JP2794181B2 - デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤 - Google Patents
デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤Info
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- JP2794181B2 JP2794181B2 JP1004393A JP439389A JP2794181B2 JP 2794181 B2 JP2794181 B2 JP 2794181B2 JP 1004393 A JP1004393 A JP 1004393A JP 439389 A JP439389 A JP 439389A JP 2794181 B2 JP2794181 B2 JP 2794181B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明はデスチオビオチン誘導体及びそれからなるデ
スチオビオチン標識化剤に関する。さらに詳細には、生
化学等の分野で標識化（ラベル化）剤として有用なデス
チオビオチン誘導体及びそれを用いたデスチオビオチン
標識化剤に関する。
スチオビオチン標識化剤に関する。さらに詳細には、生
化学等の分野で標識化（ラベル化）剤として有用なデス
チオビオチン誘導体及びそれを用いたデスチオビオチン
標識化剤に関する。
＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞ 従来、生化学等の分野において、生体等から得られる
微量の生化学物質の分離にアフィニティクロマトグラフ
ィーが汎用されている。アフィニティクロマトグラフィ
ーは生体系の特定の物質間の特異的相互作用を利用する
分離方法で、選択性が高く、酵素を始めとする生化学物
質の分離精製法として最適の方法である。このような相
互作用を及ぼしあう物質対には、酵素とその基質、抗原
とその抗体などの多くのものが知られており、この物質
対の一方を不溶性担体（アガロース、セルロース等）に
固定化し、他方の物質と接触させることにより、特異的
吸着体を得ることができ、次いで吸着体の結合を解離さ
せることにより目的物を高純度で得ることができる。
微量の生化学物質の分離にアフィニティクロマトグラフ
ィーが汎用されている。アフィニティクロマトグラフィ
ーは生体系の特定の物質間の特異的相互作用を利用する
分離方法で、選択性が高く、酵素を始めとする生化学物
質の分離精製法として最適の方法である。このような相
互作用を及ぼしあう物質対には、酵素とその基質、抗原
とその抗体などの多くのものが知られており、この物質
対の一方を不溶性担体（アガロース、セルロース等）に
固定化し、他方の物質と接触させることにより、特異的
吸着体を得ることができ、次いで吸着体の結合を解離さ
せることにより目的物を高純度で得ることができる。
このようなアフィニティクロマトグラフィーの一方法
として、単離・精製をしようとする物質（以下、目的物
質という）に、特異的相互作用を及ぼしあう物質対の一
方を結合させて標識化すると共に上記物質対の他方を固
定化した不溶性担体（固相）を用い、標識化された目的
物質を固相上に固定化し、次いで該物質対間の結合を解
離して、目的物質を単離・精製する方法が知られてい
る。この方法に使用される特異的相互作用を及ぼしあう
物質対として、ビオチン−アビジンが汎用され、既に不
溶化担体としてアビジン固定化アガロース、ビオチン固
定化アガロース、またビオチン標識化剤としてビオチン
メチルエステル、ビオチンヒドラジド等が販売されてい
る。
として、単離・精製をしようとする物質（以下、目的物
質という）に、特異的相互作用を及ぼしあう物質対の一
方を結合させて標識化すると共に上記物質対の他方を固
定化した不溶性担体（固相）を用い、標識化された目的
物質を固相上に固定化し、次いで該物質対間の結合を解
離して、目的物質を単離・精製する方法が知られてい
る。この方法に使用される特異的相互作用を及ぼしあう
物質対として、ビオチン−アビジンが汎用され、既に不
溶化担体としてアビジン固定化アガロース、ビオチン固
定化アガロース、またビオチン標識化剤としてビオチン
メチルエステル、ビオチンヒドラジド等が販売されてい
る。
しかしながら、ビオチン−アビジン間の相互作用は極
めて強く、上記の方法で形成されたビオチン−アビジン
結合体のビオチン−アビジン間の結合の解離が容易でな
く又その解離に苛酷な条件を必要とするため解離操作中
に目的物質が変性し易いという問題がある。
めて強く、上記の方法で形成されたビオチン−アビジン
結合体のビオチン−アビジン間の結合の解離が容易でな
く又その解離に苛酷な条件を必要とするため解離操作中
に目的物質が変性し易いという問題がある。
かかる問題から、ビオチンよりもアビジンとの結合性
の弱いデスチオビオチンを用いる方法が提案され、この
方法に使用される標識化剤としてデスチオビオチンスク
シンイミドエステル誘導体が知られている。このデスチ
オビオチンスクシンイミドエスエル誘導体は、目的物
質、例えば、蛋白質等のアミノ基と反応し、アミド結合
を介してデスチオビオチンを導入するものであるが、ア
ミノ基とランダムに反応する結果、目的物質１分子当り
に導入されるデスチオビオチンの数を一定とすることが
困難であり、また蛋白質の変性等を生じ易いという問題
がある。
の弱いデスチオビオチンを用いる方法が提案され、この
方法に使用される標識化剤としてデスチオビオチンスク
シンイミドエステル誘導体が知られている。このデスチ
オビオチンスクシンイミドエスエル誘導体は、目的物
質、例えば、蛋白質等のアミノ基と反応し、アミド結合
を介してデスチオビオチンを導入するものであるが、ア
ミノ基とランダムに反応する結果、目的物質１分子当り
に導入されるデスチオビオチンの数を一定とすることが
困難であり、また蛋白質の変性等を生じ易いという問題
がある。
本発明はかかる従来技術の欠点を解消するためになさ
れたもので、本発明者らが、アビジンとの結合定数が小
さく比較的緩和な条件下で解離することができると共に
