JPH0717672B2 - コバラミン―酸ヒドラジド，その製造法およびコバラミン接合体 - Google Patents
コバラミン―酸ヒドラジド，その製造法およびコバラミン接合体Info
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- JPH0717672B2 JPH0717672B2 JP2002635A JP263590A JPH0717672B2 JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2 JP 2002635 A JP2002635 A JP 2002635A JP 263590 A JP263590 A JP 263590A JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規のコバラミン−酸ヒドラジド、殊にシア
ノコバラミン−酸ヒドラジド、その製造法およびそれか
ら誘導されたコバラミン接合体に関する。
ノコバラミン−酸ヒドラジド、その製造法およびそれか
ら誘導されたコバラミン接合体に関する。
従来の技術 コバラミン（ビタミンB12）の免疫学的測定は、通常、
試料のコバラミンおよび放射性標識されるコバラミンを
コバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質（内因子）
について協同させる（RIA試験）競合的試験で行なわれ
る。固体相を液状相と分離した後、２つの相の一方の中
でその中に含有されている放射性標識物質の量から試料
中に含有されているコバラミンの量を測定することがで
きる。
試料のコバラミンおよび放射性標識されるコバラミンを
コバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質（内因子）
について協同させる（RIA試験）競合的試験で行なわれ
る。固体相を液状相と分離した後、２つの相の一方の中
でその中に含有されている放射性標識物質の量から試料
中に含有されているコバラミンの量を測定することがで
きる。
RIA試験の公知の欠点（例えば、放射能の負荷、廃棄）
のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代えるこ
とが望まれている。
のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代えるこ
とが望まれている。
例えば、免疫原としての蛋白質−ビタミンB12接合体を
製造することが記載されている公知のカップリング技術
（H.Gershman.他、Archives of Biochemistry and Biop
hysics 153、（1972）、407;D.F.M.v.d.Wiel他、Clin.C
him.Acta56（1974）、143;D.B.Endres他、Clin.Chem.24
/3（1978）、460;米国特許第3981863号明細書参照）に
よれば、安定なB12誘導体は導かれない。また、B12−酵
素接合体を製造するための相応する方法も記載されてい
る。
製造することが記載されている公知のカップリング技術
（H.Gershman.他、Archives of Biochemistry and Biop
hysics 153、（1972）、407;D.F.M.v.d.Wiel他、Clin.C
him.Acta56（1974）、143;D.B.Endres他、Clin.Chem.24
/3（1978）、460;米国特許第3981863号明細書参照）に
よれば、安定なB12誘導体は導かれない。また、B12−酵
素接合体を製造するための相応する方法も記載されてい
る。
このようにして得られたB12誘導体は、加水分解に敏感
であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能で
ある。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。
であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能で
ある。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、前記欠点を示さず、かつ簡単で再現可
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミン−酸誘導体を提供することである。
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミン−酸誘導体を提供することである。
課題を解決するための手段 この課題は、本発明により設定された新規のコバラミン
酸−ヒドラジドで解決される。
酸−ヒドラジドで解決される。
本発明の対象は、式（Ｉ）： Ｂ−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHxH （Ｉ） ［式中、Ｂはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
て形成された基を表わし、Ｒは１個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、ｘは０または１であ
る］で示されるコバラミン−酸ヒドラジドである。
て形成された基を表わし、Ｒは１個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、ｘは０または１であ
る］で示されるコバラミン−酸ヒドラジドである。
有利に、Ｂはシアノ−コバラミンから誘導された基B12
であり、特に有利には、このヒドラジドは、式（II）： Ｂ−ｄ−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHxH （II） ［式中、Ｂ、Ｒおよびｘは前記のものを表わし、ｄは−
CO−NH−NH−を表わす］を有する。この化合物の場合、
−Ｒ−CO−は、基−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−
CO−（但し、ｎは１、２または３である）を表わし、殊
にこれは、式:B12−ｄ−CO−NH−NH2［式中、B12および
ｄは前記のものを表わす］に相当するか、または式:B12
−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−
CO−NH−NH2［式中、B12およびｄは前記のものを表わ
し、ｎは１、２または３である］に相当する。
であり、特に有利には、このヒドラジドは、式（II）： Ｂ−ｄ−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHxH （II） ［式中、Ｂ、Ｒおよびｘは前記のものを表わし、ｄは−
CO−NH−NH−を表わす］を有する。この化合物の場合、
−Ｒ−CO−は、基−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−
CO−（但し、ｎは１、２または３である）を表わし、殊
にこれは、式:B12−ｄ−CO−NH−NH2［式中、B12および
ｄは前記のものを表わす］に相当するか、または式:B12
−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−
CO−NH−NH2［式中、B12およびｄは前記のものを表わ
し、ｎは１、２または３である］に相当する。
本発明によれば、次式： ［式中、R1は個々のコバラミンを区別する種々の基を表
わす（但し、シアノコバラミンに対しては、R1はCNであ
る；例えば、Ｒmpps,Chemie−Lexikon、第２巻、第８
版、1981、Franckn′sche Verlagshandlung Stuttgar
t、第784頁参照）］で示されるコバラミンの酸アミド基
−CO−NH2から得られた遊離カルボキシル基は、一般式
（Ｉ）のヒドラジドに変換される。
わす（但し、シアノコバラミンに対しては、R1はCNであ
る；例えば、Ｒmpps,Chemie−Lexikon、第２巻、第８
版、1981、Franckn′sche Verlagshandlung Stuttgar
t、第784頁参照）］で示されるコバラミンの酸アミド基
−CO−NH2から得られた遊離カルボキシル基は、一般式
（Ｉ）のヒドラジドに変換される。
遊離カルボキシル基への酸アミド基−CO−NH2の変換
は、自体公知の方法で酸鹸化および遊離カルボン酸の単
離によって行なわれる（R.YamadaおよびH.P.C.Hogenkam
p、J.Biol.Chem.1972（247）6266〜6270;D.L.Anton他、
J.Amer.Chem.Soc.102（1980）、2215参照）。有利に
は、相応するカルボキシル基の１個のみかまたは若干の
数が遊離されるようにするために、コバラミン分子中に
存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成が達成されるよ
