JPH0717672B2 - コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体 - Google Patents

コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体

Info

Publication number
JPH0717672B2
JPH0717672B2 JP2002635A JP263590A JPH0717672B2 JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2 JP 2002635 A JP2002635 A JP 2002635A JP 263590 A JP263590 A JP 263590A JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
cobalamin
formula
acid
hydrazide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2002635A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02233693A (ja
Inventor
エラスムス・フーバー
ヨゼフ・デイツクホフ
クリスチアン・クライン
コンラート・キユルツインガー
Original Assignee
ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング filed Critical ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Publication of JPH02233693A publication Critical patent/JPH02233693A/ja
Publication of JPH0717672B2 publication Critical patent/JPH0717672B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規のコバラミン−酸ヒドラジド、殊にシア
ノコバラミン−酸ヒドラジド、その製造法およびそれか
ら誘導されたコバラミン接合体に関する。
従来の技術 コバラミン(ビタミンB12)の免疫学的測定は、通常、
試料のコバラミンおよび放射性標識されるコバラミンを
コバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質(内因子)
について協同させる(RIA試験)競合的試験で行なわれ
る。固体相を液状相と分離した後、2つの相の一方の中
でその中に含有されている放射性標識物質の量から試料
中に含有されているコバラミンの量を測定することがで
きる。
RIA試験の公知の欠点(例えば、放射能の負荷、廃棄)
のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代えるこ
とが望まれている。
例えば、免疫原としての蛋白質−ビタミンB12接合体を
製造することが記載されている公知のカップリング技術
(H.Gershman.他、Archives of Biochemistry and Biop
hysics 153、(1972)、407;D.F.M.v.d.Wiel他、Clin.C
him.Acta56(1974)、143;D.B.Endres他、Clin.Chem.24
/3(1978)、460;米国特許第3981863号明細書参照)に
よれば、安定なB12誘導体は導かれない。また、B12−酵
素接合体を製造するための相応する方法も記載されてい
る。
このようにして得られたB12誘導体は、加水分解に敏感
であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能で
ある。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、前記欠点を示さず、かつ簡単で再現可
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミン−酸誘導体を提供することである。
課題を解決するための手段 この課題は、本発明により設定された新規のコバラミン
酸−ヒドラジドで解決される。
本発明の対象は、式(I): B−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (I) [式中、Bはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
て形成された基を表わし、Rは1個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、xは0または1であ
る]で示されるコバラミン−酸ヒドラジドである。
有利に、Bはシアノ−コバラミンから誘導された基B12
であり、特に有利には、このヒドラジドは、式(II): B−d−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (II) [式中、B、Rおよびxは前記のものを表わし、dは−
CO−NH−NH−を表わす]を有する。この化合物の場合、
−R−CO−は、基−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2
CO−(但し、nは1、2または3である)を表わし、殊
にこれは、式:B12−d−CO−NH−NH2[式中、B12および
dは前記のものを表わす]に相当するか、または式:B12
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2
CO−NH−NH2[式中、B12およびdは前記のものを表わ
し、nは1、2または3である]に相当する。
本発明によれば、次式: [式中、R1は個々のコバラミンを区別する種々の基を表
わす(但し、シアノコバラミンに対しては、R1はCNであ
る;例えば、Rmpps,Chemie−Lexikon、第2巻、第8
版、1981、Franckn′sche Verlagshandlung Stuttgar
t、第784頁参照)]で示されるコバラミンの酸アミド基
−CO−NH2から得られた遊離カルボキシル基は、一般式
(I)のヒドラジドに変換される。
遊離カルボキシル基への酸アミド基−CO−NH2の変換
は、自体公知の方法で酸鹸化および遊離カルボン酸の単
離によって行なわれる(R.YamadaおよびH.P.C.Hogenkam