目的物質を変性させることのない標識化物質を鋭意研究
した結果、本発明のデスチオビオチン誘導体が上記目的
を達成できることを見出したもので、新規なデスチオビ
オチン誘導体及びそれからなるデスチオビオチン標識化
剤を提供することを目的とする。
れたもので、本発明者らが、アビジンとの結合定数が小
さく比較的緩和な条件下で解離することができると共に
目的物質を変性させることのない標識化物質を鋭意研究
した結果、本発明のデスチオビオチン誘導体が上記目的
を達成できることを見出したもので、新規なデスチオビ
オチン誘導体及びそれからなるデスチオビオチン標識化
剤を提供することを目的とする。
＜課題を解決するための手段及び作用＞ 上記の課題を解決すべくなされた本発明は、一般式
（１） ［式中、Ｒはアミノ基又は基： （式中、Ａは低級アルキレン基を示す）］ で表されるデスチオビオチン誘導体であり、また上記一
般式（１）で表されるデスチオビオチン誘導体からなる
標識化剤である。
（１） ［式中、Ｒはアミノ基又は基： （式中、Ａは低級アルキレン基を示す）］ で表されるデスチオビオチン誘導体であり、また上記一
般式（１）で表されるデスチオビオチン誘導体からなる
標識化剤である。
本発明は上記の構成よりなり、デスチオビオチン−ア
ビジン間の結合定数は、ビオチン−アビジン間の結合定
数より小さいので、デスチオビオチン−アビジン間の解
離はビオチンを用いた場合に比べ、比較的緩和な条件下
で行なうことができる。また一般式（１）で表される化
合物において、Ｒはアミノ基であるヒドラジド化合物
は、糖を含有する目的物質へ該糖を介してデスチオビオ
チンを導入することができ、糖は目的物質の側鎖として
存在することが多いので、目的物質の立体構造等がその
まま維持されるので変性等の問題が少なく、また予め求
められた１分子当りの糖の数から導入されるデスチオビ
オチンの数を定めることも容易にできる。
ビジン間の結合定数は、ビオチン−アビジン間の結合定
数より小さいので、デスチオビオチン−アビジン間の解
離はビオチンを用いた場合に比べ、比較的緩和な条件下
で行なうことができる。また一般式（１）で表される化
合物において、Ｒはアミノ基であるヒドラジド化合物
は、糖を含有する目的物質へ該糖を介してデスチオビオ
チンを導入することができ、糖は目的物質の側鎖として
存在することが多いので、目的物質の立体構造等がその
まま維持されるので変性等の問題が少なく、また予め求
められた１分子当りの糖の数から導入されるデスチオビ
オチンの数を定めることも容易にできる。
また一般式（１）で表される化合物において、Ｒが
基： （式中、Ａは前記と同じ） であるマレイミド誘導体は、目的物質中のチオール基
（−SH基）を介してデスチオビオチンを目的物質に導入
するもので、予め求められたチオール基の数から導入さ
れるデスチオビオチンの数を容易に定めることができ、
又遊離チオール基と反応するので変性の程度も少ない。
基： （式中、Ａは前記と同じ） であるマレイミド誘導体は、目的物質中のチオール基
（−SH基）を介してデスチオビオチンを目的物質に導入
するもので、予め求められたチオール基の数から導入さ
れるデスチオビオチンの数を容易に定めることができ、
又遊離チオール基と反応するので変性の程度も少ない。
上記一般式（１）で表される化合物の基Ｒにおいて、
Ａで示される低級アルキレン基としては、例えば、メチ
レン、メチルメチレン、エチレン、ジメチルメチレン、
トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルト
リメチレン、2,2−ジメチルトリメチレン、テトラメチ
レン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン等の炭素数１〜
６の直鎖状又は分枝鎖状のアルキレン基が挙げられる。
Ａで示される低級アルキレン基としては、例えば、メチ
レン、メチルメチレン、エチレン、ジメチルメチレン、
トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルト
リメチレン、2,2−ジメチルトリメチレン、テトラメチ
レン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン等の炭素数１〜
６の直鎖状又は分枝鎖状のアルキレン基が挙げられる。
一般式（１）で表される化合物の好ましい態様として
は、デスチオビオチンヒドラジド又はＮ−デスチオビオ
チニル−Ｎ′−（４−マレイミドブタノイル）ヒドラジ
ンが挙げられる。
は、デスチオビオチンヒドラジド又はＮ−デスチオビオ
チニル−Ｎ′−（４−マレイミドブタノイル）ヒドラジ
ンが挙げられる。
本発明の目的化合物である一般式（１）で表される化
合物は種々の方法により得ることができ、例えば、下記
反応工程式−１又は２の方法により製造することができ
る。
合物は種々の方法により得ることができ、例えば、下記
反応工程式−１又は２の方法により製造することができ
る。
（式中、Ｒ及びＡは前記と同じ） 上記の反応工程式において、反応工程式−１に示され
る方法は、一般式（２）で表される化合物又はそのカル
ボキシ基における反応性誘導体と一般式（３）で表され
る化合物とを反応させることにより行われる。
る方法は、一般式（２）で表される化合物又はそのカル
ボキシ基における反応性誘導体と一般式（３）で表され
る化合物とを反応させることにより行われる。
上記の一般式（２）で表される化合物のカルボキシ基
における反応性誘導体の例としては、エステル、酸ハロ
ゲン化物、酸無水物等が挙げられる。これらの反応性誘
導体の好適な例としては、酸ハロゲン化物（例えば、酸
塩化物、酸臭化物など）；対称性酸無水物；脂肪族カル
ボン酸（例えば、酢酸、ピバリン酸など）、置換された
リン酸（例えば、ジアルキルリン酸、ジフェニルリン酸
など）のような酸との混合酸無水物；低級アルキルエス
エル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロ
ピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステ
ル、ペンチルエステル、ヘキシルエステルなど）、置換
されていてもよいアル（低級）アルキルエステル（例え
ば、ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、ｐ−
クロロベンジルエステルなど）、置換されていてもよい
アリールエステル（例えば、フェニルエステル、トリル
エステル、４−ニトロフェニルエステル、2,4−ジニト
ロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、
ナフチルエステルなど）、N,N−ジメチルヒドロキシル
アミン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シフタルイミドなどとのエステル等のようなエスエルが
挙げられる。
における反応性誘導体の例としては、エステル、酸ハロ
ゲン化物、酸無水物等が挙げられる。これらの反応性誘
導体の好適な例としては、酸ハロゲン化物（例えば、酸
塩化物、酸臭化物など）；対称性酸無水物；脂肪族カル
ボン酸（例えば、酢酸、ピバリン酸など）、置換された
リン酸（例えば、ジアルキルリン酸、ジフェニルリン酸
など）のような酸との混合酸無水物；低級アルキルエス
エル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロ
ピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステ
ル、ペンチルエステル、ヘキシルエステルなど）、置換
されていてもよいアル（低級）アルキルエステル（例え
ば、ベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル、ｐ−
クロロベンジルエステルなど）、置換されていてもよい
アリールエステル（例えば、フェニルエステル、トリル
エステル、４−ニトロフェニルエステル、2,4−ジニト
ロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、
ナフチルエステルなど）、N,N−ジメチルヒドロキシル
アミン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シフタルイミドなどとのエステル等のようなエスエルが
挙げられる。
一般式（２）で表される化合物が遊離酸の形で使用さ
れる場合には、本反応は縮合剤の存在下に行われ、ここ
で使用される縮合剤としては、例えば、N,N′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′
−モルホリノエチルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩
化チオニル、塩化オキサリル、低級アルコキシカルボニ
ルハロゲン化物（例えば、クロロギ酸エチル、クロロギ
酸イソブチルなど）等が挙げられる。
れる場合には、本反応は縮合剤の存在下に行われ、ここ
で使用される縮合剤としては、例えば、N,N′−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ′
−モルホリノエチルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩
化チオニル、塩化オキサリル、低級アルコキシカルボニ
ルハロゲン化物（例えば、クロロギ酸エチル、クロロギ
酸イソブチルなど）等が挙げられる。
本反応は通常溶媒中で行われ、使用される溶媒として
は、この反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればいずれ
の溶媒も用いることができ、例えば、水、例えばメタノ
ール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、
例えばベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化
水素類、例えばクロロホルム、塩化メチレン、1,2−ジ
クロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、例えばジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、モノ
グライム、ジグライムなどのエーテル類、例えばピリジ
ン、ピコリンなどの有機アミン類、例えばN,N−ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルモ
ルホリンなどの非プロトン性極性溶媒またはこれらの混
合溶媒等が例示される。
は、この反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればいずれ
の溶媒も用いることができ、例えば、水、例えばメタノ
ール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、
例えばベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化
水素類、例えばクロロホルム、塩化メチレン、1,2−ジ
クロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、例えばジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、モノ
グライム、ジグライムなどのエーテル類、例えばピリジ
ン、ピコリンなどの有機アミン類、例えばN,N−ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルモ
ルホリンなどの非プロトン性極性溶媒またはこれらの混
合溶媒等が例示される。
また本反応は塩基性化合物の存在下に行なうのがより
好ましい。該塩基性化合物としては、例えば、トリエチ
ルアミン、トリブチルアミンなどのトリアルキルアミ
ン、ピリジン、ピコリン、N,N−ジメチルアニリン、1,5
−ジアザビシクロ［4.3.0］ノネン−５、1,4−ジアザビ
シクロ［2.2.2］オクタン、1,8−ジアザビシクロ［5.4.