うに作業する。次に、こうして得られた混合物から自体
公知の方法で、遊離カルボキシル基が一定の位置に存在
しているような化合物を単離することができる。特に、
遊離カルボキシル基を有する化合物は、ｄ位（コバラミ
ンの前記式参照）で単離される。更に、この遊離カルボ
ン酸は、後反応によって一般式（Ｉ）の相応するヒドラ
ジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混合物
の形成下にコバラミン−カルボン酸の混合物から出発す
ることも可能である。しかし、イミノアッセイに使用す
るためのコバラミン接合体を製造するために、測定法の
感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯１つの
精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルボン酸を
相応する定義された純粋なヒドラジドに変換するのが好
ましい。
は、自体公知の方法で酸鹸化および遊離カルボン酸の単
離によって行なわれる（R.YamadaおよびH.P.C.Hogenkam
p、J.Biol.Chem.1972（247）6266〜6270;D.L.Anton他、
J.Amer.Chem.Soc.102（1980）、2215参照）。有利に
は、相応するカルボキシル基の１個のみかまたは若干の
数が遊離されるようにするために、コバラミン分子中に
存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成が達成されるよ
うに作業する。次に、こうして得られた混合物から自体
公知の方法で、遊離カルボキシル基が一定の位置に存在
しているような化合物を単離することができる。特に、
遊離カルボキシル基を有する化合物は、ｄ位（コバラミ
ンの前記式参照）で単離される。更に、この遊離カルボ
ン酸は、後反応によって一般式（Ｉ）の相応するヒドラ
ジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混合物
の形成下にコバラミン−カルボン酸の混合物から出発す
ることも可能である。しかし、イミノアッセイに使用す
るためのコバラミン接合体を製造するために、測定法の
感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯１つの
精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルボン酸を
相応する定義された純粋なヒドラジドに変換するのが好
ましい。
相応するヒドラジドへの遊離カルボン酸の変換は、自体
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミン−モノカルボン酸は、例えばＮ−エチル
−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
のようなカルボジイミドおよび相応するヒドラジン化合
物との反応によって式（Ｉ）のカルボン酸ヒドラジドに
変換することができる。ｘが１であるような一般式
（Ｉ）の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Ｂに結合した基を段階的に、例えばＢ−COOH→Ｂ−
CO−NH−NH−Ｒ−COOH→Ｂ−CO−NH−NH−Ｒ−CO−NH−
NH2の順序で構成させることによって行なうことができ
るか、または化合物H2N−NH−Ｒ−CO−NH−NH2、例えば
トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
（TEDEH）との反応によって行なうことができる。この
場合、反応条件は、このような反応のために知られた常
用の条件に相応する。
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミン−モノカルボン酸は、例えばＮ−エチル
−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
のようなカルボジイミドおよび相応するヒドラジン化合
物との反応によって式（Ｉ）のカルボン酸ヒドラジドに
変換することができる。ｘが１であるような一般式
（Ｉ）の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Ｂに結合した基を段階的に、例えばＢ−COOH→Ｂ−
CO−NH−NH−Ｒ−COOH→Ｂ−CO−NH−NH−Ｒ−CO−NH−
NH2の順序で構成させることによって行なうことができ
るか、または化合物H2N−NH−Ｒ−CO−NH−NH2、例えば
トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
（TEDEH）との反応によって行なうことができる。この
場合、反応条件は、このような反応のために知られた常
用の条件に相応する。
従って、本発明の対象は、式（Ｉ）の本発明によるコバ
ラミン−酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式:B−COOHのコバラミン−カルボン酸中でカルボ
キシル基を自体公知の方法でヒドラジドとの反応によっ
て基 −CO−NH−NHCO−NH−NHxH に変換し、その際ｘが１である場合には、前記の基変換
の構成はＢ−COOH→Ｂ−CO−NH−NH−Ｒ−COOH→Ｂ−CO
−NH−NH−Ｒ−Ｃ−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に
有利なものとして記載した式（Ｉ）の本発明による化合
物が得られる。
ラミン−酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式:B−COOHのコバラミン−カルボン酸中でカルボ
キシル基を自体公知の方法でヒドラジドとの反応によっ
て基 −CO−NH−NHCO−NH−NHxH に変換し、その際ｘが１である場合には、前記の基変換
の構成はＢ−COOH→Ｂ−CO−NH−NH−Ｒ−COOH→Ｂ−CO
−NH−NH−Ｒ−Ｃ−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に
有利なものとして記載した式（Ｉ）の本発明による化合
物が得られる。
式（Ｉ）の本発明によるカルボン酸ヒドラジドは、良好
に単離可能で特性決定可能の安定な化合物であり、この
化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定性
を有する。
に単離可能で特性決定可能の安定な化合物であり、この
化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定性
を有する。
式（Ｉ）の本発明によるコバラミンとヒドラジドの中、
コバラミン基Ｂがメチルコバラミンまたは殊にシアノコ
バラミンB12の基を表わすようなものが有利である。酸
ヒドラジド基−CO−NH−NH−は、特にｂ位、ｅ位および
殊にｄ位（コリン基本骨格中の−CH2−CH2−CO−NH2基
の３位、13位および殊に８位に相当する）に存在する。
コバラミン基Ｂがメチルコバラミンまたは殊にシアノコ
バラミンB12の基を表わすようなものが有利である。酸
ヒドラジド基−CO−NH−NH−は、特にｂ位、ｅ位および
殊にｄ位（コリン基本骨格中の−CH2−CH2−CO−NH2基
の３位、13位および殊に８位に相当する）に存在する。
特に、基−Ｒ−CO−は、アルキレン基が１個またはそれ
以上のヘテロ原子、殊にNH基またはＯ原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルボン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−Ｒ−COは、ポリアル
キレングリコール−ジカルボン酸、ポリエーテルポリオ
ール−ジカルボン酸またはポリエステルポリオール−ジ
カルボン酸から誘導されたジアシル基および第１にトリ
エチレングリコール−ジ酢酸（TEDE）から誘導された
式： −CH−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO− ［式中、ｎは３である］で示されるジアシル基であり、
但し、ｎが１または２であるジアシル基であってもよ
い。
以上のヘテロ原子、殊にNH基またはＯ原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルボン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−Ｒ−COは、ポリアル
キレングリコール−ジカルボン酸、ポリエーテルポリオ
ール−ジカルボン酸またはポリエステルポリオール−ジ
カルボン酸から誘導されたジアシル基および第１にトリ
エチレングリコール−ジ酢酸（TEDE）から誘導された
式： −CH−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO− ［式中、ｎは３である］で示されるジアシル基であり、
