WO2004096814A1

WO2004096814A1 - ポリ塩化ビフェニル誘導体及びこれを使用した測定法

Info

Publication number: WO2004096814A1
Application number: PCT/JP2004/006136
Authority: WO
Inventors: Yoshifumi Ohno; Yasuaki Usuki; Chizuko Yanaihara; Ikuo Kato; Kazuyuki Kitamura
Original assignee: Yanaihara Institute Inc.
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2004-11-11
Also published as: JPWO2004096814A1

Description

明細書ポリ塩ィヒビフエニル誘導体及びこれを使用した測定法技術分野

本発明は、新規なポリ塩化ビフエニル（以下、 rpCBj という）誘導体、及びこれを使用した P C B又はコブラナー P C Bの改良された免疫測定法に関する。背景技術

PCBは毒性が強く、製造、使用が禁止されているが、過去に製造されたものが、環境中の大気、河川、土壌、底質に拡散されており、また、製造物も多量に保管されたままになっている。そして、 2001年 6月に PCB処理特別措置法が成立し、同年 7月に施行されたことから、現在保管している PC Bを 2016 年までに無害化処理することが企業に義務付けられている。

一方、コブラナー PC Bは PC Bのうち平面構造を有する PC Bであり、ダイォキシン類に属し、毒性係数（TEF) が定められている。そして、 1999年に発表されたダイォキシン類特別措置法に基づき、地域の自浄能力を基本目標として、 TEFに従って環境基準が定められ、環境保全がなされている。

従来、 PCBの測定に関しては、主にガスクロマトグラフィー（GC) が行われている。しかしながら、この方法は GC機器をもつ特別な施設を要し、多数の検体（サンプル）の処理能力に限界があり、また、上記に示した PCB分解処理事業が進むことから、適性に分解されているか否かを調査するため、 PCB測定の需要はさらに増すことが予想される。

従って、より簡便で多数の検体中の P CBを迅速に測定 ·検出できる方法が望まれ、最近では、免疫測定（EL I SA) による PCBの測定法が報告されている (例えば、フィールドアナリティカルケミストリ一アンドテクノロジー (F ield analytical chemistryand technology) , 1999年， 3卷， 179-184) 。

しかしながら、該 E L I S Α法は間接競合法によるもので、 P C B自体を測定プレートに固定しなければならず、現在特定化学物質第一類に属する PCBは永久保管が義務付けられているため、プレート自体も保管対象となってしまうという問題がある。

本発明は、上記の保管の問題もなく PCB又はコブラナー PCBを簡便に測定できる方法を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は、上述した免疫測定法本来の利点は保持したままで、 P C B又はコブラナー P C Bを測定プレ一トに固相化することなく測定 ·検出できる改良された免疫測定法及びこれに用いられる標識体を提供することをその主要な目的とする。発明の開示

本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、下記一般式（1) で表される新規なピオチン化 P C B誘導体が、上記目的に合致する免疫測定法における標識体として有用であることを見出した。

すなわち、本発明は、一般式（1) ：

(1)

〔式中、 X及び Yは同一又は相異なって水素原子又は塩素原子を示し、 R¹はビォチン残基を示し、 R²は同一又は相異なってアルギニン残基又はリジン残基を示し、 ηは 1〜5の整数を示し、 mは 1〜 3の整数を示す。〕

で表されるピオチン化 P C B誘導体を提供するものである。また、本発明は、上記ピオチン化 P C B誘導体を標識体として利用することを特徴とする P C B又はコブラナー P C Bの免疫測定法を提供するものである。本発明のピオチン化 P C B誘導体を用いれば、 P C B又はコプラナ一 P C Bを測定プレートに固相化することなく P C B又はコブラナー P C Bを測定 ·検出できる。従って、プレート自体を保管しなければならないという問題を起こすことなく、迅速且つ簡便に P C B又はコプラナ一 P C Bを測定 ·検出することができる。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 2に従い作成された本発明免疫測定法における標準曲線である。発明を実施するための最良の形態

