JP2648162B2 - ビオチニル化剤 - Google Patents
ビオチニル化剤Info
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- JP2648162B2 JP2648162B2 JP63031973A JP3197388A JP2648162B2 JP 2648162 B2 JP2648162 B2 JP 2648162B2 JP 63031973 A JP63031973 A JP 63031973A JP 3197388 A JP3197388 A JP 3197388A JP 2648162 B2 JP2648162 B2 JP 2648162B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
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- Organic Chemistry (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はビオチニル化剤（biotinylating agents）と
して有用な化合物に関する。更に特定的には本発明は、
ビオチンを低分子量チオールおよび蛋白質に可逆的に結
合させるの使用することのできる化合物に関するもので
ある。
して有用な化合物に関する。更に特定的には本発明は、
ビオチンを低分子量チオールおよび蛋白質に可逆的に結
合させるの使用することのできる化合物に関するもので
ある。
発明の背景 チオールとアミノ官能基を経てビオチンを蛋白質に結
合させるために数多くの試薬がこれまでに使われてき
た。チオール官能基に特異的な非開裂性ビチオニル化剤
の例には、３−（Ｎ−マレイミド）プロピオニルビオチ
ンが含まれこれはBayerらによつてAnalytical Biochemi
stry,149、529〜536（1985）に述べられておりＮ−イン
ドアセチル−Ｎ′−ビオチニルヘキシレンジアミンはSu
tohらによつてJ.Mol.Biology,178,323〜339（1984）に
述べられている。アミノ官能基に特異的な開裂性のビオ
チニル化剤の例には３−（４−（Ｎ−ビオチノイル−６
−アミノカプロイルオキシ）フエニル）プロピオン酸Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BPE）が含ま
れ、これはMoutonらによつてArchives of Biochemistry
and Biophysics,218、101〜108（1982）に述べられそ
してスルホスクシンイミジル２−（ビオチンアミド）エ
チル1,3′−ジチオプロピオネート（NHS−SS−Biotin）
はPierce Chemical社から販売されている。
合させるために数多くの試薬がこれまでに使われてき
た。チオール官能基に特異的な非開裂性ビチオニル化剤
の例には、３−（Ｎ−マレイミド）プロピオニルビオチ
ンが含まれこれはBayerらによつてAnalytical Biochemi
stry,149、529〜536（1985）に述べられておりＮ−イン
ドアセチル−Ｎ′−ビオチニルヘキシレンジアミンはSu
tohらによつてJ.Mol.Biology,178,323〜339（1984）に
述べられている。アミノ官能基に特異的な開裂性のビオ
チニル化剤の例には３−（４−（Ｎ−ビオチノイル−６
−アミノカプロイルオキシ）フエニル）プロピオン酸Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BPE）が含ま
れ、これはMoutonらによつてArchives of Biochemistry
and Biophysics,218、101〜108（1982）に述べられそ
してスルホスクシンイミジル２−（ビオチンアミド）エ
チル1,3′−ジチオプロピオネート（NHS−SS−Biotin）
はPierce Chemical社から販売されている。
幾つかの応用のためにはビオチン残基を取り去りそし
て遊離のラベルされていない蛋白質を再生することが望
ましいことである。例えばチオール含有蛋白質を含む混
合物からのチオール含有蛋白質を回収するためには、ビ
オチン残基は固定化されたアビジンとともに用いること
ができる。一たび、単離されれば、非修飾の状態の蛋白
質を研究することが重要なこととなる。このような場
合、蛋白質の全体性に影響を及ぼさない条件下にビオチ
ン残基を開裂させる必要がある。
て遊離のラベルされていない蛋白質を再生することが望
ましいことである。例えばチオール含有蛋白質を含む混
合物からのチオール含有蛋白質を回収するためには、ビ
オチン残基は固定化されたアビジンとともに用いること
ができる。一たび、単離されれば、非修飾の状態の蛋白
質を研究することが重要なこととなる。このような場
合、蛋白質の全体性に影響を及ぼさない条件下にビオチ
ン残基を開裂させる必要がある。
上記したこれらの開裂しうるビオチニル化剤、例えば
BPEおよびNHS−SS−ビオチンは試薬の一部分、すなわ
ち、アルキルアミド残基を蛋白質上に残留させる。多く
の蛋白質は遊離チオール官能基および／またはジスルフ
イド官能基を含みそれらは容易に還元されて遊離チオー
ル官能基となることから、チオール官能基に対して特異
的な、開裂性ビオチニル化剤であつて遊離のラベルされ
ていない蛋白質の再生を許容するものは、アフイニテイ
ー精製の技術に広い応用性を有するものである。
BPEおよびNHS−SS−ビオチンは試薬の一部分、すなわ
ち、アルキルアミド残基を蛋白質上に残留させる。多く
の蛋白質は遊離チオール官能基および／またはジスルフ
イド官能基を含みそれらは容易に還元されて遊離チオー
ル官能基となることから、チオール官能基に対して特異
的な、開裂性ビオチニル化剤であつて遊離のラベルされ
ていない蛋白質の再生を許容するものは、アフイニテイ
ー精製の技術に広い応用性を有するものである。
発明の要約 チオール−ジスルフイド交換反応を経てチオール含有
物質に可逆的にビオチンを結合させるのに使われる化合
物がここに合成され、そして試験された。かかる化合物
は連結手によつてビオチン部分がジチオピリジル部分に
連結したものからなる。
物質に可逆的にビオチンを結合させるのに使われる化合
物がここに合成され、そして試験された。かかる化合物
は連結手によつてビオチン部分がジチオピリジル部分に
連結したものからなる。
１つのこの好ましい具体例によれば本発明は次の式 を有するビオチン−２−（２′−ピリジルジチオ）−エ
チルアミドを提供するものである。
チルアミドを提供するものである。