但し、ｎが１または２であるジアシル基であってもよ
い。
式（Ｉ）の本発明による化合物の中、殊にコバラミン／
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第１にB12−ｄ−CO−NH−NH2およびB12−ｄ−CO−N
H−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−NH2
（但し、ｎは１または２および殊に３である）を挙げる
ことができる。
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第１にB12−ｄ−CO−NH−NH2およびB12−ｄ−CO−N
H−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−NH2
（但し、ｎは１または２および殊に３である）を挙げる
ことができる。
式（Ｉ）の本発明によるコバラミン−酸ヒドラジドは、
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわ
ち、式（Ｉ）のコバラミンは、例えば直接に高い収量
で、例えばペルオキシダーゼ（POD）のようなグリコ蛋
白質の酸化されたグリコシル基にカップリングすること
ができる。この場合には、加水分解安定性である良好に
特性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合
には、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免
疫学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の
場合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Ｒで延長させ
ることによってなお高めることができる（式III、ｘ＝
１参照）。こうして、例えば抗体へのコバラミン−ヒド
ラジド（ハプテン成分）の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわ
ち、式（Ｉ）のコバラミンは、例えば直接に高い収量
で、例えばペルオキシダーゼ（POD）のようなグリコ蛋
白質の酸化されたグリコシル基にカップリングすること
ができる。この場合には、加水分解安定性である良好に
特性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合
には、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免
疫学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の
場合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Ｒで延長させ
ることによってなお高めることができる（式III、ｘ＝
１参照）。こうして、例えば抗体へのコバラミン−ヒド
ラジド（ハプテン成分）の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。
従って、本発明の対象は、一般式（III）： Ｂ−CO−NHNH−Ｒ−CO−NHxN＝GP （III） ［式中、Ｂ、Ｒおよびｘは請求項１記載のものを表わ
し、GPはグリコシル基を介して−NH−Ｎ＝−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす］で示され
るコバラミン接合体でもある。
し、GPはグリコシル基を介して−NH−Ｎ＝−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす］で示され
るコバラミン接合体でもある。
特に、Ｂは、シアノ基−コバラミンから誘導された基B1
2であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式（I
V）： Ｂ−ｄ−CO−NHNH−Ｒ−CO−NHxN＝GP （IV） を有する。
2であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式（I
V）： Ｂ−ｄ−CO−NHNH−Ｒ−CO−NHxN＝GP （IV） を有する。
この化合物の場合、−Ｒ−CO−は、基： −CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO ［但し、ｎは１、２または３である］を意味し、殊にこ
れは、式： B12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝GPまたは式： B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−Ｎ＝GP ［但し、ｎは１、２または３である］に相当する。
れは、式： B12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝GPまたは式： B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−Ｎ＝GP ［但し、ｎは１、２または３である］に相当する。
グリコ蛋白質基GPは、とにかく適当なグリコ蛋白質また
はグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、
グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導すること
ができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は、
前記に有利に記載したコバラミン−酸ヒドラジドから誘
導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標識
化酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ（AP）および
殊にペロキシダーゼ（POD）が使用される。イムノアッ
セイーに使用するための適性に関連して、第１には次の
ものが記載される:B12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝GPおよび B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO −CH2−CO−NH−Ｎ＝GP 但し、ｎは１または２および殊に３である。
はグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、
グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導すること
ができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は、
前記に有利に記載したコバラミン−酸ヒドラジドから誘
導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標識
化酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ（AP）および
殊にペロキシダーゼ（POD）が使用される。イムノアッ
セイーに使用するための適性に関連して、第１には次の
ものが記載される:B12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝GPおよび B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2nO −CH2−CO−NH−Ｎ＝GP 但し、ｎは１または２および殊に３である。
式（III）の本発明によるコバラミン接合体の製造は、
式（Ｉ）のコバラミン−酸ヒドラジドをグリコ蛋白質の
グリコシル基のOH基と、酸化およびヒドラゾン基−NH−
Ｎ＝CH−グリコ蛋白質の形成の後にカップリング（縮
合）することによって行なうことができる。この場合、
反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造にとって
常用の条件に相当する。
式（Ｉ）のコバラミン−酸ヒドラジドをグリコ蛋白質の
グリコシル基のOH基と、酸化およびヒドラゾン基−NH−
Ｎ＝CH−グリコ蛋白質の形成の後にカップリング（縮
合）することによって行なうことができる。この場合、
反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造にとって
常用の条件に相当する。
式（III）の本発明によるコバラミン接合体は、ビタミ
ンB12の免疫学的測定の際に使用するのに特に適当であ
る。殊に、B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−C
H2 3O−CH2−CO−NH−Ｎ＝GPの本発明によるシアノ−
コバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンB12を再
