JPH06322000A - 免疫学的に活性な複合体およびそれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式： Ａ−Ｌ₁−Ｌ₂−Ｂ （式中、ＡおよびＢは、ハプテン、タンパク質、多糖
類、可溶性ポリスチレン、またはペプチドからなる群か
ら選択された、カップリングすべき物質であり、Ｌ ₁ お
よびＬ₂ は３価のリンカーであって、Ｌ₁ およびＬ₂ が
２つのチオエーテル結合を介して互いに結合している）
で表される複合体。 【効果】 これらは免疫学的検定に使用することがで
き、改善された保存安定性を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の主題は、安定な形態で結
合しているハプテン、タンパク質および高分子物質の免
疫学的に活性な複合体である。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質、ハプテンおよび高分子物質
の結合に関して数多くの方法が述べられてきている。通
常、この種の２つの物質は２官能性リンカーを介して共
有結合によって結合される。これらの方法の総説が、
Ｍ．ブリンクレイ（Brinkley）によってBioconjugate C
hem.3 (1992) 2-13 に、そしてウォング（Wong）によっ
てChemistry of protein conjugating and cross-linki
ng,CRC press 1991 に記載されている。特に好適なもの
は、マレインイミジル基とチオール基からのチオエーテ
ル結合（ＭＨ−ＳＨ結合）の形成を介するカップリング
である。

【０００３】しかし、こうしたリンカーを介した結合は
不安定なことが多く、これらの複合体を液体中または凍
結乾燥形態で保存する間に、それらは次第に分解する。
この点は、この複合体を免疫学的検定において使用する
場合、測定の感度、正確度および精密度に悪影響を及ぼ
すので、特に不都合である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、複合体化すべき物質が従来技術からの既知リン
カーよりも実質的により安定な結合能を有している、安
定で免疫学的に活性な複合体を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この目的は、一般式： Ａ−Ｌ₁−Ｌ₂−Ｂ （式中、ＡおよびＢは、ハプテン、タンパク質（例えば
抗体、ＰＯＤ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリフ
ォスファターゼなどの酵素）、多糖類（デキストランな
ど）、可溶性ポリスチレン（例えば格子（lattice
s））、またはペプチド（例えばＥＤ、β−ガラクトシ
ダーゼサブユニット）からなる群から選択された、カッ
プリングすべき物質であり、Ｌ₁ およびＬ₂ は３価のリ
ンカーであって、Ｌ₁ およびＬ₂ が２つのチオエーテル
結合を介して互いに結合している）で表される複合体に
よって達成される。

【０００６】リンカーＬ₁ およびＬ₂ は、１つのＣ原子
を介して結合された３つの側枝（スペーサー）を有する
化合物である。リンカーＬ₁ のこれらの側枝の２つがマ
レインイミド基を有し、リンカーＬ₂ の２つの側枝のそ
れぞれがチオール基を有している。リンカーＬ₁ および
Ｌ₂ を介して物質ＡおよびＢをカップリングさせるため
に、マレインイミドにＳＨ基を付加することによって、
２つのマレインイミド基とチオール基が連結されて２つ
のチオエーテル結合が形成される。

【０００７】本発明に従って使用されるリンカーは、こ
れら２つのマレインイミド基とチオール基の他に、この
リンカーとカップリングさせる物質ＡおよびＢ（たとえ
ばハプテン、タンパク質、高分子物質またはペプチド）
との結合に適したもう１つの官能基を含んでいる。こう
した官能基として、例えばＮ−ヒドロキシエステル基の
ようなエステル活性化基、イミダゾリド、ピリダゾリ
ド、アミノアルキルカルボン酸または活性化アリールエ
ステル基（例えばｐ−ニトロフェニルエステル）があ
る。好ましいカップリング基はＮ−ヒドロキシスクシン
イミドである。

【０００８】好ましくは、物質ＡおよびＢをカップリン
グさせるために、１つのリンカーが２つのマレインイミ
ド基と１つのヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジ
イミダゾリル基を有し、もう１つのリンカーが２つのチ
オール基またはアシル基で保護されたチオール基と１つ
のヒドロキシスクシンイミドまたはカルボジイミダゾリ
ル基を有している、ホモ２座配位性の（homobidental）
３官能性のリンカー２つを使用する。

【０００９】本発明の複合体を製造するためには、好ま
しくは、カップリングすべき物質をヒドロキシスクシン
イミドまたはカルボジイミダゾリル基を介して、２つの
ホモ２座配位性の３官能性リンカーのうちの１つに連結
させる。第２段階として、マレインイミド基がチオール
基と反応して２つのチオエーテル結合を形成する。これ
らの操作に使用される方法は当業者にはよく知られてお
り、たとえばS.Mitra, J.Am.Chem.Soc. 101 (1979) 309
7-3110に記載されている。