もう１つの好ましい具体例によれば本発明は次の式 を有するＮ−（２−ピリジルジチオプロピオニル）ビオ
シチンを提供するものである。
シチンを提供するものである。
その使用において本発明の化合物は蛋白質チオールの
ようなチオールと反応して、ピリジン−２−チオンを放
出しビオチン−ジチオ−連結蛋白質を生成する。
ようなチオールと反応して、ピリジン−２−チオンを放
出しビオチン−ジチオ−連結蛋白質を生成する。
遊離の蛋白質はジチオ基の還元により遊離される。固
定化アビジンと組合わせて、使用する際には本発明の化
合物は選択的な蛋白質の分離の手段とアフイニテイーク
ロマトグラフイーを介した蛋白質と蛋白質複合物との選
択的分離のための手段を提供する。
定化アビジンと組合わせて、使用する際には本発明の化
合物は選択的な蛋白質の分離の手段とアフイニテイーク
ロマトグラフイーを介した蛋白質と蛋白質複合物との選
択的分離のための手段を提供する。
本発明の詳細な説明 本発明は次の式 （式中ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０また
は１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含有
する非環式連結基であり、そしてＺは場合によつて−Ｓ
−Ｓ−基の開裂で生じるチオール−チオンの互変異性を
保持するような型または位置における１つまたはそれ以
上の置換基で置換されたピリジル基である）で示される
化合物を提供するものである。
は１であり、Ｒは少なくとも１つのアミド官能基を含有
する非環式連結基であり、そしてＺは場合によつて−Ｓ
−Ｓ−基の開裂で生じるチオール−チオンの互変異性を
保持するような型または位置における１つまたはそれ以
上の置換基で置換されたピリジル基である）で示される
化合物を提供するものである。
非環式連結基として上で定義されたＲで表わされた２
価の基は、少なくとも１つのアミド官能基を含有し少な
くとも１つのアミド官能基の窒素原子と炭素原子が鎖原
子である原子の直鎖からなるものである。好ましいＲ基
は−CONH−および−CH（CO2H）NHCO−からなる。
価の基は、少なくとも１つのアミド官能基を含有し少な
くとも１つのアミド官能基の窒素原子と炭素原子が鎖原
子である原子の直鎖からなるものである。好ましいＲ基
は−CONH−および−CH（CO2H）NHCO−からなる。
Ｚ基に関しては好ましい例には２−ピリジル、４−ピ
リジル、５−ニトロ−２−ピリジルおよび５−カルボキ
シ−２−ピリジルが含まれるが、しかし生成したチオー
ル−チオンの互変異性を安定化するどのような置換基も
好適である。
リジル、５−ニトロ−２−ピリジルおよび５−カルボキ
シ−２−ピリジルが含まれるが、しかし生成したチオー
ル−チオンの互変異性を安定化するどのような置換基も
好適である。
ＲとＺの両方の好ましい具体例をこれまでに記載した
が、この分野で普通の技術を持つた人が化合物の製造す
るためのＲおよびＺにすることができる種々の変化およ
び修飾は本発明の範囲に含まれるものであると理解すべ
きである。
が、この分野で普通の技術を持つた人が化合物の製造す
るためのＲおよびＺにすることができる種々の変化およ
び修飾は本発明の範囲に含まれるものであると理解すべ
きである。
本発明の化合物は多くの異なつた方法で製造しうる。
これらの方法のもつとも好ましいものは下記する通りで
ある。
これらの方法のもつとも好ましいものは下記する通りで
ある。
式（Ｉ）の化合物で式中ｎが０であるものは次の式 H2N−（CH2）x+y−Ｓ−Ｓ−Ｚ （II） （式中、ｘ、ｙおよびＺは上記で定義したとおりであ
る）で示されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩と
ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとを第
三アミンの存在下に接触させることによつて製造され
る。この反応は有機溶媒中で０〜50℃の温度で行なわれ
る。好適した溶媒は例えばN,N−ジメチルホルムアミ
ド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホ
キシドを含むものである。反応時間は反応温度に応じて
変化する。
る）で示されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩と
ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとを第
三アミンの存在下に接触させることによつて製造され
る。この反応は有機溶媒中で０〜50℃の温度で行なわれ
る。好適した溶媒は例えばN,N−ジメチルホルムアミ
ド、N,N−ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホ
キシドを含むものである。反応時間は反応温度に応じて
変化する。
式（II）の出発化合物は、次の式 Ｚ−Ｓ−Ｓ−Ｚ （III） （式中、Ｚは上記で定義した通りである）で示されるジ
ピリジルスルフイドと次の式 HS−（CH2）x+y−NH2 （IV） （式中、ｘおよびｙは上記に定義した通りである）で示
されるメルカプトアルキルアミンの酸塩とを接触させる
ことによつて製造することができる。反応は有機溶媒中
で０〜30℃の温度１〜24時間の間に行なわれる。好適し
た溶媒は、エタノール、酢酸エチルおよびジオキサンで
ある。
ピリジルスルフイドと次の式 HS−（CH2）x+y−NH2 （IV） （式中、ｘおよびｙは上記に定義した通りである）で示
されるメルカプトアルキルアミンの酸塩とを接触させる
ことによつて製造することができる。反応は有機溶媒中
で０〜30℃の温度１〜24時間の間に行なわれる。好適し
た溶媒は、エタノール、酢酸エチルおよびジオキサンで
ある。
式（Ｉ）の化合物で式中ｎが１でＲが−CONH−である
ものは、次の式 （式中、ｘは上記で定義した通りである）で示される化
合物と次の式 H2N−（CH2）ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ （VI） （式中、ｙおよびｚは上記で定義した通りである）で示
されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩とを第三ア
ミンの存在下に接触させることによつて製造される。反
応は有機溶媒中で０〜50℃の温度で行なわれる。好適し
た溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルア
セトアミドおよびジメチルスルホキシドを含む。反応は
１〜24時間の間に行なわれる。