現可能に迅速で簡単に実施すべき測定（ビタミンB12−
イムノアッセイ）は、高い感度および正確さをもって可
能である。この種の測定法は、本願と同一の出願日で本
願と同一人の西ドイツ国特許出願第3900650号明細書
（発明の名称：ビタミン−B12の測定法）に記載の対象
であり、その内容は、本願の対象である。
ンB12の免疫学的測定の際に使用するのに特に適当であ
る。殊に、B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−C
H2 3O−CH2−CO−NH−Ｎ＝GPの本発明によるシアノ−
コバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンB12を再
現可能に迅速で簡単に実施すべき測定（ビタミンB12−
イムノアッセイ）は、高い感度および正確さをもって可
能である。この種の測定法は、本願と同一の出願日で本
願と同一人の西ドイツ国特許出願第3900650号明細書
（発明の名称：ビタミン−B12の測定法）に記載の対象
であり、その内容は、本願の対象である。
しかし、本発明によるコバラミン接合体を、ビタミンB1
2を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンB12の代
わりに使用することも可能である。この種の適当なラジ
オイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオケミス
トリー（Clinical Biochemistry）18（1985）261−26
6、米国特許第3981863号明細書、クリニカ・シミカ・ア
クタ（Clinica Chimica Acta）56（1974）143−149、Li
t.Clin.Path.20（1967）683−686、Brit.J.Hmat.22
（1972）、21−31に記載されている。
2を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンB12の代
わりに使用することも可能である。この種の適当なラジ
オイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオケミス
トリー（Clinical Biochemistry）18（1985）261−26
6、米国特許第3981863号明細書、クリニカ・シミカ・ア
クタ（Clinica Chimica Acta）56（1974）143−149、Li
t.Clin.Path.20（1967）683−686、Brit.J.Hmat.22
（1972）、21−31に記載されている。
次の実施例および特徴は、本発明をさらに詳説するもの
である。
である。
実施例 例1: トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
（TEDEH）の製造 TEDEHを次の反応工程により製造した： ａ）トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−第三ブチ
ルエステル（２） 無水トリエチレングリコール（１）33g（0.22モル）を
無水ジオキサン300mlに溶解し、この溶液に攪拌しなが
ら室温で滴下法で水素化ナトリウム12g（0.4モル）（パ
ラフィン油20％を含有する）を添加する。この場合に
は、約45℃への弱い昇温が起こる。この懸濁液を室温で
３時間攪拌する。その後に、氷冷却下に１時間で臭化酢
酸−第三ブチルエステル78g（0.4モル）を滴加させる。
この懸濁液を室温でさらに16時間攪拌する。引続き、沈
澱したNaBrを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプ
による真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステ
ル0.5に溶解し、この溶液を水0.5で洗浄し、有機相
をNa2SO4 30gで乾燥する。この溶液を約100mlの残存容
量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲルカラム（8.5×5
5cm）上に載せる。酢酸エステルで溶離し、個々の画分
を分析薄層クロマトグラフィーによって試験する（珪酸
ゲル、流展剤：酢酸エステル）。ポリエチレングリコー
ル誘導体含有画分をドラ−ゲンドルフ（Dragendorff）
試薬（K.Thoma他、Sci.Pharm.32（1964）、216参照）を
用いる噴霧によって目で見ることができるようにする。
生成物（２）（Rf＝0.60）を含有する画分を合わせ、か
つ水ポンプで蒸発濃縮する。
（TEDEH）の製造 TEDEHを次の反応工程により製造した： ａ）トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−第三ブチ
ルエステル（２） 無水トリエチレングリコール（１）33g（0.22モル）を
無水ジオキサン300mlに溶解し、この溶液に攪拌しなが
ら室温で滴下法で水素化ナトリウム12g（0.4モル）（パ
ラフィン油20％を含有する）を添加する。この場合に
は、約45℃への弱い昇温が起こる。この懸濁液を室温で
３時間攪拌する。その後に、氷冷却下に１時間で臭化酢
酸−第三ブチルエステル78g（0.4モル）を滴加させる。
この懸濁液を室温でさらに16時間攪拌する。引続き、沈
澱したNaBrを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプ
による真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステ
ル0.5に溶解し、この溶液を水0.5で洗浄し、有機相
をNa2SO4 30gで乾燥する。この溶液を約100mlの残存容
量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲルカラム（8.5×5
5cm）上に載せる。酢酸エステルで溶離し、個々の画分
を分析薄層クロマトグラフィーによって試験する（珪酸
ゲル、流展剤：酢酸エステル）。ポリエチレングリコー
ル誘導体含有画分をドラ−ゲンドルフ（Dragendorff）
試薬（K.Thoma他、Sci.Pharm.32（1964）、216参照）を
用いる噴霧によって目で見ることができるようにする。
生成物（２）（Rf＝0.60）を含有する画分を合わせ、か
つ水ポンプで蒸発濃縮する。
収量：無色の油状物19.2g（理論値の23％）。
ｂ）トリエチレングリコール−ジ酢酸（３） エステル（２）18.9g（50ミリモル）を室温でトリフル
オロ酢酸30mlに溶解し、かつ２時間攪拌する。この溶液
を水流ポンプによる真空中で35℃で蒸発濃縮し、残留物
を３回それぞれジエチルエーテル100ml宛で蒸解し、か
つ45℃で高真空中で乾燥する。生成物（３）を後生成す
ることなしにさらに使用する。
オロ酢酸30mlに溶解し、かつ２時間攪拌する。この溶液
を水流ポンプによる真空中で35℃で蒸発濃縮し、残留物
を３回それぞれジエチルエーテル100ml宛で蒸解し、か
つ45℃で高真空中で乾燥する。生成物（３）を後生成す
ることなしにさらに使用する。
収量：無色の油状物11.2g（理論値の84％）。
DC:珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール＝4/
1:Rf＝0.08。
1:Rf＝0.08。
ｃ）トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−（BOC−
ヒドラジド）（４） ジカルボン酸（３）8.0g（30ミルモル）をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド8.28g（72ミルモル）と一緒に無水テ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、この溶液に無水テト
ラヒドロフラン50ml中のN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド14.8g（72ミルモル）を水浴による冷却下に2
0℃で添加する。この溶液を室温で20時間攪拌させ、そ
の後に沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真
空中で蒸発濃縮する。粘稠な残留物を酢酸エステル100m
lに溶解し、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮す
る。この最後の過程をなお２回繰り返し、次に残留物を
イソプロパノール50mlで蒸解し、引続き高真空中で乾燥
する。得られた粘稠な油状物（約9g）を無水クロロホル
ム60mlに溶解し、この溶液に攪拌しながら室温で第三ブ
チルカルバザート（BOC−ヒドラジン）7.9g（60ミルモ
ル）を添加する。最初に少し昇温する反応混合物を室温
で20時間攪拌させる。その後に、２回それぞれ水100ml
