JPH04230855A - ポリ塩化ビフェニルの検出用試薬および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般にポリ塩化ビフェ
ニルに関する。さらに詳しくは、試料中のポリ塩化ビフ
ェニルの存在または量を検出するための試薬およびイム
ノアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
、試料中のポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の存在また
は量を検出するために環境保護局（ＥＰＡ）により承認
されている方法（ＥＰＡ法６０８、ＳＷ８４６法８０８
０）は、該試料をヘキサンや塩化メチレンなどの有機溶
媒で抽出し、ついで電子捕獲検出器（ＥＣＤ）を備えた
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて抽出物を分析
することを含んでいる。もっと厳しい試料の前処理、た
とえば硫酸を用いた洗浄、水銀脱硫、またはケイ酸マグ
ネシウム［フロロシル（Ｆｌｏｒｏｓｉｌ）、アルドリ
ッチ・ケイミカル、ミルウオーキー、ＷＩから入手可能
］またはアルミナ上での精製なども時に必要とされる。 この方法で直面する問題は、分析法に本来的なものであ
る。ＧＣ／ＥＣＤは一度に一つの試料しか分析できず、
試料当たり４０〜６０分必要である上、試験を行い装置
を維持するには高度に訓練された技術者が必要であるた
め、上記方法は時間がかかり、費用がかかる。

【０００３】ＰＣＢｓを検出するための種々のラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡｓ）が報告されている。たとえば
、市販のＰＣＢｓ混合物であるアロクロル（ａｒｏｃｌ
ｏｒ）１２４２、１２４８および１２５４を検出するた
めのラジオイムノアッセイが、ラスター（Ｍ．Ｉ．Ｌｕ
ｓｔｅｒ）らのＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９７９、５０
、１４７〜１５５に報告されている。この方法では、３
つの免疫原を用いてウサギ中で抗血清を産生させ、ハプ
テンである４−アミノ−４’−クロロビフェニル、２−
アミノ−４，５，３’，４’−テトラクロロビフェニル
および３−アミノ−２，６，２’，６’−テトラクロロ
ビフェニルをアジポアミドリンカーアームによりウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）およびチログロブリンに結合さ
せ、この方法で使用する１２５Ｉトレーサーは、上記ハ
プテンの５−ブロモバレルアミド誘導体から調製した。 標準試料で１〜３ｎｇの最小感度が報告された。これら
アロクロルの鉱油中の混合物を検出することができるこ
とが示された。

【０００４】ラジオイムノアッセイによる乳汁および血
液中のＰＣＢｓの検出は、ニューサム（Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ
ｓｏｍｅ）およびシールズ（Ｊ．Ｂ．Ｓｈｉｅｌｄｓ）
のＩｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，１９８１、１０、２９５〜３０４に報告されて
いる。このアッセイ法に用いられるハプテンは２−アミ
ノ−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニ
ルである。抗血清は、該ハプテンに対するスクシンイミ
ド連結アームを用いてウサギ中で産生させ、ラジオトレ
ーサーは２−［１２５ヨード］−２’，４，４’，５，
５’−ペンタクロロビフェニルであった。アロクロル１
２６０に対して報告された最小感度は０．１ｎｇであっ
た。アロクロル１２５４について報告された感度は同様
であったが、より低級のアロクロルは同じ感度では検出
されなかった。

【０００５】スターク（Ｓ．Ｓｔａｒｋ）らの米国特許
第４，４５６，６９１号には、アミノ化し、ジアゾ化し
、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させたアロクロ
ル１２５４を用いてＰＣＢｓに対するポリクローナル抗
体を調製することが教示されている。この抗血清は、Ｒ
ＩＡにより評価された。

【０００６】ラジオイムノアッセイは感度の良い結果を
もたらすことが知られている。しかしながら、上記方法
では通常、一層高度の技術熟練者が要求され、他のイム
ノアッセイ法に比べて繁雑であり、一層高価な装置が必
要であり、放射能物質の取り扱いを含んでいる。

【０００７】アロクロル１２２１、１２３２、１２４２
、１０１６、１２４８、１２５４および１２６０を単一
のアッセイで検出するのに使用することのできるアッセ
イを提供することが有利である。また、放射性同位元素
を用いないアッセイを提供することも有利である。さら
に、ＥＰＡ法と同様の試料調製物を利用するが、試料中
のＰＣＢｓの存在または量を一層迅速かつ自動システム
において検出し得るアッセイを提供することも有利であ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のポリ
塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）を含む分析対象物の存在ま
たは量を検出するための方法を提供する。本発明の方法
は、検出可能な残基で標識した既知濃度のトレーサーお
よび既知濃度の分析対象物特異的抗体を該試料に加えて
混合物とし、標識トレーサー−抗体複合体および分析対
象物−抗体複合体を生成するのに充分な条件および時間
で該混合物をインキュベートし、ついで該生成したトレ
ーサー−抗体複合体の存在または量を測定して試料中の
分析対象物の存在または量を測定する、ことを特徴とす
る。抽出工程を試料において行ってもよい。好ましい検
出可能な残基は、フルオレセインまたはフルオレセイン
誘導体である。生成した複合体は、蛍光偏光イムノアッ
セイにより測定する。本発明の方法はまた、ＰＣＢｓま
たはＰＣＢｓトレーサーのタンパク質への非特異的結合
を減少させるための化合物を該混合物と接触させる工程
をも包含する。

【０００９】本発明はまた、ハプテン化合物、トレーサ
ー化合物（本発明の方法において試薬として用いられる
）、抗体を産生させるための免疫原化合物（本発明の方
法において試薬として用いられる）、ＰＣＢｓおよびＰ
ＣＢｓトレーサーの非特異的結合を減少させるのに有用
な化合物、および本発明の方法に使用するキットを提供
する。

【００１０】本明細書においては下記定義を採用する。 本明細書において「抗原決定基」とは、抗原と抗体との
間の特異的結合反応に関与する抗原領域をいう。本質に
おいて、抗原を識別するもの、それゆえ免疫学的特異性
に基づいて抗体を互いに識別するものは抗原決定基であ
る。

【００１１】本明細書において「試料」とは、目的とす
る分析対象物の存在または量を試験するために使用する
試料をいう。該試料は、液体または固体の形態であって
よく、土壌試料、油試料、水試料、およびＥＰＡ法６０
８、ＳＷ８４６法８０８０に記載された他の試料を含む
。

【００１２】本明細書において「分析対象物」とは、そ
れに対して抗体などの結合成分を得ることができるかま
たは生成することのできる分子をいう。本発明において
目的とする分析対象物は、下記式：

【化７】 で示されるポリ塩化ビフェニル化合物である。上記式中
、ｘは０〜５であり、それゆえ、モノクロロビフェニル
からデカクロロビフェニルまでの同族化合物を包含する
。そのような分析対象物は、一般に約５０〜約４０００
ダルトン、より好ましくは約１００〜約２０００ダルト
ンの範囲の低分子量のタンパク質不含化合物である。 そのような分析対象物は、動物中に注射したときに抗体
生成を引き起こさないが、抗体とは反応性である。

【００１３】本明細書において「分析対象物類似体」と
は、目的とする分析対象物の１または２以上の抗原決定
基と実質的に同じ空間構造および極性構造を有する分子
をいう。そのような分析対象物類似体は、一般に約５０
〜約４０００ダルトン、より好ましくは約１００〜約２
０００ダルトンの範囲の低分子量のタンパク質不含化合
物である。このように１または２以上の抗原決定基が重
複しているため、分析対象物類似体は、抗体などの分析
対象物特異的結合成分上の結合部位に対して試料中の分
析対象物と競合し得る。加えて、分析対象物類似体は、
分析対象物特異的結合成分への結合に必要な抗原決定基
を保持しながら、分析対象物と同一ではないように修飾
することができる。

【００１４】分析対象物類似体の抗原決定基の構造は、
分析対象物の抗原決定基と同一である必要はない。分析
対象物類似体が適当な抗原決定基を実質的に重複させて
おれば充分である。それゆえ、分析対象物特異的結合成
分（すなわち、抗体、レセプター、ヌクレオチド配列な
ど）が上記実質的に重複した抗原決定基を認識し結合す
ることができる限り、分析対象物とは異なる化学基、ア
ミノ酸またはヌクレオチドを含有するいかなる分子であ
ってもよい。

【００１５】本明細書において「分析対象物特異的結合
成分」とは、分析対象物に特異的に結合する抗体やレセ
プターなどの成分をいう。そのような分析対象物に対す
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、一
般に、まず該分析対象物または分析対象物類似体をタン
パク質担体に結合させ、ついで該結合体を動物中に注射
することにより産生させる。得られた抗体は、通常のよ
く知られた抗体単離法により単離することができる。

【００１６】本明細書において「トレーサー」とは、下
記で説明する検出可能な残基で標識した分析対象物また
は分析対象物類似体をいう。検出可能な残基は、該トレ
ーサーのシグナル生成成分である。

【００１７】本発明の方法に従い、目的の分析対象物を
含有していると思われる試料を、標識トレーサーおよび
該分析対象物および該トレーサーに特異的な抗体と混合
し、ついでインキュベートする。試料の調製は、ＥＰＡ
法６０８、ＳＷ８４６法８０８０に記載されているよう
に、ヘキサンや塩化メチレンなどの有機溶媒で抽出する
などのＥＰＡ承認抽出法に従って行うこともできる。試
料中に存在するあらゆる分析対象物およびトレーサーは
、抗体上の限られた数の結合部位に対して競合し、その
結果、分析対象物−抗体複合体およびトレーサー−抗体
複合体を生成する。トレーサーおよび抗体の濃度を一定
に保つことにより、トレーサー−抗体複合体に対する分
析対象物−抗体複合体の生成比は試料中に存在する分析
対象物の量に正比例する。

【００１８】好ましい検出法は、蛍光偏光法である。こ
の方法において試料中の分析対象物の量の決定は、上記
混合物を偏光で励起し、遊離のトレーサーおよびトレー
サー−抗体複合体から放出される蛍光の偏光を測定する
ことにより行う。抗体と複合体を形成しなかったトレー
サーは、蛍光の吸収および再放出に必要な時間よりも短
い時間で回転することができる。その結果、再放出され
た光は比較的ランダムな方向を向いており、それゆえ抗
体と複合体を形成しないトレーサーの蛍光偏光は低く、
０に近付く。特異的抗体と複合体を形成すると、かく形
成されたトレーサー抗体複合体は抗体分子の回転（比較
的小さなトレーサー分子の回転よりも小さな回転）を引
き受け、それゆえ観察される偏光は増大する。従って、
分析対象物が抗体部位への結合についてトレーサーと競
合する場合には、観察される蛍光の偏光は遊離のトレー
サーとトレーサー−抗体複合体との間の値になる。

【００１９】試料が高濃度の分析対象物を含有しておれ
ば、観察される偏光値は遊離のトレーサーの偏光値に近
付く、すなわち低くなる。分析対象物が低濃度の分析対
象物を含有している場合は、偏光値は結合トレーサーの
偏光値に近付く、すなわち高くなる。イムノアッセイの
反応混合物を垂直偏光および水平偏光で順番に励起し、
放出される光の垂直成分のみを分析することにより、反
応混合物における蛍光の偏光を正確に決定することがで
きる。測定しようとする分析対象物の濃度と偏光との間
の正確な関係は、既知濃度を有するカリブレーターの偏
光値を測定することにより確立される。分析対象物の濃
度は、このようにして得られた標準曲線から内挿するこ
とができる。

【００２０】本発明のイムノアッセイ法は均一アッセイ
であり、その意味するところは、結合トレーサーを遊離
のトレーサーから分離していない溶液で最終的な偏光の
読み取りを行うということである。この点は、読み取り
を行う前に結合トレーサーを遊離トレーサーから分離し
なければならない不均一イムノアッセイに対する顕著な
利点である。