【００１０】Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基によるタ
ンパク質の活性化は、たとえば弱アルカリ緩衝液中での
タンパク質のリシン側鎖のε−アミノ基における親核置
換によって実際に行なわれる。これを実施するには、誘
導体化すべきタンパク質のアミノ基に対して１〜１５倍
過剰のリンカーを使用する。この反応で形成されたＮ−
ヒドロキシスクシンイミドと過剰のリンカーを透析また
はゲルクロマトグラフィーによって分離する。

【００１１】アミノ基を含有するハプテンは、トリエチ
ルアミンを添加したジオキサンまたはＤＭＦのような有
機溶媒中、または緩衝液混合物、好ましくはｐＨ7.5 の
リン酸カリウム緩衝液中で、等モル量の本発明によるリ
ンカーと反応させることができる。リンカーを形成して
いる３つの側基（スペーサー）は、Ａ、Ｂとチオエーテ
ル基との好適な空間的配置を確保し、かつ本発明の複合
体の水溶性を保持することを目的とした化学基であると
理解される。

【００１２】このホモ２座配位性の３官能性リンカーの
他の組成および官能基の長さは重要でない。こうしたリ
ンカーと同様の組成を有する例が米国特許第 5091542号
に記載されているが、ここでは本発明のホモ２座配位性
の３官能性リンカーは、米国特許第 5091542号によるリ
ンカーとは異なり、マレインイミド官能基をもつことが
できない。その代わり、それらは、２つのマレインイミ
ド基と、たとえば１つのヒドロキシスクシンイミド基、
または２つのチオール基と１つのヒドロキシスクシンイ
ミド基を有しているにすぎない。その他の好適なリンカ
ーが例えば米国特許第 5168057号に記載されているが、
やはりホモ２座配位性の構造のカップリング基を有して
いる。

【００１３】米国特許第 5082930号に記載されたリンカ
ーについても同様である。他の好適なリンカーが本特許
出願と同一の優先権を有する Boehringer Mannheim Gmb
H のドイツ特許出願第 P.4310141.0号に記載されてい
る。この特許出願の主題は、本特許出願が開示する主題
と同一である。好ましい態様として、リンカーに使用さ
れるスペーサー基はイミド、エーテル、カルボニルまた
はカルボキシル基が介在する飽和または不飽和のアルキ
ル基である。３つのスペーサー基の長さもまた無関係
で、基本的にはＡＢ間およびチオエーテル結合の際の立
体障害を回避するという点に基づいて決定される。スペ
ーサー基として、２〜40原子数を含むものが好適であ
る。

【００１４】本発明のもう１つの主題は、本発明による
複合体の製造方法である。この方法は、第１の物質Ａが
２つのマレインイミド基を有するホモ２座配位性の３官
能性リンカーＬ₁ と結合する第１段階と、第２の物質Ｂ
が２つのチオール官能性基を有するホモ２座配位性の３
官能性リンカーＬ₂ と結合する第２段階からなってい
る。次に、これらの活性化されたカップリングすべき物
質が、マレインイミドにＳＨ基を付加することにより２
つのチオエーテル結合を介して結合する。

【００１５】本発明のさらにもう１つの主題は、免疫学
的試験における免疫学的に活性な物質の測定のための本
発明の複合体の使用法である。こうした試験において
は、本発明の複合体は、たとえばアナライトの固相への
結合またはアナライトの標識（たとえば酵素）への結合
を行なわせるために使用される。特に好ましい複合体と
して、抗体／酵素複合体、抗体／ビオチン複合体、ハプ
テン／ビオチン複合体、抗体／抗体複合体、アビジン／
ストレプトアビジン／抗体複合体、アビジン／ストレプ
トアビジン−ハプテン−複合体が含まれる。

【００１６】本発明を説明するため、以下に実施例を示
す。

【００１７】

【実施例】実施例１ Ｓ，Ｓ−ジアセチル−６，８−ジメルカプト−オクタノ
イルビホスホネート（ビホスホネート−ＬＩＰＯＳ） ビホスホネート102.1mg （３mmol）を水７mlに溶解し、
ジオキサン４ml中のＬＩＰＯＳ（実施例２）155.8mg
（0.4mmol）を加えた。希釈アンモニウムを使用してｐ
ＨをｐＨ６−７に調整し、20℃で24時間撹拌した。つづ
いて新たにジオキサン２ml中にＬＩＰＯＳ78mg（２mmo
l）を溶解し、加えた。24時間後、さらにＬＩＰＯＳ39m
g（0.1mmol ）を加えた。総計４日後、水流ポンプによ
る減圧下で溶媒を除去し、残留物を各回ＴＨＦ50mlずつ
使用して２回蒸解（digest）し、上清をデカントした。
粗生成物を水0.5ml に溶解し、メタノールによって沈澱
させ、Ｃa Ｃl₂を使用した乾燥器で乾燥した。 収量： 20mg（理論値の12％） ＴＬＣ：セルロース、ｎ−ブタノール／氷酢酸／水（3/
1/1 v/v/v ）、ニンヒドリンによる検出 ＲＦ＝0.58