p、J.Biol.Chem.1972(247)6266〜6270;D.L.Anton他、
J.Amer.Chem.Soc.102(1980)、2215参照)。有利に
は、相応するカルボキシル基の1個のみかまたは若干の
数が遊離されるようにするために、コバラミン分子中に
存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成が達成されるよ
うに作業する。次に、こうして得られた混合物から自体
公知の方法で、遊離カルボキシル基が一定の位置に存在
しているような化合物を単離することができる。特に、
遊離カルボキシル基を有する化合物は、d位(コバラミ
ンの前記式参照)で単離される。更に、この遊離カルボ
ン酸は、後反応によって一般式(I)の相応するヒドラ
ジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混合物
の形成下にコバラミン−カルボン酸の混合物から出発す
ることも可能である。しかし、イミノアッセイに使用す
るためのコバラミン接合体を製造するために、測定法の
感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯1つの
精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルボン酸を
相応する定義された純粋なヒドラジドに変換するのが好
ましい。
相応するヒドラジドへの遊離カルボン酸の変換は、自体
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミン−モノカルボン酸は、例えばN−エチル
−N′−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド
のようなカルボジイミドおよび相応するヒドラジン化合
物との反応によって式(I)のカルボン酸ヒドラジドに
変換することができる。xが1であるような一般式
(I)の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Bに結合した基を段階的に、例えばB−COOH→B−
CO−NH−NH−R−COOH→B−CO−NH−NH−R−CO−NH−
NH2の順序で構成させることによって行なうことができ
るか、または化合物H2N−NH−R−CO−NH−NH2、例えば
トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
(TEDEH)との反応によって行なうことができる。この
場合、反応条件は、このような反応のために知られた常
用の条件に相応する。
従って、本発明の対象は、式(I)の本発明によるコバ
ラミン−酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式:B−COOHのコバラミン−カルボン酸中でカルボ
キシル基を自体公知の方法でヒドラジドとの反応によっ
て基 −CO−NH−NHCO−NH−NHxH に変換し、その際xが1である場合には、前記の基変換
の構成はB−COOH→B−CO−NH−NH−R−COOH→B−CO
−NH−NH−R−C−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に
有利なものとして記載した式(I)の本発明による化合
物が得られる。
式(I)の本発明によるカルボン酸ヒドラジドは、良好
に単離可能で特性決定可能の安定な化合物であり、この
化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定性
を有する。
式(I)の本発明によるコバラミンとヒドラジドの中、
コバラミン基Bがメチルコバラミンまたは殊にシアノコ
バラミンB12の基を表わすようなものが有利である。酸
ヒドラジド基−CO−NH−NH−は、特にb位、e位および
殊にd位(コリン基本骨格中の−CH2−CH2−CO−NH2
の3位、13位および殊に8位に相当する)に存在する。
特に、基−R−CO−は、アルキレン基が1個またはそれ
以上のヘテロ原子、殊にNH基またはO原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルボン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−R−COは、ポリアル
キレングリコール−ジカルボン酸、ポリエーテルポリオ
ール−ジカルボン酸またはポリエステルポリオール−ジ
カルボン酸から誘導されたジアシル基および第1にトリ
エチレングリコール−ジ酢酸(TEDE)から誘導された
式: −CH−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO− [式中、nは3である]で示されるジアシル基であり、
但し、nが1または2であるジアシル基であってもよ
い。
式(I)の本発明による化合物の中、殊にコバラミン/
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第1にB12−d−CO−NH−NH2およびB12−d−CO−N
H−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−NH2
(但し、nは1または2および殊に3である)を挙げる
ことができる。
式(I)の本発明によるコバラミン−酸ヒドラジドは、
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわ
ち、式(I)のコバラミンは、例えば直接に高い収量
で、例えばペルオキシダーゼ(POD)のようなグリコ蛋
白質の酸化されたグリコシル基にカップリングすること
ができる。この場合には、加水分解安定性である良好に
特性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合
には、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免
疫学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の
場合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Rで延長させ
ることによってなお高めることができる(式III、x=
1参照)。こうして、例えば抗体へのコバラミン−ヒド
ラジド(ハプテン成分)の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。