【００２１】本発明の方法を行うに際して、化学発光分
子、発光性分子、酵素、および当業者に知られた他の検
出可能な残基などの検出可能な残基を用いることができ
る。本発明において好ましい検出可能な残基は、発光性
分子であるフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体
である。分析対象物類似体を標識してトレーサーを形成
するのに使用する蛍光分子の選択は有利にも融通のきく
ものであり、通常の実施者の選択に実質的に基づいてい
る。蛍光標識がそのサイズに従って理想的に選択される
こと、すなわち、分子が小さければ小さいほど一層急速
に回転することができ、それゆえ蛍光偏光イムノアッセ
イ（ＦＰＩＡ）のトレーサー成分として一層有効になる
であろうということは容易に理解されるであろう。これ
ら化合物は、適当な波長の偏光で励起したときに蛍光応
答をもたらし、それゆえ蛍光偏光測定が可能となる。

【００２２】本発明に使用することのできるフルオレセ
イン誘導体の例としては、フルオレセインアミン、カル
ボキシフルオレセイン、α−ヨードアセトアミドフルオ
レセイン、４’−アミノメチルフルオレセイン、４’−
Ｎ−アルキルアミノメチルフルオレセイン、５−アミノ
メチルフルオレセイン、６−アミノメチルフルオレセイ
ン、２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−
イル−アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、４−クロロ
−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル−
アミノフルオレセインおよびフルオレセインイソチオシ
アネートなどが挙げられる。特に好ましい誘導体は、ア
ミノメチルフルオレセインおよび５−カルボキシフルオ
レセインである。

【００２３】フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）
に依存して２つの互変異体で存在する。開環（酸）形で
は、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体（また
は蛍光分子を含有するトレーサー）は、約４ナノ秒の励
起状態寿命の後、青色の光を吸収し緑色の蛍光を放出す
ることができる。開環形と閉環形が共存する場合は、開
環形と閉環形の分子の相対濃度はｐＨレベルの調節によ
り容易に変えることができる。一般に、本発明のトレー
サーはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩など
の生物学的に許容し得る塩として溶液中に存在するので
、該化合物は開環形、すなわち蛍光形で存在する。存在
する特定の塩は、ｐＨレベルを調節するのに使用した緩
衝液に依存する。たとえば、リン酸ナトリウム緩衝液の
存在下では、本発明の化合物は一般にナトリウム塩とし
て開環形で存在する。

【００２４】本明細書において「フルオレセイン」とは
、個々の化合物としてかまたはトレーサーの成分として
のいずれかにおいて、蛍光の文脈で記載する場合（その
場合は、蛍光が起こるため開環形であることが必要）を
除き、開環形および閉環形の両方の互変異体を包含する
（それら化合物が特定の分子として存在するならば）。

【００２５】本発明に従って調製した特別のトレーサー
は、下記実施例で詳細に説明するように良好なアッセイ
結果が得られることがわかった。本発明に従って測定す
ることのできる分析対象物の濃度は約１０−６〜約１０
−１０Ｍである。一層高濃度の分析対象物は、試料を希
釈することにより測定することができる。試料中の分析
対象物の濃度範囲によりトレーサーや抗体などの試験試
薬の濃度範囲が決定されるであろうが、個々の試薬の濃
度はアッセイ感度を最適にするため経験的に決定される
。 トレーサーおよび抗体の適当な濃度は、当業者により確
認することができる。

【００２６】抗体を産生させるための免疫原として、お
よび／またはトレーサーの分析対象物類似体として使用
するため、ポリ塩化ビフェニルに類似の構造を有するハ
プテンを調製する。ポリ塩化ビフェニルに属する化合物
には２０９の同族体が可能であるので、下記構造のＰＣ
Ｂ同族体を選択してハプテンをこれら同族体に類似する
ように選択した。

【化８】

【００２７】上記ポリ塩化ビフェニルは、市販のアロク
ロル混合物中に存在する一層著名な同族体のうちの幾つ
かから選んだ４つの同族体である。アッセイに使用した
ときに同様の挙動を示す他の著名な同族体を上記ＰＣＢ
に属する化合物から選択することは当業者がなし得るこ
とである。

【００２８】クロロ基をアミノ基または水酸基で置き換
えることにより、上記同族体に似せてハプテンを調製し
た。これら両置換基はクロロ基と類似のサイズを有し、
クロロ基と類似の孤立電子対を保持している。アミノ置
換またはヒドロキシ置換したＰＣＢ同族体を、下記反応
式（Ｉ）に従い標準法で調製した。

【００２９】反応式Ｉ：

【化９】 下記反応式（ＩＩ）に従い、上記アミノ置換またはヒド
ロキシ置換ＰＣＢ同族体にリンカーアームを付加した。

【化１０】

【００３０】上記式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を
含む０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽
和または不飽和の直鎖または分枝鎖からなるスペーサー
基であり（ただし、２個以下のヘテロ原子が連続して連
結し分枝は炭素原子上でのみ起こる）；Ｂは−ＣＯ２Ｈ
、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、および−ＯＨよりなる群から選
ばれた連結基であり；ＸはＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＣＨ
３ＳＯ３−、式：

【化１１】 で示される基、ＣＦ３ＳＯ３−、および式：

【化１２】 （式中、Ｙは式：

【化１３】 で示される基、または当業者に知られた他の認められた
カルボキシル活性化基である）で示される基よりなる群
から選ばれた基である。

【００３１】Ａが炭素原子のみを含む場合は、Ａは炭素
数が１〜１０であるのが好ましい。適当なヘテロ原子と
しては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。た
とえば、Ａが窒素および酸素を含む場合は、Ａは−ＣＨ
２ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−であってよい。２個を越える
ヘテロ原子が連続した化合物は安定性に欠けるように思
われる。

【００３２】別法として、アミノ置換ＰＣＢ同族体は、
下記反応式（ＩＩＩ）に従い、直接活性化することがで
きる。 反応式（ＩＩＩ）：

【化１４】

【００３３】ハプテンは、所望の抗原決定基と実質的に
類似の化学基を含む側鎖を有する化合物を製造するため
に当業者に知られた方法に従って調製する。ついで、こ
れら化合物またはその誘導体をポリ（アミノ酸）担体ま
たは蛍光分子に結合させる。

【００３４】本発明で使用する抗体は、下記免疫原の一
つに対する応答を動物で引き起こすことにより調製した
。免疫原を注射し、適当な抗体を当業者によく知られた
方法に従って選択した。下記実験では免疫宿主としてウ
サギおよびマウスを使用したが、該免疫原に対する抗体
を産生し得るあらゆるインビボ宿主を使用することがで
きる。これら抗体は、試料中に存在するＰＣＢｓおよび
トレーサーと結合する。

【００３５】免疫原は、広範囲のＰＣＢ誘導体から調製
することができる。本発明の免疫原は、下記構造式のい
ずれかを有する。

【化１５】 上記式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を含む０〜５０
個の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽和または不飽
和の直鎖または分枝鎖であって、２個以下のヘテロ原子
が連続して連結し分枝は炭素原子上でのみ起こるものか
ら選ばれるスペーサー基；Ｍは＞Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ
−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から
選ばれた連結基；Ｑは免疫原性担体である。

【００３６】ポリ（アミノ酸）免疫原性担体としては、
種々のタンパク質担体を用いることができる。適当な免
疫原性担体としては、アルブミン、血清タンパク質（た
とえば、グロブリンなど）、眼レンズタンパク質、リポ
タンパク質などが挙げられる。具体的なタンパク質担体
の例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵アルブミン
、チログロブリンおよびウシガンマグロブリンなどが挙
げられる。また、適当に誘導体化したリポ多糖（ＬＰＳ
）または合成ポリ（アミノ酸）を用いることができる。

【００３７】本発明の免疫原において、カルボキシ基含
有ＰＣＢハプテンとタンパク質担体上のアミノ基との間
の化学結合を当業者に知られた種々の方法を用いて形成
することができる。アミド結合を形成するのがしばしば
好ましい。アミド結合を形成するには、まず１，３−ジ
シクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化試薬および
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの添加剤と反応させ
ることによりＰＣＢハプテンのカルボン酸残基を活性化
させる。この活性化したハプテンを、ついで担体タンパ
ク質を含有する緩衝溶液と反応させる。別法として、カ
ルボン酸ハプテンを単離しまたは単離することなく、高
度に反応性の混合酸無水物、アシルハライド、アシルイ
ミダゾリドまたは混合炭酸塩に変換した後、担体タンパ
ク質と混合してもよい。当業者であれば、これら以外に
もアミド結合を形成させるために使用する多くの試薬が
あることが明らかであろう。

【００３８】末端アミン官能基を有するＰＣＢハプテン
は、アセトニトリルやジメチルホルムアミドなどの適当
な溶媒中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート
と反応させることにより、高度に反応性のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドウレタンに変換することができる。得
られたウレタンを、ついで緩衝水溶液中の担体タンパク
質と反応させて免疫原を得る。

【００３９】末端アルデヒド官能基を有するＰＣＢハプ
テンは、当業者に知られた方法に従って還元的アミノ化
により、水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下、緩衝
水溶液中で担体タンパク質に結合させることができる。

【００４０】アルコール基を含有するＰＣＢハプテンを
担体タンパク質に結合させるには、まずホスゲンまたは
ジホスゲンもしくはトリホスゲンもしくはカルボニルジ
イミダゾールなどのホスゲン等価物と反応させて高度に
反応性のクロロホルメートまたはイミダゾロホルメート
誘導体を生成させる（通常、分離させることなく）。得
られた活性ホルメートエステルを、ついで緩衝水溶液中
の担体タンパク質と反応させて免疫原を得る。

【００４１】本発明の好ましいトレーサーは、種々のＰ
ＣＢ誘導体から製造することができ、下記に示される一
般式を有する。

【化１６】 上記式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を含む０〜５０
個の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽和または不飽
和の直鎖または分枝鎖であって、２個以下のヘテロ原子
が連続して連結し分枝は炭素原子上でのみ起こるものか
ら選ばれるスペーサー基；Ｍは＞Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ
−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓから選ばれた連
結基；Ｆｌは検出可能な残基、好ましくはフルオレセイ
ンまたはフルオレセイン誘導体である。本発明において
は、基ＡとＭが一緒になって０〜１２個の炭素原子およ
び上記ヘテロ原子からなるのが好ましい。

【００４２】アミノ基かまたはカルボキシル基を含有す
るＰＣＢハプテンをフルオレセインまたはフルオレセイ
ン誘導体に結合して本発明のトレーサーを調製すること
ができる。末端カルボキシル基を有するＰＣＢハプテン
は、まず１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドなど
の活性化試薬およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなど
の添加剤と反応させて該ＰＣＢハプテンのカルボン酸残
基を活性化することによって、アミノ末端フルオレセイ
ン誘導体に結合させることができる。得られた活性形の
ハプテンを、ついでフルオレセイン誘導体の溶液と反応
させてトレーサーを生成させる。別法として、カルボン
酸ハプテンは、単離しまたは単離することなく、高度に
反応性の混合酸無水物、アシルハライド、アシルイミダ
ゾリドまたは混合カーボネートに変換し、ついで担体タ
ンパク質に結合することもできる。当業者であれば、こ
れら以外にもアミド結合を生成するのに使用することの
できる多くの試薬が存在することは明らかであろう。

【００４３】末端アミン官能基を有するＰＣＢハプテン
は、アセトニトリルやジメチルホルムアミドなどの適当
な溶媒中、Ｎ，Ｎ’，−ジスクシンイミジルカーボネー
トと反応させることにより高度に反応性のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドウレタンに変換することができる。ま
たは、反応式（ＩＩＩ）に従い、アミノＰＣＢハプテン
をイソシアネートに活性化することもできる。ついで、
得られた生成物をアミノフルオレセイン誘導体と反応さ
せて尿素トレーサーを生成させる。アミノ基含有ハプテ
ンはまた、適当な溶媒中のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドで活性化したカルボキシフルオレセインに結合させる
こともできる。

