａ　−ＮＨＮＨ２（
Ｄ　Ｄ　Ｍ　Ｆ　２０　ｍｌ　溶液及びトリエチルアミ
ン１．２４　ｓＪ溶液を加え、１分間攪拌する。Ｏ′Ｃ
で６分間次いで４０”Ｃで２分間温めた後、室温で１６
分間攪拌する。ＴＨＦ及びＤＭＦを留去後、酢酸エチル
で抽出する。抽出液をＩＮクエン酸、つづいて飽和炭酸
水素ナトリウム次いで飽和食塙水で洗浄後、酢酸エチル
を留去し、酢酸エチル−エーテルで再沈澱させて、８．
７（ｌのＢｏｃ−ムｒＩ（ＮＯＩ）−Ａｊａ−ＮＨＮＨ
２を得る。

Ｒｆ、０．６８ Ｒｆ、０．７９ 元素分析値（０１！Ｈ８４ＮＩＯａとして）ＯＨＮ 計算値（％）　　４９，０６　　６．８６　　２０．８
０実測値（％）　　４９．４０　　６．７２　　２０．
４８９、　　ａ）　Ｂｏｏ　−Ａｒｇ　（ＮＯＩ）−Ａ
Ｊａ　　ＮＨＮＨｚ　８．６７１をトリフルオロ酢酸１
６−に溶解、１ｂ分間室温放置後４乾燥エーテルを加え
結晶′化させ、結晶を１取してＨ−ムｒｐ（ＮＯｌ）−
＾ムーＮ１（ＮＨ２を得る。

Ｒｆ、０１０ ｂ）　Ｂｏｏ−ムｒｆ（ＮＯＩ）−ＯＨ２，１７１をＴ
ＨＰ５０ｍｌとＮ−メチルモルホリン０．６９ｓｔ混散
に溶カし、−１５°Ｃに冷却後イソブチルクロロホルメ
イト０、８９　ｍｌを加え８０秒間激しく攪拌する。こ
れに上記（ａ）で得たＥＩ　Ａｒｆ（ＮＯＩ　）−ムｊ
ａ−ＮＨＮＨｚのＤＭｌｉ’８０耐およびトリエチルア
ミン０．９６ｄ溶１’＆を加え１分間攪拌する。０°Ｃ
で６分間、次いで４０’Ｃで２分間温めた後、室温で１
５分間攪拌する。

Ｔｌ１Ｆ及びＤＭｉＦを留去し、残渣を酢酸エチルで抽
出する。抽出液をＩＮ−クエン酸及び飽和炭酸水素ナト
リウム水溶液の順で洗浄後、酢酸エチルを留去する。酢
酸エチル−ニー参ルにより再沈澱させて、８．７Ｏｆの
Ｂｏｃ−ムｒｙ　（ＮＯＩ　）−ムｒｙ（ＮＯＩ）−Ａ
ＩＩＬ−ＮＨＮＨ２を得る。

Ｒｆ、０．５８ Ｒｆ、０．７６ 元素分析値（ＯＨＨ４１ｉＮ１１０１１として）ＨＮ 計算値（％’）　　４５．４６　　＆１８　２４．６１
実測値（％）　　４６．１８　６．７１　２４．５１１
０、　　ａ）Ｂｏａ−Ａｒｇ（ＮＯｌ）−ムｒｇ　（Ｎ
Ｏｇ　）−Ａｌａ−ＮＨＮＨ２８，０（ｌをトリフルオ
ロ酢酸２０耐に溶解し、１６分間室温で放置後、乾燥エ
ーテルを加えて結晶化−させる。結晶を１取してＨ＝Ａ
ｒｙ（ＮＯＩ）−ムｘｇ　（ＮＯＩ）−ムｊａ−ＮＨＮ
Ｈ２を得る。

Ｒｆｌ：０．１１ ｂ）上記（転）で得たＭ−Ａｒｐ（ＮＯり　ＡｒｊＦ（
ＮＯＩ）　Ａｌａ−ＮＨＮＨｚをＤＭＦ　６０ｓ／にと
かし、それにトリエチルアミン０．５６ｓ／とＢｏｏ−
ムｓｎ　−０ＮＢ８２．１７　ｆを加え、２０時間室温
で放置する。ＤＭＦを留去し、残渣をブタノールで抽出
する。抽出液を２％酢酸で洗浄後、エーテルを加えて結
晶化させ、結晶を戸数して、メタノール−酢酸より再沈
澱させ−て、２．６４ＦのＢｏｏ−ム５ｎ−Ａｒｆ（Ｎ
ＯＩ　）−ムｒｙ（ＮＯＩ）−ムｔａ−Ｎｕ−ＮＨｚを
得る。

Ｒｆ鳳　：０．４０ 几ｆｌ：０．７２ 元素分析値（０８１Ｈ５１Ｎ１１１０１−として）ＣＨ
Ｎ 計算値（％）　　４５．０１　６．０２　２４．６０実
測値（％）　　４４，８０　５．８６　２４．１２ｏ）
　　　Ｂｏｏ　−Ａｓｎ−Ａｒｐ（ＮＯＩ）−Ａｒｇ（
ＮＯＩ）−ＡＪａ　−ＮＨ−ＮＨｚ２．５０１をメタノ
ール８０ｓＪ？と８．０％酢酸と曇と溶かし、パラジウ
ムを触媒として接触還元して、２、２　ＯｆのＢｏａ　
−Ａａｎ−ムｒｌ−ムｒｆ−ムムーＮＨ−Ｎｎ。

を得る。

Ｒｆｌ：０．０＠ Ｒｆ’：０．４０ 元素分析値（０，、Ｈ４，Ｍｌ、０７−２　ｏｎ、ｏｏ
、ｎ　・Ｈ，ｏとして）（ｌ　　　　　　ＩＩ　　　　
　　Ｎ 計算値（％）　　４８，８０　７．４８　２８．７１実
測値（％）　　４８．５１　７．６２　２８．４ＪＳ１
１、　Ｎ−メチルモルホリン１．８６ｓ／をＴＨＦ　６
０−にとかし、それにＺ　−Ｌｅｕ−ＯＨ４，８６ｆを
加える。−１６℃に冷却して、イソブチルクロロホルメ
イト２．４１ｍ１を加え８０秒間激しく攪拌する。