従って、本発明の対象は、一般式(III): B−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (III) [式中、B、Rおよびxは請求項1記載のものを表わ
し、GPはグリコシル基を介して−NH−N=−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす]で示され
るコバラミン接合体でもある。
特に、Bは、シアノ基−コバラミンから誘導された基B1
2であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式(I
V): B−d−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (IV) を有する。
この化合物の場合、−R−CO−は、基: −CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO [但し、nは1、2または3である]を意味し、殊にこ
れは、式: B12−d−CO−NH−N=GPまたは式: B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−N=GP [但し、nは1、2または3である]に相当する。
グリコ蛋白質基GPは、とにかく適当なグリコ蛋白質また
はグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、
グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導すること
ができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は、
前記に有利に記載したコバラミン−酸ヒドラジドから誘
導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標識
化酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)および
殊にペロキシダーゼ(POD)が使用される。イムノアッ
セイーに使用するための適性に関連して、第1には次の
ものが記載される:B12−d−CO−NH−N=GPおよび B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO −CH2−CO−NH−N=GP 但し、nは1または2および殊に3である。
式(III)の本発明によるコバラミン接合体の製造は、
式(I)のコバラミン−酸ヒドラジドをグリコ蛋白質の
グリコシル基のOH基と、酸化およびヒドラゾン基−NH−
N=CH−グリコ蛋白質の形成の後にカップリング(縮
合)することによって行なうことができる。この場合、
反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造にとって
常用の条件に相当する。
式(III)の本発明によるコバラミン接合体は、ビタミ
ンB12の免疫学的測定の際に使用するのに特に適当であ
る。殊に、B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−C
H2 3O−CH2−CO−NH−N=GPの本発明によるシアノ−
コバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンB12を再
現可能に迅速で簡単に実施すべき測定(ビタミンB12−
イムノアッセイ)は、高い感度および正確さをもって可
能である。この種の測定法は、本願と同一の出願日で本
願と同一人の西ドイツ国特許出願第3900650号明細書
(発明の名称:ビタミン−B12の測定法)に記載の対象
であり、その内容は、本願の対象である。
しかし、本発明によるコバラミン接合体を、ビタミンB1
2を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンB12の代
わりに使用することも可能である。この種の適当なラジ
オイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオケミス
トリー(Clinical Biochemistry)18(1985)261−26
6、米国特許第3981863号明細書、クリニカ・シミカ・ア
クタ(Clinica Chimica Acta)56(1974)143−149、Li
t.Clin.Path.20(1967)683−686、Brit.J.Hmat.22
(1972)、21−31に記載されている。
次の実施例および特徴は、本発明をさらに詳説するもの
である。
実施例 例1: トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
(TEDEH)の製造 TEDEHを次の反応工程により製造した: a)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−第三ブチ
ルエステル(2) 無水トリエチレングリコール(1)33g(0.22モル)を
無水ジオキサン300mlに溶解し、この溶液に攪拌しなが
ら室温で滴下法で水素化ナトリウム12g(0.4モル)(パ
ラフィン油20%を含有する)を添加する。この場合に
は、約45℃への弱い昇温が起こる。この懸濁液を室温で
3時間攪拌する。その後に、氷冷却下に1時間で臭化酢
酸−第三ブチルエステル78g(0.4モル)を滴加させる。
この懸濁液を室温でさらに16時間攪拌する。引続き、沈
澱したNaBrを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプ
による真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステ
ル0.5に溶解し、この溶液を水0.5で洗浄し、有機相
をNa2SO4 30gで乾燥する。この溶液を約100mlの残存容
量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲルカラム(8.5×5
5cm)上に載せる。酢酸エステルで溶離し、個々の画分
を分析薄層クロマトグラフィーによって試験する(珪酸
ゲル、流展剤:酢酸エステル)。ポリエチレングリコー
ル誘導体含有画分をドラ−ゲンドルフ(Dragendorff)
試薬(K.Thoma他、Sci.Pharm.32(1964)、216参照)を
用いる噴霧によって目で見ることができるようにする。