0］ウンデセン−７などの有機塩基、モノトリメチルシ
リルアセトアミド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリ
ウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭
酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩などの無機
塩基が例示できる。
好ましい。該塩基性化合物としては、例えば、トリエチ
ルアミン、トリブチルアミンなどのトリアルキルアミ
ン、ピリジン、ピコリン、N,N−ジメチルアニリン、1,5
−ジアザビシクロ［4.3.0］ノネン−５、1,4−ジアザビ
シクロ［2.2.2］オクタン、1,8−ジアザビシクロ［5.4.
0］ウンデセン−７などの有機塩基、モノトリメチルシ
リルアセトアミド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリ
ウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭
酸水素カリウム等のアルカリ金属炭酸水素塩などの無機
塩基が例示できる。
本反応において、一般式（２）で表される化合物又は
そのカルボキシ基における反応性誘導体に対する一般式
（３）で表される化合物の使用割合は、１〜５倍モル
量、好ましくは１〜３倍モル量とするのがよい。一般式
（２）で表される化合物又はそのカルボキシ基における
反応性誘導体に対する塩基性化合物の使用割合は、等モ
ル〜20倍モル量、好ましくは２〜10倍モル量とするのが
よい。反応温度は−20〜100℃、好ましくは−20〜50℃
程度において行われ、通常５分〜24時間程度で終了す
る。
そのカルボキシ基における反応性誘導体に対する一般式
（３）で表される化合物の使用割合は、１〜５倍モル
量、好ましくは１〜３倍モル量とするのがよい。一般式
（２）で表される化合物又はそのカルボキシ基における
反応性誘導体に対する塩基性化合物の使用割合は、等モ
ル〜20倍モル量、好ましくは２〜10倍モル量とするのが
よい。反応温度は−20〜100℃、好ましくは−20〜50℃
程度において行われ、通常５分〜24時間程度で終了す
る。
前記の反応工程式−２に示される反応は、一般式（１
−ａ）で表される化合物に一般式（４）で表される化合
物又はそのカルボキシ基における反応性誘導体を反応さ
せることにより行われる。
−ａ）で表される化合物に一般式（４）で表される化合
物又はそのカルボキシ基における反応性誘導体を反応さ
せることにより行われる。
一般式（４）で表される化合物のカルボキシ基の反応
性誘導体としては、前記反応工程式−１における一般式
（２）で表される化合物のカルボキシ基における反応性
誘導体と同様なものが例示される。
性誘導体としては、前記反応工程式−１における一般式
（２）で表される化合物のカルボキシ基における反応性
誘導体と同様なものが例示される。
本反応は、反応工程式−１と実質的に同様な方法にて
行なうことができ、従って、反応条件（例えば、反応温
度、反応時間など）及び試薬（例えば、溶媒、縮合剤、
塩基性化合物など）は反応工程式−１で例示されたもの
が挙げられる。
行なうことができ、従って、反応条件（例えば、反応温
度、反応時間など）及び試薬（例えば、溶媒、縮合剤、
塩基性化合物など）は反応工程式−１で例示されたもの
が挙げられる。
斯くして得られた一般式（１）で表される化合物及び
一般式（１−ｂ）で表される化合物は、例えば、溶媒抽
出、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の慣用の分離
手段で単離・精製することができる。
一般式（１−ｂ）で表される化合物は、例えば、溶媒抽
出、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の慣用の分離
手段で単離・精製することができる。
本発明の一般式（１）で表される化合物は、目的物質
にデスチオビオチンを導入するデスチオビオチン標識化
剤として有用である。例えば、一般式（１）において、
Ｒがアミノ基である化合物（即ち、一般式（１−ａ）で
表される化合物）は、糖を含有する目的物質に該糖を介
してデスチオビオチンを導入することができる。この導
入方法の一例をより詳細に説明すると、まず目的物質を
適宜な緩衝液に溶解し、該物質に含まれる糖の1,2−ジ
オールを酸化剤［例えば、過ヨウ素酸又はその塩（例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、四酢酸鉛等］を
用いて酸化し、1,2−ジアルデヒドに変換した後、必要
に応じて、ゲル濾過等の慣用の手段で精製する。次い
で、得られた反応生成物に、一般式（１−ａ）で表され
る化合物を反応させることによりシッフ塩基が形成さ
れ、必要に応じて、再度ゲル濾過等の手段で精製するこ
とにより、デスチオビオチンで標識化された目的物質が
得られる。
にデスチオビオチンを導入するデスチオビオチン標識化
剤として有用である。例えば、一般式（１）において、
Ｒがアミノ基である化合物（即ち、一般式（１−ａ）で
表される化合物）は、糖を含有する目的物質に該糖を介
してデスチオビオチンを導入することができる。この導
入方法の一例をより詳細に説明すると、まず目的物質を
適宜な緩衝液に溶解し、該物質に含まれる糖の1,2−ジ
オールを酸化剤［例えば、過ヨウ素酸又はその塩（例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、四酢酸鉛等］を
用いて酸化し、1,2−ジアルデヒドに変換した後、必要