これに、　Ｈ−Ｇａｙ−００２Ｈ６・ＨＯ４１２，５４
ｆのＤＭＩＦ４０ｇ／溶液及びトリエチルアミン２．５
６　ｓｓｌを加え、１分間攪拌する。０℃で５分間、次
いで４０℃で２分間温めた後、室温で１６分間攪拌する
。　’Ｉ’ＨＦ及びＤＭＦを留去し、残渣に１Ｍクエン
酸を加え、析出する結晶を戸数する。ろ液が中性になる
まで、水で洗浄し、析出した結晶を戸数し乾燥し、酢酸
エチル−エーテルで再沈澱させて、４．６１１の２−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−００１Ｈ＠を得る。

Ｒｆｌ：０．８０ Ｒｆｌ　：０．７７ 元素分析値（０１畠Ｈ１６Ｎ！０１１として）Ｏｎ　　
　　　　　Ｎ 計算値（％）　　６１．７０　７．４８　　’１９９実
測値（％）　　６１．５１　７，８２　７．８０１１　
　ａ）　Ｚ−Ｌｅｕ−Ｇｊｙ　　０ＯＩＨ＠　８．１２
１のメタノ−Ｊし６０露ＣとＩＮ塩酸１１．９０　ｍｌ
とに浴かし、パラジウムを触媒として接触還元して、Ｈ
−Ｌｅｕ　−ＧＪｙ−ｏｏ、ｎ、を掃る。

Ｒｆ、０．４１ Ｎ塩酸／ジオキサン４．８９ｓｇＪに溶解し、−１６’
Ｃに冷却後亜硝酸イソアミル１．８１　ｍｌを加え、５
分間攪拌する。次いでトリエチルアミン４．１１−を加
えて中和する。上記（社）で得られたＨ−Ｌｅｕ　−Ｇ
１７−００１１Ｈ，・Ｉ　Ｈｏｇ及びトリエチルア【ン
１．２４ｍのＤＭＦアミド１０ｓ／溶液に上記の反応液
を加え、４℃で２０時間攪拌する。Ｉ）ＭＰを留去後、
残留物を酢酸エチルで抽出し、抽出液をＩＮ−クエン酸
、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥する。

酢酸エチルを留去後、酢酸エチルより再沈澱させて、２
．６４ｆのＺ　−８ｅｒ　−Ｌｅｕ　−０１ｙ　−００
＠Ｈ尋を得る。

Ｒｆｌ：０．７８ Ｒｆｌ：０．８５ 元素分析値（０！ｌＨｍｌＮ、Ｏ，として）ＯＨＮ 計算ｆｌｕ（％）　　６７．６６　７．１４　９．８０
実測値（％”）　　５７，６０　６．８８　９．６８１
８、　　ａ）　Ｚ　　８ｅｒ−Ｌｅｕ　　Ｇｊｙ−００
１１ＨｇｉＬ６０　ｆを１０％酢酸１０ｓ／及びメタノ
ール６０ｓｌに溶かし、１＜ラジウムを触媒として接触
還元して、Ｈ−８ａｒ−Ｌｅｕ　　ＧＩＹ　　０ＯＩＨ
６を得る。

Ｒｆｌ：０．８１ に＋）　Ｚ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−ＮＨＮＨｓ２．６４　ｆ
ｌをＤＭＦ２０＋ｗｊ及び６Ｎ−塩酸／ジオキサン４．
１９−に溶解し、−１５°Ｃに冷却後、亜硝酸イソアミ
ル０．８４ｇ／を加え、５分間攪拌する。次いでトリエ
チ・ルアミン８、５１　ｍｌを加え中和する。上記（ａ
）で得たＨ−ｓｅｒ−Ｌｅｕ−０４ｙ−００１ＨＢとト
リエチルアミン０．７９ｓＪとのＤＭＦＳ！Ｏ−溶液に
、上記の反応液を加え、４℃で２０時間攪拌する。ＤＭ
Ｆを留去後、残渣をブタノールで抽出し、抽出液を水洗
する。＠縄を留去して、メタノール−酢酸エチルで再結
晶して、４．８１ｆ　　の　Ｚ　−’Ｉ’ｈｒ　−Ｈｌ
ｓ　−８ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇｊｙ　−００１Ｈ＠を得
る。

Ｒｆｌ：　０．’３５ Ｂｆ厘　：　　０．７１ 元素分析値（０ｓｌＨ，、Ｎ、０．　・Ｈ，Ｏとして）
ＯＨＮ 計算値（％”）　　６４．００　　＆、１４　１６．８
５実測値（％）　　６４．４８　８．１０　１６．５４
１４、　　ａ）　Ｚ　−Ｔｈｒ　−Ｈｌａ−８ｅｒ　−
Ｌｅｕ　−Ｇｊｙ−ＱＣ，Ｈ。

４．８０ｆをメタノール２０ｓ／に溶かし、ヒドラジン
・１水和物８．１８　ｍｌを加え、室温で２０時間放置
する。反応液に工・−チルを加えて、析出する結晶をＰ
取し乾燥する。熱メタノールで洗浄して、１６６　ｆの
Ｚ　’Ｉ’ｈｒ−Ｈ１ｓ　８ｅｒ　Ｌｅｕ−Ｇｌｙ　Ｎ
ＩＨＮＨ！を得る。