生成物(2)(Rf=0.60)を含有する画分を合わせ、か
つ水ポンプで蒸発濃縮する。
収量:無色の油状物19.2g(理論値の23%)。
b)トリエチレングリコール−ジ酢酸(3) エステル(2)18.9g(50ミリモル)を室温でトリフル
オロ酢酸30mlに溶解し、かつ2時間攪拌する。この溶液
を水流ポンプによる真空中で35℃で蒸発濃縮し、残留物
を3回それぞれジエチルエーテル100ml宛で蒸解し、か
つ45℃で高真空中で乾燥する。生成物(3)を後生成す
ることなしにさらに使用する。
収量:無色の油状物11.2g(理論値の84%)。
DC:珪酸ゲル、流展剤:酢酸エステル/メタノール=4/
1:Rf=0.08。
c)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−(BOC−
ヒドラジド)(4) ジカルボン酸(3)8.0g(30ミルモル)をN−ヒドロキ
シスクシンイミド8.28g(72ミルモル)と一緒に無水テ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、この溶液に無水テト
ラヒドロフラン50ml中のN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド14.8g(72ミルモル)を水浴による冷却下に2
0℃で添加する。この溶液を室温で20時間攪拌させ、そ
の後に沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真
空中で蒸発濃縮する。粘稠な残留物を酢酸エステル100m
lに溶解し、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮す
る。この最後の過程をなお2回繰り返し、次に残留物を
イソプロパノール50mlで蒸解し、引続き高真空中で乾燥
する。得られた粘稠な油状物(約9g)を無水クロロホル
ム60mlに溶解し、この溶液に攪拌しながら室温で第三ブ
チルカルバザート(BOC−ヒドラジン)7.9g(60ミルモ
ル)を添加する。最初に少し昇温する反応混合物を室温
で20時間攪拌させる。その後に、2回それぞれ水100ml
宛で洗浄し、Na2SO4 5gで乾燥し、この溶液を水流ポン
プによる真空中で蒸発濃縮する。
収量:粘稠な淡黄色の油状物9.2g(理論値の60%)。
DC:珪酸ゲル、流展剤:酢酸エステル/メタノール=4/
1;Rf=0.52。
d)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジ
ド塩酸塩(5) 化合物(4)5.1g(10ミリモル)をトリフルオル酢酸20
mlに溶解し、この溶液を室温で2時間攪拌する。その後
に、この溶液を35℃で水流ポンプによる真空中で蒸発濃
縮し、残流物を無水酢酸80mlに溶解し、かつ0℃で冷却
下に10分間HClガスを溶液に導通する。この場合には、
固体のカルボン酸ヒドラジド塩酸塩(5)の沈澱物が形
成する。この懸濁液を0℃で2時間放置させ、引続き吸
引濾過し、かつ得られた吸湿性塩を無水酢酸40mlで洗浄
する。この塩を乾燥器中で高真空下にCaCl2上で乾燥す
る。
収量:淡褐色の粉末2.8g(理論値の75%)。
DC:珪酸ゲル、n−ブタノール/氷酢酸/水=50/15/25;
Rf=0.45。
例2: シアノコバラミン−d−酸ヒドラジド(B12−d−CO−N
H−NH2) シアノコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド/水=1:1の混合物に溶解し、
この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH 1モ
ル/lでpH6に調節する。この溶液にN−エチル−N′−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩(ED
C)77mg(0.4ミリモル)およびヒドラジニウムスルフェ
ート650mg(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHでさ
らに調節し、引続き反応容器を暗くし、溶液を室温で攪
拌する。6〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞ
れN−ヒドロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを
反応溶液に添加し、この場合には、そのつどpH価を6に
後調節する。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発
濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン10mlで蒸解し、か
つ吸引漏斗により吸引濾過する。固体の残留物を水10ml
に溶解し、この溶液をクロマトグラフィーカラム(物
質:スチロールジビニルベンゾール共重合体)アンバー
ライト(Amberlite)−XAD−2(V=100ml)上に載せ
る。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗浄し、引
続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離する。溶液を
水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水100m
lに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowex)−1x2−
カラム(酸性イオン交換体、アセテート形、80ml)上に
与える。最終生成物を水250mlで溶離し、この場合に
は、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリ
ウム緩衝液0.04モル/1(pH4.7)で溶離する。生成物を
含有する画分を合わせ、かつ親液性化する。
収量:桜色の粉末84mg(理論値の60%)。
同様にして、メチルコバラミン−d−酸から出発し、メ
チルコバラミン−d−酸ヒドラジドが得られる。
例3: シアノコバラミン−d−酸ヒドラジド−POD−接合体(B
12−d−CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mg(POD、EC 1.1
1.1.7)を酢酸ナトリウム緩衝液4.5ml 0.03モル/l pH
5.5に溶解する。ナトリウムペリオダート溶液0.6ml 0.