【００４４】別法として、アルコール基を含有するＰＣ
Ｂハプテンを担体タンパク質に結合させるには、まずホ
スゲン、またはジホスゲンもしくはトリホスゲンもしく
はカルボニルジイミダゾールなどのホスゲン誘導体と反
応させて、高度に反応性のクロロホルメートまたはイミ
ダゾロホルメート誘導体を得る（通常、単離することな
く）。ついで、得られた活性ホルメートをアミノ末端フ
ルオレセイン誘導体と反応させてトレーサーを生成する
。

【００４５】ＰＣＢｓ、ＰＣＢトレーサー、および分析
対象物類似体のタンパク質や表面などへの非特異的相互
反応を減少させるのに有効な添加剤としては、界面活性
剤、有機溶媒、および下記一般式：

【化１７】 （式中、ＹはＯまたはＮＨ、Ｒ１およびＲ２のうち一方
はクロロであり他方は水素、ＪはＣＯ２ＨまたはＣＨ２
ＣＯ２Ｈである）で示される他の化合物などが挙げられ
る。

【００４６】ＰＣＢｓおよびトレーサーのタンパク質や
表面への非特異的結合を減少させるのに好ましい本発明
の化合物は、ゴッドフレイ（Ｋ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙ）
の米国特許第３，７６６，２６３号明細書に記載されて
いるフェンクロフェナク（ｆｅｎｃｌｏｆｅｎａｃ）で
ある。この化合物は血清結合タンパク質から甲状腺ホル
モンを解離する試薬として用いられてきたが、ＰＣＢｓ
アッセイでの使用は今までに知られていない。血清結合
タンパク質から甲状腺ホルモンを解離する能力において
フェンクロフェナクと関連する化合物もまた、本発明で
の有用性が示される。本発明においてフェンクロフェナ
ク（Ｙ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｃｌ、Ｒ２＝Ｈ、Ｊ＝ＣＨ２ＣＯ２
Ｈ）が好ましい化合物である。

【００４７】本発明のトレーサーおよび本発明の免疫原
に対して産生された抗体は、ＰＣＢｓの半定量的検出の
ための本発明の蛍光偏光アッセイにおいて優れた結果を
もたらすことがわかった。しかしながら、抗体および抗
原を使用した他のアッセイも用いることができる。

【００４８】本発明のアッセイ法は、下記手順に従って
行うことができる。既知容量の標準試料およびＰＣＢｓ
を含有しているかまたは含有していると思われる抽出試
料を試験管などの容器に移す。既知濃度のトレーサーを
試験管に加える。上記免疫原を用いて産生した既知濃度
の分析対象物特異的抗体もまた試験管に加える。この反
応混合物を条件下および充分な時間インキュベートし（
この間にトレーサーと分析対象物は限られた抗体結合部
位に対して競合する）、トレーサー−抗体複合体および
分析対象物−抗体複合体を生成させる。生成したトレー
サー−抗体複合体の量を測定して、試料中に存在する分
析対象物の存在および／または量を決定する。

【００４９】本発明のアッセイ法は、自動システム上で
行うように適合することができ、そのような自動システ
ムとしては、たとえばＴＤｘＲセラピューティックドラ
ッグモニタリングシステム、ＡＤｘＴＭアビューズドド
ラッグシステム、ＩＭｘＲフルオレッセンスポーラリゼ
ーションアナライザーアンドマイクロパーティクルエン
ザイムイムノアッセイアナライザー（これらはすべてア
ボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイか
ら入手可能）などが挙げられるが、これらに限られるも
のではない。これらＴＤｘＲ、ＡＤｘＴＭ、ＩＭｘＲな
どの自動アッセイを使用した場合は、いったん試料を調
製すればアッセイは前処理から最終的な読み取りにいた
るまで完全に自動化される。しかしながら、手動のアッ
セイを行うこともできる。本発明のアッセイ法は手動法
にも適用可能ではあるが、ＴＤｘＲ、ＡＤｘＴＭ、およ
びＩＭｘＲシステムなどの自動化システムは、アッセイ
を行い分析を解析するための技術時間が最小になること
が保証される。

【００５０】蛍光偏光を使用する場合は、結果の定量は
「ミリ偏光単位」、「スパン（ミリ偏光単位にて）」お
よび「相対強度」にて行うことができる。ミリ偏光単位
の測定は、試料中にＰＣＢが存在しない状態で最大量の
トレーサーが抗体に結合する場合の最大偏光を示す。正
味のミリ偏光単位が高ければ高いほど、トレーサーの抗
体への結合は良好である。本発明の目的のためには、５
μｇ／ｍｌのアロクロルのカットオフレベルのため、少
なくとも１５０の正味のミリ偏光値が好ましい。

【００５１】本明細書において「スパン」とは、正味の
ミリ偏光値と最少量のトレーサーが抗体に結合した場合
のミリ偏光値との差異を示す。大きなスパン値ほどデー
タの数値分析が良くなる。本発明の目的のためには、少
なくとも１５のミリ偏光単位のスパンが好ましい。

【００５２】「相対強度」とは、バックグラウンド蛍光
に対する蛍光シグナルの強度の測定手段である。従って
、高い強度ほど正確な測定値が得られる。この強度は、
垂直偏光強度に水平偏光強度を２倍したものを加えて決
定される。強度は、トレーサーおよび他のアッセイ成分
の濃度に依存して、バックグラウンドノイズの約３倍か
ら約３０倍のシグナルの範囲である。本発明の目的のた
めには、バックグラウンドノイズの約３倍から約２０倍
の強度が好ましい。

【００５３】本発明の方法を行う場合のｐＨは、トレー
サーのフルオレセイン残基が開環形で存在するのに充分
なものでなければならない。そのようなｐＨは約４〜９
、好ましくは約６〜８、最も好ましくは約７〜７．５で
ある。アッセイ手順の間に上記ｐＨを達成し保持するた
め、種々の緩衝液を用いることができる。代表的な緩衝
液としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタールなどが挙げられる。特定の緩衝液を選択する
ことは、本発明の方法を行う上で重要ではない。しかし
ながら、トリスおよびリン酸緩衝液が好ましい。

【００５４】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限られるものでは
ない。 ハプテンの合成 実施例１：２−アミノ−２’，４，４’，５，５’−ペ
ンタクロロビフェニルの調製： Ａ．カドガンらの標準法［カドガン（Ｊ．Ｉ．Ｇ．Ｃａ
ｄｇａｎ）ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（ロンドン）、
１９６２、４２５７〜５８］に従い、２’，４，４’，
５，５’−ペンタクロロビフェニルを調製した。２，４
，５−トリクロロアニリン（２０ｇ、０．１モル）を１
，２−ジクロロベンゼン（１２５ｍｌ、１．１モル）中
に溶解し、この撹拌溶液に１０分間かけて３回に分けて
ｔ−ブチルナイトレート（２８．２ｍｌ、１．１モル）
を導入した。１５分後にガスの発生は静まり、反応混合
物を安全シールドの後ろで９０分間加熱還流し、ついで
周囲温度で１２時間撹拌した。

【００５５】過剰の１，２−ジクロロベンゼンを減圧除
去し、ヤウ（Ｅ．Ｋ．Ｙａｕ）およびカワード（Ｊ．Ｋ
．Ｃｏｗａｒｄ）のＡｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔ
ａ　１９８８、２Ｉ（４）、１０６〜１０７に記載の方
法に従い、生成物を含有する残渣をシリカゲルで濾過精
製し、エタノールから結晶化した後、標記生成物（３ｇ
、９．３％）を得た。質量分析：ｍ／ｚ、３２４（Ｃ１
２Ｈ５Ｃｌ５）

【００５６】Ｂ．ニューサム（Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗｓｏｍｅ
）およびシールズ（Ｊ．Ｂ．Ｓｈｉｅｌｄｓ）のＩｎｔ
ｅｒｎ．Ｊ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，
１９８１、１０、２９５〜３０４に記載の標準法に従い
、２−ニトロ−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロ
ロビフェニルを調製した。２’，４，４’，５，５’−
ペンタクロロビフェニル（２．８ｇ、８．９ミリモル）
を０℃にて撹拌しながら濃硝酸／硫酸混液（５０ｍｌ、
１：１）に加えた。この反応混合物を周囲温度に温め、
ついで６０℃で２時間加熱した。最後に周囲温度で４８
時間加熱した後、反応混合物を氷（１００ｇ）中に注ぎ
、濾過し、空気乾燥して標記化合物（３ｇ）を得た。質
量分析：ｍ／ｚ、４１４（Ｃ１２Ｈ４Ｃｌ５ＮＯ２）。

【００５７】Ｃ．２−アミノ−２’，４，４’，５，５
’−ペンタクロロビフェニルの調製は、２−ニトロ−２
’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（２
．５ｇ、６．８ミリモル）を出発物質とし、この化合物
を１００℃に加熱した酢酸（６０ｍｌ）中に溶解し、濃
ＨＣｌ（３０ｍｌ）中のＳｎＣｌ２（６ｇ）の溶液に加
えた。温度を還流温度まで３時間上昇させ、ついで反応
混合物を周囲温度に冷却し、ついで氷（１００ｇ）中に
注いだ。ＮａＯＨを用いて溶液のｐＨを９に調節し、つ
いで塩化メチレン（２×１００ｍｌ）で抽出した。この
抽出物をＮａＯＨ（１Ｎ、２×２５ｍｌ）および水（１
００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過して不
純なアミンを得た。得られた粗製の生成物を２つの等し
いバッチ［クロマトトロン（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ
Ｒ），ハリソン・リサーチ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ　Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）、パロアルト、カリフォルニア、４ｍｍシ
リカゲル、ヘキサンから１０％酢酸エチル／ヘキサンへ
の段階勾配、２０ｍｍ／分］中でクロマトグラフィーに
かけて標記ハプテン（８３０ｍｇ）を得た。質量分析：
ｍ／ｚ、３４０（Ｍ＋１）（Ｃ１２Ｈ６Ｃｌ５Ｎ）。

【００５８】実施例２：２，４’−ジクロロ−４−アミ
ノビフェニルの調製： Ａ．２−クロロ−４−ニトロアニリン（２．６ｇ、１５
ミリモル）をクロロベンゼン（２０ｍｌ、２００ミリモ
ル）中に溶解し、窒素雰囲気下で１２０℃に加熱するこ
とにより、２，４’−４−ニトロビフェニルを調製した
。この溶液に手動ポンプおよびカニューレを用いてｉ−
アミルニトリル（３．４ｍｌ、２５ミリモル）を１時間
かけてゆっくりと加えた。１２時間撹拌した後、反応混
合物を周囲温度に冷却し、過剰のクロロベンゼンを減圧
下で除去した。蒸発後の残渣を実施例１Ａと同様にシリ
カゲルでの濾過によるクロマトグラフィー［溶離液とし
てヘキサンおよび酢酸エチル（８０：２０）を使用］に
かけた。さらにクロマトグラフィー［クロマトトロンＲ
，４ｍｍシリカゲル、ヘキサン／塩化メチレン（８０：
２０）、２０ｍｌ／分］にかけて標記化合物（１．７５
ｇ）を得た。質量分析：ｍ／ｚ、２６７（Ｃ１２Ｈ７Ｃ
ｌ２ＮＯ２）。