本発明のピオチン化 P C B誘導体は、免疫測定系の液相に可溶である（水溶性である）ことによって特徴付けられる。従って、これは P C B又はコブラナー P

C B免疫測定法における標識体として極めて有用である。

ピオチンは、ピオチン/ァビジンの特異結合を利用した間接標識剤として慣用されており、また、一般の酵素類と比較して、低分子（分子量 2 4 4. 3 1 ) であることより、免疫測定法における標識体としての利用が好ましいものの、それ自体水溶性に欠けており、水溶性に欠ける P C Bとの結合体は、当然に水不溶性であるため、上記免疫測定法には採用することが極めて困難である。

これに対して、本発明のピオチン化 P C B誘導体は、 P C B又はコプラナ一 P

C B免疫測定法への利用に適した水溶性を具備しており、しかも抗 P C B抗体との交差反応性を消失しないものであり、これらの点より、斯界で要望される P C

B又はコプラナ一 P C B免疫測定法への利用に適したものである。一般式（1) 中、 Xが水素原子であり、 Yが塩素原子であり、 nが 5であり且つ mが 2である本発明ピオチン化 P C B誘導体は、毒性係数が定められておらず、毒性係数の定められているコブラナー P C Bに比し、毒性が極めて低いと予想され、従ってこの誘導体を利用することは、その安全性が高く保たれると考えられる。

一般式（1) における一（R²) _ffi-NHNH-R'tt, R'で示されるピオチン残基のカルボキシル基と、 R²で示されるアミノ酸残基のカルボキシル基がヒドラゾ基を介して結合することを意味する。

また、 R²で示されるアミノ酸残基（A r g及び Ly s) は、特に断らない限り、 D体及び L体の両者を包含するものとする。

本発明のピオチン化 PCB誘導体は、例えば、下記一般式（2) で示される化合物と、一般式（3) で示される化合物との縮合反応により製造することができる。

〔式中、 R R²、 X、 Y、 m、 nは前記に同じ。〕

ここで一般式（3) の化合物は、通常の液相法及び固相法を包含する一般的なペプチド化学合成法に従い、例えば、ピオチンヒドラジド及び所望のアミノ酸の 1種を、又は 2種以上を順次、縮合反応させることにより製造することができる。該合成法において、採用される縮合反応も、公知の各種縮合反応に従うことができる。

該合成法に採用される縮合反応としては、例えば、アジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、酸化還元法、 DPPA (ジフエニルホスホリルアジド法）、 DCC+添加物 ( 1ーヒドロキシベンゾ卜リァゾール、 N—ヒドロキシスクシンアミド、 N—ヒドロキシー 5—ノルポルネン一 2， 3—ジカルポキシイミド等）、ゥッドワード法等を例示できる。

これら各方法に利用される溶媒も、この種のぺプチド縮合反応に慣用される各種の溶媒から適宜選択することができる。その例としては、例えば N—メチリピ口リドン (NMP) 、ジメチルホルムアミド (DMF) 、ジメチルスルホキシド (DMSO) 等及びこれらの混合溶媒等を例示できる。

尚、上記縮合反応において、反応に関与しない官能基は、常法に従い、通常の保護基により保護でき、これらは反応終了後に脱離できる。これら各反応方法は公知であり、それらに用いられる試薬類も公知のものから適宜選択できる。例えば、ァミノ基の保護基としては、ベンシルォキシカルポニル、第三級ブトキシカルポニル（Boc) 、イソポルニルォキシカルポニル、 p—メトキシベンジルォキシカルポ二ル等を例示できる。

アルギニンのグァニジノ基の保護基としては、例えば 2, 2, 5, 7, 8—ぺンタメチルクロモン— 6—スルホニル (Pmc) 、 2, 2, 4, 6, 7—ペン夕メチルジヒドロべンゾフラン一 5—スルホニル（Pb f) 、ニトロ、ベンジルォキシカルボニル、 Bo c, p—トルエンスルホニル等を例示できる。