2モル/l(酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)
を添加し、かつ室温で1時間攪拌させる。その後に、こ
の溶液をセファデックス(Sephadex)−G−25−カラム
(モレキュラーシーブ、V=50ml)上に載せ、かつ酢酸
ナトリウム緩衝液0.03モル/l(ph5.5)で溶離する(403
nmでの検知)。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例2から
のB12−d−CO−NH−NH2を添加する。室温で16時間攪拌
し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)−AcA−202カラ
ム(モレキュラーシーブ、V=80ml)上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶
離する(検知ν=403nm)。最終生成物を含有する画分
を合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性
化する。
収量:26mg(理論値の87%)。
例4: シアンコバラミン−d−酸−TEDEH(B12−d−CO−NH−
NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2−CO−NH−NH2
の製造 シアンコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド−水1:1の混合物10mlに溶解
し、この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH1
モル/lでpH5.5に調節する。この溶液にN−エチル−
N′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩
(EDC)77mg(0.4ミリモル)およびTEDEH塩酸塩1.84g
(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHで後調節し、引
続き反応容器を暗くし、この溶液を室温で攪拌する。6
〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞれN−ヒド
ロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを反応溶液に
添加し、この場合には、そのつどpH価を5.5に後調節す
る。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、
残留物をアセトン10mlで溶解し、溶剤をデカントする。
殆ど固体の残留物を水10mlに溶解し、この溶液をアンバ
ーライト(Amberlite)−XAD−2カラム(V=100ml)
上に載せる。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗
浄し、引続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離す
る。溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留
物を水100mlに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowe
x)−1x2−カラム(アセテート形、80ml)上に与える。
最終生成物を水250mlで溶離し、この場合には、未反応
の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリウム緩衝液
0.04モル/l(pH4.7)で溶離する。生成物を含有する画
分を合わせ、かつ親液性化する。
収量:桜色の易吸湿性粉末75mg(理論値の46%)。
同様にして、メチルコバラミン−d−酸から出発し、メ
チルコバラミン−d−酸が得られる。
例5: シアノコバラミン−d−酸−TEDEH−POD−接合体(B12
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2
CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mgを酢酸ナトリウ
ム緩衝液4.5ml0.03モル/l pH5.5に溶解する。ナトリウ
ムペルヨーダート溶液0.6ml 0.2モル/l(酢酸ナトリウ
ム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)を添加し、かつ室温で
1時間攪拌させる。その後に、この溶液をセファデック
ス(Sephadex)−G−25−カラム(V=50ml)上に載
せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l(pH5.5)で
溶離する(ν=403nmでの検知)。蛋白質含有画分を合
わせ、かつ例4からのヒドラジド2.7mgを添加する。室
温で16時間攪拌し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)
−AcA−202カラム(V=80ml)上に載せる。この混合物
を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶離する
(ν=403nmでの検知)。最終生成物を含有する画分を
合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性化
する。
収量:27mg(理論値の90%)。
POD接合体を製造するための前記例3および5に記載に
方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素、
例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)の使用下に相応
する接合体を製造することができる。
例6: シアノコバラミン−d−モノカルボン酸−POD−接合体
(比較化合物)の製造 製造は、Clin.Chim.Acta.56(1974)、143−149の記載
のように行なう。
そのために、B12−モノカルボン酸をジャーナル・オブ
・ズィ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ(J.Am.Che
m.Soc.)102(1980)2215の記載のように製造する。
POD100mgおよびビタミンB12 10mgを燐酸塩緩衝液2.5ml
(0.07モル/l、pH8.2)に溶解し、この溶液にカルボジ
イミド25mgを添加する。この溶液を4℃で72時間攪拌
し、引続き脱イオン水に対して72時間透析する。
接合体の精製は、例5の記載のように行なわれる。
例7: ビタミンB12 a)試料の調製 ヒト血清250μを分解試薬125μ(NaOH 0.5モル/l
に溶解したリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlか
らなる)と混合し、かつ室温で15分間恒温保持する。引
続き燐酸塩緩衝液125μ、200ミリモル/l、pH4.1を添
加する。
b)試薬 テルモ(Thermo)−RSAストレプタビジン(Streptavidi
n)で被覆されたポリスチロール小管(欧州特許出願公
開第0269092号明細書の記載により製造) 試薬1 ビタミンB12に対するビオチニル化されたモノクロナー
ル抗体95ng/ml(JACS100(1978)3585−3590の記載によ
るビオチニル化)。
適当なモノクロナール抗体を生産するツェリニーンは、
European Collection of Animal Ce11 Culture(ECAC
C)Porton Down,GBに番号EC ACC 88101301およびECAC
C88101302で寄託されている。
燐酸塩緩衝液40イリモル/l、pH7.2。
試薬2 B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH
2−CO−NH−N=POD(活性約20mU/ml) 燐酸塩緩衝液40ミリモル/l、pH7.2 試薬3 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液100ミリモル/l、pH4.4。
