JPH0717672B2 - コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体 - Google Patents
コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体Info
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- JPH0717672B2 JPH0717672B2 JP2002635A JP263590A JPH0717672B2 JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2 JP 2002635 A JP2002635 A JP 2002635A JP 263590 A JP263590 A JP 263590A JP H0717672 B2 JPH0717672 B2 JP H0717672B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規のコバラミン−酸ヒドラジド、殊にシア
ノコバラミン−酸ヒドラジド、その製造法およびそれか
ら誘導されたコバラミン接合体に関する。
ノコバラミン−酸ヒドラジド、その製造法およびそれか
ら誘導されたコバラミン接合体に関する。
従来の技術 コバラミン(ビタミンB12)の免疫学的測定は、通常、
試料のコバラミンおよび放射性標識されるコバラミンを
コバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質(内因子)
について協同させる(RIA試験)競合的試験で行なわれ
る。固体相を液状相と分離した後、2つの相の一方の中
でその中に含有されている放射性標識物質の量から試料
中に含有されているコバラミンの量を測定することがで
きる。
試料のコバラミンおよび放射性標識されるコバラミンを
コバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質(内因子)
について協同させる(RIA試験)競合的試験で行なわれ
る。固体相を液状相と分離した後、2つの相の一方の中
でその中に含有されている放射性標識物質の量から試料
中に含有されているコバラミンの量を測定することがで
きる。
RIA試験の公知の欠点(例えば、放射能の負荷、廃棄)
のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代えるこ
とが望まれている。
のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代えるこ
とが望まれている。
例えば、免疫原としての蛋白質−ビタミンB12接合体を
製造することが記載されている公知のカップリング技術
(H.Gershman.他、Archives of Biochemistry and Biop
hysics 153、(1972)、407;D.F.M.v.d.Wiel他、Clin.C
him.Acta56(1974)、143;D.B.Endres他、Clin.Chem.24
/3(1978)、460;米国特許第3981863号明細書参照)に
よれば、安定なB12誘導体は導かれない。また、B12−酵
素接合体を製造するための相応する方法も記載されてい
る。
製造することが記載されている公知のカップリング技術
(H.Gershman.他、Archives of Biochemistry and Biop
hysics 153、(1972)、407;D.F.M.v.d.Wiel他、Clin.C
him.Acta56(1974)、143;D.B.Endres他、Clin.Chem.24
/3(1978)、460;米国特許第3981863号明細書参照)に
よれば、安定なB12誘導体は導かれない。また、B12−酵
素接合体を製造するための相応する方法も記載されてい
る。
このようにして得られたB12誘導体は、加水分解に敏感
であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能で
ある。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。
であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能で
ある。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。
発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、前記欠点を示さず、かつ簡単で再現可
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミン−酸誘導体を提供することである。
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミン−酸誘導体を提供することである。
課題を解決するための手段 この課題は、本発明により設定された新規のコバラミン
酸−ヒドラジドで解決される。
酸−ヒドラジドで解決される。
本発明の対象は、式(I): B−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (I) [式中、Bはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
て形成された基を表わし、Rは1個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、xは0または1であ
る]で示されるコバラミン−酸ヒドラジドである。
て形成された基を表わし、Rは1個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、xは0または1であ
る]で示されるコバラミン−酸ヒドラジドである。
有利に、Bはシアノ−コバラミンから誘導された基B12
であり、特に有利には、このヒドラジドは、式(II): B−d−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (II) [式中、B、Rおよびxは前記のものを表わし、dは−
CO−NH−NH−を表わす]を有する。この化合物の場合、
−R−CO−は、基−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−
CO−(但し、nは1、2または3である)を表わし、殊
にこれは、式:B12−d−CO−NH−NH2[式中、B12および
dは前記のものを表わす]に相当するか、または式:B12