に応じて、ゲル濾過等の慣用の手段で精製する。次い
で、得られた反応生成物に、一般式（１−ａ）で表され
る化合物を反応させることによりシッフ塩基が形成さ
れ、必要に応じて、再度ゲル濾過等の手段で精製するこ
とにより、デスチオビオチンで標識化された目的物質が
得られる。
また、一般式（１−ｂ）で表される化合物は、チオー
ル基を含有する目的物質に該チオール基を介してデスチ
オビオチンを導入することができる。この導入方法の一
例をより詳細に説明すると、まず目的物質を適宜な緩衝
液に溶解し、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカ
プトエタノール等の還元剤で該物質に含まれるジスルフ
ィド結合を還元し、還元型の目的物質に変換した後、必
要に応じて、ゲル濾過などの慣用の手段で精製する。次
いで、得られた反応生成物に、一般式（１−ｂ）で表さ
れる化合物を反応させ、必要に応じて、再度ゲル濾過等
の手段で精製することにより、デスチオビオチンで標識
化された目的物質が得られる。
ル基を含有する目的物質に該チオール基を介してデスチ
オビオチンを導入することができる。この導入方法の一
例をより詳細に説明すると、まず目的物質を適宜な緩衝
液に溶解し、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカ
プトエタノール等の還元剤で該物質に含まれるジスルフ
ィド結合を還元し、還元型の目的物質に変換した後、必
要に応じて、ゲル濾過などの慣用の手段で精製する。次
いで、得られた反応生成物に、一般式（１−ｂ）で表さ
れる化合物を反応させ、必要に応じて、再度ゲル濾過等
の手段で精製することにより、デスチオビオチンで標識
化された目的物質が得られる。
以上のように本発明の一般式（１）で表されるデスチ
オビオチン誘導体は、目的物質に容易にデスチオビオチ
ンを導入することができる。
オビオチン誘導体は、目的物質に容易にデスチオビオチ
ンを導入することができる。
本発明の標識化剤は、一般式（１）で表される化合物
単独で又は適当な担体と共に、この分野で慣用の方法に
て適宜な製剤形態に調製されて使用される。
単独で又は適当な担体と共に、この分野で慣用の方法に
て適宜な製剤形態に調製されて使用される。
＜発明の効果＞ 本発明のデスチオビオチン誘導体及びそれからなるデ
スチオビオチン標識化剤によれば、目的物質に容易にデ
スチオビオチンを導入することができ、また導入された
デスチオビオチンの数を定めることが容易であると共に
目的物質の変性が少ないという効果を奏する。
スチオビオチン標識化剤によれば、目的物質に容易にデ
スチオビオチンを導入することができ、また導入された
デスチオビオチンの数を定めることが容易であると共に
目的物質の変性が少ないという効果を奏する。
＜実施例＞ 以下、実施例、試験例及び比較例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
より詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
実施例１ デスチオビオチンヒドラジド（以下、DBHZという）の合
成 メタノール（10ml）を−10℃に冷却し、撹拌しながら
塩化チオニル（1ml）を徐々に添加した。10分後、デス
チオビオチン（1g）を加え、室温で一夜放置した。溶媒
を減圧留去し、乾固させた。メタノール（10ml）を添加
し、溶媒を留去して乾固させる操作を２回繰り返した。
得られた残渣にメタノール（5ml）を添加して溶解した
後、抱水ヒドラジン（1ml）を加えて一夜撹拌した。生
成した沈殿物を濾取し、ジエチルエーテル（10ml）で洗
浄した後、ジメチルホルムアミドから再結晶し、標記目
的化合物（0.65g:収率61％）を得た。
成 メタノール（10ml）を−10℃に冷却し、撹拌しながら
塩化チオニル（1ml）を徐々に添加した。10分後、デス
チオビオチン（1g）を加え、室温で一夜放置した。溶媒
を減圧留去し、乾固させた。メタノール（10ml）を添加
し、溶媒を留去して乾固させる操作を２回繰り返した。
得られた残渣にメタノール（5ml）を添加して溶解した
後、抱水ヒドラジン（1ml）を加えて一夜撹拌した。生
成した沈殿物を濾取し、ジエチルエーテル（10ml）で洗
浄した後、ジメチルホルムアミドから再結晶し、標記目
的化合物（0.65g:収率61％）を得た。
融点:212±２℃（分解） 元素分析:C10H20O2N4として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値： 61.19 10.27 28.54 実測値： 60.98 10.53 28.49 実施例２ Ｎ−デスチオビオチニル−Ｎ′−（４−マレイミドブタ
ノイル）ヒドラジン（以下、DBMalという）の合成 ジメチルホルムアミド（10ml）にＮ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）スクシンイミド（280mg）を溶解し
た後、デスチオビオチンヒドラジド（280mg）を添加
し、室温で一夜撹拌した。次いで、1N−塩酸（2ml）を
加え、４℃で放置し、生成した結晶を濾取した後、0.1N
−塩酸（20ml）とジエチルエーテル（20ml）で洗浄し、
標記目的化合物（212mg:収率44％）を得た。
ノイル）ヒドラジン（以下、DBMalという）の合成 ジメチルホルムアミド（10ml）にＮ−（γ−マレイミ
ドブチリルオキシ）スクシンイミド（280mg）を溶解し
た後、デスチオビオチンヒドラジド（280mg）を添加
し、室温で一夜撹拌した。次いで、1N−塩酸（2ml）を