ものは、次の式 （式中、ｘは上記で定義した通りである）で示される化
合物と次の式 H2N−（CH2）ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｚ （VI） （式中、ｙおよびｚは上記で定義した通りである）で示
されるピリジルジチオアルキルアミンの酸塩とを第三ア
ミンの存在下に接触させることによつて製造される。反
応は有機溶媒中で０〜50℃の温度で行なわれる。好適し
た溶媒はN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルア
セトアミドおよびジメチルスルホキシドを含む。反応は
１〜24時間の間に行なわれる。
式Ｖの化合物の製造方法はこの技術分野で公知のもの
である。例えば式（Ｖ）の化合物で式中ｘ＝５であるも
の、すなわち、ビオチンアミド−ヘキサン酸Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルの製造法は、Costelloらの
Clin.Chem.,25、1572〜1580（1979）に記載され、またB
ehring Diagnostics社（カリホルニア州ラジヨラ）から
入手することができる。
である。例えば式（Ｖ）の化合物で式中ｘ＝５であるも
の、すなわち、ビオチンアミド−ヘキサン酸Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルの製造法は、Costelloらの
Clin.Chem.,25、1572〜1580（1979）に記載され、またB
ehring Diagnostics社（カリホルニア州ラジヨラ）から
入手することができる。
式Ｉの化合物で、式中Ｒが−CH（CO2H）NHC（Ｏ）−
であるものは次の式 （式中、ｘは上記で定義したとおりである）で示される
化合物の有機酸塩と、次の式 （式中、ｙとＺはまた上記で定義された通りである）で
示される化合物とを接触させて製造することができる。
反応は水性の緩衝液中に溶解した式（VII）の適当な塩
と、水と混和しうる有機溶媒、好ましくは双極性非プロ
トン溶媒例えばN,N−ジメチルホルムアミド中の式（VII
I）の溶液とを接触させることによつて行なわれる。混
合物の全体のpHはアミノ基が脱プロトン化（depro−ton
ate）され、それゆえ反応性であるようなものであるべ
きである。7.5および8.5の間のpHが任意に用いられる。
適当な緩衝液は妨害性の官能基を含まないようなもので
ある。アルカリ金属の重炭酸塩の緩衝液が好ましい。反
応は０〜30℃の範囲で行なわれ、好ましくは試薬が０〜
５℃で混和され混合物は、室温にまであたたまるのにま
かされる。反応物はほぼ等モル量で0.1〜0.2Mの間の濃
度において一緒にされる。反応は一般には室温で２時間
後に完了するが、しかしより長く行なうこともできる。
生成物は混合物をpH3またはそれ以下に酸性にして沈殿
される。
であるものは次の式 （式中、ｘは上記で定義したとおりである）で示される
化合物の有機酸塩と、次の式 （式中、ｙとＺはまた上記で定義された通りである）で
示される化合物とを接触させて製造することができる。
反応は水性の緩衝液中に溶解した式（VII）の適当な塩
と、水と混和しうる有機溶媒、好ましくは双極性非プロ
トン溶媒例えばN,N−ジメチルホルムアミド中の式（VII
I）の溶液とを接触させることによつて行なわれる。混
合物の全体のpHはアミノ基が脱プロトン化（depro−ton
ate）され、それゆえ反応性であるようなものであるべ
きである。7.5および8.5の間のpHが任意に用いられる。
適当な緩衝液は妨害性の官能基を含まないようなもので
ある。アルカリ金属の重炭酸塩の緩衝液が好ましい。反
応は０〜30℃の範囲で行なわれ、好ましくは試薬が０〜
５℃で混和され混合物は、室温にまであたたまるのにま
かされる。反応物はほぼ等モル量で0.1〜0.2Mの間の濃
度において一緒にされる。反応は一般には室温で２時間
後に完了するが、しかしより長く行なうこともできる。
生成物は混合物をpH3またはそれ以下に酸性にして沈殿
される。
出発物質の式（VII）の化合物は、ビオチンＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステルと次の式 H2N−（CH2）ｘ−CH（CO2H）NHW （式中、ｘは上記に定義された通りでありＷはtert−ブ
チロキシカルボニル（tert−BOC）のような適当な保護
基である）の化合物と接触させることにより製造され
る。反応物は保護されたアミノ酸の緩衝溶液をエステル
の有機溶媒溶液に加えることによつて接触させる。この
反応は０〜30℃の温度で１時間〜24時間の間に行なわれ
る。適切な有機溶媒にはN,N−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシドおよび同様のものが含まれる。得
られた生成物は式（VII）のＮ−α−tert−BOC誘導体で
ある。使用するに先立つて、この誘導体は適当な、有機
酸との処理によつて脱保護され、（VII）の酸塩誘導体
とされる。
ロキシスクシンイミドエステルと次の式 H2N−（CH2）ｘ−CH（CO2H）NHW （式中、ｘは上記に定義された通りでありＷはtert−ブ
チロキシカルボニル（tert−BOC）のような適当な保護
基である）の化合物と接触させることにより製造され
る。反応物は保護されたアミノ酸の緩衝溶液をエステル
の有機溶媒溶液に加えることによつて接触させる。この
反応は０〜30℃の温度で１時間〜24時間の間に行なわれ
る。適切な有機溶媒にはN,N−ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシドおよび同様のものが含まれる。得
られた生成物は式（VII）のＮ−α−tert−BOC誘導体で
ある。使用するに先立つて、この誘導体は適当な、有機
酸との処理によつて脱保護され、（VII）の酸塩誘導体
とされる。
式（VIII）の化合物の製造方法はこの技術分野で既知
であり米国特許第4,149,003号、4,231,999号、および4,
232,119号に記載されている。
であり米国特許第4,149,003号、4,231,999号、および4,
232,119号に記載されている。
本発明の新規な化合物は、ビオチン誘導体化チオール
を適当な還元状態に曝露したときに遊離チオール含有物
質の再生を許容する、開裂可能でチオール特異性のビチ
オニル化剤である。
を適当な還元状態に曝露したときに遊離チオール含有物
質の再生を許容する、開裂可能でチオール特異性のビチ
オニル化剤である。
その使用において本発明の化合物は、チオールを含有