【００１８】

【化１】

【００１９】実施例２ Ｓ，Ｓ−ジアセチル−６，８−ジメルカプト−オクタン
酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＬＩＰＯ
Ｓ） ２．１ ジヒドロリポ酸 リポ酸1.03mg（５mmol) を水20mlおよびエタノール５ml
中に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム380mg （10mmol）
を添加し、20℃で撹拌した。60分後、さらに水素化ホウ
素ナトリウム380mg （10mmol）を添加し、20℃でさらに
５時間撹拌した。次に混合物を水50mlで希釈し、１Ｍ塩
酸を使用してｐＨ１−２に調整し、酢酸エチル50mlで２
回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥
し、水流ポンプによる減圧蒸留で溶媒を除去し、油状の
残留物を高真空で乾燥した。 収量： 1.0ｇ（理論値の95％）

【００２０】分析用ＨＰＬＣ カラム： ＶydacＣ18，4.6x250mm,５μm,300Å 溶離剤：Ａ：ミリポア（Millipore ）水、0.01％ＴＦＡ Ｂ：アセトニトリル、0.01％ＴＦＡ 勾配： 90分間に０−65％Ｂ 流速： １ml／分 検出器： 226nm におけるＵＶ検出 保持時間：ジヒドロリポ酸 46.7分 リポ酸 44.2分 ＴＬＣ：シリカゲル（Merck 60）、イソプロピルエーテ
ル／１％氷酢酸、Ｎ−ブロモスクシンイミド／フルオレ
セイン噴霧による検出 Ｒｆ＝0.46（抽出物(educt)Ｒｆ＝0.43） Ｎ−ブロモスクシンイミド／フルオレセイン噴霧： 噴霧溶液１：塩化メチレン中0.2 ％Ｎ−ブロモスクシン
イミド 噴霧溶液２：エタノール97mlで希釈したフルオレセイン
溶液（0.1 Ｎ水酸化ナトリウム溶液中0.33％フルオレセ
イン）３ml 検出：溶液１をＴＬＣに噴霧し、20℃で乾燥し、さらに
溶液２を噴霧した。 着色：長時間放置後、黄色のバックグラウンド上のピン
クの点が硫黄化合物を示す。

【００２１】２．２ Ｓ，Ｓ−ジアセチル−６，８−ジ
メルカプト−オクタン酸 ジヒドロリポ酸（実施例２．１）１ｇ（4.75mmol）を塩
化アセチル50ml中に溶解し、還流しながら15時間加熱し
た。次に、反応溶液を氷水 500ml上に注意深く注ぎ、各
回酢酸エチル200ml を使用して、２回抽出した。有機相
を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、水流ポンプによ
る減圧蒸留で溶媒を除去し、残留物を開放カラムクロマ
トグラフィー（シリカゲル Merck60 ，３ｘ40cm，溶離
剤：エーテル／ヘキサン（4/1 v/v)／１％氷酢酸）によ
り精製した。 収量： 860mg（理論値の62％） ＴＬＣ：シリカゲル（Merck 60）、イソプロピルエーテ
ル／１％氷酢酸、Ｎ−ブロモスクシンイミド／フルオレ
セイン噴霧による検出 Ｒｆ＝0.45（抽出物Ｒｆ＝0.43） ＨＰＬＣ：上記の条件 保持時間：52.0分（ジアセテート） 49.8分（モノアセテート）