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−
CO−NH−NH2[式中、B12およびdは前記のものを表わ
し、nは1、2または3である]に相当する。
であり、特に有利には、このヒドラジドは、式(II): B−d−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (II) [式中、B、Rおよびxは前記のものを表わし、dは−
CO−NH−NH−を表わす]を有する。この化合物の場合、
−R−CO−は、基−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−
CO−(但し、nは1、2または3である)を表わし、殊
にこれは、式:B12−d−CO−NH−NH2[式中、B12および
dは前記のものを表わす]に相当するか、または式:B12
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−
CO−NH−NH2[式中、B12およびdは前記のものを表わ
し、nは1、2または3である]に相当する。
本発明によれば、次式: [式中、R1は個々のコバラミンを区別する種々の基を表
わす(但し、シアノコバラミンに対しては、R1はCNであ
る;例えば、Rmpps,Chemie−Lexikon、第2巻、第8
版、1981、Franckn′sche Verlagshandlung Stuttgar
t、第784頁参照)]で示されるコバラミンの酸アミド基
−CO−NH2から得られた遊離カルボキシル基は、一般式
(I)のヒドラジドに変換される。
わす(但し、シアノコバラミンに対しては、R1はCNであ
る;例えば、Rmpps,Chemie−Lexikon、第2巻、第8
版、1981、Franckn′sche Verlagshandlung Stuttgar
t、第784頁参照)]で示されるコバラミンの酸アミド基
−CO−NH2から得られた遊離カルボキシル基は、一般式
(I)のヒドラジドに変換される。
遊離カルボキシル基への酸アミド基−CO−NH2の変換
は、自体公知の方法で酸鹸化および遊離カルボン酸の単
離によって行なわれる(R.YamadaおよびH.P.C.Hogenkam
p、J.Biol.Chem.1972(247)6266〜6270;D.L.Anton他、
J.Amer.Chem.Soc.102(1980)、2215参照)。有利に
は、相応するカルボキシル基の1個のみかまたは若干の
数が遊離されるようにするために、コバラミン分子中に
存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成が達成されるよ
うに作業する。次に、こうして得られた混合物から自体
公知の方法で、遊離カルボキシル基が一定の位置に存在
しているような化合物を単離することができる。特に、
遊離カルボキシル基を有する化合物は、d位(コバラミ
ンの前記式参照)で単離される。更に、この遊離カルボ
ン酸は、後反応によって一般式(I)の相応するヒドラ
ジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混合物
の形成下にコバラミン−カルボン酸の混合物から出発す
ることも可能である。しかし、イミノアッセイに使用す
るためのコバラミン接合体を製造するために、測定法の
感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯1つの
精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルボン酸を
相応する定義された純粋なヒドラジドに変換するのが好
ましい。
は、自体公知の方法で酸鹸化および遊離カルボン酸の単
離によって行なわれる(R.YamadaおよびH.P.C.Hogenkam
p、J.Biol.Chem.1972(247)6266〜6270;D.L.Anton他、
J.Amer.Chem.Soc.102(1980)、2215参照)。有利に
は、相応するカルボキシル基の1個のみかまたは若干の
数が遊離されるようにするために、コバラミン分子中に
存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成が達成されるよ
うに作業する。次に、こうして得られた混合物から自体
公知の方法で、遊離カルボキシル基が一定の位置に存在
しているような化合物を単離することができる。特に、
遊離カルボキシル基を有する化合物は、d位(コバラミ
ンの前記式参照)で単離される。更に、この遊離カルボ
ン酸は、後反応によって一般式(I)の相応するヒドラ
ジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混合物
の形成下にコバラミン−カルボン酸の混合物から出発す
ることも可能である。しかし、イミノアッセイに使用す
るためのコバラミン接合体を製造するために、測定法の
感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯1つの
精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルボン酸を
相応する定義された純粋なヒドラジドに変換するのが好
ましい。
相応するヒドラジドへの遊離カルボン酸の変換は、自体
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミン−モノカルボン酸は、例えばN−エチル
−N′−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド
のようなカルボジイミドおよび相応するヒドラジン化合
物との反応によって式(I)のカルボン酸ヒドラジドに
変換することができる。xが1であるような一般式
(I)の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Bに結合した基を段階的に、例えばB−COOH→B−
CO−NH−NH−R−COOH→B−CO−NH−NH−R−CO−NH−
NH2の順序で構成させることによって行なうことができ
るか、または化合物H2N−NH−R−CO−NH−NH2、例えば
トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
(TEDEH)との反応によって行なうことができる。この
場合、反応条件は、このような反応のために知られた常
用の条件に相応する。
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミン−モノカルボン酸は、例えばN−エチル