する物質、例えば蛋白質のチオールと反応しピリジル−
２−チオンを放出してビオチン誘導体化蛋白質を生ず
る。この反応はチオール−ジスルフイド交換に基づくも
のでこの際ビオチニル化中に放出されたピリジン−２−
チオンはほとんどの蛋白質が透明である波長（λmax＝3
43:εmax＝8,000）において最大値をもつ色原体であ
る。このチオンの生成によつてビオチニル化が都合よく
単純な分光計でモニターされることになる。
する物質、例えば蛋白質のチオールと反応しピリジル−
２−チオンを放出してビオチン誘導体化蛋白質を生ず
る。この反応はチオール−ジスルフイド交換に基づくも
のでこの際ビオチニル化中に放出されたピリジン−２−
チオンはほとんどの蛋白質が透明である波長（λmax＝3
43:εmax＝8,000）において最大値をもつ色原体であ
る。このチオンの生成によつてビオチニル化が都合よく
単純な分光計でモニターされることになる。
本発明によるビオチニル化は、水性緩衝液中のチオー
ル含有物質と水混和性有機溶媒、好ましくは双極性非プ
ロトン溶媒中の式（Ｉ）の化合物とを接触させることか
ら成るものである。多くの生化学の応用のために便利な
緩衝液はpH7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）である。しか
し、通常はラベルされるべき分子の関数である正確な組
成のpH6〜９の範囲の多様な緩衝液も満足に用いられ
る。好ましい態様において緩衝液はまたチオール基に対
する少量の酸化防止剤を含有する。適当な酸化防止剤は
エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）である。チオール
−ジスルフイド交換であるビオチニル化反応は４℃〜30
℃の温度の範囲で１時間から８時間の間に行なわれる。
上で述べたように縮合反応の副生成物が色原体であるの
で反応の進行は便利に分光分析でモニターされる。ひと
たび反応が完了したと判断されると過剰のビオチニル化
剤と副生成物はのぞかれる。巨大分子の場合にはこれは
ゲルロ過または透析によつて容易になし遂げられる。
ル含有物質と水混和性有機溶媒、好ましくは双極性非プ
ロトン溶媒中の式（Ｉ）の化合物とを接触させることか
ら成るものである。多くの生化学の応用のために便利な
緩衝液はpH7.4のリン酸緩衝食塩水（PBS）である。しか
し、通常はラベルされるべき分子の関数である正確な組
成のpH6〜９の範囲の多様な緩衝液も満足に用いられ
る。好ましい態様において緩衝液はまたチオール基に対
する少量の酸化防止剤を含有する。適当な酸化防止剤は
エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）である。チオール
−ジスルフイド交換であるビオチニル化反応は４℃〜30
℃の温度の範囲で１時間から８時間の間に行なわれる。
上で述べたように縮合反応の副生成物が色原体であるの
で反応の進行は便利に分光分析でモニターされる。ひと
たび反応が完了したと判断されると過剰のビオチニル化
剤と副生成物はのぞかれる。巨大分子の場合にはこれは
ゲルロ過または透析によつて容易になし遂げられる。
本発明の化合物は天然のまたは人工的に誘導されたチ
オール基を経ていろいろな物質をビオチニル化するのに
使用することができる。そのような物質は例えばホルモ
ン、酵素および抗体のような蛋白質並びに低分子量物質
よりなるものである。
オール基を経ていろいろな物質をビオチニル化するのに
使用することができる。そのような物質は例えばホルモ
ン、酵素および抗体のような蛋白質並びに低分子量物質
よりなるものである。
適当なアビジン共役体（avidin conjugate）、特に酵
素で標識したアジビン共役体と組合わせた式（Ｉ）の化
合物の使用により、普遍的で多目的のチオール特異性プ
ローブが提供される。例えばブロツト化されたチオール
蛋白質の式（Ｉ）の化合物による直接のステインニング
（染色）は引き続くアビシン酵素複合体の検出を可能と
する。
素で標識したアジビン共役体と組合わせた式（Ｉ）の化
合物の使用により、普遍的で多目的のチオール特異性プ
ローブが提供される。例えばブロツト化されたチオール
蛋白質の式（Ｉ）の化合物による直接のステインニング
（染色）は引き続くアビシン酵素複合体の検出を可能と
する。
アビシンアフイニテイーマトリツクス（例えば固定化
アビジン）と組みあわせた式（Ｉ）の化合物の使用はタ
ンパク質およびタンパク質複合体をアフイニテイークロ
マトグラフイーを経て選択的に分離する手段を提供す
る。例えば、特に目的とする抗原のためのアフイニテイ
ーを持つており式（Ｉ）の化合物でビオチニル化された
抗体は目的の抗原を含んだ粗混合物を加えられる。目的
抗原は、ビオチンでラベルされた抗体に結合し、結果と
して得られる複合体はアビシンアフイニテイーマトリツ
クスで回収される。結合した複合体はアビジンマトリツ
クスからジチオスレイトールのような適当なチオールで
ジスルフイド結合を還元することによりアビジンマトリ
ツクスから回収できる。
アビジン）と組みあわせた式（Ｉ）の化合物の使用はタ
ンパク質およびタンパク質複合体をアフイニテイークロ
マトグラフイーを経て選択的に分離する手段を提供す
る。例えば、特に目的とする抗原のためのアフイニテイ
ーを持つており式（Ｉ）の化合物でビオチニル化された
抗体は目的の抗原を含んだ粗混合物を加えられる。目的
抗原は、ビオチンでラベルされた抗体に結合し、結果と
して得られる複合体はアビシンアフイニテイーマトリツ
クスで回収される。結合した複合体はアビジンマトリツ
クスからジチオスレイトールのような適当なチオールで
ジスルフイド結合を還元することによりアビジンマトリ
ツクスから回収できる。
本発明の化合物は特に抗体またはそのフラグメントに
ビオチンを結合させるのに好適している。抗体の抗原結
合部位には遊離のアミノ基を含む。抗体がこれらのアミ
ノ官能基と反応性のビオチンラベル剤でラベルされてい
るとすればこのラベル化された抗体のその抗原へ結合す
る能力は妨害される。しかしながらもしも抗体がいくつ
かの内部鎖のおよび／またはジスルフイド基を遊離チオ
ール基に変換するためのおだやかな還元に付されている
ならば抗体は次いで本発明のチオール特異性の化合物に
よつてビオチンでラベルされる。チオール特異性ラベル
化剤の使用によつて抗原結合部位による妨害を回避する
ことができる。
ビオチンを結合させるのに好適している。抗体の抗原結
合部位には遊離のアミノ基を含む。抗体がこれらのアミ
ノ官能基と反応性のビオチンラベル剤でラベルされてい
るとすればこのラベル化された抗体のその抗原へ結合す
る能力は妨害される。しかしながらもしも抗体がいくつ