宛で洗浄し、Na2SO4 5gで乾燥し、この溶液を水流ポン
プによる真空中で蒸発濃縮する。
ヒドラジド）（４） ジカルボン酸（３）8.0g（30ミルモル）をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド8.28g（72ミルモル）と一緒に無水テ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、この溶液に無水テト
ラヒドロフラン50ml中のN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド14.8g（72ミルモル）を水浴による冷却下に2
0℃で添加する。この溶液を室温で20時間攪拌させ、そ
の後に沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真
空中で蒸発濃縮する。粘稠な残留物を酢酸エステル100m
lに溶解し、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮す
る。この最後の過程をなお２回繰り返し、次に残留物を
イソプロパノール50mlで蒸解し、引続き高真空中で乾燥
する。得られた粘稠な油状物（約9g）を無水クロロホル
ム60mlに溶解し、この溶液に攪拌しながら室温で第三ブ
チルカルバザート（BOC−ヒドラジン）7.9g（60ミルモ
ル）を添加する。最初に少し昇温する反応混合物を室温
で20時間攪拌させる。その後に、２回それぞれ水100ml
宛で洗浄し、Na2SO4 5gで乾燥し、この溶液を水流ポン
プによる真空中で蒸発濃縮する。
収量：粘稠な淡黄色の油状物9.2g（理論値の60％）。
DC:珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール＝4/
1;Rf＝0.52。
1;Rf＝0.52。
ｄ）トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジ
ド塩酸塩（５） 化合物（４）5.1g（10ミリモル）をトリフルオル酢酸20
mlに溶解し、この溶液を室温で２時間攪拌する。その後
に、この溶液を35℃で水流ポンプによる真空中で蒸発濃
縮し、残流物を無水酢酸80mlに溶解し、かつ０℃で冷却
下に10分間HClガスを溶液に導通する。この場合には、
固体のカルボン酸ヒドラジド塩酸塩（５）の沈澱物が形
成する。この懸濁液を０℃で２時間放置させ、引続き吸
引濾過し、かつ得られた吸湿性塩を無水酢酸40mlで洗浄
する。この塩を乾燥器中で高真空下にCaCl2上で乾燥す
る。
ド塩酸塩（５） 化合物（４）5.1g（10ミリモル）をトリフルオル酢酸20
mlに溶解し、この溶液を室温で２時間攪拌する。その後
に、この溶液を35℃で水流ポンプによる真空中で蒸発濃
縮し、残流物を無水酢酸80mlに溶解し、かつ０℃で冷却
下に10分間HClガスを溶液に導通する。この場合には、
固体のカルボン酸ヒドラジド塩酸塩（５）の沈澱物が形
成する。この懸濁液を０℃で２時間放置させ、引続き吸
引濾過し、かつ得られた吸湿性塩を無水酢酸40mlで洗浄
する。この塩を乾燥器中で高真空下にCaCl2上で乾燥す
る。
収量：淡褐色の粉末2.8g（理論値の75％）。
DC:珪酸ゲル、ｎ−ブタノール／氷酢酸／水＝50/15/25;
Rf＝0.45。
Rf＝0.45。
例2: シアノコバラミン−ｄ−酸ヒドラジド（B12−ｄ−CO−N
H−NH2） シアノコバラミン−ｄ−酸135mg（0.1ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド46mg（0.4ミリモル）と一緒
にジメチルホルムアミド／水＝1:1の混合物に溶解し、
この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH １モ
ル/lでpH6に調節する。この溶液にＮ−エチル−Ｎ′−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩（ED
C）77mg（0.4ミリモル）およびヒドラジニウムスルフェ
ート650mg（５ミリモル）を添加する。pH価をNaOHでさ
らに調節し、引続き反応容器を暗くし、溶液を室温で攪
拌する。６〜14時間の間隔をもって、全部で５回それぞ
れＮ−ヒドロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを
反応溶液に添加し、この場合には、そのつどpH価を６に
後調節する。４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発
濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン10mlで蒸解し、か
つ吸引漏斗により吸引濾過する。固体の残留物を水10ml
に溶解し、この溶液をクロマトグラフィーカラム（物
質：スチロールジビニルベンゾール共重合体）アンバー
ライト（Amberlite）−XAD−２（Ｖ＝100ml）上に載せ
る。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗浄し、引
続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離する。溶液を
水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水100m
lに溶解し、この溶液をダウエックス（Dowex）−1x2−
カラム（酸性イオン交換体、アセテート形、80ml）上に
与える。最終生成物を水250mlで溶離し、この場合に
は、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリ
ウム緩衝液0.04モル/1（pH4.7）で溶離する。生成物を
含有する画分を合わせ、かつ親液性化する。
H−NH2） シアノコバラミン−ｄ−酸135mg（0.1ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド46mg（0.4ミリモル）と一緒
にジメチルホルムアミド／水＝1:1の混合物に溶解し、
この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH １モ
ル/lでpH6に調節する。この溶液にＮ−エチル−Ｎ′−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩（ED
C）77mg（0.4ミリモル）およびヒドラジニウムスルフェ
ート650mg（５ミリモル）を添加する。pH価をNaOHでさ
らに調節し、引続き反応容器を暗くし、溶液を室温で攪
拌する。６〜14時間の間隔をもって、全部で５回それぞ
れＮ−ヒドロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを
反応溶液に添加し、この場合には、そのつどpH価を６に
後調節する。４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発
濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン10mlで蒸解し、か
つ吸引漏斗により吸引濾過する。固体の残留物を水10ml
に溶解し、この溶液をクロマトグラフィーカラム（物
質：スチロールジビニルベンゾール共重合体）アンバー
ライト（Amberlite）−XAD−２（Ｖ＝100ml）上に載せ
る。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗浄し、引
続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離する。溶液を
水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水100m
lに溶解し、この溶液をダウエックス（Dowex）−1x2−
カラム（酸性イオン交換体、アセテート形、80ml）上に
与える。最終生成物を水250mlで溶離し、この場合に
は、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリ
ウム緩衝液0.04モル/1（pH4.7）で溶離する。生成物を
含有する画分を合わせ、かつ親液性化する。
収量：桜色の粉末84mg（理論値の60％）。
同様にして、メチルコバラミン−ｄ−酸から出発し、メ
チルコバラミン−ｄ−酸ヒドラジドが得られる。
チルコバラミン−ｄ−酸ヒドラジドが得られる。
例3: シアノコバラミン−ｄ−酸ヒドラジド−POD−接合体（B
12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝POD）の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mg（POD、EC 1.1
1.1.7）を酢酸ナトリウム緩衝液4.5ml 0.03モル/l pH
5.5に溶解する。ナトリウムペリオダート溶液0.6ml 0.