【００２２】

【化２】

【００２３】２．３ Ｓ，Ｓ−ジアセチル−６，８−ジ
メルカプト−オクタン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＬＩＰＯＳ） 実施例２．２の化合物 860mg（2.94mmol）を無水ＴＨＦ
50mlに溶解し、つぎにＮ−ヒドロキシスクシンイミド 3
72mg（3.23mmol）およびジシクロヘキシルカルボジイミ
ド 666mg（3.23mmol）を添加した。20℃で３時間撹拌
後、さらにＮ−ヒドロキシスクシンイミド 115mg（ 1mm
ol）およびＤＣＣ 206mg（ 1mmol）を添加し、20℃で24
時間撹拌を続けた。続いて、沈殿したジシクロヘキシル
尿素を濾過によって除去し、濾液を濃縮し、無水ＴＨＦ
20ml中に入れた。不溶成分を濾過によって除去し、溶媒
を蒸留によって除去した。残留物を酢酸エチル75ml中に
溶解させ、各回水40mlずつで２回抽出した。酢酸エチル
相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、水流ポンプによる減圧
下で溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルを使用したク
ロマトグラフィー（Ｍerck60，４ｘ30cm，溶離剤：酢酸
エチル／ヘキサン（３/２v/v) ）によって精製した。集
めた画分を濃縮し、残留物をジオキサン20ml中に溶解
し、凍結乾燥品を生成させた。 収量： 820mg（理論値の72％） ＴＬＣ：シリカゲル（Merck 60）、エーテル／１％氷酢
酸、Ｎ−ブロモスクシンイミド／フルオレセイン噴霧に
よる検出 Ｒｆ＝0.36

【００２４】

【化３】

【００２５】実施例３ ３．１ Ｎ−α−Ｂｏｃ−ε−マレインイミド−α−ア
ミノヘキサン酸（α−Ｂｏｃ−ε−Ｍａｌ−Ｌｙｓ） 飽和炭酸水素ナトリウム溶液 200mlをα−Ｎ−ｔ−ブチ
ルオキシカルボニルリシン 3.70ｇ（15mmol）に添加
し、Ｎ−エトキシカルボニル−マレインイミド2.54ｇ
（15mmol）と反応させ、20℃で30分間撹拌した。続いて
反応溶液を水 200mlで希釈し、２Ｎ塩酸を使用してｐＨ
1.8に調整し、酢酸エチルを各回 200mlずつ使用して２
回抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、そして溶媒を
水流ポンプによる減圧下で蒸留することによって除去し
た。粗生成物をシリカゲル、溶離剤：酢酸エチル／メタ
ノール（4/1 v/v ）／１％酢酸を用いる開放カラムクロ
マトグラフィー（５ｘ50cm）によって精製した。画分を
含む生成物を精製し、溶媒を水流ポンプによる減圧で除
去し、残留物をＣaＣl₂ 上で高減圧下で乾燥した。 収量： 3.8ｇ（11.58mmol）、理論値の78％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（3/2 v/v ）／１％酢酸、過マンガン酸カリウムに
よる検出 Ｒｆ＝0.83

【００２６】

【化４】

【００２７】３．２ Ｎ−α−Ｂｏｃ−ε−マレインイ
ミド−α−アミノヘキサノイル−β−アラニン（α−Ｂ
ｏｃ−ε−Ｍａｌ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ） Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 676mg（5.92mmol）およ
びジシクロヘキシルカルボジイミド1.21ｇ（5.92mmol）
をＴＨＦ 200ml中の実施例３．１の化合物1.60ｇ（ 4.9
mmol）に添加し、20℃で１時間撹拌した。β−アラニン
480mg(5.4mmol)を 0.1ＭＫＰＯ₄ 緩衝液（ｐＨ8.5 ）20
0ml に溶解し、反応混合物に滴下した。20℃で16時間撹
拌後、有機溶媒を水流ポンプによる減圧蒸留で除去し、
水相を水100ml で希釈し、各回 250mlずつの酢酸エチル
を使用して２回抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、
水流ポンプによる減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲ
ルカラム（５ｘ30cm）上で乾燥した。溶離剤は酢酸エチ
ル／メタノール（4/1 v/v ）／１％酢酸である。 収量： 1.17ｇ（2.96mmol）、理論値の61％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（4/1 v/v ）／１％氷酢酸、過マンガン酸カリウム
による検出 Ｒｆ＝0.7

【００２８】

【化５】

【００２９】３．３ ε−マレインイミド−α−アミノ
ヘキサノイル−β−アラニン（ε−Ｍａｌ−Ｌｙｓ−β
−Ａｌａ） トリフルオロ酢酸15mlを実施例３．２の化合物 710mg
（ 1.8mmol）に撹拌しながら０℃で添加し、その後徐々
に20℃まで加熱した。30分後、溶液を酢酸エチル15mlで
希釈し、撹拌を20℃でさらに15分間継続した。そして溶
媒を水流ポンプによる減圧蒸留で除去し、残留物をジオ
キサン／水（1/1 v/v ）に溶解し、凍結乾燥物を製造し
た。 収量： 430mg （ 1.5mmol）、理論値の81％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（1/4 v/v ）／１％氷酢酸、ニンヒドリンによる検
出 Ｒｆ＝0.33