かの内部鎖のおよび／またはジスルフイド基を遊離チオ
ール基に変換するためのおだやかな還元に付されている
ならば抗体は次いで本発明のチオール特異性の化合物に
よつてビオチンでラベルされる。チオール特異性ラベル
化剤の使用によつて抗原結合部位による妨害を回避する
ことができる。
次に本発明を実施例によつて例示する。
実施例 Ｉ 2,2′−ジピリジルジスルフイドの溶液は試薬エタノ
ール75ml中にこのジスルフイド2.64g（12mmol）を溶解
させて調製された。試薬エタノール75ml中の２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩1.29g（11.3mmol）のロ過され
た溶液は、次いで最初の溶液に１時間にわたり撹拌しな
がら加えられた。添加の完了後に撹拌は、室温でつづけ
られた。２時間の後、反応混合物は18時間、冷蔵庫の中
に置かれた。その後得られた懸濁液は不溶解物質、すな
わち酸化された２−メルカプトエチルアミンを除くため
にロ過され、そしてロ液はジエチルエーテル500mlで希
釈された。形成された沈殿物はロ過によつて除かれ、そ
してロ液は回転蒸発器で蒸発させて、体積50mlとした。
濃縮したロ液は再びジエチルエーテルで500mlの容積に
希釈され、こうして羊毛状の沈殿物が生成した。４℃に
冷却した後、生成物は回収され真空下で乾燥され、２−
（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミン塩酸塩を得
た。生成物はTLC（ｎ−ブタノール：酢酸：水（4:1:1）
の系、Merckシリカゲル60F−254プレート）によつてほ
ぼ均一のものであり、UV吸収にてRf0.47のニンヒドリン
陽性のスポツトを示した。D2O中のNMRは指定された構造
と一致した。
ール75ml中にこのジスルフイド2.64g（12mmol）を溶解
させて調製された。試薬エタノール75ml中の２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩1.29g（11.3mmol）のロ過され
た溶液は、次いで最初の溶液に１時間にわたり撹拌しな
がら加えられた。添加の完了後に撹拌は、室温でつづけ
られた。２時間の後、反応混合物は18時間、冷蔵庫の中
に置かれた。その後得られた懸濁液は不溶解物質、すな
わち酸化された２−メルカプトエチルアミンを除くため
にロ過され、そしてロ液はジエチルエーテル500mlで希
釈された。形成された沈殿物はロ過によつて除かれ、そ
してロ液は回転蒸発器で蒸発させて、体積50mlとした。
濃縮したロ液は再びジエチルエーテルで500mlの容積に
希釈され、こうして羊毛状の沈殿物が生成した。４℃に
冷却した後、生成物は回収され真空下で乾燥され、２−
（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミン塩酸塩を得
た。生成物はTLC（ｎ−ブタノール：酢酸：水（4:1:1）
の系、Merckシリカゲル60F−254プレート）によつてほ
ぼ均一のものであり、UV吸収にてRf0.47のニンヒドリン
陽性のスポツトを示した。D2O中のNMRは指定された構造
と一致した。
実施例 II ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと２
−（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミン塩酸塩の溶
液は、このエステル0.73g（2.15mmol）とこのアミン塩
酸塩0.53g（2.39mmol）とをN,N−ジメチルホルムアミド
15ml中に溶解することによつて調製された。トリエチル
アミン（0.63ml、4.54mmol）が加えられ混合物はおおい
をかけて18時間、室温で撹拌された。反応混合物は次い
でロ過されてトリエチルアミン塩酸塩の沈殿を除き、ロ
液は真空下に50℃で回転蒸発器中で蒸発させられた。得
られた油状物は、蒸留水25mlで磨砕され、羊毛状の固体
が得られ、それはあつめられ乾燥されそしてメタノール
（25ml）／水（100ml）から再結晶された。再結晶され
た固体は真空中P2O5の存在下で乾燥し、ビオチン−２−
（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミド0.37gを得
た。
−（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミン塩酸塩の溶
液は、このエステル0.73g（2.15mmol）とこのアミン塩
酸塩0.53g（2.39mmol）とをN,N−ジメチルホルムアミド
15ml中に溶解することによつて調製された。トリエチル
アミン（0.63ml、4.54mmol）が加えられ混合物はおおい
をかけて18時間、室温で撹拌された。反応混合物は次い
でロ過されてトリエチルアミン塩酸塩の沈殿を除き、ロ
液は真空下に50℃で回転蒸発器中で蒸発させられた。得
られた油状物は、蒸留水25mlで磨砕され、羊毛状の固体
が得られ、それはあつめられ乾燥されそしてメタノール
（25ml）／水（100ml）から再結晶された。再結晶され
た固体は真空中P2O5の存在下で乾燥し、ビオチン−２−
（２′−ピリジルジチオ）−エチルアミド0.37gを得
た。
生成物のTLC（ｎ−ブタノール：酢酸：水（4:1:1）Me
rckシリカゲル60F−254プレート）による分析では主
な、UV吸収とヨード染色によるスポツトRf0.65を示し
た。DMSO−D6中のNMRはピリジルチオとビオチン部分の
特徴あるピークを示した。過剰の２−メルカプトエチル
アミンによる生成物の処理では、スペクトル分析（Amax
＝343nm;emax＝7.06×104）による測定でほとんど化学
量論的な２−ピリジルチオンの放出があつたことが分つ
た。
rckシリカゲル60F−254プレート）による分析では主
な、UV吸収とヨード染色によるスポツトRf0.65を示し
た。DMSO−D6中のNMRはピリジルチオとビオチン部分の
特徴あるピークを示した。過剰の２−メルカプトエチル
アミンによる生成物の処理では、スペクトル分析（Amax
＝343nm;emax＝7.06×104）による測定でほとんど化学
量論的な２−ピリジルチオンの放出があつたことが分つ
た。
実施例 III 凍結乾燥大腸菌（Escherichia coli）のβ−ガラクト
シダーゼ（Behring Diagnostics社製、一分子あたり14
個の遊離スルフイジリル基を有するEIAグレード）を、
エチレンジアミンテトラ酢酸1mMを含有するpH7.4のリン
酸塩で緩衝された食塩水に溶解し全酵素濃度0.7mg/mlを