2モル/l（酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5中）
を添加し、かつ室温で１時間攪拌させる。その後に、こ
の溶液をセファデックス（Sephadex）−Ｇ−25−カラム
（モレキュラーシーブ、Ｖ＝50ml）上に載せ、かつ酢酸
ナトリウム緩衝液0.03モル/l（ph5.5）で溶離する（403
nmでの検知）。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例２から
のB12−ｄ−CO−NH−NH2を添加する。室温で16時間攪拌
し、混合物をウルトロゲル（Ultrogel）−AcA−202カラ
ム（モレキュラーシーブ、Ｖ＝80ml）上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶
離する（検知ν＝403nm）。最終生成物を含有する画分
を合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き親液性
化する。
12−ｄ−CO−NH−Ｎ＝POD）の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mg（POD、EC 1.1
1.1.7）を酢酸ナトリウム緩衝液4.5ml 0.03モル/l pH
5.5に溶解する。ナトリウムペリオダート溶液0.6ml 0.
2モル/l（酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5中）
を添加し、かつ室温で１時間攪拌させる。その後に、こ
の溶液をセファデックス（Sephadex）−Ｇ−25−カラム
（モレキュラーシーブ、Ｖ＝50ml）上に載せ、かつ酢酸
ナトリウム緩衝液0.03モル/l（ph5.5）で溶離する（403
nmでの検知）。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例２から
のB12−ｄ−CO−NH−NH2を添加する。室温で16時間攪拌
し、混合物をウルトロゲル（Ultrogel）−AcA−202カラ
ム（モレキュラーシーブ、Ｖ＝80ml）上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶
離する（検知ν＝403nm）。最終生成物を含有する画分
を合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き親液性
化する。
収量:26mg（理論値の87％）。
例4: シアンコバラミン−ｄ−酸−TEDEH（B12−ｄ−CO−NH−
NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2 3O−CH2−CO−NH−NH2）
の製造 シアンコバラミン−ｄ−酸135mg（0.1ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド46mg（0.4ミリモル）と一緒
にジメチルホルムアミド−水1:1の混合物10mlに溶解
し、この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH1
モル/lでpH5.5に調節する。この溶液にＮ−エチル−
Ｎ′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩
（EDC）77mg（0.4ミリモル）およびTEDEH塩酸塩1.84g
（５ミリモル）を添加する。pH価をNaOHで後調節し、引
続き反応容器を暗くし、この溶液を室温で攪拌する。６
〜14時間の間隔をもって、全部で５回それぞれＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを反応溶液に
添加し、この場合には、そのつどpH価を5.5に後調節す
る。４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、
残留物をアセトン10mlで溶解し、溶剤をデカントする。
殆ど固体の残留物を水10mlに溶解し、この溶液をアンバ
ーライト（Amberlite）−XAD−２カラム（Ｖ＝100ml）
上に載せる。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗
浄し、引続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離す
る。溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留
物を水100mlに溶解し、この溶液をダウエックス（Dowe
x）−1x2−カラム（アセテート形、80ml）上に与える。
最終生成物を水250mlで溶離し、この場合には、未反応
の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリウム緩衝液
0.04モル/l（pH4.7）で溶離する。生成物を含有する画
分を合わせ、かつ親液性化する。
NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2 3O−CH2−CO−NH−NH2）
の製造 シアンコバラミン−ｄ−酸135mg（0.1ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド46mg（0.4ミリモル）と一緒
にジメチルホルムアミド−水1:1の混合物10mlに溶解
し、この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH1
モル/lでpH5.5に調節する。この溶液にＮ−エチル−
Ｎ′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩
（EDC）77mg（0.4ミリモル）およびTEDEH塩酸塩1.84g
（５ミリモル）を添加する。pH価をNaOHで後調節し、引
続き反応容器を暗くし、この溶液を室温で攪拌する。６
〜14時間の間隔をもって、全部で５回それぞれＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを反応溶液に
添加し、この場合には、そのつどpH価を5.5に後調節す
る。４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、
残留物をアセトン10mlで溶解し、溶剤をデカントする。
殆ど固体の残留物を水10mlに溶解し、この溶液をアンバ
ーライト（Amberlite）−XAD−２カラム（Ｖ＝100ml）
上に載せる。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗
浄し、引続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離す
る。溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留
物を水100mlに溶解し、この溶液をダウエックス（Dowe
x）−1x2−カラム（アセテート形、80ml）上に与える。
最終生成物を水250mlで溶離し、この場合には、未反応
の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリウム緩衝液
0.04モル/l（pH4.7）で溶離する。生成物を含有する画
分を合わせ、かつ親液性化する。
収量：桜色の易吸湿性粉末75mg（理論値の46％）。
同様にして、メチルコバラミン−ｄ−酸から出発し、メ
チルコバラミン−ｄ−酸が得られる。
チルコバラミン−ｄ−酸が得られる。
例5: シアノコバラミン−ｄ−酸−TEDEH−POD−接合体（B12
−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2 3O−CH2−
CO−NH−Ｎ＝POD）の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mgを酢酸ナトリウ
ム緩衝液4.5ml0.03モル/l pH5.5に溶解する。ナトリウ
ムペルヨーダート溶液0.6ml 0.2モル/l（酢酸ナトリウ
ム緩衝液0.03モル/l pH5.5中）を添加し、かつ室温で
１時間攪拌させる。その後に、この溶液をセファデック
ス（Sephadex）−Ｇ−25−カラム（Ｖ＝50ml）上に載
せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l（pH5.5）で
溶離する（ν＝403nmでの検知）。蛋白質含有画分を合
わせ、かつ例４からのヒドラジド2.7mgを添加する。室
温で16時間攪拌し、混合物をウルトロゲル（Ultrogel）
−AcA−202カラム（Ｖ＝80ml）上に載せる。この混合物
を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶離する
（ν＝403nmでの検知）。最終生成物を含有する画分を
合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き親液性化
する。
−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2 3O−CH2−
CO−NH−Ｎ＝POD）の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mgを酢酸ナトリウ
ム緩衝液4.5ml0.03モル/l pH5.5に溶解する。ナトリウ