【００５９】Ｂ，実施例１Ｃに記載の手順に従い、２，
４’−ジクロロ−４−ニトロビフェニル（１．７５ｇ、
６．５ミリモル）から２，４’−ジクロロ−４−アミノ
ビフェニルを調製した。得られた粗製の生成物をクロマ
トグラフィー［クロマトトロンＲ、４ｍｍシリカゲル、
ヘキサン／塩化メチレン（８０：２０）、２０ｍｌ／分
］、ついでプレパラティブ薄層クロマトグラフィー［フ
ァットマンＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０ｃｍ逆
相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液（７５：２５
）］にかけて精製した。２つの主要な成分を油状物とし
て単離した。速溶出成分（４８０ｍｇ）を２，２’−ジ
クロロ−４−アミノビフェニルとして同定し、遅溶出成
分は標記化合物（５８０ｍｇ）であった。質量分析：ｍ
／ｚ、２３８（Ｍ＋１）（Ｃ１２Ｈ９Ｃｌ２Ｎ）。

【００６０】実施例３：２，５，５’−トリクロロ−２
’−アミノビフェニルの調製： Ａ．実施例２Ａに記載の手順に従い、２−ニトロ−５−
クロロアニリン（２．６ｇ、１５ミリモル）および１，
４−ジクロロベンゼン（２９．５ｇ、２００ミリモル）
から２，５，５’−トリクロロ−２’−ニトロビフェニ
ルを調製した。シリカゲルで濾過し（実施例１Ａ参照）
、ヘキサン／塩化メチレン（８０：２０）で溶離して標
記化合物（８３０ｍｇ）を得た。質量分析：ｍ／ｚ、３
０１（Ｃ１２Ｈ６Ｃｌ３ＮＯ２）。

【００６１】Ｂ．実施例１Ｃの手順に従い、２，５，５
’−トリクロロ−２’−ニトロビフェニル（８３０ｍｇ
、２．８ミリモル）から２，５，５’−トリクロロ−２
’−アミノビフェニルを調製した。クロマトグラフィー
［クロマトトロンＲ，２ｍｍシリカゲル、酢酸エチル／
ヘキサン（５０：５０）、１０ｍｌ／分］により精製し
て標記化合物（４４８ｍｇ）を得た。質量分析：ｍ／ｚ
、２７２（Ｍ＋１）（Ｃ１２Ｈ８Ｃｌ３Ｎ）。

【００６２】実施例４：５−ヒドロキシ−２，２’，４
，４’，５’−ペンタクロロビフェニルの調製：Ａ．２
，４−ジクロロアニソール ２，４−ジクロロフェノール（５０ｇ、０．３モル）を
Ｋ２ＣＯ３（２００ｇ）とともに２−ブタノン（５００
ｍｌ）中に溶解し、この撹拌溶液にヨウ化メチル（９０
ｍｌ、１．４５モル）を２時間かけて滴下して処理した
。この溶液を１２時間加熱還流し、冷却し、濾過し、蒸
発させた。 蒸留［クーゲルロール（Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ）、５ｍｍ
Ｈｇ、沸点１１０℃］して標記化合物（５８ｇ）を得た
。質量分析：ｍ／ｚ、１７６（Ｃ７Ｈ６Ｃｌ２Ｏ）。

【００６３】Ｂ．実施例２Ａの手順に従い、２，４，５
−トリクロロアニリン（２．９５ｇ、１５ミリモル）お
よび２，４−ジクロロアニソール（３５ｇ、２００ミリ
モル）から５−メトキシ−２，２’，４，４’，５’−
ペンタクロロビフェニルを調製した。粗製の反応混合物
を蒸留（クーゲルロール、１ｍｍＨｇ、沸点１９０℃）
して５−メトキシ−２，２’，４，４’，５’−ペンタ
クロロビフェニルおよび２−メトキシ−２’，４，４’
，５，５’−ペンタクロロビフェニルの混合物を得た。 これら異性体をクロマトグラフィー（クロマトトロンＲ
、４ｍｍシリカゲル、ヘプタン、２０ｍｌ／分）により
分離した。最初に溶出する異性体は２−メトキシ−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（３８
３ｍｇ）であり、２番目に溶出する異性体は所望の５−
メトキシ−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビ
フェニル（４９０ｍｇ）と同定された。質量分析：ｍ／
ｚ、３５４（Ｃ１３Ｈ７Ｃｌ５Ｏ）。

【００６４】Ｃ．マックモビー（Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍ
ｂｉｅ）らのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７６、２４
、２２８９〜９２に記載の方法に従い、５−メトキシ−
２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビフェニル（
４００ｍｇ、１．２ミリモル）から５−ヒドロキシ−２
，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビフェニルを調
製した（収量：２６０ｍｇ）。質量分析：ｍ／ｚ、３４
０（Ｃ１２Ｈ５Ｃｌ５Ｏ）。

【００６５】実施例５：４−ヒドロキシ−２，２’，４
’，５，５’−ペンタクロロビフェニルの調製：Ａ．実
施例４Ａに記載の手順に従い、２，５−ジクロロフェノ
ール（５０ｇ、０．３モル）から２，５−ジクロロアニ
ソールを調製した。蒸留（沸点９８℃、５ｍｍＨｇ）し
て生成物（５２ｇ）を得た。質量分析：ｍ／ｚ、１７６
（Ｃ７Ｈ６Ｃｌ２Ｏ）。

【００６６】Ｂ．実施例２Ａに記載の手順に従い、２，
５−ジクロロアニソール（３５ｇ、２００ミリモル）お
よび２，４，５−トリクロロアニリン（２．９５ｇ、１
５ミリモル）から４−メトキシ−２，２’，４’，５，
５’−ペンタクロロビフェニルを調製した。過剰のジク
ロロアニソールを蒸留により除去し、ついで残渣をシリ
カゲルにより濾過し（溶離液：ヘプタン）、さらに精製
して（クロマトトロンＲ，４ｍｍシリカゲル、ヘキサン
、２０ｍｌ／分）生成物（９８０ｍｇ）を得た。ＭＳ：
ｍ／ｚ、３５４（Ｃ１３Ｈ７Ｃｌ５Ｏ）。

【００６７】Ｃ．実施例４Ｃの手順に従い、４−メトキ
シ−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニ
ル（９５０ｍｇ、２．７ミリモル）から４−ヒドロキシ
−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル
を調製した（収量：９１８ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、３４
０（Ｃ１２Ｈ５Ｃｌ５Ｏ）。

【００６８】実施例６：２−ヒドロキシ−２’，４，４
’，５，５’−ペンタクロロビフェニルの調製：実施例
４Ａの手順に従い、３，４−ジクロロフェノール（５０
ｇ、０．３モル）から３，４−ジクロロアニソールを調
製した。蒸留（沸点；７５〜８０℃）して生成物（５６
ｇ）を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ、１７６（Ｃ７Ｈ６Ｃｌ２Ｏ
）。

【００６９】Ｂ．実施例２Ａの手順に従い、３，４−ジ
クロロアニソール（３５ｇ、２００ミリモル）および２
，４，５−トリクロロアニリン（２．９５ｇ、１５ミリ
モル）から２−メトキシ−２’，４，４’，５，５’−
ペンタクロロビフェニルを調製した。過剰のジクロロア
ニソールを蒸留により除去し、ついで残渣をシリカゲル
で濾過し（溶離液：ヘプタン）、さらに精製して（クロ
マトトロンＲ，４ｍｍシリカゲル、シクロヘキサン、２
０ｍｌ／分）２−メトキシ−２’，４，４’，５，５’
−ペンタクロロビフェニル（７００ｍｇ）および２−メ
トキシ−２’，４’，５，５’，６−ペンタクロロビフ
ェニル（１．２ｇ）を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ、３５４（Ｃ
１３Ｈ７Ｃｌ５Ｏ）／

【００７０】Ｃ．実施例４Ｃの手
順に従い、２−メトキシ−２’，４，４’，５，５’−
ペンタクロロビフェニル（７００ｍｇ、２ミリモル）か
ら２−ヒドロキシ−２’，４，４’，５，５’−ペンタ
クロロビフェニルを調製した（収量：２９５ｍｇ）。Ｍ
Ｓ：ｍ／ｚ、３４０（Ｃ１２Ｈ５Ｃｌ５Ｏ）。

【００７１】実施例７：２−クロロ−４−ヒドロキシビ
フェニルの調製： Ａ．実施例２Ａの手順に従い、ｐ−アニシジン（１．８
５ｇ、１５ミリモル）およびクロロベンゼン（５０ｍｌ
）から２−クロロ−４−メトキシビフェニルを調製した
。過剰のクロロベンゼンを蒸留により除去し、ついで残
渣をシリカゲルで濾過して（シクロヘキサン／酢酸エチ
ル、９５：５、溶離液）、生成物（８６０ｍｇ）を得た
。ＭＳ：ｍ／ｚ、２３６（Ｍ＋ＮＨ４）（Ｃ１３Ｈ１１
ＣｌＯ）。

【００７２】Ｂ．実施例４Ｃの手順に従い、２−クロロ
−４−メトキシビフェニル（４３７ｍｇ、２ミリモル）
から２−クロロ−４−ヒドロキシビフェニルを調製した
（収量：４０８ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、２０４（Ｃ１２
Ｈ９ＣｌＯ）。

【００７３】リンカーアームを有するハプテンの合成実
施例８：２−アジパミド−２’，４，４’，５，５’−
ペンタクロロビフェニルの調製： Ａ．塩化チオニル（２０ｍｌ）とともに２時間還流する
ことにより、モノメチルアジペート（１０ｇ、６２．４
ミリモル）からクロロメチルアジペートを調製した。蒸
留して酸クロライド（沸点８０℃、０．３５ｍｍＨｇ、
７．４ｇ）を得た。

【００７４】Ｂ．メチル２−アジパミド−２’，４，４
’，５，５’−ペンタクロロビフェニルを以下のように
して調製した。２−アミノ−２’，４，４’，５，５’
−ペンタクロロビフェニル（３００ｍｇ、０．８８ミリ
モル）をピリジン（５ｍｌ）中のクロロメチルアジペー
ト（１８０ｍｇ、１ミリモル）で周囲温度にて１２時間
処理した。ついで、この混合物をエチルエーテル（５０
ｍｌ）に加え、ＨＣｌ水溶液（１．２Ｎ、４×２５ｍｌ
）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×２０ｍｌ）、塩水（２×２
０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。蒸
発させて生成物（４４０ｍｇ）を得た。ＭＳ；ｍ／ｚ、
４８２（Ｍ＋１）（Ｃ１９Ｈ１６Ｃｌ５ＮＯ３）。

【００７５】Ｃ．実施例８Ｂのエステルを鹸化（エタノ
ール性ＮａＯＨ、２時間還流）することにより、２−ア
ジパミド−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビ
フェニルを調製した。酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え
、ＨＣｌ水溶液（１．２Ｎ、１５ｍｌ）、塩水（２０ｍ
ｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させ
て生成物を単離した（収量：２２６ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／
ｚ、４６８（Ｍ＋１）（Ｃ１８Ｈ１４Ｃｌ５ＮＯ３）。

【００７６】実施例９：２，４’−ジクロロ−４−アジ
パミドビフェニルの調製： Ａ．実施例８Ｂの手順に従い、２，４’−ジクロロ−４
−アミノビフェニル（３００ｍｇ、１．２６ミリモル）
からメチル２，４’−ジクロロ−４−アジパミドビフェ
ニルを調製した（収量：５５０ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、
３８０（Ｍ＋１）（Ｃ１９Ｈ１９Ｃｌ２ＮＯ３）。