加え、４℃で放置し、生成した結晶を濾取した後、0.1N
−塩酸（20ml）とジエチルエーテル（20ml）で洗浄し、
標記目的化合物（212mg:収率44％）を得た。
融点:220±２℃（分解） 元素分析:C18H27O5N5として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値： 68.98 8.68 22.34 実測値： 68.21 9.01 22.78 上記で得られたDBMal（3.9mg）を秤量し、N,N−ジメ
チルホルムアミド（100μ）に溶解した後、0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液pH7にて希釈し全量を10mlとした。
このようにして調製した溶液の吸収スペクトルを分光光
度計で測定したところ、波長302nmに極大吸収を示し、
その吸光度は0.57であった。
チルホルムアミド（100μ）に溶解した後、0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液pH7にて希釈し全量を10mlとした。
このようにして調製した溶液の吸収スペクトルを分光光
度計で測定したところ、波長302nmに極大吸収を示し、
その吸光度は0.57であった。
試験例１ DBHZによるペルオキシダーゼの修飾 西洋ワサビペルオキシダーゼ（1mg）を0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液pH7（1ml）に溶解し、10mM過ヨウ素酸ナ
トリウムを加えた後、０℃に冷却し30分間反応させた。
反応終了後、SephadexG−25カラムに通し、ペルオキシ
ダーゼ画分を集め、DBHZ（0.2mg）を加えて室温で２時
間反応させ、再度SephadexG−25カラムに通し、ペルオ
キシダーゼ画分を集めた。集めたペルオキシダーゼ画分
のペルオキシダーゼ濃度は、波長403nmの吸光度を測定
し、次式より求めた。
トリウム緩衝液pH7（1ml）に溶解し、10mM過ヨウ素酸ナ
トリウムを加えた後、０℃に冷却し30分間反応させた。
反応終了後、SephadexG−25カラムに通し、ペルオキシ
ダーゼ画分を集め、DBHZ（0.2mg）を加えて室温で２時
間反応させ、再度SephadexG−25カラムに通し、ペルオ
キシダーゼ画分を集めた。集めたペルオキシダーゼ画分
のペルオキシダーゼ濃度は、波長403nmの吸光度を測定
し、次式より求めた。
ペルオキシダーゼ濃度（モル／）＝ 吸光度÷2.275÷40,000 なお、上記式中、2.275は波長403nmにおけるペルオキ
シダーゼ（1g/）の吸光度であり、40,000はペルオキ
シダーゼの分子量である。
シダーゼ（1g/）の吸光度であり、40,000はペルオキ
シダーゼの分子量である。
また、導入されたデスチオビオチンの定量を、グリー
ンの方法（N.M.Green,Methods in Enzymology,Vol.18,p
p418−424,1970）に準じて、アビジン−HABA（４−ヒド
ロキシベンゼン−２′−カルボン酸）試薬を用いた波長
500nmにおける比色法により行ない、ペルオキシダーゼ
１分子当りに導入されたデスチオビオチンの分子数を求
めた。
ンの方法（N.M.Green,Methods in Enzymology,Vol.18,p
p418−424,1970）に準じて、アビジン−HABA（４−ヒド
ロキシベンゼン−２′−カルボン酸）試薬を用いた波長
500nmにおける比色法により行ない、ペルオキシダーゼ
１分子当りに導入されたデスチオビオチンの分子数を求
めた。
その結果、上記方法により得られたペルオキシダーゼ
１分子当り、3.1個のデスチオビオチンが導入されてお
り、DBHZは有用な標識化剤であることが判った。
１分子当り、3.1個のデスチオビオチンが導入されてお
り、DBHZは有用な標識化剤であることが判った。
試験例２ DBMalによる抗体の修飾 抗ヒトアルファフェトプロテイン（AFP）モノクロー
ナル抗体（A4）（5mg）を0.1M酢酸緩衝液pH4（1ml）に
溶解し、ペプシン（0.5mg）を添加し、37℃で５時間反
応させた。反応終了後、TSKゲルG3000SWGにてＦ（a
b′）２画分を分離精製した。分離精製したＦ（ab′）
２を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に1mMEDTAを加
えた緩衝液に溶解し、10mMの２−メルカプトエチルアミ
ンを加えて室温で1.5時間反応させた。反応終了後、Sep
hadexG−25カラムにて過剰の２−メルカプトエチルアミ
ンを除去し、還元型のFab′−SHを得た。得られたFab′
−SH（1mg）に、DBMal（0.1mg）をN,N−ジメチルホルム
アミド（10μ）に溶解した溶液を加えて室温で２時間
反応させた。反応終了後、SephadexG−25カラムにて過
剰のDBMalを除去し、Fab′−デスチオビオチン複合体を
得た。得られたFab′−デスチオビオチン複合体のFab′
量は、波長280nmの吸光度を測定し、次式より求めた。
ナル抗体（A4）（5mg）を0.1M酢酸緩衝液pH4（1ml）に
溶解し、ペプシン（0.5mg）を添加し、37℃で５時間反
応させた。反応終了後、TSKゲルG3000SWGにてＦ（a
b′）２画分を分離精製した。分離精製したＦ（ab′）
２を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に1mMEDTAを加
えた緩衝液に溶解し、10mMの２−メルカプトエチルアミ
ンを加えて室温で1.5時間反応させた。反応終了後、Sep