Ｂｆ、０．１７ Ｒｆ、０．６７ 元素分析値（０１１Ｈ４１ＮＩＩ０１１として）ＯＨＮ 計算値（％’）　　５２．６４　６．６５　１９．０６
実測値（％）　　５１５６　６．４４　１９．０９ｂ）
　Ｂｏｏ−ＡＢｎ−ムｒｙ−Ａｒｐ−ムｌａ　−ＮＨＮ
Ｈ，０，７８９をＤＭＦ８ｓ／及び６Ｎ−塩酸／ジオキ
サン１．０８　ｄニ溶解し、−１６℃に冷却後、亜硝酸
イソアミル０．１６−を加え５分間攪拌する。次いでト
リエチルアミン０．８７　ｍｌを加え中和する。Ｈ−Ｌ
ｅｕ　−ＩＬｅ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｊ
ｎ　−ＯＨとトリエチ）Ｌ／７ミン０、０８７禦ｌとの
ＤＭ’！’　２０厘ｌとへキサメチフレリン酸トリアミ
ド１０ｍ１との溶液に、上記の反応液を加え、４℃で２
４時間、さらにＢｏｏ−ムａｎ　−Ａｒｙ　−Ａｒｐ　
−Ａｊａ　−ＮＨＮＨｇ　Ｏ，８９ｆをアジド化して得
たものを加えて、合計７２時間攪拌する。ＤＭＦを留去
し、残渣をブタノールで抽出する。抽出液を水洗して、
ブタノールを留去する。残渣にエーテルを加えることで
結晶化させ、析出結晶を戸数する。

水洗し、６酸化リンで乾燥する。得られたＢｏｏ−ムＩ
ｎ−ムｒｆ−ムｒｙ−ＡムーＬｅｕ　−ＩＬｅ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ−Ｇｊｎ　−ＯＨをトリフルオ
ロ酢酸８ＩＩｌに溶解し、１５分間室温で放置後、乾燥
エーテルを加え沈澱を析出させ、これを戸数乾燥後セフ
ァデックスＧ−２６（溶出液６０％酢酸）で精製して、
Ｈ−ムーｎ−ムｒｙ−ムｒｙ−ムＩｔ　−Ｌｅｕ　−Ｉ
Ｌｅ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ａｊａ　−Ｇｌｎ　−０Ｈ
１２０１１Ｉを得る。

Ｒｆ、０．０Ｉ Ｒｆｌ：０．８５ 元素分析値（０，ＩＨ，４”Ｎｌ畠０１．・２０Ｈ畠０
００Ｈ・６Ｈ８０として）ｆｌＮ 計算値（％）　　４７．９６　８．１９　１８．８０実
絢値（％）　　４７，６６　８．４１　　　ｔｇ、ｓｇ
（ａ）Ｖニーｔｓｓ、＜４（ａ：ｏ、ｓｙ　　ｘｙｔａ
Ｈ，ａｏｏＨ）１６、　　Ｚ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−８ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｇａｙ−ＮＨＮＨＩ１２６１１をＤＭＦ　１
０ｓ／及び６Ｎ−塩酸／ジオキサン０．１２６　＃／に
溶かし、−１５℃に冷却後、亜硝酸イソアミル０．０２
５ｇｔを加え５分間攪拌する。次いでトリエチルアミン
０．１０５ｓＺを加え中和する。

Ｅ−Ａｓｎ−ムｒｙ−ムｒｌ−Ａｊａ　−Ｌｅｕ　−Ｉ
Ｌｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−ムｊａ　−ＧＪｎ　−Ｏ
Ｈ１１０Ｑとトリ１ｆｋ７Ｅン０．０１８ｓＺのＤＭＦ
ＩＯｓ／とのへキサメチルリン酸トリアミド６　ｍｌの
溶液に、上記反応液を加え、４℃で２４時間攪拌する。

さらにＺ　−Ｔｈｒ　−Ｈｌｓ−８ｅｒ　−Ｌａｕ　−
Ｑｌｙ　−ＮＨＮＨＩ　１２５　Ｑをアジド化したもの
を加え、４８時間攪拌する。ＤＭＦを留去し、残渣をブ
タノールで抽出する。抽出液を水洗する。ブタノールを
留去し、メタノール−酢酸エチルで再ムｓｎ−ムｒＩＩ
−Ａｒｇ−ムＩａ−Ｌｅｕ　−ＩＬａ　−Ｌｅｕ　−Ｌ
ｅｕ−ムＪａ−Ｇｊｎ−ＯＨをメタノール５０ｍ１及び
１０％酢酸１０ｄに溶かし、パラジウムを触媒として接
触還元する。触媒を炉去つづいてメタノールを留去して
、得られた残渣をセファデックスＧ−２５（溶出液６０
％酢酸）で精製して、１２６ｑのＨ−Ｔｈｒ−Ｈｌｓ　
−８ｏｒ　−Ｌｅｕ−Ｇａｙ−ムａｎ−ムｒｌ−ムｒｌ
−ムｊａ　−Ｌａｕ−１ＩＬｅ　−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−ム
ｊａ　−Ｇｊｎ−ＯＨを得る。

Ｒｆ、０．０１ Ｒｆ、０．８８ 元、素分析値（０テ声、１．　Ｎ、、０１６−２０Ｈ＠
０ＯＱＨ−４Ｈ，０として）ＨＮ 計算値（％）　　４９．２１　７、’ＩＴ　　　１ｇ、
８７実測値（％）　　４９．６０　　？、９２　１８．
５４（ｆｆ）’、’ニー６６．７６　　（０：０．ｌ！
　　ＩＭＯＲ，０ＯＱＨ）１６、　　ａ）　Ｚ　−（Ｍ
ｎ　−ＮＨＮｋｌ　−１３ｏｃ　　７．００１をメタノ
ール６０−に溶かし、パラジウムを触媒として、接触還
元して、Ｈ−Ｇｌｎ　−ＮＨＮＨ−Ｂｏｏ　　を得る。