これら保護基の脱離反応もまた慣用される方法、例えば、接触還元法や、液体アンモニア zナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルォロ酢酸

(TFA) 、酢酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従い実施できる。一般式 (2) の化合物と一般式 (3) の化合物の縮合反応も、上記した縮合反応に準じて実施することができ、保護基の導入と脱離も同様にして行うことができる。尚、一般式 (2) の化合物は、公知の方法 (Toxicology and Appliedpharmaco logy, 50, 137-146 (1979)等）に従い容易に製造することができる。

斯くして得られる本発明の一般式 (1) で表されるピオチン化 PC B誘導体は、定法に従い、高速液体クロマトグラフィー等の各種の精製手段により適宜その精製を行うことができる。

本発明のピオチン化 PCB誘導体の利用によれば、通常の免疫測定法、例えば酵素免疫測定法（EL I SA法）等の方法に従って、 PCB又はコプラナ一 PC Bの特異的且つ高感度な測定 ·検出が可能である。ここで、 PCBとは、ビフエニル骨格に塩素 1〜10個が結合した化合物をいい、例えば産業界で使用されていたカネクロール、ァロクロール等の PCB異性体（2〜6塩素化体）混合物も含まれる。

本発明の免疫測定法は、当該ピオチン化 PC B誘導体を測定系の標識体として利用するものであり、それ以外は通常の各種免疫分析方法に従い実施することができる。

測定系の抗 PCB抗体は、所望により、各種の任意の固相に固定化して用いることができる。当該固相としては、この種の技術分野において慣用の各種の固相が利用できる。該固相への抗体の固定化も、特に制限はなく、通常の物理的結合及び化学的結合のいずれによっても実施することができる。

免疫反応も特に制限はなく、通常の免疫測定法で採用されている条件、例えば、一般には 45で以下、通常 4〜4 Ot:にて約 0. 5から数時間程度の条件下に実施することができる。また、反応に使用される溶媒及びその pHも当該反応に悪影響を与えないものであれば、特に制限されない。その例としては、例えばクェン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液等を挙げることができる。

本発明測定法は、好適には、本発明標識体を用いる競合法に従い実施することができる。例えば、抗 PC B抗体を固相化してなる固相化抗体に、標識体としての本発明誘導体の存在下に、測定対象の PC Bを含み得る検体を加えて、抗原抗体反応（競合）を行わせる。次いで、固相化抗体に結合した標識体を通常のアビジンからなる検出試薬を用いて測定する。

ここでアビジンからなる検出試薬としては、特に制限されることなく一般に当業界で採用されている各種の標識剤で修飾されたアビジンあるいはストレブトァビジンを広く用いることができる。アビジンの標識剤としては、特に制限されず、従来公知のもの又は将来使用され得るいずれのものをも用いることができる。具体的には、ペルォキシダーゼ（HRP) やアルカリフォスファターゼ（A LP) 等の酵素類を好ましいものとして例示することができる。これら標識剤によるアビジンの修飾は、自体公知の方法に従って実施できる。また、これらの修飾体は、市販品としても入手できる。

また、抗 PCB抗体がプレートに固相化されており、 PCB、コプラナ一 PC B及び標識体は直接プレートに固相化されないことから、発色後に p Hを操作することにより容易に液相に移行し得る。

尚、標準品（スタンダード）としては、 PCB或いはその構造類似物質が利用でき、特に PC Bの一つである下記の 3, 4, 5- Trichlorobiphenylが好ましいものとして例示できる。