hadexG−25カラムにて過剰の２−メルカプトエチルアミ
ンを除去し、還元型のFab′−SHを得た。得られたFab′
−SH（1mg）に、DBMal（0.1mg）をN,N−ジメチルホルム
アミド（10μ）に溶解した溶液を加えて室温で２時間
反応させた。反応終了後、SephadexG−25カラムにて過
剰のDBMalを除去し、Fab′−デスチオビオチン複合体を
得た。得られたFab′−デスチオビオチン複合体のFab′
量は、波長280nmの吸光度を測定し、次式より求めた。
Fab′量（モル／）＝吸光度÷1.5÷50,000 なお、上記式中、1.5は波長280nmにおける抗体Fab′
（1g/）の吸光度であり、50,000は抗体Fab′の分子量
である。
（1g/）の吸光度であり、50,000は抗体Fab′の分子量
である。
また、Fab′−デスチオビオチン複合体のデスチオビ
オチン含量を試験例１と同様にして定量したところ、Fa
b′１分子当り、0.96個のデスチオビオチンが結合して
おり、DBMalは有用な標識化剤であることが判った。
オチン含量を試験例１と同様にして定量したところ、Fa
b′１分子当り、0.96個のデスチオビオチンが結合して
おり、DBMalは有用な標識化剤であることが判った。
比較例 試験例２で得られたデスチオビオチン化抗ヒトAFP抗
体Fab′画分（以下、Fab′−DBという）と、市販のデス
チオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を用いて抗ヒトAFP抗体Ｆ（ab′）２画分を標識化した
Ｆ（ab′）２−デスチオビオチン複合体［以下、Ｆ（a
b′）２−DBという］の抗体性能比較試験を行なった。
体Fab′画分（以下、Fab′−DBという）と、市販のデス
チオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を用いて抗ヒトAFP抗体Ｆ（ab′）２画分を標識化した
Ｆ（ab′）２−デスチオビオチン複合体［以下、Ｆ（a
b′）２−DBという］の抗体性能比較試験を行なった。
なお、上記Ｆ（ab′）２−DBは、試験例２で得られた
Ｆ（ab′）２（0.1mg）を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液p
H7.0に溶解し、デスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（0.1mg）をN,N−ジメチルホルムア
ミド（10μ）に溶解した溶液を添加して室温で２時間
反応させ、反応終了後、SephadexG−25カラムにて過剰
のデスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを除去して調製した。得られたＦ（ab′）２−DB
中のデスチオビオチン含量を試験例２と同様にして求め
たところ、Ｆ（ab′）21分子当り4.36個のデスチオビオ
チンが結合していた。
Ｆ（ab′）２（0.1mg）を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液p
H7.0に溶解し、デスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（0.1mg）をN,N−ジメチルホルムア
ミド（10μ）に溶解した溶液を添加して室温で２時間
反応させ、反応終了後、SephadexG−25カラムにて過剰
のデスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルを除去して調製した。得られたＦ（ab′）２−DB
中のデスチオビオチン含量を試験例２と同様にして求め
たところ、Ｆ（ab′）21分子当り4.36個のデスチオビオ
チンが結合していた。
市販マイクロタイタープレートに、ヒトAFPを10μg/m
lの濃度となるように10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7で
溶解した溶液（100μ）を分注し、２〜８℃で一夜放
置した。次いで、液を除去し、１％（W/V）ウシ血清ア
ルブミンを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ
）を分注したのち一夜放置した。液を除去した後、Ｆ
（ab′）２−DBとFab′−DBとの性能を比較するため
に、Ｆ（ab′）２−DB及びFab′−DBをそれぞれ0.1mg/m
lとなるように0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7で調製
し、その0.1mlをマイクロタイタープレートの各ウェル
に添加した。室温で１時間反応した後、反応液を除去
し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ）で３回
洗浄し、次いで、市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識アビジン溶液（100μ）を添加して30分間反応させ
た。反応後、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ
）で３回洗浄し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH5）に5mM過
酸化水素と5mMオルト−フェニレンジアミンを溶解した
溶液（100μ）を加えて室温で30分間反応後、2N−硫
酸（100μ）を添加して反応を停止させた。各ウェル
の吸光度を波長492nmで測定し、第１表に示される結果
を得た。