Ｒｆｌ：０．１ｍ？ ｂ）　　Ｚ　−Ｐｒｏ　−ＯＨ４，４１９をＴＨＦ５０
ｇ／及びＮ−メチルモルホリン１．８０ｍに溶かし、−
１６１Ｃに冷却後、イソブチルクロロポルメイト２．８
４露ｌを加え、８０秒間激しく攪拌する。これに上記（
ωで得た）Ｉ　Ｇｊｎ　−ＮＨＮＨ限のＤＭＦ８０ｍ？
溶液を加え、１分間攪拌する。０℃で６分間、次いで４
０℃で２分間温めた後、室温で１６分間攪拌する。’Ｉ
’ＨＩ’及びＤＭＦを留去して、残渣を少麓のブタノー
ル含有酢酸エチルで抽出する。抽出液をＩＮ−クエン酸
、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水の順に洗浄する
。熱酢酸エチルで洗浄して、ｈ、ｆｉ’ｌｆｌのＺ　−
Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ−ＮＨＮ用−を得る。

Ｒｆ’ｌ：０．６０ Ｒｆｌ：０．７６ 元素分析値（０１１ＨＩＩＮＩＩＯ？として）ＨＮ ｍｓ値Ｃ％＞　　５６．２０　６．７７　１４．２６実
測値（％）　　８６．９７　６．６８　１４．１６１７
、　　ａ）　Ｚ　−Ｐｒｏ　−（Ｊｎ−ＮＨＮＨＢ、（
，５，５Ｏｆをメタノール５０＋ｗｌに溶かし、パラジ
ウムを触媒として接触還元して、Ｈ−Ｐｒｏ　−ＧＪｎ
−Ｎ’ＨＮＨ′Ｂｅｃを得る。

Ｒｆｌ：０．０９ ｂ）　　Ｚ　−Ｌｅｕ　０ＮＨ８４，０６ｆを上記（ａ
）で得たＨ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ　−ＮＨＮｌ＆ｃのＤＭ
Ｆ　１００　ｓ／及びトリエチルアミン１．５６篩！溶
液に加え、２０時間室温にて放置する。ＤＭＦを留去後
、残渣を酢酸エチルで抽出する。抽出液をＩＮ−クエン
酸、飽和食塩水の順に洗浄する。酢酸エテル−エーテル
で再沈澱させて、８．Ｔ２ｆのＺ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ
　　Ｇｌｎ　　Ｎ）ＩＮＨＢＪＱを得る。

Ｒｆｌ：０．６ｇ Ｒｆ、０．８０ 元素分析値（０□Ｈ４４Ｎ＠０１として）ＣＲＮ 計算値（％）　　５７．６０　７．８８　１８．９０実
測値（％’）　　５７．２１　７．０８　１Ｂ、５８１
８、　　ａ）　　Ｚ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ−Ｎ
ＨＮＨＢｏｏ８．５Ｏｆをメタノール５０鱈ｌｉζ溶か
し、パラジウムを触媒として接触還元して、Ｈ−Ｌａｕ
−Ｐｒｏ　−Ｇｉｎ　−ＮＨＮＨＢｏｃを得る。

Ｒｆ厘：　　０．　１　４ ｂ）　　Ｚ−Ａｓｐ（ＯＯＨ”、０６Ｈｇ　）−ＯＨｌ
　２７　ＩＩをＴＨＦ８０−及びＮ−メチルモルホリン
０．６５ｓＪに溶かし、−１５℃に冷却後イソブチルク
ロロホルメイト０．８４ｓ／を加え８０秒間激しく攪拌
する。これに上記（ａ）で得たＨ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ
　　Ｇｊｎ　　ＮＨＮＨＢｅｃのＤＭＦ２０ｍ及びトリ
エチルアミン０．８１ｍ溶液を加え、１分間攪拌する。

０℃で６分間、次いで４０℃で２分間温めた後、室温で
１６分間攪拌する。ＴＨＦ及びＤＭＩＦを留去して、残
渣を酢酸エチルで抽出する。抽出液をＩＮ−クエン酸、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し
、抽出液を留去する。酢酸エテル−エーテル−石油エー
テルで再沈澱させて、４．０　Ｏｆ　（Ｄ　Ｚ　　ＡＳ
Ｐ　（ＯＯＨ＊Ｏ，Ｈｉ　）−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇ
ｊｎ　−ＮＨＮＩＩＢｏｏを得る・Ｒｆｌ：０．６８ Ｒｆ、０．７７ 元素分析値（０４・Ｈ，ｉＮマ０１にとして）ＱＨＮ 計算値（％）　　５９．８２　６．８４　　１２．１１
実測値（％）　　６８．８８　６．６５　１１．７２１
９、　　　ａ）　　　Ｚ−ムＢＰ（ｏｏｕ、ｏ＠［６）
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−ＮＨＮＨＢｏｏ　　２．０
　Ｏｆをメタノール５０Ｉｌｌ及び１０％酢酸１０−に
洛かし、ノ（ラジウム黒を触媒として接触還元して、Ｈ
−ム５ｐ−Ｌｅｕ　　Ｐｒ０−Ｇｊｎ−ＮＨＮＨＢａ（
−を得る。

ａｒｔ：ｏ、ｏｓ ｂ）　　Ｚ　−８ｅｒ　−ＮＨＮＨ！　　０．７５１を
ＤＭＦ　１５ｍ及び６Ｎ−塩酸／ジオキサン１．４８ｓ
／に浴かし、−１６°Ｃに冷却後、亜硝酸イソア疋ル０
．８９　ｍｌを加え５分間攪拌する。次いでトリエチル
アミン１．２４１１ｔ加え中和する。上記（ａ）で得た
Ｈ−ムｓｐ　−Ｌｅｕ　−ｐｒｏ　−Ｇｉｎ−ＮＨＮＨ
ＢｏｃのＤＭＦ１０ｇ／及びトリエチルアミン０．８４
　ｄ溶液に、上記の反応波を加え、４℃で２０時間攪拌
する。ＤＭＦｌｔｌｉｌ去し、残渣をブタノールで抽出
する。抽出液を水洗し、ブタノールを留去する。メタノ
ール−酢酸エチルより再結晶して、１．５２ｆのｚ−８
ｅｒ−ムｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−０４ｔｎ　−Ｎ
ＵＮ）ｉＢｏｏ　　を得る。