本発明に係る P CB又はコブラナー P CBの特異的測定 ·検出法の特に好ましい一例としては、後述する実施例に記載の高感度 EL I S A法が挙げられる。本発明に係る P CB又はコブラナー P CBの測定 ·検出に際しては、本発明ビォチン化 P CB誘導体を有効成分として含有する測定キットを利用するのが簡便である。斯かるキットには、当該誘導体に加えて、前記したアビジンからなる検出試薬、抗 P C B抗体、標準品及びアツセィ緩衝液等の、当該測定 ·検出を実施するのに際して必要な、任意の他の試薬をさらに包含させることができる。本発明に係る P C B又はコブラナー P C Bの測定法は、被検物質としてのヒト及び動物中の、即ちヒト及び動物の組織、血液、尿、骨髄液、唾液及び魚類の組織及び血液中の測定 ·検出に有効な手段を与えるものであり、外因性物質の生体刺激一分泌機構或いは臓器組織への影響の解明 ·研究に役立つものである。本発明に係る P C B又はコプラナ一 P C Bの測定法は、被検物質としての灰、土壌、底質、オイル、河川、海水、排水、大気等環境中の P C B又はコプラナ一 P C Bの測定 ·検出にも有用である。

本発明測定法に利用される抗 P C B抗体は、測定対象である P C B或いはコプラナ一 P C Bに特異反応性を有するものであれば、特に制限はなく、これらは前記した各種公知の抗体或いはそれらに準じて製造した抗体であることができる。該抗体には、温血動物の抗血清や鶏卵抗体等のポリクローナル抗体及びモノク口 —ナル抗体が含有され、対象とする P C B異性体に応じて適宜選択することがでぎる。

上記において免疫抗原としては、好ましくは前記一般式（2 ) で表される化合物のキヤリァ蛋白結合体であることができる。

上記キャリア蛋白としては、抗原又はハプテンの免疫原性を高めるものとして当該分野で慣用の各種キャリア蛋白、例えばアルブミン、グロブリン、チォグロブリン、へモシァニン等の各種動物蛋白質やポリリジン等を制限なく採用できる。これらキャリア蛋白質は、前記した縮合反応と同様にして、慣用の試薬を用いた縮合反応により、一般式 ( 2 ) の化合物との結合体とすることができる。斯くして得られるキャリア蛋白結合体は、それ自体所望の免疫原性を有し、本発明測定法に良好に採用し得る特異抗体製造用の免疫抗原として使用できる。尚、かかる免疫抗原は、所望により、上記キャリア蛋白結合体を高分子吸着体に吸着させて得られる吸着体として使用することもできる。

ここで、高分子吸着体としては、免疫原性を高めるものとして、当該分野で慣用される各種高分子物質を採用することができ、例えば、ポリビニルピロリドン、ラテックス、ブタチォグロプリン等の血清蛋白質及び炭素末等を例示できる。該高分子吸着体と上記キャリア蛋白質とを常法に従い混和することにより所望の吸着体が得られる。

上記免疫抗原を用いた免疫及び所望の抗体の取得操作も、常法に従うことができる。例えば、ポリクローナル抗体の製造は、ゥサギ、ヒッジ、モルモッ卜、二ヮトリのような温血動物に、上記免疫抗原を通常、フロイン卜の完全アジュバン卜と混和して調製した乳化物を、複数回注射免疫し、得られる抗血清を常法に従い取得することにより実施できる。また、ニヮトリの場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニヮトリが産卵する鶏卵にィムノグロブリン（I g Y) を産生させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従い I g Yを取得することによっても、所望のポリクローナル抗体を得ることができる。

また、斯かる抗体は、勿論モノクローナル抗体として取得することもできる。該モノクローナル抗体は、例えば上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバントとともにマウスに複数回投与して免疫し、抗体を産生させるとともに、例えば細胞融合等の常法に従い、得られる抗体産生細胞と骨髄脾細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができる。斯くして得られる抗体は、所望により、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー等の常法に従いさらに精製することができる。実施例

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は非制限的なものであり、本発明の範囲はそれらの例によって限定解釈されるべきものではない。実施例 1 ピオチン化 P C B誘導体の作製