ムペルヨーダート溶液0.6ml 0.2モル/l（酢酸ナトリウ
ム緩衝液0.03モル/l pH5.5中）を添加し、かつ室温で
１時間攪拌させる。その後に、この溶液をセファデック
ス（Sephadex）−Ｇ−25−カラム（Ｖ＝50ml）上に載
せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l（pH5.5）で
溶離する（ν＝403nmでの検知）。蛋白質含有画分を合
わせ、かつ例４からのヒドラジド2.7mgを添加する。室
温で16時間攪拌し、混合物をウルトロゲル（Ultrogel）
−AcA−202カラム（Ｖ＝80ml）上に載せる。この混合物
を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶離する
（ν＝403nmでの検知）。最終生成物を含有する画分を
合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き親液性化
する。
収量:27mg（理論値の90％）。
POD接合体を製造するための前記例３および５に記載に
方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素、
例えばアルカリ性ホスファターゼ（AP）の使用下に相応
する接合体を製造することができる。
方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素、
例えばアルカリ性ホスファターゼ（AP）の使用下に相応
する接合体を製造することができる。
例6: シアノコバラミン−ｄ−モノカルボン酸−POD−接合体
（比較化合物）の製造 製造は、Clin.Chim.Acta.56（1974）、143−149の記載
のように行なう。
（比較化合物）の製造 製造は、Clin.Chim.Acta.56（1974）、143−149の記載
のように行なう。
そのために、B12−モノカルボン酸をジャーナル・オブ
・ズィ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J.Am.Che
m.Soc.）102（1980）2215の記載のように製造する。
・ズィ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（J.Am.Che
m.Soc.）102（1980）2215の記載のように製造する。
POD100mgおよびビタミンB12 10mgを燐酸塩緩衝液2.5ml
（0.07モル/l、pH8.2）に溶解し、この溶液にカルボジ
イミド25mgを添加する。この溶液を４℃で72時間攪拌
し、引続き脱イオン水に対して72時間透析する。
（0.07モル/l、pH8.2）に溶解し、この溶液にカルボジ
イミド25mgを添加する。この溶液を４℃で72時間攪拌
し、引続き脱イオン水に対して72時間透析する。
接合体の精製は、例５の記載のように行なわれる。
例7: ビタミンB12 ａ）試料の調製 ヒト血清250μを分解試薬125μ（NaOH 0.5モル/l
に溶解したリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlか
らなる）と混合し、かつ室温で15分間恒温保持する。引
続き燐酸塩緩衝液125μ、200ミリモル/l、pH4.1を添
加する。
に溶解したリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlか
らなる）と混合し、かつ室温で15分間恒温保持する。引
続き燐酸塩緩衝液125μ、200ミリモル/l、pH4.1を添
加する。
ｂ）試薬 テルモ（Thermo）−RSAストレプタビジン（Streptavidi
n）で被覆されたポリスチロール小管（欧州特許出願公
開第0269092号明細書の記載により製造） 試薬１ ビタミンB12に対するビオチニル化されたモノクロナー
ル抗体95ng/ml（JACS100（1978）3585−3590の記載によ
るビオチニル化）。
n）で被覆されたポリスチロール小管（欧州特許出願公
開第0269092号明細書の記載により製造） 試薬１ ビタミンB12に対するビオチニル化されたモノクロナー
ル抗体95ng/ml（JACS100（1978）3585−3590の記載によ
るビオチニル化）。
適当なモノクロナール抗体を生産するツェリニーンは、
European Collection of Animal Ce11 Culture（ECAC
C）Porton Down,GBに番号EC ACC 88101301およびECAC
C88101302で寄託されている。
European Collection of Animal Ce11 Culture（ECAC
C）Porton Down,GBに番号EC ACC 88101301およびECAC
C88101302で寄託されている。
燐酸塩緩衝液40イリモル/l、pH7.2。
試薬２ B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2Ｏ−CH2−CH2 3O−CH
2−CO−NH−Ｎ＝POD（活性約20mU/ml） 燐酸塩緩衝液40ミリモル/l、pH7.2 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液100ミリモル/l、pH4.4。
2−CO−NH−Ｎ＝POD（活性約20mU/ml） 燐酸塩緩衝液40ミリモル/l、pH7.2 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液100ミリモル/l、pH4.4。
ABTS（2,2″−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホネート］）1.9ミリモル/l ペルオキシ硼酸ナトリウム3.2ミリモル/l。
リン−スルホネート］）1.9ミリモル/l ペルオキシ硼酸ナトリウム3.2ミリモル/l。
ｃ）測定の実施 測定を実施するために、試料200μを試薬800μと一
緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温で60分間恒
温保持する。引続き、洗浄液（塩化ナトリウム250mg/m
l、硫酸銅1mg/ml）で洗浄し、試薬２ 1000μを添加
し、かつ室温で30分間恒温保持する。洗浄液（塩化ナト
リウム250mg/ml、硫酸銅1mg/100ml）で洗浄し、かつ試
薬３ 1000μを添加し、室温で30分間恒温保持し、形
成された色を420nmでのビタミンB12含量のための尺度と
して定める。
緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温で60分間恒
温保持する。引続き、洗浄液（塩化ナトリウム250mg/m
l、硫酸銅1mg/ml）で洗浄し、試薬２ 1000μを添加
し、かつ室温で30分間恒温保持する。洗浄液（塩化ナト
リウム250mg/ml、硫酸銅1mg/100ml）で洗浄し、かつ試
薬３ 1000μを添加し、室温で30分間恒温保持し、形
成された色を420nmでのビタミンB12含量のための尺度と
して定める。
第１図は、この場合に得られた校正曲線を例６による試
験のための校正曲線と比較して示す。校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム0.9％、
クロテインC0.9％および塩化カリウム0.1％と一緒の燐
酸塩緩衝液40ミリモル/1、pH7.2中のシアノコバラミン
からなる標準を使用する。
験のための校正曲線と比較して示す。校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム0.9％、
クロテインC0.9％および塩化カリウム0.1％と一緒の燐
酸塩緩衝液40ミリモル/1、pH7.2中のシアノコバラミン
からなる標準を使用する。
例8: ビタミンB12の測定（比較例） ビタミンB12の測定を例７の記載と同様にして実施し、
この場合には例７に記載の標準を使用する。試薬２で使
用した本発明による接合体の代わりに、約90mU/mlの活
性を有する例６によるPOD接合体を使用する。第１図
は、例７と例８によるビタミンB12を測定した校正曲線
の比較を示す。それによれば、例６による接合体を用い
た場合には高い活性にも拘束わらず本発明による接合体
を用いた場合よりも平らな校正曲線が得られることが判
明する。
この場合には例７に記載の標準を使用する。試薬２で使
用した本発明による接合体の代わりに、約90mU/mlの活
性を有する例６によるPOD接合体を使用する。第１図
は、例７と例８によるビタミンB12を測定した校正曲線
の比較を示す。それによれば、例６による接合体を用い
た場合には高い活性にも拘束わらず本発明による接合体
を用いた場合よりも平らな校正曲線が得られることが判
明する。
第１図は、例５に記載の本発明によるB12−酵素接合体
の使用下でのビタミンB12の酵素イムノアッセイ（曲線
２、活性20mU/ml）と、例６に記載の接合体の使用下で
の試験（曲線１、活性90mU/ml）の校正曲線の比較を示
す。測定波長:425nm、E:吸光度。
の使用下でのビタミンB12の酵素イムノアッセイ（曲線
２、活性20mU/ml）と、例６に記載の接合体の使用下で
の試験（曲線１、活性90mU/ml）の校正曲線の比較を示
す。測定波長:425nm、E:吸光度。