有し、全固体濃度3.1mg/mlを有するストツク溶液4.0ml
を得た。ストツク溶液の1/2（1.4mgまたは酵素分子量46
5,000を基にして3.0mmol）を4mlの石英キユベツトに加
え、これらのキユベツトは、Hitachi100−80型分光計に
おいて343nmにおいて互にゼロに調節された。
シダーゼ（Behring Diagnostics社製、一分子あたり14
個の遊離スルフイジリル基を有するEIAグレード）を、
エチレンジアミンテトラ酢酸1mMを含有するpH7.4のリン
酸塩で緩衝された食塩水に溶解し全酵素濃度0.7mg/mlを
有し、全固体濃度3.1mg/mlを有するストツク溶液4.0ml
を得た。ストツク溶液の1/2（1.4mgまたは酵素分子量46
5,000を基にして3.0mmol）を4mlの石英キユベツトに加
え、これらのキユベツトは、Hitachi100−80型分光計に
おいて343nmにおいて互にゼロに調節された。
N,N−ジメチルホルムアミド中のビオチン−２−
（２′−ピリジルジチオ）エチルアミドの4.0mM溶液はD
MF5mlにこのビオチン誘導体8.34mgを加えることによつ
て、調製された。シリンジを使つてビオチン試薬39μ
（156mmol）がβ−ガラクトシダーゼ溶液2mlを含んだキ
ユベツトの１つに加えられた。２つの溶液の混合物は直
ちに行なわれた。またβ−ガラクトシダーゼ溶液2mlを
含む他のキユベツトに対して、溶媒39μが加えられ
た。これらの溶液の混合は、直ちに行なわれた。
（２′−ピリジルジチオ）エチルアミドの4.0mM溶液はD
MF5mlにこのビオチン誘導体8.34mgを加えることによつ
て、調製された。シリンジを使つてビオチン試薬39μ
（156mmol）がβ−ガラクトシダーゼ溶液2mlを含んだキ
ユベツトの１つに加えられた。２つの溶液の混合物は直
ちに行なわれた。またβ−ガラクトシダーゼ溶液2mlを
含む他のキユベツトに対して、溶媒39μが加えられ
た。これらの溶液の混合は、直ちに行なわれた。
充填されたキユベツトは、分光計に置かれ、ピリジル
チオンの放出による吸収が連続的に343nmでモニターさ
れた。1.5時間後、0.161の吸収が現われ、これは２−ピ
リジルチオン45.6nmolに対応した。反応の化学量論に従
えば、２−ピリジルチオンの収率は酵素1nmolあたり平
均して、反応したビオチン15nmolに相当する。
チオンの放出による吸収が連続的に343nmでモニターさ
れた。1.5時間後、0.161の吸収が現われ、これは２−ピ
リジルチオン45.6nmolに対応した。反応の化学量論に従
えば、２−ピリジルチオンの収率は酵素1nmolあたり平
均して、反応したビオチン15nmolに相当する。
過剰のビオチン試薬はpH7.4の緩衝液で平衡化された
セフアデツクス25カラム（Pharmacia PD−10）中に反応
溶液を通ずることによつてビオチニル化された酵素から
除かれた。ビオチニル化された酵素を含む分画は、A280
タンパク質吸収で捜し出されそして分画はプールされ、
3.4mlの溶液が得られた。
セフアデツクス25カラム（Pharmacia PD−10）中に反応
溶液を通ずることによつてビオチニル化された酵素から
除かれた。ビオチニル化された酵素を含む分画は、A280
タンパク質吸収で捜し出されそして分画はプールされ、
3.4mlの溶液が得られた。
実施例 IV 280nmにおける0.70蛋白質吸収単位を含有する溶液で
ある実施例IIIからのビオチニル化された酵素溶液の1ml
が、アビジン−アガロースゲル（カリホルニア州、ラ
ジヨラのBehrig Diagnostics社製）1mlのベツドを通し
て、パーコレートせしめられた。その流出物が集められ
た後、ベツドはpH7.4の緩衝液1.7mlで洗浄された。一緒
にされた流出物は280nmにおいてタンパク質吸収単位を
0.04だけしか含まないことが見出された。このことは、
カラム上に94％のビオチニル化酵素が保持されているこ
とを示す。対照実験において、流出物中に現れた非ビオ
チニル化β−ガラクトシダーゼの試料によつて生じた事
実上すべての吸収単位は、修飾されていない酵素はカラ
ム上には保持されないことを示すものである。
ある実施例IIIからのビオチニル化された酵素溶液の1ml
が、アビジン−アガロースゲル（カリホルニア州、ラ
ジヨラのBehrig Diagnostics社製）1mlのベツドを通し
て、パーコレートせしめられた。その流出物が集められ
た後、ベツドはpH7.4の緩衝液1.7mlで洗浄された。一緒
にされた流出物は280nmにおいてタンパク質吸収単位を
0.04だけしか含まないことが見出された。このことは、
カラム上に94％のビオチニル化酵素が保持されているこ
とを示す。対照実験において、流出物中に現れた非ビオ
チニル化β−ガラクトシダーゼの試料によつて生じた事
実上すべての吸収単位は、修飾されていない酵素はカラ
ム上には保持されないことを示すものである。
実施例 Ｖ 実施例IVで記載したようにして調製された固定化ビオ
チニル化β−ガラクトシダーゼ生成物の1mlを1mMのエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含有するpH7.4のリン酸塩で
緩衝された食塩水中の50mMのジチオスレイトール溶液4m
lで処理された。ジチオスレイトール試薬はゲルベツド
を通して室温でロ過され、ロ液はあつめられた。この過
程でほぼ２時間の間、ゲルは試薬にさらされた。全体の
集められたロ液はセフアデツクスＧ−25のゲルロ過カラ
ムに通されて回収されたβ−ガラクトシダーゼからジチ
オスレイトールを分離した。アビジン−アガロースゲル
に結合したビオチンでラベルされたβ−ガラクトシダー
ゼのOD280の単位のうち1.28のOD280単位が回収され、酵
素の82％が開裂していることが示された。
チニル化β−ガラクトシダーゼ生成物の1mlを1mMのエチ
レンジアミンテトラ酢酸を含有するpH7.4のリン酸塩で
緩衝された食塩水中の50mMのジチオスレイトール溶液4m
lで処理された。ジチオスレイトール試薬はゲルベツド
を通して室温でロ過され、ロ液はあつめられた。この過
程でほぼ２時間の間、ゲルは試薬にさらされた。全体の
集められたロ液はセフアデツクスＧ−25のゲルロ過カラ
ムに通されて回収されたβ−ガラクトシダーゼからジチ
オスレイトールを分離した。アビジン−アガロースゲル
に結合したビオチンでラベルされたβ−ガラクトシダー
ゼのOD280の単位のうち1.28のOD280単位が回収され、酵
素の82％が開裂していることが示された。
実施例 VI ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（1.