【００７７】Ｂ．実施例８Ｂと同様にして、上記エステ
ルを鹸化（エタノール性のＮａＯＨ、２時間還流）する
ことにより２，４’−ジクロロ−４−アジパミドビフェ
ニルを調製した。酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え、Ｈ
Ｃｌ水溶液（１．２Ｎ、１５ｍｌ）、塩水（２０ｍｌ）
で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて生
成物を単離した（収量：２３３ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、
３６６（Ｍ＋１）（Ｃ１８Ｈ１７Ｃｌ２ＮＯ３）。実施
例１０：２，５，５’−トリクロロ−２’−アジパミド
ビフェニルの調製：Ａ．実施例８Ｂの手順に従い、２，
５，５’−トリクロロ−２’−アミノビフェニル（３０
０ｍｇ、１．１ミリモル）からメチル２，５，５’−ト
リクロロ−２’−アジパミドビフェニルを調製した（収
量：４４０ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、４１４（Ｍ＋１）（
Ｃ１９Ｈ１８Ｃｌ３ＮＯ３）。 Ｂ．実施例８Ｂと同様にして、上記エステルを鹸化（エ
タノール性のＮａＯＨ、２時間還流）することにより２
，５，５’−トリクロロ−２’−アジパミドビフェニル
を調製した。酢酸エチル（１００ｍｌ）を加え、ＨＣｌ
水溶液（１．２Ｎ、１５ｍｌ）、塩水（２０ｍｌ）で洗
浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて生成物
を単離した（収量：２６０ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、４０
０（Ｍ＋１）（Ｃ１８Ｈ１６Ｃｌ３ＮＯ３）。

【００７８】実施例１１：５−（メトキシカルボキシラ
ト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビフェ
ニルの調製： Ａ．５−ヒドロキシ２，２’，４，４’，５’−ペンタ
クロロビフェニル（２００ｍｇ、０．５８ミリモル、実
施例４Ｃ）およびブロモ酢酸エチル（８０μｌ、０．７
３ミリモル）からエチル５−（メトキシカルボキシラト
）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビフェニ
ルを調製するため、両者をＫ２ＣＯ３（１００ｍｇ、０
．７２５ミリモル）および触媒量のＮａＩの存在下で２
−ブタノン（１０ｍｌ）中に溶解した。この反応混合物
を窒素雰囲気下で１６時間、還流撹拌し、エチルエーテ
ルで希釈し、Ｈ３ＰＯ４（１．４Ｍ、５０ｍｌ）および
塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発
させて所望の生成物を得た。 ＭＳ：ｍ／ｚ、４４６（Ｍ＋ＮＨ４）（Ｃ１６Ｈ１１Ｃ
ｌ５Ｏ３）。

【００７９】Ｂ．メタノール性のＫＯＨ（２０ｍｌ、２
００ｍｇ）を用いてエチル５−（メトキシカルボキシラ
ト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビフェ
ニルを周囲温度で５時間鹸化することにより、５−（メ
トキシカルボキシラト）−２，２’，４，４’，５’−
ペンタクロロビフェニルを調製した。ついで、この溶液
を蒸発させ、残渣をＨ３ＰＯ４（１．４Ｍ、２５ｍｌ）
中に懸濁し、エチルエーテル（４×２５ｍｌ）で抽出し
、抽出物を塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾
燥し、蒸発させて所望の生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ、
４１６（Ｍ＋ＮＨ４）（Ｃ１４Ｈ７Ｃｌ５Ｏ３）。

【００８０】実施例１２：４−（メトキシカルボキシラ
ト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロビフェ
ニルの調製： Ａ．実施例１１Ａの方法に従い、４−ヒドロキシ−２，
２’，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（６５
０ｍｇ、１．９ミリモル）からエチル４−（メトキシカ
ルボキシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタク
ロロビフェニルを調製した。クロマトグラフィー［クロ
マトトロンＲ，２ｍｍシリカゲル、５％酢酸エチル／シ
クロヘキサン、１０ｍｌ／分］により精製して標記化合
物（７１５ｍｇ）を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ、４４６（Ｍ＋
ＮＨ４）（Ｃ１６Ｈ１１Ｃｌ５Ｏ３）／

【００８１】Ｂ．実施例１１Ｂの方法により、エチル４
−（メトキシカルボキシラト）−２，２’，４’，５，
５’−ペンタクロロビフェニル（７００ｍｇ、１．６５
ミリモル）から４−（メトキシカルボキシラト）−２，
２’，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニルを調製
した（５２０ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、４１６（Ｍ＋ＮＨ
４）（Ｃ１４Ｈ７Ｃｌ５Ｏ３）。

【００８２】実施例１３：２−（メトキシカルボキシラ
ト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェ
ニルの調製： Ａ．実施例１１Ａの方法により、２−ヒドロキシ−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（２９
５ｍｇ、０．８６ミリモル、実施例６Ｃ）からエチル２
−（メトキシカルボキシラト）−２’，４，４’，５，
５’−ペンタクロロビフェニルを調製した（４３８ｍｇ
）。ＭＳ：ｍ／ｚ、４４６（Ｍ＋ＮＨ４）（Ｃ１６Ｈ１
１Ｃｌ５Ｏ３）。

【００８３】Ｂ．実施例１１Ｂの方法により、エチル２
−（メトキシカルボキシラト）−２’，４，４’，５，
５’−ペンタクロロビフェニル（４３８ｍｇ）から２−
（メトキシカルボキシラト）−２’，４，４’，５，５
’−ペンタクロロビフェニルを調製した（２００ｍｇ）
。ＭＳ：ｍ／ｚ、４１６（Ｃ１４Ｈ７Ｃｌ５Ｏ３）。

【００８４】実施例１４：４−（ブトキシ−４−カルボ
キシラト）−２−クロロビフェニルの調製：Ａ．実施例
１１Ａの方法により、２−クロロ−４−ヒドロキシビフ
ェニル（４０８ｍｇ、２．０ミリモル、実施例６Ｃ）お
よび４−ブロモ酪酸エチル（２９０ｍｇ、２．０５ミリ
モル）からエチル４−（ブトキシ−４−カルボキシラト
）−２−クロロビフェニルを調製した。クロマトグラフ
ィー［クロマトトロンＲ，４ｍｍシリカゲル、１０％酢
酸エチル／シクロヘキサン、２０ｍｌ／分］により精製
して標記化合物を得た（５８５ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、
３１９（Ｍ＋１）、３３６（Ｍ＋ＮＨ４）（Ｃ１８Ｈ１
９Ｃｌ１Ｏ３）。

【００８５】Ｂ．実施例１１Ｂの方法により、エチル４
−（ブトキシ−４−カルボキシラト）−２−クロロビフ
ェニル（５８５ｍｇ、１．８ミリモル）から４−（ブト
キシ−４−カルボキシラト）−２−クロロビフェニルを
調製した（４６２ｍｇ）。ＭＳ：ｍ／ｚ、３０８（Ｍ＋
ＮＨ４）（Ｃ１６Ｈ１５Ｃｌ１Ｏ３）。

【００８６】免疫原の合成 実施例１５ 　　Ａ．一般法Ｉ 窒素雰囲気下、ハプテン（２５ｍｇ）をテトラヒドロフ
ラン（５ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新たに蒸留）
中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；１５ｍ
ｇ、０．０７ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ；２５ｍｇ、０．２ミリモル）で０℃に
て２時間および周囲温度にて１２時間、活性化した。ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ；２００ｍｇ）をリン酸緩衝
液（１０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ８．０）中に溶解した。 上記活性化ハプテンの溶液を、上記ＢＳＡの撹拌溶液中
にガラス綿の栓を通して濾過して入れた。撹拌を２４時
間続け、ついで反応混合物を透析管（分子量カットオフ
値：１５，０００）中に移し、４℃にてギ酸アンモニウ
ム（６Ｌ、０．１Ｎ）に対して４８時間透析した。透析
物を凍結乾燥して固体を得、これをクロロホルム（２５
ｍｌ）で洗浄し、Ｐ２Ｏ５で減圧下に乾燥させた。ＵＶ
分析により、得られた免疫原はＢＳＡ１分子当たり１３
〜２６分子のハプテンを含有していることがわかった。

【００８７】Ｂ．一般法ＩＩ ハプテン（２５ｍｇ）を塩化チオニル（１Ｌ）中に溶解
し、６０℃で１２時間加熱した。ついで、過剰の塩化チ
オニルを減圧除去し、ハプテンの酸クロライドを得た。 ついで、この酸クロライドをＴＨＦ（２ｍｌ、ベンゾフ
ェノンケチルから新たに蒸留）中に溶解した。ＢＳＡ（
２００ｍｇ）をリン酸緩衝液（１０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐ
Ｈ８．０）中に溶解し、０℃に冷却した。上記酸クロラ
イド溶液を撹拌しながら、さらにＴＨＦ（８ｍｌ）とと
もに一度に加えた。撹拌を周囲温度で１２時間続け、つ
いで反応混合物を透析管（分子量カットオフ値：１５，
０００）に移し、４℃にてギ酸アンモニウム（６Ｌ、０
．１Ｎ）に対して４８時間透析した。透析物を凍結乾燥
して固体を得、これをクロロホルム（２５ｍｌ）で洗浄
し、Ｐ２Ｏ５で減圧下に乾燥させた。ＵＶ分析により、
得られた免疫原はＢＳＡ１分子当たり１３〜２６分子の
ハプテンを含有していることがわかった。

【００８８】実施例１６ 　　実施例１５Ａの手順に従い、２−アジパミド−２，
４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施例
８Ｃ）から（２−アジパミド−２，４，４’，５，５’
−ペンタクロロビフェニル）×ＢＳＡを調製した。

【００８９】実施例１７ 　　実施例１５Ａの手順に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アジパミドビフェニル（実施例９Ｂ）から（２，４
’−ジクロロ−４−アジパミドビフェニル）×ＢＳＡを
調製した。

【００９０】実施例１８ 　　実施例１５Ａの手順に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アジパミドビフェニル（実施例１０Ｂ）か
ら（２，５，５’−トリクロロ−２’−アジパミドビフ
ェニル）×ＢＳＡを調製した。

【００９１】実施例１９ 　　実施例１５Ｂの手順に従い、５−（メトキシカルボ
キラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビ
フェニル（実施例１１Ｂ）から［５−（メトキシカルボ
キラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロビ
フェニル］×ＢＳＡを調製した。

【００９２】実施例２０ 　　実施例１５Ｂの手順に従い、４−（メトキシカルボ
キラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロビ
フェニル（実施例１２Ｂ）から［４−（メトキシカルボ
キラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロビ
フェニル］×ＢＳＡを調製した。

【００９３】実施例２１ 　　実施例１５Ｂの手順に従い、２−（メトキシカルボ
キラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビ
フェニル（実施例１３Ｂ）から［２−（メトキシカルボ
キラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロビ
フェニル］×ＢＳＡを調製した。

【００９４】実施例２２ 　　実施例１５Ａの手順に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４Ｂ
）から［４−（ブトキシ−４−カルボキラト）−２−ク
ロロビフェニル］×ＢＳＡを調製した。

【００９５】トレーサーの合成 実施例２３ 　　Ａ．一般法Ｉ：窒素雰囲気下、ハプテン（２５ｍｇ
）をテトラヒドロフラン（５ｍｌ、ベンゾフェノンケチ
ルから新たに蒸留）またはジメチルホルムアミド（５ｍ
ｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；１
５ｍｇ、０．０７ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（ＮＨＳ；２５ｍｇ、０．２ミリモル）で０
℃にて２時間および周囲温度にて１２時間、活性化した
。この活性ハプテンのアリコート（１ｍｌ）に、アミノ
含有フルオレセイン誘導体（４ｍｇ）を２滴のトリエチ
ルアミンとともに加えた。この反応混合物を１２時間撹
拌し、蒸発させ、クロマトグラフィー［ファットマン（
Ｗｈａｔｍａｎ）ＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０
ｃｍ逆相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液（６０
：４０）、またはメルクシリカゲル６０Ｆ−２５４、２
ｍｍ、２０×２０ｃｍ、クロロホルム／メタノール（８
５：１５）］にかけた。