フロントページの続き (72)発明者 クリスチアン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (72)発明者 コンラート・キユルツインガー ドイツ連邦共和国トウツチング・グレーバ ーヴエーク ５
Claims (4)
- 【請求項１】式（Ｉ）： Ｂ−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHxH （Ｉ） 〔式中、Ｂはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
て形成された基を表わし、Ｒは１個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、ｘは０または１であ
る〕で示されるコバラミン−酸ヒドラジド。 - 【請求項２】請求項１記載の式（Ｉ）のコバラミン−酸
ヒドラジドを製造する方法において、式:B−COOHのコバ
ラミン−カルボン酸中でカルボキシル基を自体公知の方
法でヒドラジドとの反応によって基 −CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHxH に変換し、その際Ｘが１である場合には、前記の基変換
の構成はＢ−COOH→Ｂ−CO−NH−NH−Ｒ−COOH→Ｂ−CO
−NH−NH−Ｒ−Ｃ−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする、式（Ｉ）のコバラミン−酸ヒドラ
ジドの製造法。 - 【請求項３】式（III）： Ｂ−CO−NHNH−Ｒ−CO−NHxN＝GP （III） 〔式中、Ｂ、Ｒおよびｘは請求項１記載のものを表わ
し、GPはグリコシル基を介して−NH−Ｎ＝−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす〕で示され
るコバラミン接合体。 - 【請求項４】トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビスヒ
ドラジド（TEDEH）がスペーサー基として導入されてい
る、請求項３記載のコバラミン接合体。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE3900648.4 | 1989-01-11 | ||
| DE3900648A DE3900648A1 (de) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | Neue cobalamin-saeurehydrazide und davon abgeleitete cobalamin-konjugate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02233693A JPH02233693A (ja) | 1990-09-17 |
| JPH0717672B2 true JPH0717672B2 (ja) | 1995-03-01 |
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|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0378203B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0717672B2 (ja) |
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| DE4239815A1 (de) * | 1992-11-26 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate |
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| US5739287A (en) * | 1994-04-08 | 1998-04-14 | University Of Washington | Biotinylated cobalamins |
| ATE225799T1 (de) * | 1994-04-08 | 2002-10-15 | Receptagen Corp | Rezeptor modulierendes mitteln und entsprechendes verfahren |
| US5869465A (en) * | 1994-04-08 | 1999-02-09 | Receptagen Corporation | Methods of receptor modulation and uses therefor |
| US5840880A (en) * | 1994-04-08 | 1998-11-24 | Receptagen Corporation | Receptor modulating agents |
| EP1015475A1 (en) * | 1995-10-19 | 2000-07-05 | Receptagen Corporation | Vitamin b 12? receptor modulating agents and methods related thereto |
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| WO2005061527A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-07 | Solidago Ag | Cobalamine derivatives useful for diagnosis and treatment of abnormal cellular proliferation |
| US9120858B2 (en) | 2011-07-22 | 2015-09-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antibodies to the B12-transcobalamin receptor |
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|---|---|---|---|---|
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| US3981863A (en) * | 1975-02-25 | 1976-09-21 | Micromedic Diagonistics, Inc. | Cyanocobalamin derivatives |
| US4334069A (en) * | 1978-07-24 | 1982-06-08 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates |
| US4550163A (en) * | 1979-02-05 | 1985-10-29 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates |
| CA1180273A (en) * | 1981-06-22 | 1985-01-02 | Technicon Instruments Corporation | Assay of vitamin b in12 xx |
| US4925931A (en) * | 1988-07-14 | 1990-05-15 | Mccully Kilmer S | N-homocysteine thiolactonyl retinamido cobalamin and methods of use thereof |
-
1989
- 1989-01-11 DE DE3900648A patent/DE3900648A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-05 US US07/461,215 patent/US5171679A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-10 EP EP90100462A patent/EP0378203B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 AT AT90100462T patent/ATE141926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-10 DE DE59010462T patent/DE59010462D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-11 JP JP2002635A patent/JPH0717672B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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| JPH02233693A (ja) | 1990-09-17 |
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| DE3900648A1 (de) | 1990-07-12 |
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| EP0378203A2 (de) | 1990-07-18 |
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