ABTS(2,2″−アジノ−ジ[3−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホネート])1.9ミリモル/l ペルオキシ硼酸ナトリウム3.2ミリモル/l。
c)測定の実施 測定を実施するために、試料200μを試薬800μと一
緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温で60分間恒
温保持する。引続き、洗浄液(塩化ナトリウム250mg/m
l、硫酸銅1mg/ml)で洗浄し、試薬2 1000μを添加
し、かつ室温で30分間恒温保持する。洗浄液(塩化ナト
リウム250mg/ml、硫酸銅1mg/100ml)で洗浄し、かつ試
薬3 1000μを添加し、室温で30分間恒温保持し、形
成された色を420nmでのビタミンB12含量のための尺度と
して定める。
第1図は、この場合に得られた校正曲線を例6による試
験のための校正曲線と比較して示す。校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム0.9%、
クロテインC0.9%および塩化カリウム0.1%と一緒の燐
酸塩緩衝液40ミリモル/1、pH7.2中のシアノコバラミン
からなる標準を使用する。
例8: ビタミンB12の測定(比較例) ビタミンB12の測定を例7の記載と同様にして実施し、
この場合には例7に記載の標準を使用する。試薬2で使
用した本発明による接合体の代わりに、約90mU/mlの活
性を有する例6によるPOD接合体を使用する。第1図
は、例7と例8によるビタミンB12を測定した校正曲線
の比較を示す。それによれば、例6による接合体を用い
た場合には高い活性にも拘束わらず本発明による接合体
を用いた場合よりも平らな校正曲線が得られることが判
明する。
【図面の簡単な説明】
第1図は、例5に記載の本発明によるB12−酵素接合体
の使用下でのビタミンB12の酵素イムノアッセイ(曲線
2、活性20mU/ml)と、例6に記載の接合体の使用下で
の試験(曲線1、活性90mU/ml)の校正曲線の比較を示
す。測定波長:425nm、E:吸光度。
フロントページの続き (72)発明者 クリスチアン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (72)発明者 コンラート・キユルツインガー ドイツ連邦共和国トウツチング・グレーバ ーヴエーク 5

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】式(I): B−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (I) 〔式中、Bはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
    て形成された基を表わし、Rは1個またはそれ以上のヘ
    テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
    ン基またはアリーレン基を表わし、xは0または1であ
    る〕で示されるコバラミン−酸ヒドラジド。
  2. 【請求項2】請求項1記載の式(I)のコバラミン−酸
    ヒドラジドを製造する方法において、式:B−COOHのコバ
    ラミン−カルボン酸中でカルボキシル基を自体公知の方
    法でヒドラジドとの反応によって基 −CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH に変換し、その際Xが1である場合には、前記の基変換
    の構成はB−COOH→B−CO−NH−NH−R−COOH→B−CO
    −NH−NH−R−C−NH−NH2の順序で行なうこともでき
    ることを特徴とする、式(I)のコバラミン−酸ヒドラ
    ジドの製造法。
  3. 【請求項3】式(III): B−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (III) 〔式中、B、Rおよびxは請求項1記載のものを表わ
    し、GPはグリコシル基を介して−NH−N=−基に結合し
    ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす〕で示され
    るコバラミン接合体。
  4. 【請求項4】トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビスヒ
    ドラジド(TEDEH)がスペーサー基として導入されてい
    る、請求項3記載のコバラミン接合体。
JP2002635A 1989-01-11 1990-01-11 コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体 Expired - Lifetime JPH0717672B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3900648A DE3900648A1 (de) 1989-01-11 1989-01-11 Neue cobalamin-saeurehydrazide und davon abgeleitete cobalamin-konjugate
DE3900648.4 1989-01-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02233693A JPH02233693A (ja) 1990-09-17
JPH0717672B2 true JPH0717672B2 (ja) 1995-03-01

Family

ID=6371886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002635A Expired - Lifetime JPH0717672B2 (ja) 1989-01-11 1990-01-11 コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5171679A (ja)
EP (1) EP0378203B1 (ja)
JP (1) JPH0717672B2 (ja)
AT (1) ATE141926T1 (ja)
DE (2) DE3900648A1 (ja)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3900650A1 (de) * 1989-01-11 1990-07-12 Boehringer Mannheim Gmbh Vitamin-b12-bestimmung
JP2778304B2 (ja) * 1991-09-17 1998-07-23 三菱電機株式会社 有機電子素子材料
DE4239815A1 (de) * 1992-11-26 1994-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate
US5548064A (en) * 1993-05-24 1996-08-20 Biotech Australia Pty Limited Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions
US5840880A (en) * 1994-04-08 1998-11-24 Receptagen Corporation Receptor modulating agents
KR100361075B1 (ko) * 1994-04-08 2003-04-10 리셉타겐 코포레이션 리셉터조절제및그와관련된방법
US5739287A (en) * 1994-04-08 1998-04-14 University Of Washington Biotinylated cobalamins
US5869465A (en) * 1994-04-08 1999-02-09 Receptagen Corporation Methods of receptor modulation and uses therefor
NZ323127A (en) * 1995-10-19 2001-03-30 Receptagen Corp Vitamin B12 receptor modulating agents and methods related thereto