上記一般式 (1) のうち、 nが 5、 mが 2で R²はいずれもアルギニン (A r g) 残基である 6— （3, 3' ， 4，， 5' - t e t r ac h l o r ob i ph eny 1— 4— y 1 o x y) h e x a n o y 1— Ar g— Ar g— NHNH— b i o t i nを作製するにあたり、上記一般式 (3) のうち、 mが 2で R²はいずれも A r g残基である H— A r g (Pb f) -A r g (Pb f) —NHNH— b i o t i nの作製を行った。

即ち、 Fmo c— Ar g (P b f ) -OH (648. 8mg) 、 HOB t (1 35. lmg) 及び b i o t i n-N₂H₃ (258. 3mg) を DMF (5m L) に溶解後、ー10°(で 3 0 (211. 7 iL) を加え室温で 18時間攪拌した。溶媒を留去、残さを酢酸ェチルに溶解し、 IN HC 1、 5%NaHC 0₃及び飽和食塩水で洗浄後、無水 Na₂S〇₄で乾燥、ろ過した。ろ液を濃縮、残さに石油エーテルを加え固化後、酢酸ェチルー石油エーテルより再沈殿し Fm o c—Ar g (Pb f) — NHNH— b i o t i n (800. 2mg) を得た。ここで得た Fmo c -Ar g (Pb f) — NHNH— b i o t i n (800. 2mg) を 20%ピぺリジンのジクロロメタン溶液 (5mL) に溶解、室温で 1 0分間攪拌後溶媒留去、残さを酢酸ェチルに溶解した。酢酸ェチル層を蒸留水及び飽和食塩水で洗浄、乾燥後、溶媒留去し残さにエーテルを加え固化し H— A r g (Pb f) — NHNH— b i o t i nを 366. 8mg得た。

この H— Ar g (Pb f) — NHNH—b i o t i n (366. 8mg) 、 H OB t (89. 2mg) 及び Fmo c— Ar g (Pb f) 一 OH (374. 7 m g) を DMF (5mL) に溶解、一 10。Cで WSCD (116. 4 xL) を加え室温で 18時間攪拌後、溶媒を留去した。残さに氷冷下蒸留水を加え固化、メタノール一エーテルから再沈殿し Fmo c—Ar g (Pb f) 一 Ar g (Pb f) —NHNH—b i o t i n (635. 2mg) を得た。

ここで得た Fmo c— Ar g (Pb f) —Ar g (Pb f) -NHNH-b i o t i n (635. 2mg) を先の方法と同様に 20 %ピぺリジンのジクロロメタン溶液（5mL) で室温 10分間処理し、残さを酢酸ェチルに溶解、蒸留水及ぴ飽和食塩水で洗浄、乾燥後、溶媒を留去した。残さをメタノールに懸濁し不溶物をろ去後、ろ液を濃縮、残さにエーテルを加え 503. 2mgの H— Ar g (Pb f ) -Ar g (Pb f ) 一 NHNH— b i o t i nを得た。

上記一般式（2) のうち nが 5の 6— (3, 3 ' , 4' , 5， - t e t r a c h l o r ob i phe ny l— 4— y l oxy) h e x a n o i c a c i d (8. 4mg) 、 HOB t (5. 9mg) 及び H— Ar g (P b f ) 一 Ar g (Pb f ) — NHNH— b i o t i n (23. 7mg) を DMF (3mL) に溶解、 — 10 で WSCD (7. 8/iL) を加え室温で 18時間攪捽後、溶媒を留去した。残さに氷冷下蒸留水を加え固化し粗生成物 26. 7mgを得た。この粗生成物（26. 7mg) を T I PS (0. 15mL) を含む T FA (3. 85m L) に溶解し、室温で 2時間攪拌後溶媒を留去後、残さにエーテルを加え粗生成物 6— (3, 3 ' ， 4 ' ， 5 ' - t e t r ac h l o r ob i pheny l -4 一 y l oxy) he x anoy l— Ar g— Ar g— NHNH— b i o t i n (17. 8mg) を得た。ここで得た粗生成物 17. 8mgを 50%酢酸（3m L) に溶解し 0. 2 %TFA/ァセトニトリル混合溶媒系を用いる逆相 HP LC により精製し、目的の化合物 6— （3, 3' , 4' ， 5' - t e t r ac h l o r ob i pheny l— 4— y l oxy) he xanoy l— Ar g— Ar g— NHNH_b i o t i nを 6. Omg得た。