−N′−(ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド
のようなカルボジイミドおよび相応するヒドラジン化合
物との反応によって式(I)のカルボン酸ヒドラジドに
変換することができる。xが1であるような一般式
(I)の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Bに結合した基を段階的に、例えばB−COOH→B−
CO−NH−NH−R−COOH→B−CO−NH−NH−R−CO−NH−
NH2の順序で構成させることによって行なうことができ
るか、または化合物H2N−NH−R−CO−NH−NH2、例えば
トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
(TEDEH)との反応によって行なうことができる。この
場合、反応条件は、このような反応のために知られた常
用の条件に相応する。
従って、本発明の対象は、式(I)の本発明によるコバ
ラミン−酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式:B−COOHのコバラミン−カルボン酸中でカルボ
キシル基を自体公知の方法でヒドラジドとの反応によっ
て基 −CO−NH−NHCO−NH−NHxH に変換し、その際xが1である場合には、前記の基変換
の構成はB−COOH→B−CO−NH−NH−R−COOH→B−CO
−NH−NH−R−C−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に
有利なものとして記載した式(I)の本発明による化合
物が得られる。
ラミン−酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式:B−COOHのコバラミン−カルボン酸中でカルボ
キシル基を自体公知の方法でヒドラジドとの反応によっ
て基 −CO−NH−NHCO−NH−NHxH に変換し、その際xが1である場合には、前記の基変換
の構成はB−COOH→B−CO−NH−NH−R−COOH→B−CO
−NH−NH−R−C−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に
有利なものとして記載した式(I)の本発明による化合
物が得られる。
式(I)の本発明によるカルボン酸ヒドラジドは、良好
に単離可能で特性決定可能の安定な化合物であり、この
化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定性
を有する。
に単離可能で特性決定可能の安定な化合物であり、この
化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定性
を有する。
式(I)の本発明によるコバラミンとヒドラジドの中、
コバラミン基Bがメチルコバラミンまたは殊にシアノコ
バラミンB12の基を表わすようなものが有利である。酸
ヒドラジド基−CO−NH−NH−は、特にb位、e位および
殊にd位(コリン基本骨格中の−CH2−CH2−CO−NH2基
の3位、13位および殊に8位に相当する)に存在する。
コバラミン基Bがメチルコバラミンまたは殊にシアノコ
バラミンB12の基を表わすようなものが有利である。酸
ヒドラジド基−CO−NH−NH−は、特にb位、e位および
殊にd位(コリン基本骨格中の−CH2−CH2−CO−NH2基
の3位、13位および殊に8位に相当する)に存在する。
特に、基−R−CO−は、アルキレン基が1個またはそれ
以上のヘテロ原子、殊にNH基またはO原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルボン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−R−COは、ポリアル
キレングリコール−ジカルボン酸、ポリエーテルポリオ
ール−ジカルボン酸またはポリエステルポリオール−ジ
カルボン酸から誘導されたジアシル基および第1にトリ
エチレングリコール−ジ酢酸(TEDE)から誘導された
式: −CH−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO− [式中、nは3である]で示されるジアシル基であり、
但し、nが1または2であるジアシル基であってもよ
い。
以上のヘテロ原子、殊にNH基またはO原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルボン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−R−COは、ポリアル
キレングリコール−ジカルボン酸、ポリエーテルポリオ
ール−ジカルボン酸またはポリエステルポリオール−ジ
カルボン酸から誘導されたジアシル基および第1にトリ
エチレングリコール−ジ酢酸(TEDE)から誘導された
式: −CH−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO− [式中、nは3である]で示されるジアシル基であり、
但し、nが1または2であるジアシル基であってもよ
い。
式(I)の本発明による化合物の中、殊にコバラミン/
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第1にB12−d−CO−NH−NH2およびB12−d−CO−N
H−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−NH2
(但し、nは1または2および殊に3である)を挙げる
ことができる。
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第1にB12−d−CO−NH−NH2およびB12−d−CO−N
H−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−NH2
(但し、nは1または2および殊に3である)を挙げる
ことができる。
式(I)の本発明によるコバラミン−酸ヒドラジドは、
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわ
ち、式(I)のコバラミンは、例えば直接に高い収量
で、例えばペルオキシダーゼ(POD)のようなグリコ蛋
白質の酸化されたグリコシル基にカップリングすること
ができる。この場合には、加水分解安定性である良好に
特性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合