【００３０】

【化６】

【００３１】３．４ Ｎ−α−（６−マレインイミドヘ
キサノイル）−ε−マレインイミド−α−アミノヘキサ
ノイル−β−アラニン（α−ＭＨＳ−ε−Ｍａｌ−Ｌｙ
ｓ−β−Ａｌａ） ＴＨＦ10ml中のマレインイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（ＭＨＳ） 462mg（ 1.5mm
ol）溶液を 0.1ＭＫＰＯ₄ 緩衝液（ｐＨ7.5 ）10ml中の
実施例３．３の化合物 400mg（1.35mmol）からなる溶液
に撹拌しながら滴下した。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を
使用して、ｐＨを 7.5に調整した。20℃で16時間撹拌
後、有機溶媒を水流ポンプによる減圧蒸留で除去し、残
留物を水10mlで希釈し、１Ｎ塩酸を使用してｐＨ3.0 に
調整し、各回30mlずつの酢酸エチルで３回抽出した。生
成物はここで有機相に移動した。この相を硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、水流ポンプによる減圧下で濃縮した。残
留物をシリカゲルの開放カラムクロマトグラフイー（溶
離剤：酢酸エチル／メタノール（2/1 v/v ）／１％酢
酸）によって精製した。集めた画分を濃縮し、酢酸エチ
ル／ＴＨＦ（1/1 v/v ）10mlからジイソプロピルエーテ
ルを使用して沈殿させた。沈殿物を濾過によって取り出
し、ＣaＣl₂ 上で高減圧下で濃縮した。 収量： 230mｇ（0.47mmol）、理論値の35％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（2/1 v/v ）／１％氷酢酸、過マンガン酸カリウム
による検出 Ｒｆ＝0.63

【００３２】

【化７】

【００３３】３．５ Ｎ−α−（６−マレインイミドヘ
キサノイル）−ε−マレインイミド−α−アミノヘキサ
ノイル−β−アラニル−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド）（α−ＭＨＳ−ε−Ｍａｌ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−
ＯＳｕ）（ＭＡＬＯＳ） 実施例３．４の化合物 180mg（0.36mmol）を無水ＤＭＦ
10mlに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド49mg（0.
43mmol）およびモルホリノエチルイソシアネート（ＭＥ
Ｉ）60μl（0.43mmol）を加え、20℃で16時間撹拌し
た。さらにＮ−ヒドロキシスクシンイミド49mg（0.43mm
ol）およびＭＥＩ60μl（0.43mmol）を８時間間隔で、
２回繰り返し加えた。反応を完全に行なわせるため、さ
らに６時間撹拌し続けた。次に、溶媒を高減圧下で除去
し、残留物を酢酸エチル25mlで蒸解させ、不溶性成分を
濾過によって除去し、濾液をおよそ10mlに濃縮した。極
少量の酢酸エチルに溶解した生成物をジイソプロピルエ
ーテル 200ml中に滴下し、沈殿物質を取り出し（設置さ
れた真空システムのみを使用）、ジイソプロピルエーテ
ルで洗浄し、ＣaＣl₂ を用いた乾燥器中で乾燥した。 収量： 115mｇ（0.20mmol）、理論値の56％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（2/1 v/v ）／１％氷酢酸、過マンガン酸カリウム
による検出 Ｒｆ＝0.83

【００３４】

【化８】

【００３５】実施例４ ＭＡＬＯＳによるＰＯＤｐ¹ の活性化 ＰＯＤに対してモル過剰のＭＡＬＯＳ（実施例３．５に
したがって調製）つまり25：１中で活性化を行なった。
50mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5 ）、 150mMＮaＣl
中にＰＯＤｐを濃度25mg/ml にして溶解した。相当量の
ＭＡＬＯＳをあらかじめＤＭＳＯに100mg/mlとなるよう
に溶解しておいた。この溶液の92μl/mlのＰＯＤをＰＯ
Ｄ溶液に加えた。混合物のｐＨを調べ、必要に応じて7.
0 に調整した。つぎに混合物を撹拌しながら25℃で１時
間インキュベートした。ｐＨを6.1 に変更し、混合物を
氷浴中で冷却することによって、反応を終了させた。つ
づいて、結合していないＭＡＬＯＳを10mMリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ6.1 ）、50mMＮa Ｃl、１mMＥＤＴＡに
対する流動透析で除去した。一定量のシステインと反応
させ、システインの残量をジチオジピリジンで滴定する
ことによって、ＭＨ基の取り込み量を測定した。

【００３６】¹ ：あらかじめ重合させたＰＯＤ（ＰＯＤ
ｐ）は、エングバルおよびパールマンによって述べられ
ているように（Engvall and Perlmann,Immuno-chemistr
y 8(1971) 871-874）、ＰＯＤモノマー（ＰＯＤmono）に
グルタルジアルデヒドを反応させることによって、得る
ことができる。