【００９６】Ｂ．一般法ＩＩ：ハプテン（２５ｍｇ）を
塩化チオニル（１ｍｌ）中に溶解し、６０℃にて１２時
間加熱した。ついで、過剰の塩化チオニルを減圧除去し
、ハプテンの酸クロライドを得た。ついで、この酸クロ
ライドをＴＨＦ（５ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新
たに蒸留）中に溶解した。この活性ハプテンのアリコー
ト（１ｍｌ）にアミノ含有フルオレセイン誘導体（４ｍ
ｇ）を２滴のトリエチルアミンとともに加えた。この反
応混合物を１２時間撹拌し、蒸発させ、クロマトグラフ
ィー［ファットマンＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２
０ｃｍ逆相プレート、メタノール／１％酢酸水溶液（６
０：４０）、またはメルクシリカゲル６０Ｆ−２５４、
２ｍｍ、２０×２０ｃｍ、クロロホルム／メタノール（
８５：１５）］にかけた。

【００９７】Ｃ．一般法ＩＩＩ：アミノ含有ハプテンを
エーテル性塩化水素で処理することにより塩酸塩に変換
した。このハプテン塩酸塩（５０ｍｇ）をＴＨＦ（１０
ｍｌ、ベンゾフェノンケチルから新たに蒸留）中に溶解
し、窒素雰囲気下、トリクロロメチルクロロホルメート
（１００μｌ）で３０分間処理した。ついで、揮発成分
を減圧除去し、残渣をＤＭＦ中に取り、アリコートに分
け、１滴のトリエチルアミンとともにアミノ含有フルオ
レセイン誘導体で処理した。１２時間撹拌した後、反応
混合物を蒸発させ、クロマトグラフィー［ファットマン
ＰＬＫＣ１８Ｆ、１ｍｍ、２０×２０ｃｍ逆相プレート
、メタノール／１％酢酸水溶液（６０：４０）、または
メルクシリカゲル６０Ｆ−２５４、２ｍｍ、２０×２０
ｃｍ、クロロホルム／メタノール（８５：１５）］にか
けた。

【００９８】実施例２４ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２−アミノ−２’，４
，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施例１
Ｃ）および４’−アミノメチルフルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ、７２７（Ｍ＋１）（Ｃ３４Ｈ１９Ｃｌ５Ｎ２Ｏ
６）。

【化１８】

【００９９】実施例２５ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２−アミノ−２’，４
，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施例１
Ｃ）および４’−（Ｎ−グリシルアミノメチル）フルオ
レセインから下記構造を有するトレーサーを調製した。 ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７８４（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ
２２Ｃｌ５Ｎ３Ｏ７）。

【化１９】

【０１００】実施例２６ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２−アミノ−２’，４
，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施例１
Ｃ）および５−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサ
ミド］フルオレセインから下記構造を有するトレーサー
を調製した。 ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７８４（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ
２２Ｃｌ５Ｎ３Ｏ７）。

【化２０】

【０１０１】実施例２７ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アミノビフェニル（実施例２Ｂ）および４’−アミ
ノメチルフルオレセインから下記構造を有するトレーサ
ーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、６２５（Ｍ＋
１）（Ｃ３４Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ２Ｏ６）。

【化２１】

【０１０２】実施例２８ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アミノビフェニル（実施例２Ｂ）および４’−（Ｎ
−グリシルアミノメチル）フルオレセインから下記構造
を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／
ｚ、６８２（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ２５Ｃｌ２Ｎ３Ｏ７）
。

【化２２】

【０１０３】実施例２９ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アミノビフェニル（実施例２Ｂ）および５−［Ｎ−
（２−アミノエチル）カルボキサミド］フルオレセイン
から下記構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（Ｆ
ＡＢ）：ｍ／ｚ、６８２（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ２５Ｃｌ
２Ｎ３Ｏ７）。

【化２３】

【０１０４】実施例３０ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アミノビフェニル（実施例３Ｂ）および４
’−アミノメチルフルオレセインから下記構造を有する
トレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、６８
１（Ｍ＋Ｎａ）（Ｃ３４Ｈ２１Ｃｌ３Ｎ２Ｏ６）。

【化２４】

【０１０５】実施例３１ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アミノビフェニル（実施例３Ｂ）および４
’−（Ｎ−グリシルアミノメチル）フルオレセインから
下記構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ
）：ｍ／ｚ、７１６（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ２４Ｃｌ３Ｎ
３Ｏ７）。

【化２５】

【０１０６】実施例３２ 　　実施例２３Ｃの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アミノビフェニル（実施例３Ｂ）および５
−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサミド］フルオ
レセインから下記構造を有するトレーサーを調製した。 ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７１６（Ｍ＋１）（Ｃ３６Ｈ
２４Ｃｌ３Ｎ３Ｏ７）。

【化２６】

【０１０７】実施例３３ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２−アジパミド−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施
例８Ｃ）および４’−アミノメチルフルオレセインから
下記構造を有するトレーサーを調製した。

【化２７】

【０１０８】実施例３４ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２−アジパミド−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施
例８Ｃ）および４’−（Ｎ−グリシルアミノメチル）フ
ルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製し
た。

【化２８】

【０１０９】実施例３５ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２−アジパミド−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施
例８Ｃ）および５−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボ
キサミド］フルオレセインから下記構造を有するトレー
サーを調製した。

【化２９】

【０１１０】実施例３６ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２−アジパミド−２’
，４，４’，５，５’−ペンタクロロビフェニル（実施
例８Ｃ）および６−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボ
キサミド］フルオレセインから下記構造を有するトレー
サーを調製した。

【化３０】

【０１１１】実施例３７ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アジパミドビフェニル（実施例９Ｂ）および４’−
アミノメチルフルオレセインから下記構造を有するトレ
ーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７０９（
Ｍ＋１）（Ｃ３９Ｈ３０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ７）。

【化３１】

【０１１２】実施例３８ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アジパミドビフェニル（実施例９Ｂ）および４’−
（Ｎ−グリシルアミノメチル）フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ、７６６（Ｍ＋１）（Ｃ４１Ｈ３３Ｃｌ２Ｎ３Ｏ
８）。

【化３２】

【０１１３】実施例３９ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アジパミドビフェニル（実施例９Ｂ）および５−［
Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサミド］フルオレセ
インから下記構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ
（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７６６（Ｍ＋１）（Ｃ４１Ｈ３３
Ｃｌ２Ｎ３Ｏ８）。

【化３３】

【０１１４】実施例４０ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，４’−ジクロロ−
４−アジパミドビフェニル（実施例９Ｂ）および６−［
Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサミド］フルオレセ
インから下記構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ
（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、７６６（Ｍ＋１）（Ｃ４１Ｈ３３
Ｃｌ２Ｎ３Ｏ８）。

【化３４】

【０１１５】実施例４１ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アジパミドビフェニル（実施例１０Ｂ）お
よび４’−アミノメチルフルオレセインから下記構造を
有するトレーサーを調製した。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ
、７４３（Ｍ＋１）（Ｃ３９Ｈ２９Ｃｌ３Ｎ２Ｏ７）。

【化３５】

【０１１６】実施例４２ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アジパミドビフェニル（実施例１０Ｂ）お
よび４’−（Ｎ−グリシルアミノメチル）フルオレセイ
ンから下記構造を有するトレーサーを調製した。ＭＳ（
ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、８０１（Ｍ＋１）（Ｃ４１Ｈ３３Ｃ
ｌ３Ｎ３Ｏ８）。

【化３６】

【０１１７】実施例４３ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アジパミドビフェニル（実施例１０Ｂ）お
よび５−［Ｎ−（アミノエチル）カルボキサミド］フル
オレセインから下記構造を有するトレーサーを調製した
。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、８０１（Ｍ＋１）（Ｃ４１
Ｈ３３Ｃｌ３Ｎ３Ｏ８）。

【化３７】

【０１１８】実施例４４ 　　実施例２３Ａの方法に従い、２，５，５’−トリク
ロロ−２’−アジパミドビフェニル（実施例１０Ｂ）お
よび６−［Ｎ−（アミノエチル）カルボキサミド］フル
オレセインから下記構造を有するトレーサーを調製した
。ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ、８０１（Ｍ＋１）（Ｃ４１
Ｈ３３Ｃｌ３Ｎ３Ｏ８）。

【化３８】

【０１１９】実施例４５ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および４’−アミノメチル
フルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製
した。

【化３９】

【０１２０】実施例４６ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および４’−（Ｎ−グリシ
ルアミノメチル）フルオレセインから下記構造を有する
トレーサーを調製した。

【化４０】

【０１２１】実施例４７ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および５−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化４１】

【０１２２】実施例４８ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および６−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化４２】

【０１２３】実施例４９ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および５−［Ｎ−（６−ア
ミノヘキシル）カルボキサミド］フルオレセインから下
記構造を有するトレーサーを調製した。

【化４３】

【０１２４】実施例５０ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、５−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４，４’，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１１Ｂ）および５−アミノメチルフ
ルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製し
た。

【化４４】

【０１２５】実施例５１ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および４’−アミノメチル
フルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製
した。

【化４５】

【０１２６】実施例５２ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および４’−（Ｎ−グリシ
ルアミノメチル）フルオレセインから下記構造を有する
トレーサーを調製した。

【化４６】

【０１２７】実施例５３ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および５−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化４７】

【０１２８】実施例５４ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および６−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化４８】

【０１２９】実施例５５ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および５−［Ｎ−（６−ア
ミノヘキシル）カルボキサミド］フルオレセインから下
記構造を有するトレーサーを調製した。

【化４９】

【０１３０】実施例５６ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、４−（メトキシカルボ
キシラト）−２，２’，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１２Ｂ）および５−アミノメチルフ
ルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製し
た。

【化５０】

【０１３１】実施例５７ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および４’−アミノメチル
フルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製
した。

【化５１】

【０１３２】実施例５８ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および４’−（Ｎ−グリシ
ルアミノメチル）フルオレセインから下記構造を有する
トレーサーを調製した。

【化５２】

【０１３３】実施例５９ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および５−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化５３】

【０１３４】実施例６０ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および６−［Ｎ−（２−ア
ミノエチル）カルボキサミド］フルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化５４】

【０１３５】実施例６１ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および５−［Ｎ−（６−ア
ミノヘキシル）カルボキサミド］フルオレセインから下
記構造を有するトレーサーを調製した。

【化５５】

【０１３６】実施例６２ 　　実施例２３Ｂの方法に従い、２−（メトキシカルボ
キシラト）−２’，４，４’，５，５’−ペンタクロロ
ビフェニル（実施例１３Ｂ）および５−アミノメチルフ
ルオレセインから下記構造を有するトレーサーを調製し
た。

【化５６】

【０１３７】実施例６３ 　　実施例２３Ａの方法に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキシラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４
Ｂ）および４’−アミノメチルフルオレセインから下記
構造を有するトレーサーを調製した。

【化５７】

【０１３８】実施例６４ 　　実施例２３Ａの方法に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキシラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４
Ｂ）および４’−（Ｎ−グリシルアミノメチル）フルオ
レセインから下記構造を有するトレーサーを調製した。

【化５８】

【０１３９】実施例６５ 　　実施例２３Ａの方法に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキシラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４
Ｂ）および５−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサ
ミド］フルオレセインから下記構造を有するトレーサー
を調製した。

【化５９】

【０１４０】実施例６６ 　　実施例２３Ａの方法に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキシラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４
Ｂ）および６−［Ｎ−（２−アミノエチル）カルボキサ
ミド］フルオレセインから下記構造を有するトレーサー
を調製した。

【化６０】

【０１４１】実施例６７ 　　実施例２３Ａの方法に従い、４−（ブトキシ−４−
カルボキシラト）−２−クロロビフェニル（実施例１４
Ｂ）および５−アミノメチルフルオレセインから下記構
造を有するトレーサーを調製した。

【化６１】

【０１４２】抗血清の産生 実施例４８ 　　約４〜５カ月齢の雌ニュージーランドホワイト（Ｎ
ＺＷ）ウサギに、フロントの完全アジュバント中の免疫
原（実施例１６〜２２；０．２ｍｇ）の初期接種を皮下
注射または筋肉内注射にて行い、ついで１４日目に免疫
原（０．１ｍｇ）をブースター投与し、その後、１カ月
ごとにフロントの不完全アジュバント中の免疫原（０．
０５ｍｇ）をブースター投与した。各ブースター投与の
２週間後に採血し、ＴＤｘ装置中でトレーサーへの結合
およびＰＣＢｓによる抗体からトレーサーへの置換につ
いて血清を試験した。適当な正味のミリ偏光およびスパ
ンを有する抗体が、初期接種から６週間で幾つかの血液
中で認められた。