lの濃度となるように10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7で
溶解した溶液（100μ）を分注し、２〜８℃で一夜放
置した。次いで、液を除去し、１％（W/V）ウシ血清ア
ルブミンを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ
）を分注したのち一夜放置した。液を除去した後、Ｆ
（ab′）２−DBとFab′−DBとの性能を比較するため
に、Ｆ（ab′）２−DB及びFab′−DBをそれぞれ0.1mg/m
lとなるように0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7で調製
し、その0.1mlをマイクロタイタープレートの各ウェル
に添加した。室温で１時間反応した後、反応液を除去
し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ）で３回
洗浄し、次いで、市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識アビジン溶液（100μ）を添加して30分間反応させ
た。反応後、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7（200μ
）で３回洗浄し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH5）に5mM過
酸化水素と5mMオルト−フェニレンジアミンを溶解した
溶液（100μ）を加えて室温で30分間反応後、2N−硫
酸（100μ）を添加して反応を停止させた。各ウェル
の吸光度を波長492nmで測定し、第１表に示される結果
を得た。
第１表から明らかなように、Fab′−DBの方がＦ（a
b′）２−DBよりも大きな吸光度が得られ、抗体の活性
がより大きいことが判る。従って、DBMalで標識化した
抗体は、デスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルで標識化した抗体よりも抗体活性が損なわ
れないという利点があることが判る。
b′）２−DBよりも大きな吸光度が得られ、抗体の活性
がより大きいことが判る。従って、DBMalで標識化した
抗体は、デスチオビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルで標識化した抗体よりも抗体活性が損なわ
れないという利点があることが判る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/547 Ｇ０１Ｎ 33/547 (72)発明者 日裏 久英 兵庫県加古川市加古川町中津115番地の ７ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07D 233/00 - 233/96 C07D 403/00 - 403/12 ＣＡＳ ＯＮＬＩＮＥ
Claims (3)
- 【請求項１】一般式（１） ［式中、Ｒはアミノ基又は基： （式中、Ａは低級アルキレン基を示す）］ で表されるデスチオビオチン誘導体。
- 【請求項２】請求項１記載の一般式（１）で表されるデ
スチオビオチン誘導体の少なくとも１つの化合物からな
るデスチオビオチン標識化剤。 - 【請求項３】デスチオビオチンヒドラジド又はＮ−デス
チオビオチニル−Ｎ′−（４−マレイミドブタノイル）
ヒドラジンからなる請求項２記載のデスチオビオチン標
識化剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1004393A JP2794181B2 (ja) | 1989-01-10 | 1989-01-10 | デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1004393A JP2794181B2 (ja) | 1989-01-10 | 1989-01-10 | デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02184677A JPH02184677A (ja) | 1990-07-19 |
| JP2794181B2 true JP2794181B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=11583109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1004393A Expired - Lifetime JP2794181B2 (ja) | 1989-01-10 | 1989-01-10 | デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2794181B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2479268B1 (en) | 2009-09-17 | 2020-11-04 | JSR Corporation | Dissociation method and dissociation agent for avidin and biotinderivatives |
-
1989
- 1989-01-10 JP JP1004393A patent/JP2794181B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02184677A (ja) | 1990-07-19 |
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