Ｒｆｌ：０．４５ Ｒｆｌ　：０．６？ 元素分析値（０，、Ｈ・０ＮＩＯ１１として）□　　　
　　　ＨＮ 計算値（％）　　５７．５８　６．７４　１２．４９実
測値（％）５７．２０　６．６０　　１２．０８２０、
　　Ｚ−８ａｒ−ムｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｊ
ｎ　−ＮＨＮＨＢｏ。

１１６１’ｖをＴｌｌム２ｇ／により脱Ｂｏｏ化し、無
水エーテルにより沈澱をＰ取し乾燥後Ｄ　Ｍ　Ｐ　６　
ｙｓｌ及び６Ｎ−塩酸／ジオキサン０．０７２ｇ／に溶
解し、−１５°Ｃに冷却後亜硝酸イソア【ル００１９ｓ
Ｊを加え５分間攪拌する。次いで、トリエチルアミン０
．０８１ｓ／を加え中和する。Ｈ−Ｔｈｒ　−Ｈｌｓ　
−Ｂａｒ　−Ｌｅｕ−０４ｙ−Ａｓｎ−Ａｒｆ−Ａｒｇ
　−Ａｊａ　−Ｌｅｕ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　
−ＡＪａ　−Ｇｊｎ　−ＯＨ８０”ｆのＤ　Ｍ　Ｆ　５
　ｍｌ及びヘキサメチルリン酸トリアミド６ｄの浴故に
上記反応液を加え、４℃で２０時間攪拌する。さらに２
−８ｅｒ−ムａｐ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ｇｉｎ　−Ｎ
ＨＮＨ３ｏｏ１１６　”ｆ／を加え合計４８時間攪拌す
る。ＤＭＰを留去し、残渣をブタノールで抽出する。抽
出液を水洗し、ブタノールを留去して、残渣に石油エー
テルを加えることで結晶化し析出結晶を戸数し、メタノ
ール−酢酸エチルで再沈澱させる。得られたｚ　−ｓｅ
ｒ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ　−’Ｉ
’ｈｒ　−Ｈｌｓ−８ｅｒ　−Ｌｅｕ−（Ｊｊｙ−Ａｓ
ｎ−Ａｘｇ　−Ａｒｇ　−Ａ４！ａ　−Ｌｅｕ−ＩＬｅ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ムムーＧｊｎ−ＯＨをメタノール８
０ｓ／と１０％酢酸８０５８　ｑＯ）　Ｋ−８ｅｒ　−
Ａｓｐ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ　−Ｔｈｒ　−Ｈ
ｌｓ−８ｅｒ−Ｌｅｕ　−ＧＪｙ−Ａｓｎ−ムｒｐ−Ａ
ｒｇＡｌａ−Ｌｅｕ　　ＩＬｅ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−ム
Ｊｌａ　−Ｇｊｎ　−ＯＨを得る。

Ｈａｔ：ｏ、ｏｔ Ｒｆｉ：０．８７ 元集分析値（０，、Ｈｌ、、Ｎ、１０．、　・２０Ｈ，
０ＯＯＨ−７Ｈ，Ｏとして）（ｌｌ（Ｎ 計算値（％）　　４８．６４　７．６１　　１Ｔ、Ｔ２
実測値（％’）　　４８．１４　７．５０　１７．４８
゜〔α〕８″：　　−８５，７０（δ：０．２８　１Ｍ
ＯＨ，０ＯＱＨ）〈抗原の製造〉 参考例２ ペプチド合成参考例１−２０で得られるペプチド（以ト
ペブテドＡと略記する）　４．　！Ｓ　ｆ及びＢ８ム２
５ｍ’ｌ／を水４ｄに浴かす。仁の溶液に２００岬のジ
シクロヘキシル−カーポジイミド（ＤＯＯ）を加え室温
で５時間攪拌する。その後反応混合物を４８時間、４℃
で水２１で透析する。透析中す回水を交換する。その後
ペプチド−蛋白質複合体を含む溶液を凍結乾燥してヒト
ａ全インターフェロン抗原（以下［抗ｉｌｌと略記する
＞　２９．５岬を得る。

この抗ｉｆはＢ８ム１モルに対してペプチドＡが平均１
２モル結合したものである。

向上記においてペプチドとＢＳＡとの結合率は、次の通
り測定したものである。即ち上記で得られる抗原１をさ
らにセファデックスＧ−６０（溶出液：生理−食塩水、
検出：０Ｄ１１８０１１１１１、流出速度：８ｓＪ／時
間、分取量：１ｓＪずつ）でゲルー過し、ＢＳＡに結合
したペプチドムのフラクション（１）と他の生成体（ペ
ブチドムの２量体）のフラクション（１）とを分離し、
フラクション（１）を０．６％食塩水で４”Ｃ！、２４
時間透析後凍結乾燥して白色粉末状のペプチドＡ−Ｂ８
Ａ複合体（以下「抗原Ｉ」と略記する）を得る。この複
合体はＢ８１１モルに対してペプチドＡが平均１２モル
結合したものである。上記ゲ〃濾過では未反応のＢＳＡ
及びペプチドＡの存在が認められないことにより、ペプ
チドＡの２量体の標準濃度の検Ｊｌｉｌｉ！を作成し、
該検量線より上記フラクションのペプチドムの２量体の
量を求め、之を出発原料として用いたペプチドＡの皺か
ら差し引いて求めた値がすべてＢＳＡと結合していると
して計算したものである。

〈抗体の製造〉 参考例８ 抗原１２０μｆを１．５−の生理食塩水に溶解後これに
フロイントの補助液１．５　ｓＪを加えてａｔ製した懸
濁液を７羽の兎（２，６〜８．０＃）化皮下投与し、２
週間毎化６回同量投与する。更にその後１カ月毎に８回
、最初投与した量と同量を投与する。