【０１４３】ハイブリドーマの産生 　　４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、免疫原（実
施例１６）（０．０６ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ）、免疫原（
実施例１７）（０．０６ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ）、塩水（
１．８８ｍｌ）、およびモノホスホリル脂質Ａとトレハ
ロースダイマイコレートのアジュバント［リビ・イムノ
ケム・リサーチ（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ）、１００μｇ］からなる混合
物中に各免疫原（実施例１６および実施例１７）の混合
物（０．２ｍｌ）で４週間の間隔をあけて皮下注射した
。初期接種から３カ月後、ＴＤｘ装置で抗体活性の陽性
が試験されたら、最後の免疫から３日目に頸部脱臼によ
りドナーマウスを屠殺した。

【０１４４】脾臓を無菌的に取り出し、２．０ｍＭ　Ｌ
−グルタミンおよびゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）
を含有する冷ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（培
地Ａ；５ｍｌ）を入れたプラスチックペトリ皿に入れた
。脾臓を単一細胞懸濁液に分離した。これら細胞を遠心
分離にかけてペレットとし、赤血球を１０ｍＭトリス緩
衝液中の０．８３％塩化アンモニウム（２ｍｌ）中に再
懸濁することにより溶解した。２分間放置した後、培地
Ａ（２０〜３０ｍｌ）を新たに加えた。細胞を遠心分離
により洗浄し、新たな培地Ａ（１０ｍｌ）中に再懸濁し
た。

【０１４５】融合相手の細胞として、カーニー（Ｋｅａ
ｒｎｅｙ）のＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ、１９７９、１２３、１５４８（該文献を参照のた
め本明細書中に引用する）に開示されている酵素のヒポ
キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（ＨＧＰＲＴ−、ＥＣ２．４．２．８）の欠失した免
疫グロブリン非分泌マウスミエローマ細胞株（ＳＰ２／
０）を用いた。このミエローマ細胞は、２０％ウシ胎仔
血清を添加した培地Ａ中で保持した。融合の３日前に、
これらミエローマ細胞に０．１ｍＭ　８−アザグアニン
を加えてＨＧＰＲＴ＋復帰突然変異体を殺した。融合の
日にミエローマ細胞を回収し、培地Ａ中で１回洗浄し、
培地Ａ（５ｍｌ）中に再懸濁した。ミエローマ細胞およ
び先に回収した脾臓細胞数を血球計を用いてカウントし
、それら細胞の生存度をエリスロシンＢ染色排除（Ｅｒ
ｙｔｈｒｏｓｉｎ　Ｂ　ｓｔａｉｎ　ｅｘｃｌｕｓｉｏ
ｎ）により評価した。

【０１４６】使用した融合法は、ゲフター（Ｇｅｆｔｅ
ｒ）らのＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、１９８８、３、２３１（該文献を参照の本明細書に引
用する）に記載された方法の変法であった。以下に記載
する融合実験によりハイブリドーマ（「Ｈ５１Ｃ１２９
」と称する）が得られた。このハイブリドーマは、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ
）、１２３０１パークローンドライブ、ロックビル、Ｍ
ＤにＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０５３８にて寄託してある
。

【０１４７】５０ｍｌ容の円錐形滅菌遠心管に１〜１．
５×１０８個の脾臓細胞を同数のＳＰ２／０ミエローマ
細胞とともに加えた。このミエローマ−脾臓細胞懸濁液
を１４００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて細胞をペレ
ット化した。上澄み液を吸引除去し、遠心管を穏やかに
たたいて細胞ペレットを緩め、ＤＭＥＭ中の５０％ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ、ＭＷ１０００、シグマ）
（血清不含）（１ｍｌ）を細胞ペレットに加えた。１ｍ
ｌピペットを用いてゆっくりと上下に吸引することによ
り、細胞をＰＥＧ溶液中に１分間かけて穏やかに再懸濁
した。この遠心管を手中にさらに１分間保持し、ついで
培地Ａ（１ｍｌ）をゆっくりと加えてＰＥＧを希釈した
。震盪または撹拌することなく細胞をさらに１分間放置
した。さらに培地Ａ（２０ｍｌ）を３〜５分間かけて加
え、細胞を１４００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけてペ
レット化した。上澄み液を吸引除去し、細胞を、２０％
ウシ胎仔血清、１×１０−４Ｍヒポキサンチン、４×１
０−７Ｍアミノプテリンおよび３×１０−６Ｍチミジン
を含有する培地Ａ（培地ＣまたはＨＡＴ選択培地）（２
０ｍｌ）中に再懸濁した。

【０１４８】実施例６９ 実施例１７のＰＣＢ免疫原に対するモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマの選択：上記実施例で得た細
胞懸濁液を７５ｃｍ２Ｔ−フラスコ中に移し、５％ＣＯ
２インキュベーター中で３７℃にて１〜３時間インキュ
ベートした。ついで、この細胞懸濁液を培地Ｃで１×１
０６脾臓細胞／ｍｌに希釈し、この細胞懸濁液の１ｍｌ
容を２４−ウエルコスタープレートの各ウエルに加えた
。 これらプレートを３７℃および５％ＣＯ２にて２４時間
インキュベートした。インキュベーション後、培地Ｃ中
のフィーダー細胞（非免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞
）懸濁液（１ｍｌ、２〜３×１０５細胞／ｍｌ）を上記
コスタープレートの２４ウエルの各ウエルに加え、３７
℃、５％ＣＯ２にて１４〜１７日間インキュベートした
。この期間中、１日おきに各ウエルから１ｍｌの培地を
吸引により除去し、新たな培地Ｃ（１ｍｌ）で置換した
。

【０１４９】１０日目に、実施例２６および実施例２９
の選択トレーサー、フェンクロフェナク（１０％溶液）
およびハイブリドーマ上澄み液（２５μｌ）を用い、Ｔ
Ｄｘ装置中で抗体活性についてハイブリドーマ含有ウエ
ルからの上澄み液を試験した。ｍＰ単位でバックグラウ
ンドより２０％大きいトレーサー結合を示した上澄み液
を選択することにより、５つのハイブリドーマ懸濁液を
さらにクローニングするために選択した。選択した抗体
活性含有ウエルからの細胞を、２４時間以内のサンプリ
ングで限界希釈法によりクローニングした。

【０１５０】実施例７０ ＰＣＢｓに対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ培養液のクローニング：抗体分泌ウエル中の細
胞を、限界希釈法により所定量の培地Ｂ中に１０細胞／
ｍｌの濃度まで希釈した。各希釈細胞懸濁液（１００μ
ｌ）を３つの９６−ウエルコスタープレートのウエル中
にアリコートした。各ウエルに培地Ｂ中のフィーダー細
胞（１００μｌ、５×１０５細胞／ｍｌ）を加え、プレ
ートを３７℃、５％ＣＯ２にて１４日間インキュベート
した。実施例６９に記載のプロトコールと同様にして、
抗体活性について上澄み液を再び試験した。ついで、抗
体産生クローンをフィーダー細胞を用いずに２４ウエル
コスタープレート中、最後に２５ｃｍ２のＴ−フラスコ
中に広げた。このクローンの３２×１０６細胞／ｍｌ試
料を、液体窒素中、１０％グリセロールを添加した培地
Ｂ中に貯蔵した。ついで、ＴＤｘ装置プロトコールで１
〜２ｍｌの試料を置換についてさらに評価し、１つのク
ローン（Ｈ５１Ｃ１２９）を腹水産生用に選択した。

【０１５１】実施例７１ 実施例７０のモノクローナル抗体のインビボ産生：大量
のモノクローナル抗体を得るためのインビボ法には、実
施例７０のハイブリドーマＨ５１Ｃ１２９を「腹水」腫
瘍として成育するよう適合させることが含まれる。プリ
スタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカ
ン；０．５ｍｌ）を腹腔内注射することにより、雌ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに初回抗原刺激を加えた。プリスタン注
射から約４〜５週間後、実施例６９に記載したインビボ
培養液から回収した１．５×１０６個の活性成育ハイブ
リドーマ細胞を含有するアリコートを初回抗原刺激を加
えたマウスの腹腔内に接種した。ハイブリドーマ細胞の
注射から７日後、各マウスから５〜１０ｍｌの腹水を回
収した。 硫酸アンモニウム沈殿により精製後、腹水１ｍｌ当たり
約２６．４ｍｇの抗体が得られた。

【０１５２】実施例７２ ＰＣＢ蛍光偏光イムノアッセイ：すでに記載したように
、本発明のＦＰＩＡの試薬は、トレーサーおよび本発明
の免疫原に対して産生させたＰＣＢｓに特異的な抗体を
含む。加えて、希釈緩衝液、およびＰＣＢｓカリブレー
ターおよびコントロールを含む通常使用されるアッセイ
溶液も調製する。好ましいアッセイ手順は、アボット・
ラボラトリーズのＴＤｘ、ＡＤｘまたはＩＭｘシステム
などの自動化装置とともに使用するように設計したもの
である。しかしながら、手動アッセイを行うこともでき
る。いずれの手順においても、バックグラウンドの読み
取りを行う前に試料を前処理溶液および希釈緩衝液中の
抗体と混合する。ついで、試験溶液にトレーサーを加え
る。インキュベーション後、蛍光偏光の読み取りを行う
。

【０１５３】以下の抽出プロトコールは、非極性ＰＣＢ
ｓを水親和性溶媒中に抽出するために用いた。ついで、
この抽出溶媒をＴＤｘ装置上の自動化アッセイに使用す
ることができた。１ｍｌの標準試料または試験試料を１
０％アセトン／ヘキサン（９ｍｌ）に加え、１分間激し
く混合し、水浴中で１０分間超音波処理し、１５００Ｇ
で１０分間遠心分離にかけた。ついで、ヘキサン／アセ
トン（６ｍｌ）を除去し、プロピレグリコール（０．５
ｍｌベッド）を加えた。ヘキサン／アセトンを穏やかな
空気流の下、６０℃で１５分間蒸発させた除去した。激
しく混合した後、混合物を１０分間超音波処理し、１５
００Ｇで１０分間遠心分離にかけた。その後、この混合
物にＴＤｘ緩衝液（０．５ｍｌ）を加え、激しく混合し
、１０分間超音波処理し、１０ｋ／Ｇで５分間遠心分離
にかけた。上記工程３からの溶液をＴＤｘ装置の試料ウ
エルに加え、自動化アッセイプロトコールでアッセイを
行った。

【０１５４】自動化アッセイにおいて、各カリブレータ
ー、コントロールおよび試料の蛍光偏光値を測定し、Ｔ
Ｄｘ、ＡＤｘまたはＩＭｘ装置の出力テープ上にプリン
トした。この装置からはまた、非線形回帰分析により、
各カリブレーターの偏光に対してその濃度をプロットす
ることにより標準曲線が得られた。各コントロールまた
は試料の濃度を貯蔵してある曲線から読み取り、出力テ
ープ上にプリントした。

【０１５５】好ましい自動化ＰＣＢアッセイにおいて下
記試薬を用いた。一つのアッセイ態様では、アロクロル
を高濃度の高塩素化ビフェニル（アロクロル１２６０や
１２５４など）と結合置換する抗体とトレーサーの組み
合わせからなっていた。別のアッセイ態様では、アロク
ロルを高濃度の比較的低塩素化ビフェニル（アロクロル
１０１６、１２２１、１２３２、１２４２および１２４
８など）と結合置換する抗体とトレーサーの組み合わせ
からなっていた。