【００３７】実施例５ ＰＯＤｐ−ＭＡＬＯＳとビホスホネート−ＬＩＰＯＳと
の複合体化 １．ビホスホネート−ＬＩＰＯＳ中のアセチル保護基の
切断による除去 ビホスホネート−ＬＩＰＯＳ（実施例１にしたがって製
造）１mgを10mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5 ）、50
mMＮaＣl、 2mMＥＤＴＡ１ml中に溶解した。１Ｍヒドロ
キシルアミン原液0.07mlを添加し（最終濃度70mM）、そ
の後混合物を撹拌しながら25℃で１時間インキュベート
した。

【００３８】２．ＰＯＤｐ−ＭＡＬＯＳとのカップリン
グ ＰＯＤｐ−ＭＡＬＯＳ３ｍｇを10mMリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ7.5 ）、50mMＮa Ｃl、2mMＥＤＴＡ３ml中に希
釈した。上記のヒドロキシルアミン分解混合物0.044ml
（ビホスホネート：ＰＯＤmono１：１の化学量論量に相
当する）を添加した。混合物を撹拌しながら25℃で90分
間インキュベートした。つぎに、システイン（２mM）お
よびＮ−エチルマレインイミド（５mM）と順次インキュ
ベートすることによって、反応を終了させた。25mMＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ6.8 ）、150mM ＮaＣlに対する流動透析
で、低分子量成分を分離した。

【００３９】実施例６ ＭＡＬＯＳによるビオチンの活性化 ６．１ Ｎ−α−Ｂｏｃ−ε−マレインイミド−α−ア
ミノヘキサノイル−ＤＡＤＯＯ−ビオチン ＴＨＦ50ml中の実施例３．１にしたがって製造した化合
物1.00ｇ（3.06mmol）の溶液に、撹拌しながら、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド 422mg（3.67mmol）およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド757mg（3.67mmol)を添加し
た。１時間撹拌後、0.1 ＭＫＰＯ₄ 緩衝液（ｐＨ 8.5）
50ml中のビオチン−ＤＡＤＯＯ1.37ｇ（3.67mmol）の溶
液を、20℃において滴下した。混合物を20℃でさらに２
時間撹拌し、続いて有機溶媒を水流ポンプによる減圧で
除去し、水相を凍結乾燥した。粗生成物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフイー（溶離剤：酢酸エチル／メタノ
ール（2/1 v/v ）／１％酢酸）によって精製した。 収量： 930mｇ（1.36mmol）、理論値の44％ ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（2/1 v/v ）／１％氷酢酸 ビオチン噴霧および過マンガン酸カリウムによる検出 Ｒｆ＝0.44

【００４０】

【化９】

【００４１】６．２ ε−マレインイミド−α−アミノ
ヘキサノイル−ＤＡＤＯＯ−ビオチン（ε−Ｍａｌ−Ｌ
ｙｓ−ＤＡＤＯＯ−ビオチン） 実施例６．１にしたがって製造した化合物 500mg（ 0.7
mmol）に、０℃において、トリフルオロ酢酸10mlを添加
し、その後徐々に20℃に上昇させた。30分後、溶液を酢
酸エチル10mlで希釈し、さらに15分間撹拌した。溶媒を
水流ポンプによる減圧で除去し、残留物をジオキサン／
水（1/1 v/v ）に溶解し、凍結乾燥した。 収量： 約0.7mmol ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（2/1 v/v ）／１％氷酢酸 ビオチン噴霧、過マンガン酸カリウムおよびニンヒドリ
ンによる検出 Ｒｆ＝0.08

【００４２】６．３ Ｎ−α−マレインイミドヘキサノ
イル−ε−マレインイミド−α−アミノヘキサノイル−
ＤＡＤＯＯ−ビオチン（α−ＭＨＳ−ε−Ｍａｌ−Ｌｙ
ｓ−ＤＡＤＯＯ−ビオチン） 実施例６．２にしたがって製造した化合物 0.7mmol（Ｔ
ＦＡをまだ含む）を、0.1ＭＫＰＯ₄ 緩衝液（ｐＨ7.5
）10mlに溶解し、その後ＴＨＦ10ml中のマレインイミ
ドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨ
Ｓ） 260mgを添加した。そしてｐＨを１Ｎ水酸化ナトリ
ウム溶液を使用してｐＨ 7.5に調整し、それ以上ｐＨが
変化しないようにした。20℃で16時間撹拌後、有機溶媒
を水流ポンプによる減圧で除去し、残留物を凍結乾燥し
た。粗生成物をシリカゲル、酢酸エチル／メタノール
（1/1 v/v ）／１％酢酸の溶離剤で精製した。集めた画
分を水流ポンプによる減圧で濃縮し、残留物をジオキサ
ンに溶解し、不溶性成分を濾過により除去し、混合物を
凍結乾燥した。 収量： 500mg（ジオキサンおよび酢酸を含んだまま） ＴＬＣ：シリカゲル（Ｍerck60），酢酸エチル／メタノ
ール（1/1 v/v ）／１％氷酢酸 ビオチン噴霧および過マンガン酸カリウムによる検出 Ｒｆ＝0.55