最終投与後７日経過してのち試験動物から採血し、遠心
分離して抗血清を採取し、ヒトａ型インターフェロン抗
体（以下「抗体ｌ」と略記する）を得る。

〈標線ペプチドの製造〉 （転）参考例１−１９　（１））で得たＺ　−８ａｒ−
ムｓｐ　−Ｌａｕ−Ｐｒｏ　−Ｇｉｎ　−ＮＨＮＨＢｏ
ｏｌ、　０８　ｆをメタノール６０ｓＪに溶かし、パラ
ジウムを触媒として、接触還元して、Ｈ−８＊ｒ−ム−
ｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−ＮＨＮＢＪｉｂｄ＆得る。

ＩＩしｆ層　−０，０６ （ｂ）　　Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＮＨ８ｏ、　７９１を上記（
転）で得たＨ−ｇｅｒ−ムＩＩＩ　　ｌ５ｓｕ−１’ｒ
ｏ−ＮＨＮＨＢｏｏのＤＭＦ！ＯｓＪ湊液に加え、２０
時間室温で放置する。ＤＭ？を留去後、残渣を酢酸エチ
ルで抽出する。抽出液をＩＮ−クエン酸、飽和食塩水で
洗浄して、酢酸エチルを留去する。メタノール−酢酸エ
チルで再沈澱させて、６８８ｑのｚ　−’ｒｙｒ−８ｅ
ｒ−ムｌｉｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒ。

−〇１ｎ−ＮＨＮＨ！ｌｂｏを得る。

Ｒｆ＝０．６１ Ｒｆ＝０．６９ （０）　　上記Ｚ　−Ｔ）ｒｒ−８ｏｒ−ムａｐ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ　−ＮＨＮＨＢｏｏ　４４　
ＩｆをＤＭ７１１ｓＺ及び６Ｎ−塩酸／ジオキサン０．
０ｇ１ｔａｓ／に溶解し、−１６℃に冷却後亜硝酸イソ
アミル０．００６ｓ／を加え６分間攪拌する。

次いでトリエチルアミン０．０２６１！−を加え中和す
る。参考例１−１５で得たＨ−Ｔｈｒ　−ｆｆｉｓ　−
８ｅｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｊｙ−ムａｎ−Ａｒｙ−ムｒｙ−
ムムーＬｅｕ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌａｕ−ムムー
Ｇｊｎ　−ＯＨ２６ＷのＤＭＦＳｙｄ及びヘキサメチル
リン酸トリアミド２−の解故に上記の反応液を加え、４
０℃で２０時間攪拌する。さらにＺ−’Ｑｒ　−８ｅｒ
−ムａｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ　−ＮＨＮＨ
Ｂ〕ｃ　４４　ＩＩＩをアジド化したものを加えさらに
２４時間攪拌する。この溶媒を留去して残渣をブタノー
ル−水で抽出し、エーテルを加え、析出する結晶を沖取
する。

得られたＺ　−Ｔｙｒ−８ｅｒ−ムａｐ　−Ｌｅｕ　−
Ｐｒｏ　−Ｇｊｎ　−Ｔｈｒ−辻Ｌａ　−８ｏｒ　−Ｌ
ｅｕ−ＧＪｙ−ム８ｎ−ムｒｇ−ムｘｇ−ム１ａ−Ｌｅ
ｕ　−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−ム１ａ−Ｇｊｎ　
−ＯＲをメタノール８０ｇ／に溶かし、パラジウムを触
媒として接触還元する。触媒を枦去、メタノールを留去
して得られまた残渣をセファデックスＧ−２５（溶出液
６０％酢酸）続いて１．Ｈ−２０（＃出液’／１００　
ＯＮ塩酸）で精製して１８１ＦのＨ−Ｔｙｒ　−８ｅｒ
−人ｉｐ　−Ｌａｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｉｎ　−Ｔｈｒ　
−Ｈｌｓ　−８ｏｒ−Ｌｅｕ　−Ｇｊｙ　−Ａｓｎ−ム
ｒｇ−Ａｒｙ−ム１ａ−Ｌｅｕ−ＩＬｅ　−Ｌｅｕ　−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＯＨを得る。

Ｒｆ＝０．０１ Ｒｆ＝０．８８ 黛−− （α）　　−−７７，８８（８０，２２１ＭＯＨ，０Ｏ
ＯＨ）（イ）　上１で得たＨ−Ｔｙｒ−８ｅｒ　−Ａｓ
ｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｈ１＠−
８ａｒ−Ｌｅｕ　−Ｇｊｙ　−Ａｓｎ−Ａｒｆ−＾ｒｆ
／−ＡＪａ−Ｌｅｕ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｊａ
−Ｇｊｎ−ＯＨをクロラミンＴを用いる方法で標識化す
る。即ち上記ペプチド６μｆの０．６Ｍ−リン酸塩緩衝
液（ｐＨ＝１．０’）２０ｐｌにＮａ　（１２６１）　
（０ａｒｒｉｅｒ　ｆｒｅｅ　＊Ｎ、Ｅ、Ｎ　）　Ｉ　
Ｖ　４りｏ　４　ニー９−（７）　０．６　Ｍ−リン酸
塩緩衝液を加え、次にクロラミンＴ７０＃／ｇ／の０．
６Ｍ−リンｆｌＩ塩Ｗｊ！衝液２０μｌを加える。室温
で８０秒間攪拌して、６０１！ＩＦ／ｓ／のメタ重亜硝
酸ナトリウムの０．６Ｍ−リン酸塩緩衝液６０μｍを加
えることで反応を終わらせる。次いで反応液に１％の冷
ヨウ化ナトリウム水溶液を１００μ！　加える。反応混
合物をセファデックスＧ−２６のカラム（１，０Ｘ８０
３）にかける（溶出液０．２５％Ｂ８Ａ、１０ｍｎＭＦ
）ＤＴＡ及び０．０２％ＮａＮ、を含む０．０ｂモルリ
ン酸塩緩衝液、ｐＨ７，４）。第１８と１４フラクシヨ
ンとして１！Ｉｉ■で標識された上記ペプチドを得る。