10g、3.23mmol）はN,N−ジメチルホルムアミド11ml中に
溶解されそして得られた溶液は氷浴中で５℃に冷却され
た。その後1Mの重炭酸ナトリウム11ml中のＮ−α−ｔ−
BOC−Ｌ−リジン0.927g（3.77mmol）の溶液が撹拌下に
初めの溶液に1.5時間にわたつて加えられた。撹拌は室
温で一夜続けられた。反応混合物は次いで真空でロ過さ
れそしてロ液は減圧下に35℃で回転蒸発器で蒸発させら
れた。得られた白いくもつた油状物は水27mlに溶解され
得られた溶液は氷浴中で５℃に冷却された。溶液が1N塩
酸でpH3に酸性化されたとき白い沈殿物が形成された。
反応混合物は次いで約30分間撹拌され次いで真空でロ過
された。得られた白色固体は氷水中で洗浄し、次いで真
空下に一夜40℃でP2O5の存在のもとに乾燥され、Ｎ−α
−ｔ−BOC−ビオシチン1.10gを得た。
10g、3.23mmol）はN,N−ジメチルホルムアミド11ml中に
溶解されそして得られた溶液は氷浴中で５℃に冷却され
た。その後1Mの重炭酸ナトリウム11ml中のＮ−α−ｔ−
BOC−Ｌ−リジン0.927g（3.77mmol）の溶液が撹拌下に
初めの溶液に1.5時間にわたつて加えられた。撹拌は室
温で一夜続けられた。反応混合物は次いで真空でロ過さ
れそしてロ液は減圧下に35℃で回転蒸発器で蒸発させら
れた。得られた白いくもつた油状物は水27mlに溶解され
得られた溶液は氷浴中で５℃に冷却された。溶液が1N塩
酸でpH3に酸性化されたとき白い沈殿物が形成された。
反応混合物は次いで約30分間撹拌され次いで真空でロ過
された。得られた白色固体は氷水中で洗浄し、次いで真
空下に一夜40℃でP2O5の存在のもとに乾燥され、Ｎ−α
−ｔ−BOC−ビオシチン1.10gを得た。
実施例 VII トリフルオロ酢酸4.5mlとアニソール0.50mlとの混合
物をＮ−α−ｔ−BOC−ビオシチン1.08g（2.29mmol）に
加えた。得られた反応混合物を室温で30分間撹拌し次い
で真空下に30℃で回転蒸発器で蒸発させ粘調な黄色の油
状物を得た。油状物はエチルエーテル20mlで磨砕し得ら
れた懸濁液を真空ロ過した。得られた白い固体を水酸化
ナトリウムの存在下に真空で一夜乾燥させビオシチント
リフルオロアセテート1.34gを得た。
物をＮ−α−ｔ−BOC−ビオシチン1.08g（2.29mmol）に
加えた。得られた反応混合物を室温で30分間撹拌し次い
で真空下に30℃で回転蒸発器で蒸発させ粘調な黄色の油
状物を得た。油状物はエチルエーテル20mlで磨砕し得ら
れた懸濁液を真空ロ過した。得られた白い固体を水酸化
ナトリウムの存在下に真空で一夜乾燥させビオシチント
リフルオロアセテート1.34gを得た。
実施例 VIII ビオシチントリフルオロアセテート（0.50g、1.03mmo
l）をpH8.3の0.5M重炭酸ナトリウム緩衝液5.0mlに溶解
し、得られた溶液を次いで氷浴中で５℃に冷却した。そ
の後N,N−ジメチルホルムアミド2ml中のＮ−スクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート0.
32g（1.03mmol）の溶液を最初の溶液に撹拌しながら滴
下して加えた。添加が完了した後撹拌は続けられ反応は
室温にもどされた。２時間後反応混合物は1Nの塩酸でpH
3に酸性化され、そして冷蔵庫に一夜置かれて生成物を
沈殿せしめた。冷却して得られた懸濁液は真空ロ過され
そして回収された固体は真空中で乾燥され融点166〜169
℃のＮ−（２−ピリジルジチオプロピオニル）ビオシチ
ン0.36gを得た。
l）をpH8.3の0.5M重炭酸ナトリウム緩衝液5.0mlに溶解
し、得られた溶液を次いで氷浴中で５℃に冷却した。そ
の後N,N−ジメチルホルムアミド2ml中のＮ−スクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート0.