【００４３】

【化１０】

【００４４】実施例７ ＩｇＧ−（ＭＨ）−ビオチン−（ＳＨ）複合体およびＩ
ｇＧ−（ＭＡＬＯＳ）−ビオチン−（ＬＩＰＯＳ）複合
体の保存安定性 ７．１ ＭＡＬＯＳ（実施例３．５参照）およびＭＨＳ
（マレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル）によるＩｇＧの活性化 ＩｇＧ50mgずつをＭＡＬＯＳおよびＭＨＳと同時に反応
させた（使用したＩｇＧはマウス腹水からのＩｇＧで、
硫酸アンモニウム沈殿および陰イオン交換クロマトグラ
フィーにより精製した）。ＩｇＧ：ＭＡＬＯＳおよびＭ
ＨＳの化学量論的モル比を１：25とした。ＭＡＬＯＳお
よびＭＨＳはあらかじめＤＭＳＯに溶解しておいた。反
応は50mMリン酸カリウム緩衝液／ 150mMＮaＣl（ｐＨ
7.5）で実施した。ＩｇＧの濃度は25mg/ml 、反応温度
は25℃、反応時間は１時間とした。反応を終了させるた
め、反応混合物のｐＨを 6.1に下げ、混合物を10mMリン
酸カリウム緩衝液、50mMＮaＣl、１mMＥＤＴＡ（ｐＨ
6.5）に対し、４℃で一晩透析した。つぎに、ＭＨ基の
取り込みを既知の方法（ＭＨ基とジチオジピリジンとの
反応）にしたがって測定した。 結果：ＩｇＧ−ＭＡＬＯＳ：5.5mol ＭＨ／mol ＩｇＧ ＩｇＧ−ＭＨ： 5.5mol ＭＨ／mol ＩｇＧ

【００４５】７．２ ビオチン−ＬＩＰＯＳまたはビオ
チン−Ｃ１１−ＳＨによる活性化Ｉ ｇＧのビオチニル化 ＩｇＧ−ＭＡＬＯＳのビオチニル化のため、ビオチン−
ＬＩＰＯＳの保護されたＳＨ基をヒドロキシルアミン分
解によってまず放出させた。ビオチン−ＬＩＰＯＳ５mg
／mlを25mMヒドロキシルアミン含有緩衝液中でインキュ
ベートした（10mMリン酸カリウム緩衝液、50mMＮaＣl、
２mMＥＤＴＡ、ｐＨ 7.5、25℃で１時間）。つぎに、ビ
オチニル化に必要なビオチン−ＬＩＰＯＳ量をこの混合
物から直接取り出した。

【００４６】ＩｇＧ−ＭＨをビオチニル化するのには、
ビオチン−ＳＨ誘導体を直接使用した。誘導体の遊離Ｓ
Ｈ基の酸化を可能な限り防止するため、この操作で使用
する緩衝液のすべてをあらかじめ窒素にさらした。両方
のビオチニル化混合物を異なる化学量論比、それぞれ0.
25：１， 0.5：１および１：１（存在するＩｇＧのＭＨ
基に対する、使用したビオチン誘導体のＳＨ基）で調製
した。

【００４７】反応は、ＩｇＧ濃度１mg／mlで、10mMリン
酸カリウム緩衝液、50mMＮaＣl、１mMＥＤＴＡ（ｐＨ
6.5）中で、25℃で２時間にわたり行なった。Ｎ−メチ
ルマレインイミドを添加することによって（最終濃度５
mM）、反応を停止させた。つぎに、すべての混合物を10
mMリン酸カリウム緩衝液、50mMＮaＣl（ｐＨ 7.5）に対
し流動させながら透析した。

【００４８】この透析後、混合物のタンパク質濃度を測
定した。各混合物を以下のように処理した。50mMリン酸
カリウム緩衝液、 150mMＮaＣl（ｐＨ 7.5）中で、タン
パク質濃度0.8mg/mlに調節した。溶液を無菌となるまで
濾過し、35℃でのストレスおよび -80℃でのチェックの
ため、保存した。