には、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免
疫学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の
場合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Rで延長させ
ることによってなお高めることができる(式III、x=
1参照)。こうして、例えば抗体へのコバラミン−ヒド
ラジド(ハプテン成分)の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわ
ち、式(I)のコバラミンは、例えば直接に高い収量
で、例えばペルオキシダーゼ(POD)のようなグリコ蛋
白質の酸化されたグリコシル基にカップリングすること
ができる。この場合には、加水分解安定性である良好に
特性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合
には、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免
疫学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の
場合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Rで延長させ
ることによってなお高めることができる(式III、x=
1参照)。こうして、例えば抗体へのコバラミン−ヒド
ラジド(ハプテン成分)の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。
従って、本発明の対象は、一般式(III): B−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (III) [式中、B、Rおよびxは請求項1記載のものを表わ
し、GPはグリコシル基を介して−NH−N=−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす]で示され
るコバラミン接合体でもある。
し、GPはグリコシル基を介して−NH−N=−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす]で示され
るコバラミン接合体でもある。
特に、Bは、シアノ基−コバラミンから誘導された基B1
2であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式(I
V): B−d−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (IV) を有する。
2であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式(I
V): B−d−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (IV) を有する。
この化合物の場合、−R−CO−は、基: −CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO [但し、nは1、2または3である]を意味し、殊にこ
れは、式: B12−d−CO−NH−N=GPまたは式: B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−N=GP [但し、nは1、2または3である]に相当する。
れは、式: B12−d−CO−NH−N=GPまたは式: B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO−CH2−CO−NH−N=GP [但し、nは1、2または3である]に相当する。
グリコ蛋白質基GPは、とにかく適当なグリコ蛋白質また
はグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、
グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導すること
ができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は、
前記に有利に記載したコバラミン−酸ヒドラジドから誘
導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標識
化酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)および
殊にペロキシダーゼ(POD)が使用される。イムノアッ
セイーに使用するための適性に関連して、第1には次の
ものが記載される:B12−d−CO−NH−N=GPおよび B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO −CH2−CO−NH−N=GP 但し、nは1または2および殊に3である。
はグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質、
グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導すること
ができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は、
前記に有利に記載したコバラミン−酸ヒドラジドから誘
導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標識
化酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)および
殊にペロキシダーゼ(POD)が使用される。イムノアッ
セイーに使用するための適性に関連して、第1には次の
ものが記載される:B12−d−CO−NH−N=GPおよび B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2nO −CH2−CO−NH−N=GP 但し、nは1または2および殊に3である。
式(III)の本発明によるコバラミン接合体の製造は、
式(I)のコバラミン−酸ヒドラジドをグリコ蛋白質の
グリコシル基のOH基と、酸化およびヒドラゾン基−NH−
N=CH−グリコ蛋白質の形成の後にカップリング(縮
合)することによって行なうことができる。この場合、
反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造にとって
常用の条件に相当する。
式(I)のコバラミン−酸ヒドラジドをグリコ蛋白質の
グリコシル基のOH基と、酸化およびヒドラゾン基−NH−