◇力価の測定 上記で得られる抗体Ｉの力価を次の通り測定する。即ち
抗体を生理食塩水で１０，１０”、１０”、１０４．１
０６・・・・・・倍に希釈（イニシャル）シ、これらの
夫々１００μｌに、１１！５榛識ペプチド（上記で得ら
れる標線ペプチドを約９．６００　ｃｐｍになるように
希釈したもの）０．１譚ｌ及び０．０６モルリン酸塩緩
倫液（ｐＨ＝７．４　）　（０，２６％Ｂ８１１１０ミ
リモル］ＣＤ’ｌ’Ａ及び０．０２％ＮａＮ＠　　を含
む〕０．２露ｌを加え、４℃で２４時間インキュベー１
し、生２５ 成した抗体とＩ　　　１１ｍ１ｔ抗原との結合体を、デ
キストラン−活性炭法及び遠心分離法（４°Ｃ１８０分
間、８０００ｒｐｍ）により未反応（結合しない）２ａ ■　　標識ペプチドから分離し、その放射線を力１！１
５ ラントし、各希釈濃度における抗体のＩｔＩＡｍｌペプ
チドとの結合率Ｃ％）を測定する。縦軸に抗体の２６ Ｉ　　橡鵬ペプチドとの結合率（至）及び横軸に抗体の
希釈倍率（イニシャル濃度）をとり、各々の一度におい
て結合率をプロットする。結合率が５０％となる抗体の
希釈倍率即ち抗体の力価を求めるとｔ８ｏ、ｏｏｏ　で
あった。

◇抗体のヒトａ型インターフェロン特異性試験供試試料
として各槍濃度のヒトβ型インターフェロン（東京都総
合臨床研究所製、比活性８Ｘ１０’　”／、プロティン
）、ペブチドム及びヒトα型インターフェロン（体厚研
究所製、Ｌｙｍｐｈｏ　ｂｌａｇｔｏｉｄＩｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ　％Ｌｏｔ、　Ｎｏ、　８００９２８及びカン
チル（０ａｎｔ、ｅｌ　）社製）を使用する。また標準
希釈剤として０．２５％Ｂ８Ａ、５ミリモルｌｌＤ’ｌ
’ム及びｏ、ｏｇ％のＮａＮ１　　を含む０．０６モル
リン酸塩緩緩衝液ｐＨ７，４）を使用する。

各々の試験管に、標準希釈剤０．２　ｄ　、供試試料ｏ
ｔＩ＃ｔ、参考例８で得た抗体Ｉ　Ｏ，Ｉ　Ｗ！（力価
２６ ＩＨ，０００）及びＩ　　標識ペプチド（上記で得られ
る＊ｍペプチドを約２．８００　ｏｐｍになるように希
釈したもの）　０．１１１ｄを入れ、４℃で７２時間イ
ンキュベートした後、ノーマルブタ血清（ｎｏｒｍａｌ
ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　）をｏ、　ｔ　ｓＺ加え
、次いでデキストランで被膜した活性炭の懸濁液０．６
ｄを加え、４℃で８０分間放置し、次に４℃、８０００
　ｒｐｍ　　の条件下に８０分間遠心分離を行ない、抗
体と１１２６欅−ペプチドとの結合体及び未反応（結合
しない）２ｂ Ｉ　　標識ペプチドを分離し、その放射線をカウントし
、用いた抗体の力価に相当する結合率（Ｂｏ）を１００
％として、各供試試料の濃度及び希釈率１２５ における抗体とＩ　　標識ペプチドとの結合体Ｑ３）の
百分率を求める。得られる結釆をＮ１図に示す。

＃１１図中縦軸は結合％（／Ｂｏ×１００）を、横軸は
供試試料（ペプチドＡ１ヒトβ型インターフェロン及び
ヒトａｆＪ＆インターフェロン）の濃度をホす。また該
図において曲線（イ）はペプチドＡを、曲線（ロ）はヒ
トα型インターフェロン（カンチル社製）を、曲線（／
−＋はヒトα型インターフェロン（井原研究所製）を、
曲線に）はヒトβ型インターフェロンを夫々示す。第１
図より抗体１は、ヒトβ型インターフェロンに対する反
応性とヒトβ型インターフェロンに対する反応性におい
て明確に区別される曲線を示し、このことよりヒトβ型
インターフェロンとはｌｉ、７Ｘ１０　ユニット／ｄま
で交叉しない特異性の高い抗体であることが判る。

実施例１ ペプチド人１１ｖとＦＩ’Ｉ’０１１ｖを０．２　Ｍ　
−＊つ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）にだ解する。

室温で１時間反応後シリカゲル’ｆ’ＬＯ（溶出液：ブ
タノール：酢酸：水＝４　：　１　：　５　）にて分離
する。

スポットを集め、メタノール、次いでエタノールで洗浄
後、上記緩衝液（ｐＨ７，８）で溶、串して、。

ＦＩ’Ｉ’Ｏ標鴎ペプチド０．８ｑを得る。

Ｒｆｌ値＝０．１１ Ｒｆ菖値＝　０．５　０ 元素分析値（Ｏｌｌ、Ｈｌ、４Ｎ、、０．４８１−２０
Ｈ，０ＯＯＨ−７ＩＩ、０として）ＯＨＮ 計算値（％’）　　６０．７？　　　６．９６　　１６
．７９分析値（％）　　４９．９９　　６．８６　　１
５．６０実施例２ ペプチドＡ１１ｌＦを０．２Ｍ−重炭酸ナトリウム緩衝
［（ｐＨ９，５）　１　ｍｔｌｃｌｄｌｆｔ　ル。’ｌ
’ＲＩ’ｌ’０１　Ｗ＋１−の上記ＳｔＷ液に溶解して
、上記溶液と０℃にて混合する。室温で１時間反応後シ
リカゲル’Ｉ’ＬＯ（溶出液：ブタノール：酢酸：水＝
４：１：５）にて分離する。スポットを集め、上記緩衝
液で溶出して’Ｉ’ＲＩＴＯ標織ペプチド標識Ｉｖを得
る。