【００４９】７．３ 熱ストレスにさらした後の複合体
の安定性のチェック ２週間後、すべての混合物について、ビオチンの取り込
み量および遊離のビオチンを測定した。ビオチンの取り
込み量は以下のような免疫学的試験によって測定した。
ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレー
トの各ウェル（ 200ng／ml）をＩｇＧ−Ｂｉ溶液 100μ
lとともに１時間インキュベートした。つぎに、結合し
ていないＩｇＧ−Ｂｉを洗浄によって除去した。結合Ｉ
ｇＧ−Ｂｉは、ペルオキシダーゼが結合したストレプト
アビジンおよびＡＢＴＳ（商標名）基質とともに１時間
インキュベートすることによって、検出した。試料のビ
オチン取り込み量は、ビオチニル化の程度がわかってい
るＩｇＧの標準品系統を使用することによって、測定す
ることもできる。

【００５０】遊離のビオチンは以下の原理に基づく免疫
学的試験によって測定した。ビオチンで被覆した試験管
を、ペルオキシダーゼを結合したストレプトアビジンと
ともにインキュベートした。結合したストレプトアビジ
ンをＰＯＤの基質ＡＢＴＳを添加することによって検出
した。ＳＡ−ＰＯＤとともに遊離のビオチンを含む試料
を添加したら、遊離ビオチンの含有量に応じて、壁面に
結合したストレプトアビジンが置換された（最初にトリ
クロロ酢酸によって全試料からビオチニル化ＩｇＧを沈
殿させた；それから上清を試験に供した）。そして試料
のビオチン含有量は、遊離のビオチンによる標準曲線か
ら読み取ることができる。

【００５１】各種複合体の保存安定性を評価するため、
最初、ビオチン取り込み量をＩｇＧ１mol あたりのビオ
チンの mol数で計算した。次に遊離のビオチンをＩｇＧ
１mol あたりのビオチンの mol数で測定した。それから
-80℃で保存した場合のビオチン取り込み量を基準とし
て、34℃で２週間保存後の放出ビオチンの百分率を計算
した。

【００５２】この結果を次の表に示す。すべてのＳＨ：
ＭＨ化学量論比において、本発明の方法にしたがって製
造した複合体が、通常平均して10倍程度、著しく安定で
あった。

【００５３】

【表１】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年３月２９日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エヴァ ヘス ドイツ連邦共和国 82319 スターンバー ク アム ミュールバーク １エイ (72)発明者 エラスムス ヒューバー ドイツ連邦共和国 86923 フィニンク エスティー．ヴィリバルト 10

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式： Ａ−Ｌ₁−Ｌ₂−Ｂ （式中、ＡおよびＢは、ハプテン、タンパク質、ペプチ
   ド、多糖類およびその他の高分子からなる群から選択さ
   れた、カップリングすべき物質であり、Ｌ₁ およびＬ₂
   は３価のリンカーであって、Ｌ₁ およびＬ₂ が２つのチ
   オエーテル結合を介して互いに結合している）で表され
   る複合体。
2. 【請求項２】 カップリングすべき物質ＡおよびＢがヒ
   ドロキシスクシンイミド基またはカルボジイミダゾリル
   基を介してＬ₁ およびＬ₂ に連結されていることを特徴
   とする、請求項１記載の複合体。
3. 【請求項３】 ＡおよびＢが抗体、抗体フラグメント、
   酵素、ハプテン、ビオチン、ストレプトアビジンおよび
   ペルオキシダーゼからなる群から選択されることを特徴
   とする、請求項１または２記載の複合体。
4. 【請求項４】 免疫学的検定における、請求項１、２ま
   たは３記載の複合体の使用法。
5. 【請求項５】 第１段階として、カップリングすべき第
   １の物質Ａを２つのマレインイミド基を含有するホモ２
   座配位性の３官能性のリンカーＬ₁ に連結させ、第２段
   階として、カップリングすべき第２の物質Ｂを２つのチ
   オール基を含有するホモ２座配位性の３官能性のリンカ
   ーＬ₂ に連結させ、これによって活性化された２つの物
   質ＡＬ₁ およびＢＬ₂ をマレインイミドにＳＨ基を付加
   することによる２つのチオエーテル結合を介して互いに
   連結することを特徴とする、請求項１、２または３記載
   の複合体の製造方法。
6. 【請求項６】 カップリングすべき物質がホモ２座配位
   性の３官能性のリンカーＬ₁ またはＬ₂ にそれぞれヒド
   ロキシスクシンイミド基またはカルボジイミダゾリル基
   を介して連結されることを特徴とする、請求項５記載の
   方法。
7. 【請求項７】 カップリングすべき物質が、抗体、抗体
   フラグメント、酵素およびハプテンからなる群から選択
   されることを特徴とする、請求項５または６記載の方
   法。
8. 【請求項８】 カップリングすべき物質が、ビオチン、
   ストレプトアビジンおよびペルオキシダーゼからなる群
   から選択されることを特徴とする、請求項５、６または
   ７記載の方法。