N=CH−グリコ蛋白質の形成の後にカップリング(縮
合)することによって行なうことができる。この場合、
反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造にとって
常用の条件に相当する。
式(III)の本発明によるコバラミン接合体は、ビタミ
ンB12の免疫学的測定の際に使用するのに特に適当であ
る。殊に、B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−C
H2 3O−CH2−CO−NH−N=GPの本発明によるシアノ−
コバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンB12を再
現可能に迅速で簡単に実施すべき測定(ビタミンB12−
イムノアッセイ)は、高い感度および正確さをもって可
能である。この種の測定法は、本願と同一の出願日で本
願と同一人の西ドイツ国特許出願第3900650号明細書
(発明の名称:ビタミン−B12の測定法)に記載の対象
であり、その内容は、本願の対象である。
ンB12の免疫学的測定の際に使用するのに特に適当であ
る。殊に、B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−C
H2 3O−CH2−CO−NH−N=GPの本発明によるシアノ−
コバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンB12を再
現可能に迅速で簡単に実施すべき測定(ビタミンB12−
イムノアッセイ)は、高い感度および正確さをもって可
能である。この種の測定法は、本願と同一の出願日で本
願と同一人の西ドイツ国特許出願第3900650号明細書
(発明の名称:ビタミン−B12の測定法)に記載の対象
であり、その内容は、本願の対象である。
しかし、本発明によるコバラミン接合体を、ビタミンB1
2を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンB12の代
わりに使用することも可能である。この種の適当なラジ
オイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオケミス
トリー(Clinical Biochemistry)18(1985)261−26
6、米国特許第3981863号明細書、クリニカ・シミカ・ア
クタ(Clinica Chimica Acta)56(1974)143−149、Li
t.Clin.Path.20(1967)683−686、Brit.J.Hmat.22
(1972)、21−31に記載されている。
2を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンB12の代
わりに使用することも可能である。この種の適当なラジ
オイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオケミス
トリー(Clinical Biochemistry)18(1985)261−26
6、米国特許第3981863号明細書、クリニカ・シミカ・ア
クタ(Clinica Chimica Acta)56(1974)143−149、Li
t.Clin.Path.20(1967)683−686、Brit.J.Hmat.22
(1972)、21−31に記載されている。
次の実施例および特徴は、本発明をさらに詳説するもの
である。
である。
実施例 例1: トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジド
(TEDEH)の製造 TEDEHを次の反応工程により製造した: a)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−第三ブチ
ルエステル(2) 無水トリエチレングリコール(1)33g(0.22モル)を
無水ジオキサン300mlに溶解し、この溶液に攪拌しなが
ら室温で滴下法で水素化ナトリウム12g(0.4モル)(パ
ラフィン油20%を含有する)を添加する。この場合に
は、約45℃への弱い昇温が起こる。この懸濁液を室温で
3時間攪拌する。その後に、氷冷却下に1時間で臭化酢
酸−第三ブチルエステル78g(0.4モル)を滴加させる。
この懸濁液を室温でさらに16時間攪拌する。引続き、沈
澱したNaBrを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプ
による真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステ
ル0.5に溶解し、この溶液を水0.5で洗浄し、有機相
をNa2SO4 30gで乾燥する。この溶液を約100mlの残存容
量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲルカラム(8.5×5
5cm)上に載せる。酢酸エステルで溶離し、個々の画分
を分析薄層クロマトグラフィーによって試験する(珪酸
ゲル、流展剤:酢酸エステル)。ポリエチレングリコー
ル誘導体含有画分をドラ−ゲンドルフ(Dragendorff)
試薬(K.Thoma他、Sci.Pharm.32(1964)、216参照)を
用いる噴霧によって目で見ることができるようにする。
生成物(2)(Rf=0.60)を含有する画分を合わせ、か
つ水ポンプで蒸発濃縮する。
(TEDEH)の製造 TEDEHを次の反応工程により製造した: a)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−第三ブチ
ルエステル(2) 無水トリエチレングリコール(1)33g(0.22モル)を
無水ジオキサン300mlに溶解し、この溶液に攪拌しなが
ら室温で滴下法で水素化ナトリウム12g(0.4モル)(パ
ラフィン油20%を含有する)を添加する。この場合に
は、約45℃への弱い昇温が起こる。この懸濁液を室温で
3時間攪拌する。その後に、氷冷却下に1時間で臭化酢
酸−第三ブチルエステル78g(0.4モル)を滴加させる。
この懸濁液を室温でさらに16時間攪拌する。引続き、沈
澱したNaBrを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプ
による真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステ
ル0.5に溶解し、この溶液を水0.5で洗浄し、有機相
をNa2SO4 30gで乾燥する。この溶液を約100mlの残存容
量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲルカラム(8.5×5