US6326479B1 (en) 1998-01-27 2001-12-04 Boston Probes, Inc. Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same
JP4927560B2 (ja) * 2003-12-22 2012-05-09 ソリダゴ・アーゲー 異常な細胞の増殖の診断および治療に有効なコバラミン誘導体
US9120858B2 (en) 2011-07-22 2015-09-01 The Research Foundation Of State University Of New York Antibodies to the B12-transcobalamin receptor

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1044233B (it) * 1973-04-04 1980-03-20 Zambelletti L S P A Derivati della vitamina bi2 ad azione vitaminica di lunga durata
US3981863A (en) * 1975-02-25 1976-09-21 Micromedic Diagonistics, Inc. Cyanocobalamin derivatives
US4334069A (en) * 1978-07-24 1982-06-08 Miles Laboratories, Inc. Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates
US4550163A (en) * 1979-02-05 1985-10-29 Abbott Laboratories Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates
EP0069450B1 (en) * 1981-06-22 1985-04-10 TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION (a New York corporation) Labelled vitamin b12 derivatives, their preparation and use
US4925931A (en) * 1988-07-14 1990-05-15 Mccully Kilmer S N-homocysteine thiolactonyl retinamido cobalamin and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DE3900648A1 (de) 1990-07-12
EP0378203A3 (de) 1992-10-14
EP0378203B1 (de) 1996-08-28
ATE141926T1 (de) 1996-09-15
DE59010462D1 (de) 1996-10-02
EP0378203A2 (de) 1990-07-18
JPH02233693A (ja) 1990-09-17
US5171679A (en) 1992-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Elia Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins
US4150033A (en) Reagent suitable for enzyme immuno assay
CN104704366B (zh) 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物
JPH06322000A (ja) 免疫学的に活性な複合体およびそれらの製造方法
US9688663B2 (en) Crosslinking reagents, methods, and compositions for studying protein-protein interactions
EP0493745A1 (en) Fluorescent compound, complex, reagent, and specific binding assay employing said reagent
US4533493A (en) Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4760142A (en) Divalent hapten derivatives
US5595741A (en) Aminoalkylmaleimides and hapten and antigen derivatives derived therefrom as well as conjugates with peptides or proteins
JPH0717672B2 (ja) コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体
CA1152491A (en) Flavin adenine dinucleotide-labeled protein and polypeptide conjugates
JP4098839B2 (ja) インドシアニン化合物
US4650771A (en) Immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives for lidocaine and analogs thereof
JP2953501B2 (ja) 発光可能な金属錯体を用いてアナライトを測定するための干渉除去試薬
US4608336A (en) #3B theophylline immunoassay employing 9-theophylline reagents
US5106762A (en) Ligand-label conjugates which contain polyoxoanions of sulfur or phosphorus
JPS6084297A (ja) 新規なアミノプリン誘導体
JP3360174B2 (ja) 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬
EP0747707A1 (en) Propoxyphene derivatives for immunoassay reagents
GB2041919A (en) Amino-purine intermediates useful in the preparation of flavin adenine dinucleotide-labeled conjugates for use in specific binding assays
US20050215771A1 (en) Novel coupling agents, the active intermediates and the conjugates thereof and the use of said conjugates in diagnostic methods
US6307029B1 (en) Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same
Pandurangi et al. Chemistry of Bifunctional Photoprobes: 4. Synthesis of the Chromogenic, Cleavable, Water Soluble, and Heterobifunctional Sulfosuccinimidyl (N-methylamino Perfluoroaryl Azido Benzamido)-ethyl-1, 3′-Dithiopropionate: An Efficient Protein Cross-Linking Agent
JP2794181B2 (ja) デスチオビオチン誘導体及びそれからなる標識化剤
US4647668A (en) Disopyramide phenyl derivatives and labeled conjugates