【０１５６】（１）３０ｍＭ　ＮａＯＨ／水中の１０％
フェンクロフェナクを含有する前処理溶液；（２）５０
％メタノール／リン酸カリウム緩衝液（０．１５Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ７．５）中に希釈した各アッセイトレー
サー； （３）ウサギ抗血清またはＰＣＢ免疫原に対して産生さ
せたマウスモノクローナル抗体からなる各アッセイ抗体
（３０％グリセロールを含有するＴＤｘ緩衝液（０．１
Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．０１％ウシガンマグ
ロブリンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有）で希
釈）；

【０１５７】（４）ＴＤｘ緩衝液を含有する希釈
緩衝液；（５）０．００、１．０、５．０、１５、３０
および６０μｇ／ｍｌのＰＣＢアロクロル１２２１およ
び１２６０を含有する１０％アセトン／ヘキサンからな
る２セットのカリブレーター； （６）５μｇ／ｍｌのアロクロル１２２１、１２５４お
よび１２６０を含有するコントロール。

【０１５８】蛍光偏光測定はすべてＴＤｘ装置を用いて
行い、下記プロトコールに従ってアッセイを行った。 （１）２２．５μｌの標準試料または試験試料、および
各１２．５μｌの抗体試薬および前処理試薬をキュベッ
ト中に入れた。充分な量の希釈緩衝液を加えて容量を１
ｍｌとし、バックグラウンド強度の読み取りを行った。 （２）各１２．５μｌの前処理試薬および抗体、２５μ
ｌのトレーサー、および第二の２２．５μｌの試料をキ
ュベットに加え、充分な量の希釈緩衝液を加えて容量を
２．０ｍｌとした。 （３）この反応混合物をインキュベートした。

【０１５９】（４）この混合物の最終的な偏光蛍光強度
からバックグラウンドの偏光蛍光強度を差し引くことに
より、抗体にトレーサーが結合したことによる蛍光偏光
を得た。 （５）未知の試料の偏光値を、既知のＰＣＢ含量のカリ
ブレーターを用いて作成した標準曲線と比較した。

【０１６０】実施例７３ ＦＰＩＡ：本発明によるイムノアッセイから得られたデ
ータを本実施例でまとめて示す。トレーサーの抗体への
結合および試料中に存在するＰＣＢによる該トレーサー
の置換を下記第１表に示す。上記実施例に示したような
免疫原に応答して産生された抗体とトレーサーとの種々
の組み合わせについて試験した。トレーサーが抗体に結
合した各組み合わせにおいて、正味の偏光は少なくとも
１５０ミリ偏光単位であり、５μｇ／ｍｌスパンは少な
くとも１５ミリ偏光単位であり、強度比はバックグラウ
ンドノイズに比べて３倍から１０倍の間で変化した。

【０１６１】第１表のデータが示すように、実施例１６
の免疫原に対して産生された抗体と実施例２６のトレー
サーとの組み合わせから、ＰＣＢアロクロル１２６０お
よび１２５４による抗体への良好な結合および良好な置
換が得られた。実施例１７の免疫原により産生されたポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体と実施例２９の
トレーサーとの組み合わせからは、ＰＣＢアロクロル１
０１６、１２２１、１２３２、１２４２、１２４８およ
び１２５４による抗体への良好な結合および良好な置換
が得られた。 第１表（正味のミリ偏光）

【表１】 第１表（続き）

【表２】 第１表（続き）

【表３】

【０１６２】第２表（５μｇ／ｍｌスパン）

【表４】 各アッセイ系について、抗体へのトレーサーの結合およ
び試料中の各アロクロル混合物によるトレーサーの置換
を上記第２表にまとめて示す。

【０１６３】実施例７４ 　　種々の構造的に類似した化合物の交差反応性を試験
した。その結果を下記第３表にまとめて示す。化合物の
アッセイは、既知量の被験化合物をＰＣＢ不含プロピレ
ングリコールに加え、ＴＤｘ緩衝液中の５０％溶液に希
釈し、ついでＴＤｘ装置上で試料をアッセイすることに
より行った。１００μｇ／ｍｌの濃度で被験化合物を試
験した。本発明の免疫原に対して産生させた抗血清また
はモノクローナル抗体はＰＣＢｓ含有アロクロルに対し
て高度の特異性を有することが決定され、本発明のトレ
ーサーと組み合わせてＰＣＢｓに対する高感度のＦＰＩ
Ａが得られた。そのデータを第３表に示す。

【０１６４】第３表（ＦＰＩＡ特異性＊）

【表５】 （＊）単位＝μｇ／ｍｌ

【０１６５】実施例７５ 　　フェンクロフェナクをアッセイ系に用いた。フェン
クロフェナクをアッセイ系に添加することにより、アッ
セイ系に存在する血清タンパク質、たとえば、希釈緩衝
液、抗体試薬または試料中に存在する血清タンパク質へ
のＰＣＢおよびＰＣＢトレーサーの非特異的結合を最小
に抑えることができる。フェンクロフェナクの最終濃度
は、約０．００５％〜約０．２６％、好ましくは約０．
０２％〜約０．２５％であり、約０．１３％の濃度が最
も好ましい。

【０１６６】使用した試料前処理試薬にフェンクロフェ
ナクを添加して実験を行った。フェンクロフェナクを０
％、２％および１０％溶液の濃度で加え、実施例２８、
２９、３１および３２のトレーサーを正常ウサギ血清（
ＰＣＢ免疫原を接種しなかったもの）および実施例６８
の抗血清（実施例１６、１７および１８の免疫原）と組
み合わせて試験した。第４表のデータに示すように、フ
ェンクロフェナクの添加により特異的抗体結合が得られ
、許容し得る正味のミリ偏光およびスパンが得られた。

【０１６７】第４表

【表６】 実施例７６ 　　任意に、実施例１６および実施例１７の抗体混合物
を実施例２９および実施例２６のトレーサー混合物と組
み合わせて用い、すべてのＰＣＢアロクロル混合物を単
一アッセイでアッセイするように設計することができる
。 抗体混合物とトレーサー混合物との組み合わせ濃度比は
、他方の抗体またはトレーサーと混合する一方の抗体ま
たはトレーサーが１０％〜９０％の範囲であってよく、
約３．５部の実施例１６の抗体を１部の実施例１７の抗
体と混合する混合濃度比、および３．５部の実施例２６
のトレーサーを１部の実施例２９のトレーサーと混合す
る混合濃度比が最も好ましい。

【０１６８】５μｇ／ｍｌのアロクロル１２６０、１２
５４、１２４８、１２４２、１２３２、１２２１および
１０１６混合物を好ましい１アッセイ混合試薬系にてア
ッセイした。第５表にまとめてあるように、この混合試
薬系により許容し得る正味のミリ偏光値およびスパンを
有するアッセイが得られた。

【０１６９】第５表（混合試薬アッセイ）

【表７】 アッセイのインキュベーション時間は、約５秒から約３
０分の間である。インキュベーション時間は約５分未満
であるのが好ましい。インキュベーション温度もまた、
およそ周囲温度（２５℃）から約４２℃までの範囲であ
ってよく、約３７℃が好ましい温度である。インキュベ
ーション条件および時間については、アッセイの実施者
により変えることができる。

【０１７０】本発明の多くの概念を他のタイプの結合ア
ッセイにも同様に適用し得ることは、当業者には理解さ
れるであろう。記載ならびに呈示した態様は単に例示し
たにとどまり、本発明を限定するものではない。それゆ
え、本発明の記載は本発明を開示した特定の態様に限定
するものではなく、発明の詳細な説明および添付の特許
請求の範囲に記載した発明の精神および内容から逸脱す
ることなくすべての等価物および発明を包含するもので
ある。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中のポリ塩化ビフェニルを含む分
   析対象物の存在または量の検出方法であって、（ａ）検
   出可能な残基で標識した既知濃度のトレーサーおよび既
   知濃度の分析対象物特異的抗体を該試料に加えて混合物
   とし、（ｂ）標識トレーサー−抗体複合体および分析対
   象物−抗体複合体を生成するのに充分な条件および時間
   で該混合物をインキュベートし、ついで（ｃ）該生成し
   たトレーサー−抗体複合体の存在または量を測定して試
   料中の分析対象物の存在または量を測定することを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】　　ポリ塩化ビフェニルが下記式：【化１
   】 （式中、ｘ＝０〜５）で示される構造を有する、請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】　　検出可能な残基がフルオレセインおよ
   びフルオレセイン誘導体から選ばれたものであり、該フ
   ルオレセイン誘導体がフルオレセインアミン、カルボキ
   シフルオレセイン、α−ヨードアセトアミドフルオレセ
   イン、４’−アミノメチルフルオレセイン、４’−Ｎ−
   アルキルアミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチ
   ルフルオレセイン、６−アミノメチルフルオレセイン、
   ２，４−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル
   −アミノフルオレセイン、４−クロロ−６−メトキシ−
   １，３，５−トリアジン−２−イル−アミノフルオレセ
   インおよびフルオレセインイソチオシアネートよりなる
   群から選ばれたものである、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】　　トレーサーが下記式：【化２】 （式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を含む０〜５０個
   の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽和または不飽和
   の直鎖または分枝鎖であって、２個以下のヘテロ原子が
   連続して連結し分枝は炭素原子上でのみ起こるものから
   選ばれるスペーサー基；Ｍは＞Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ−
   Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選
   ばれた連結基；Ｆｌは検出可能な残基である）で示され
   る一般構造を有する請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】　　工程（ａ）が、タンパク質に対する非
   特異的結合を防ぐために、下記式： 【化３】 （式中、Ｙ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｃｌ、Ｒ２＝Ｈ、Ｊ＝ＣＨ２Ｃ
   Ｏ２Ｈである）で示される化合物を試料に加えることを
   さらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】　　下記式： 【化４】 （式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を含む０〜５０個
   の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽和または不飽和
   の直鎖または分枝鎖であって、２個以下のヘテロ原子が
   連続して連結し分枝は炭素原子上でのみ起こるものから
   選ばれるスペーサー基；Ｍは＞Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ−
   Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選
   ばれた連結基；Ｆｌは検出可能な残基である）で示され
   る一般構造を有するトレーサー。
7. 【請求項７】　　下記式： 【化５】 （式中、Ａは１０個以下のヘテロ原子を含む０〜５０個
   の炭素原子およびヘテロ原子からなる飽和または不飽和
   の直鎖または分枝鎖であって、２個以下のヘテロ原子が
   連続して連結し分枝は炭素原子上でのみ起こるものから
   選ばれるスペーサー基；Ｍは＞Ｃ＝Ｏ、−ＮＨ−、Ｏ−
   Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝ＯおよびＮ−Ｃ＝Ｓよりなる群から選
   ばれた連結基；Ｑは免疫原性担体である）で示される一
   般構造を有する免疫原。
8. 【請求項８】　　免疫原性担体がアルブミン、血清タン
   パク質、眼レンズタンパク質、リポタンパク質、ウシ血
   清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵
   アルブミン、チログロブリンおよびウシガンマグロブリ
   ンよりなる群から選ばれたものである、請求項７に記載
   の免疫原。
9. 【請求項９】　　ポリ塩化ビフェニルおよびトレーサー
   のタンパク質および表面への非特異的結合を減少させる
   ために添加する化合物であって、下記式：【化６】 （式中、Ｙ＝Ｏ、Ｒ１＝Ｃｌ、Ｒ２＝Ｈ、Ｊ＝ＣＨ２Ｃ
   Ｏ２Ｈである）で示される構造を有する化合物。
10. 【請求項１０】　　試料中のポリ塩化ビフェニルを含む
    分析対象物の存在または量を検出するためのキットであ
    って、（ａ）分析対象物特異的抗体、（ｂ）検出可能な
    残基で標識したトレーサー、および（ｃ）分析対象物の
    タンパク質への非特異的結合を防ぐために添加する化合
    物からなることを特徴とするキット。