5cm)上に載せる。酢酸エステルで溶離し、個々の画分
を分析薄層クロマトグラフィーによって試験する(珪酸
ゲル、流展剤:酢酸エステル)。ポリエチレングリコー
ル誘導体含有画分をドラ−ゲンドルフ(Dragendorff)
試薬(K.Thoma他、Sci.Pharm.32(1964)、216参照)を
用いる噴霧によって目で見ることができるようにする。
生成物(2)(Rf=0.60)を含有する画分を合わせ、か
つ水ポンプで蒸発濃縮する。
収量:無色の油状物19.2g(理論値の23%)。
b)トリエチレングリコール−ジ酢酸(3) エステル(2)18.9g(50ミリモル)を室温でトリフル
オロ酢酸30mlに溶解し、かつ2時間攪拌する。この溶液
を水流ポンプによる真空中で35℃で蒸発濃縮し、残留物
を3回それぞれジエチルエーテル100ml宛で蒸解し、か
つ45℃で高真空中で乾燥する。生成物(3)を後生成す
ることなしにさらに使用する。
オロ酢酸30mlに溶解し、かつ2時間攪拌する。この溶液
を水流ポンプによる真空中で35℃で蒸発濃縮し、残留物
を3回それぞれジエチルエーテル100ml宛で蒸解し、か
つ45℃で高真空中で乾燥する。生成物(3)を後生成す
ることなしにさらに使用する。
収量:無色の油状物11.2g(理論値の84%)。
DC:珪酸ゲル、流展剤:酢酸エステル/メタノール=4/
1:Rf=0.08。
1:Rf=0.08。
c)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−(BOC−
ヒドラジド)(4) ジカルボン酸(3)8.0g(30ミルモル)をN−ヒドロキ
シスクシンイミド8.28g(72ミルモル)と一緒に無水テ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、この溶液に無水テト
ラヒドロフラン50ml中のN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド14.8g(72ミルモル)を水浴による冷却下に2
0℃で添加する。この溶液を室温で20時間攪拌させ、そ
の後に沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真
空中で蒸発濃縮する。粘稠な残留物を酢酸エステル100m
lに溶解し、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮す
る。この最後の過程をなお2回繰り返し、次に残留物を
イソプロパノール50mlで蒸解し、引続き高真空中で乾燥
する。得られた粘稠な油状物(約9g)を無水クロロホル
ム60mlに溶解し、この溶液に攪拌しながら室温で第三ブ
チルカルバザート(BOC−ヒドラジン)7.9g(60ミルモ
ル)を添加する。最初に少し昇温する反応混合物を室温
で20時間攪拌させる。その後に、2回それぞれ水100ml
宛で洗浄し、Na2SO4 5gで乾燥し、この溶液を水流ポン
プによる真空中で蒸発濃縮する。
ヒドラジド)(4) ジカルボン酸(3)8.0g(30ミルモル)をN−ヒドロキ
シスクシンイミド8.28g(72ミルモル)と一緒に無水テ
トラヒドロフラン200mlに溶解し、この溶液に無水テト
ラヒドロフラン50ml中のN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド14.8g(72ミルモル)を水浴による冷却下に2
0℃で添加する。この溶液を室温で20時間攪拌させ、そ
の後に沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真
空中で蒸発濃縮する。粘稠な残留物を酢酸エステル100m
lに溶解し、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮す
る。この最後の過程をなお2回繰り返し、次に残留物を
イソプロパノール50mlで蒸解し、引続き高真空中で乾燥
する。得られた粘稠な油状物(約9g)を無水クロロホル
ム60mlに溶解し、この溶液に攪拌しながら室温で第三ブ
チルカルバザート(BOC−ヒドラジン)7.9g(60ミルモ
ル)を添加する。最初に少し昇温する反応混合物を室温
で20時間攪拌させる。その後に、2回それぞれ水100ml
宛で洗浄し、Na2SO4 5gで乾燥し、この溶液を水流ポン
プによる真空中で蒸発濃縮する。
収量:粘稠な淡黄色の油状物9.2g(理論値の60%)。
DC:珪酸ゲル、流展剤:酢酸エステル/メタノール=4/
1;Rf=0.52。
1;Rf=0.52。
d)トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビス−ヒドラジ
ド塩酸塩(5) 化合物(4)5.1g(10ミリモル)をトリフルオル酢酸20
mlに溶解し、この溶液を室温で2時間攪拌する。その後
に、この溶液を35℃で水流ポンプによる真空中で蒸発濃
縮し、残流物を無水酢酸80mlに溶解し、かつ0℃で冷却
下に10分間HClガスを溶液に導通する。この場合には、
固体のカルボン酸ヒドラジド塩酸塩(5)の沈澱物が形
成する。この懸濁液を0℃で2時間放置させ、引続き吸
引濾過し、かつ得られた吸湿性塩を無水酢酸40mlで洗浄
する。この塩を乾燥器中で高真空下にCaCl2上で乾燥す
る。
ド塩酸塩(5) 化合物(4)5.1g(10ミリモル)をトリフルオル酢酸20
mlに溶解し、この溶液を室温で2時間攪拌する。その後
に、この溶液を35℃で水流ポンプによる真空中で蒸発濃
縮し、残流物を無水酢酸80mlに溶解し、かつ0℃で冷却
下に10分間HClガスを溶液に導通する。この場合には、
固体のカルボン酸ヒドラジド塩酸塩(5)の沈澱物が形
成する。この懸濁液を0℃で2時間放置させ、引続き吸
引濾過し、かつ得られた吸湿性塩を無水酢酸40mlで洗浄
する。この塩を乾燥器中で高真空下にCaCl2上で乾燥す
る。
収量:淡褐色の粉末2.8g(理論値の75%)。
DC:珪酸ゲル、n−ブタノール/氷酢酸/水=50/15/25;
Rf=0.45。
Rf=0.45。
例2: シアノコバラミン−d−酸ヒドラジド(B12−d−CO−N
H−NH2) シアノコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド/水=1:1の混合物に溶解し、
この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH 1モ
ル/lでpH6に調節する。この溶液にN−エチル−N′−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩(ED