32g（1.03mmol）の溶液を最初の溶液に撹拌しながら滴
下して加えた。添加が完了した後撹拌は続けられ反応は
室温にもどされた。２時間後反応混合物は1Nの塩酸でpH
3に酸性化され、そして冷蔵庫に一夜置かれて生成物を
沈殿せしめた。冷却して得られた懸濁液は真空ロ過され
そして回収された固体は真空中で乾燥され融点166〜169
℃のＮ−（２−ピリジルジチオプロピオニル）ビオシチ
ン0.36gを得た。
生成物はTLC（ｎ−プロパノール：水（7:3）の系Merc
kシリカゲル60F−254−プレート）によつてほぼ均一の
ものであり単一のUV吸収、単一のヨウド染色成分を示し
た。過剰の２−メルカプトエチルアミンでの生成物の処
理により90％以上のピリジルジチオ部分の放出のあつた
ことが光学分析（Amax＝343nm;emax＝7.06×104）によ
つて測定された。DMSO−D6中のNMRでは、ピリジルチオ
およびビオチニル部分の特徴あるピークが示された。
kシリカゲル60F−254−プレート）によつてほぼ均一の
ものであり単一のUV吸収、単一のヨウド染色成分を示し
た。過剰の２−メルカプトエチルアミンでの生成物の処
理により90％以上のピリジルジチオ部分の放出のあつた
ことが光学分析（Amax＝343nm;emax＝7.06×104）によ
つて測定された。DMSO−D6中のNMRでは、ピリジルチオ
およびビオチニル部分の特徴あるピークが示された。
実施例 IX 実施例IIIの方法を用いるがビオチン−２−（２′−
ピリジルジチオ）−エチルアミドをＮ−（２−ピリジル
ジチオプロピオニル）−ビオシチンでおきかえたとこ
ろ、後者の試薬により、ビオチニル化されたβ−ガラク
トシダーゼが得られた。反応の測定された吸収は２−ピ
リジルチオンの放出によるものであるが処理された酵素
の1nmolあたり平均で２−ピリジルチオン12nmolの放出
に相当するものである。
ピリジルジチオ）−エチルアミドをＮ−（２−ピリジル
ジチオプロピオニル）−ビオシチンでおきかえたとこ
ろ、後者の試薬により、ビオチニル化されたβ−ガラク
トシダーゼが得られた。反応の測定された吸収は２−ピ
リジルチオンの放出によるものであるが処理された酵素
の1nmolあたり平均で２−ピリジルチオン12nmolの放出
に相当するものである。
過剰のビオチン試薬は1mMのエチレンジアミンテトラ
酢酸を含むpH7.4のリン酸塩で緩衝された食塩水で平衡
化されたセフアデツクスＧ−25に反応溶液を通すことに
よつてビチオニル化酵素から除かれた。ビオチニル化酵
素を含む分画はA280のタンパク質吸収で捜し出されプー
ルされた。
酢酸を含むpH7.4のリン酸塩で緩衝された食塩水で平衡
化されたセフアデツクスＧ−25に反応溶液を通すことに
よつてビチオニル化酵素から除かれた。ビオチニル化酵
素を含む分画はA280のタンパク質吸収で捜し出されプー
ルされた。
実施例 Ｘ 実施例IXで得られたビオチニル化酵素溶液は実施例IV
に述べられた方法により処理され、アビシンアガロース
上に固定化されたビオチニル化β−ガラクトシダーゼが
得られた。
に述べられた方法により処理され、アビシンアガロース
上に固定化されたビオチニル化β−ガラクトシダーゼが
得られた。
アビシン−アガロースゲルに加えられたビオチンでラ
ベルされたβ−ガラクトシダーゼの全体で3.00のOD280
単位のうち260のOD280単位が結合されており、このこと
は86％のビオチニル化酵素がカラム上に保持されている
ことを示すものである。
ベルされたβ−ガラクトシダーゼの全体で3.00のOD280
単位のうち260のOD280単位が結合されており、このこと
は86％のビオチニル化酵素がカラム上に保持されている
ことを示すものである。
実施例 XI 実施例Ｘの固定化されたビオチンでラベルされたβ−
ガラクトシダーゼ生成物を実施例Ｖの方法により処理し
てラベルされていないβ−ガラクトシダーゼを得た。
ガラクトシダーゼ生成物を実施例Ｖの方法により処理し
てラベルされていないβ−ガラクトシダーゼを得た。
アビシン−アガロースゲルに結合している酵素の全体
で2.60のOD280単位のうち1.84OD280単位が回収され、こ
のことは、酵素の71％がカラムから開裂されたことを示
すものである。
で2.60のOD280単位のうち1.84OD280単位が回収され、こ
のことは、酵素の71％がカラムから開裂されたことを示
すものである。
Claims (7)
- 【請求項１】次の式 （式中、ｘおよびｙは１から５の整数であり、ｎは０ま
たは１であり、Ｒは式−CONH−または−CH（CO2H）NHCO
−を有する基であり、Ｚは２−ピリジル、４−ピリジ
ル、５−ニトロ−２−ピリジルおよび５−カルボキシ−
２−ピリジルから選択される基である）で示される化合
物。 - 【請求項２】Ｚが２−ピリジルまたは４−ピリジルであ
る請求項１記載の化合物。 - 【請求項３】次の式 を有するビオチン−２−（２′−ピリジルジチオ）−エ
チルアミドである請求項１記載の化合物。 - 【請求項４】次の式 を有するＮ−（２−ピリジルチオプロピオニル）ビオシ
チンである請求項１記載の化合物。 - 【請求項５】チオールを含有する蛋白質のビオチン誘導
体を製造する方法であって、チオール含有蛋白質の水性
緩衝溶液に有機溶媒に溶解させた請求項１記載の式Ｉの
化合物をpH4〜９で接触させ、生成するビオチン誘導体
を採取することからなる方法。 - 【請求項６】標的蛋白質を含有する混合物から標的蛋白
質と抗体との錯体を採取する方法であって、上記標的蛋
白質に特異的な抗体を用意し、上記抗体と請求項１記載
の化合物とを接触させることによって上記抗体のビオチ
ン誘導体を調製し、上記標的蛋白質を含有する混合物と
ビオチン化抗体とを接触させて標的蛋白質とビオチン化
抗体との錯体とし、上記錯体を固定化されたアビジンと
接触させてアジビンが結合した錯体とし、そして上記ア
ビジンが結合した錯体をチオールで処理し、それによっ
て標的蛋白質と抗体との錯体が、上記の固定化されたア
ジビンから解放されることからなる上記方法。 - 【請求項７】標的蛋白質を含有する混合物からの標的蛋
白質と抗体との錯体を採取する方法であって上記標的蛋
白質に特異的な抗体を用意し、上記抗体と請求項１記載
の化合物とを接触させることによって上記抗体のビオチ
ン誘導体を調製し、上記のビオチン化抗体を固定化され
たアジビンと接触させて固定化された抗体とし、上記の
固定化された抗体を上記標的蛋白質を含有する混合物と
接触させて上記の標的蛋白質と上記の抗体との固定化さ
れた錯体とし、そして上記固定化された錯体をチオール
で処理し、それによって上記の標的蛋白質と抗体との錯
体が、上記の固定化されたアジビンから解放されること
からなる上記の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/015,324 US4709037A (en) | 1987-02-17 | 1987-02-17 | Biotinylating agents |
| US15,324 | 1987-02-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63203683A JPS63203683A (ja) | 1988-08-23 |
| JP2648162B2 true JP2648162B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=21770756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63031973A Expired - Fee Related JP2648162B2 (ja) | 1987-02-17 | 1988-02-16 | ビオチニル化剤 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4709037A (ja) |
| EP (1) | EP0279365B1 (ja) |
| JP (1) | JP2648162B2 (ja) |
| AT (1) | ATE87312T1 (ja) |
| AU (1) | AU615644B2 (ja) |
| CA (1) | CA1293258C (ja) |
| DE (1) | DE3879528T2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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