実施例 2 ピオチン化 PC B誘導体を使用した免疫測定法

(1) 抗体固相化プレートの作製

96ゥエルのマイクロプレートの各ゥエルに、 D— PBS (日水製薬）で 1. 2 gZmLに調整した抗 PCB I g G抗体を 100 Lづっ分注した。 4°C で 18〜24時間静置後、洗浄液（0. 9% NaC 1 , 0. 05% Twe e n 20含有）で 3回洗浄後、ブロッキング液 (1% BSA, 5% ソルビト —ル含有 D— PB S) を各ゥエルに 300 Lづっ分注して 4°Cで 1 8〜24時間静置した。上清を捨て、 25°Cインキュベータ一にて一晩乾燥させ、抗 PCB 抗体固相化プレートを得た。

(2) 標準液の調製

3, 4, 5-Tr i c h l o r ob i phe ny l (C I L社製）を DMS〇に溶かし、濃度 63 g/mLの標準液とした。この溶液をクェン酸緩衝液 (0. 05% BSA, 0. 6M N a C 1 , 0. 05% NaN₃含有 100 mMクェン酸）にて、 3000 n g/mLに希釈調整後、クェン酸緩衝液で 4倍希釈の操作を行い、 6濃度の標準希釈液を調製した。

(3) 標識体の調製

実施例 1で得たピオチン化 P C B誘導体を吸光度 2. 0となるようにクェン酸緩衝液で希釈して使用した。

(4) 酵素標識体の調製

S t r e p t av i.d i n-HRP (Onc ogen e社製）を S t a b i 1 i z yme— HRP (S u r Mo d i c s社製）で 20 g/mLに調整し、これを用時にリン酸緩衝液（0. 1 BSA, 0. 1%プロクリン， 0. 005% Twe e n 20含有 D— PBS) で 80 1倍希釈して使用した。

(5) 発色液

TMB液（DAKO社製）を使用した。

(6) 測定

抗 P C B抗体固相化プレー卜の各ゥエルに標準品 50 ^ L又は測定すべき検体 50 Lを加え、さらに上記標識体 50 / Lを添加し、プレートをシールで密封し、室温にて 2時間反応させた。つづいて、各ゥエルを洗浄液で 3回洗浄後、上記酵素標識体を 100 /i Lずつ注入し、室温で 1時間反応させた。各ゥエルを 3 回洗浄後、発色液を 1 0 0 /zLずつ注入し、室温で 1 0分間反応させ、停止液として 2N硫酸 100 Lずつ加え、マイクロプレート用吸光度計を用いて、波長 4 5 0 nm (対照波長 6 5 0 nm) の吸光度を測定した。斯くして得られた標準曲線を図 1に示す。

Claims

般式（1 )

〔式中、 X及び Υは同一又は相異なって水素原子又は塩素原子を示し、 R ¹はビォチン残基を示し、 R²は同一又は相異なってアルギニン残基又はリジン残基を示し、 ηは 1〜5の整数を示し、 mは 1〜3の整数を示す。〕

で表されるピオチン化 P C B誘導体。

2 . Xが水素原子であり、 Yが塩素原子であり、 nが 5であり、 mが 2である請求項 1記載のピオチン化 P C B誘導体。

3 . 請求項 1記載のピオチン化 P C B誘導体を標識体として利用することを特徴とする P C B又はコブラナー P C Bの免疫測定法。