C)77mg(0.4ミリモル)およびヒドラジニウムスルフェ
ート650mg(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHでさ
らに調節し、引続き反応容器を暗くし、溶液を室温で攪
拌する。6〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞ
れN−ヒドロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを
反応溶液に添加し、この場合には、そのつどpH価を6に
後調節する。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発
濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン10mlで蒸解し、か
つ吸引漏斗により吸引濾過する。固体の残留物を水10ml
に溶解し、この溶液をクロマトグラフィーカラム(物
質:スチロールジビニルベンゾール共重合体)アンバー
ライト(Amberlite)−XAD−2(V=100ml)上に載せ
る。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗浄し、引
続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離する。溶液を
水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水100m
lに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowex)−1x2−
カラム(酸性イオン交換体、アセテート形、80ml)上に
与える。最終生成物を水250mlで溶離し、この場合に
は、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリ
ウム緩衝液0.04モル/1(pH4.7)で溶離する。生成物を
含有する画分を合わせ、かつ親液性化する。
H−NH2) シアノコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド/水=1:1の混合物に溶解し、
この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH 1モ
ル/lでpH6に調節する。この溶液にN−エチル−N′−
ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩(ED
C)77mg(0.4ミリモル)およびヒドラジニウムスルフェ
ート650mg(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHでさ
らに調節し、引続き反応容器を暗くし、溶液を室温で攪
拌する。6〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞ
れN−ヒドロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを
反応溶液に添加し、この場合には、そのつどpH価を6に
後調節する。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発
濃縮し、残留物をテトラヒドロフラン10mlで蒸解し、か
つ吸引漏斗により吸引濾過する。固体の残留物を水10ml
に溶解し、この溶液をクロマトグラフィーカラム(物
質:スチロールジビニルベンゾール共重合体)アンバー
ライト(Amberlite)−XAD−2(V=100ml)上に載せ
る。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗浄し、引
続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離する。溶液を
水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水100m
lに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowex)−1x2−
カラム(酸性イオン交換体、アセテート形、80ml)上に
与える。最終生成物を水250mlで溶離し、この場合に
は、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリ
ウム緩衝液0.04モル/1(pH4.7)で溶離する。生成物を
含有する画分を合わせ、かつ親液性化する。
収量:桜色の粉末84mg(理論値の60%)。
同様にして、メチルコバラミン−d−酸から出発し、メ
チルコバラミン−d−酸ヒドラジドが得られる。
チルコバラミン−d−酸ヒドラジドが得られる。
例3: シアノコバラミン−d−酸ヒドラジド−POD−接合体(B
12−d−CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mg(POD、EC 1.1
1.1.7)を酢酸ナトリウム緩衝液4.5ml 0.03モル/l pH
5.5に溶解する。ナトリウムペリオダート溶液0.6ml 0.
2モル/l(酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)
を添加し、かつ室温で1時間攪拌させる。その後に、こ
の溶液をセファデックス(Sephadex)−G−25−カラム
(モレキュラーシーブ、V=50ml)上に載せ、かつ酢酸
ナトリウム緩衝液0.03モル/l(ph5.5)で溶離する(403
nmでの検知)。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例2から
のB12−d−CO−NH−NH2を添加する。室温で16時間攪拌
し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)−AcA−202カラ
ム(モレキュラーシーブ、V=80ml)上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶
離する(検知ν=403nm)。最終生成物を含有する画分
を合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性
化する。
12−d−CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mg(POD、EC 1.1
1.1.7)を酢酸ナトリウム緩衝液4.5ml 0.03モル/l pH
5.5に溶解する。ナトリウムペリオダート溶液0.6ml 0.