Ｒｆｌ値　０．０８ 元ＩＡ分析値（０１，ｏＩＩ、ａ４Ｎ、４０．Ｎ８−２
０Ｈ，０ＯＱＨ−７Ｈ１０トＬｒ　）ＯＨＮ 計算値（％）　　５１，１９　　７．１４　　１６．８
７分析値（％）　　５０．０８　　７．０！　　　１６
．１９実施例８ （ａ）　　蛍光標識ペプチドｆａ１め調製実施例１で得
たＦＩＴＯ標謙ペプチドを、０．９Ｗ／、％Ｎａ０Ｊ　
及ヒ０．０５Ｗ／、％Ｂ　８　Ａヲ含ム０．１Ｍ−リン
酸ナトリウム緩術液（Ｈ＝７）に溶解し、濃度を８×１
０″Ｍに＊＊する。（これを以下「ム液」とする） （ｂ）　　蛍光機織ペプチド溶液のブランク蛍光標識ペ
プチドを含まない事以外は、上記Ａ液と一一の組成の液
を調製する。（これを以下「Ｂ液」とする） （ｏ）　　抗体溶液の調製 参考例８で得た抗体Ｉを生理食塩水で１６０倍に希釈し
て得る。（これを以下「Ｃ液」とする）（ｄ）　　希釈
液の調製 Ｈ，Ｂｏ、　　９．８　９　　Ｉｌｌ　　１　　Ｎａ、
ｌ１４０．−　１０Ｈ，０４，Ｊｌ　　２ｆｌ／ｌ。

Ｎａ０１９　ｆ／Ｉｔ　、　ＮａＮ１　ｏ、　００６　
”／、％及（ｉＢＢＡｏ、　ｏ　ｔ　ｗ／、％を含むｐ
Ｈ７，８の希釈液を調製する。

（これを以下「ｐ液」とする） （ｅ）　　標準希積系列のｍ製 ■　ペプチド人を０．９　Ｗ／％Ｎａ０ｊ　及び０．０
５ｖ／ｖＶ ％Ｂ８Ａを含む０．１　Ｍ−リン酸ナトリウム緩鈎液（
ｐＨ＝６．５）に溶解して５μＩＡ＃ｔの濃度にＭ４製
する。これを上記のＤＨで希釈してペプチドＡの濃度が
５００．２５０．１２６．６２．５．８１．２６．１６
，６．７．８．８．９．１．９５．０．９２５．０．４
６８、Ｏｎｙ／ｍｌとなる希釈系列を調製する。

■　ヒトａ型インターフェロン（カンチル社＆Ｊ）を用
いて、上記■と同様にしてｌＸｌ０’、０．５Ｘ１０−
０．２５Ｘ１０・、０．１２５Ｘ１０’、０．０６８Ｘ
１０’、０．０８１Ｘ１０・、０．０１６Ｘ１０＠、ｏ
、ｏｏａｘｔｏｓ、Ｏ”ｓｌの希釈系列を調製する。

（ｆ″）偏光度Ｐ値の測定 （ｅ）−■で調製した希釈系列の各々０．２謬ｌにＡ液
０．０５ｓｔ、０液０．１　ｗ、を及びＤ液０．６５ｍ
を加えてペプチドＡのサンプルを作成する。Ａ液の代り
にＢ　Ｗｉ！ｉ　０．０５　ｍｌを用いる事以外は全く
同様にしてペプチドＡのリファレンスサンプルを作成す
る。

上記と同様にして（ｅ）−■で調製した希釈系列より、
ヒトａ型インターフェロンのサンプル及びリファレンス
サンプルを作成する。

更にＡ液０．０５　ｍｌ及びＤ液０．９５薦ｌを混合し
て、抗体のブランクサンプル、Ｂ液０．０５ｍ／及びＤ
液０、９５　ｍｌを混合して抗体のブランクリファレン
スサンプルとした。

これらの各サンプル及び各リファレンスサンプルを、各
々４℃で１２時間インキュベート後、（蛍光−光強度測
定装置により）蛍光偏光成分を測定した。それぞれの希
釈系列及びブランクにおいて、下記式より偏光度Ｐ値を
算出した。

（Ｉｖｓ−ＩｖｉＬ）−（ＭＨＩ−Ｉｎｎ　）（Ｉｖｓ
−Ｉｖｉｚ　）　＋　（ＩＨＩ−Ｉｎｎ　）（式中、Ｉ
ｖｉ　　はサンプルの重直蛍光倫光強度、ＩＨｌｉ　　
はサンプルの水平蛍光偏光強度、Ｉｖｉｚ　はリファレ
ンスサンプルの真直蛍光偏光強度、ｊａｎ　はリファレ
ンスサンプルの水平蛍光偏光強度を示す。） 結果を第２図に示す。該図より、Ｐ値の変化鰍の半分に
相当する濃度はペプチド人について０．７９ツ／Ｔｕｂ
ｅ　ｓ　ヒトａ型インターフェロンについて７、２　Ｘ
　１０’　Ｕ／Ｔｕｂｅであり、両者の比９１Ｕ／ｐｆ
が交差率として得られた。

ヒトａ型インターフェロンの濃度未知の試料について、
同様にＰ値を測定して、第２図より、力価の測定ができ
た。

【図面の簡単な説明】

＃Ｉ１図は参考例８で得た抗体のヒトａ型インターフェ
ロンに対する特異性を示すグラフであり、第２図は本発
明の蛍光偏光解消法により求められた偏光度Ｐ値を示す
グラフである。 （以上） 第２図 一５７ロー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　一般式 ％式％ 〔式中Ｒは蛍光色素を示す。〕 で表わされる蛍光標識ペプチド。 ■　一般式 ％式％ 〔式中Ｒは蛍光色素を示す。〕 で表わされる蛍光標識ペプチドを用い蛍光偏光解消法に
   よりヒトα型インターフェロンを測定することを特徴と
   するヒトα型インターフェロンの測定法。