2モル/l(酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)
を添加し、かつ室温で1時間攪拌させる。その後に、こ
の溶液をセファデックス(Sephadex)−G−25−カラム
(モレキュラーシーブ、V=50ml)上に載せ、かつ酢酸
ナトリウム緩衝液0.03モル/l(ph5.5)で溶離する(403
nmでの検知)。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例2から
のB12−d−CO−NH−NH2を添加する。室温で16時間攪拌
し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)−AcA−202カラ
ム(モレキュラーシーブ、V=80ml)上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶
離する(検知ν=403nm)。最終生成物を含有する画分
を合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性
化する。
収量:26mg(理論値の87%)。
例4: シアンコバラミン−d−酸−TEDEH(B12−d−CO−NH−
NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2−CO−NH−NH2)
の製造 シアンコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド−水1:1の混合物10mlに溶解
し、この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH1
モル/lでpH5.5に調節する。この溶液にN−エチル−
N′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩
(EDC)77mg(0.4ミリモル)およびTEDEH塩酸塩1.84g
(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHで後調節し、引
続き反応容器を暗くし、この溶液を室温で攪拌する。6
〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞれN−ヒド
ロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを反応溶液に
添加し、この場合には、そのつどpH価を5.5に後調節す
る。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、
残留物をアセトン10mlで溶解し、溶剤をデカントする。
殆ど固体の残留物を水10mlに溶解し、この溶液をアンバ
ーライト(Amberlite)−XAD−2カラム(V=100ml)
上に載せる。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗
浄し、引続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離す
る。溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留
物を水100mlに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowe
x)−1x2−カラム(アセテート形、80ml)上に与える。
最終生成物を水250mlで溶離し、この場合には、未反応
の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリウム緩衝液
0.04モル/l(pH4.7)で溶離する。生成物を含有する画
分を合わせ、かつ親液性化する。
NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2−CO−NH−NH2)
の製造 シアンコバラミン−d−酸135mg(0.1ミリモル)をN−
ヒドロキシスクシンイミド46mg(0.4ミリモル)と一緒
にジメチルホルムアミド−水1:1の混合物10mlに溶解
し、この溶液にNaCN98mgを添加する。この溶液をNaOH1
モル/lでpH5.5に調節する。この溶液にN−エチル−
N′−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩
(EDC)77mg(0.4ミリモル)およびTEDEH塩酸塩1.84g
(5ミリモル)を添加する。pH価をNaOHで後調節し、引
続き反応容器を暗くし、この溶液を室温で攪拌する。6
〜14時間の間隔をもって、全部で5回それぞれN−ヒド
ロキシスクシンイミド46mgおよびEDC77mgを反応溶液に
添加し、この場合には、そのつどpH価を5.5に後調節す
る。4日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、
残留物をアセトン10mlで溶解し、溶剤をデカントする。
殆ど固体の残留物を水10mlに溶解し、この溶液をアンバ
ーライト(Amberlite)−XAD−2カラム(V=100ml)
上に載せる。塩の形の不純物を水300mlでカラムから洗
浄し、引続き粗製生成物をメタノール300mlで溶離す
る。溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留
物を水100mlに溶解し、この溶液をダウエックス(Dowe
x)−1x2−カラム(アセテート形、80ml)上に与える。
最終生成物を水250mlで溶離し、この場合には、未反応
の酸がカラム上に残存し、引続き酢酸ナトリウム緩衝液
0.04モル/l(pH4.7)で溶離する。生成物を含有する画
分を合わせ、かつ親液性化する。
収量:桜色の易吸湿性粉末75mg(理論値の46%)。
同様にして、メチルコバラミン−d−酸から出発し、メ
チルコバラミン−d−酸が得られる。
チルコバラミン−d−酸が得られる。
例5: シアノコバラミン−d−酸−TEDEH−POD−接合体(B12
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2−
CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mgを酢酸ナトリウ
ム緩衝液4.5ml0.03モル/l pH5.5に溶解する。ナトリウ
ムペルヨーダート溶液0.6ml 0.2モル/l(酢酸ナトリウ
ム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)を添加し、かつ室温で
1時間攪拌させる。その後に、この溶液をセファデック
ス(Sephadex)−G−25−カラム(V=50ml)上に載
せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l(pH5.5)で
溶離する(ν=403nmでの検知)。蛋白質含有画分を合
わせ、かつ例4からのヒドラジド2.7mgを添加する。室
温で16時間攪拌し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)
−AcA−202カラム(V=80ml)上に載せる。この混合物
を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶離する
(ν=403nmでの検知)。最終生成物を含有する画分を
合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性化
する。
−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH2−
CO−NH−N=POD)の製造 オランダガラシ−ペルオキシダーゼ30mgを酢酸ナトリウ
ム緩衝液4.5ml0.03モル/l pH5.5に溶解する。ナトリウ
ムペルヨーダート溶液0.6ml 0.2モル/l(酢酸ナトリウ
ム緩衝液0.03モル/l pH5.5中)を添加し、かつ室温で
1時間攪拌させる。その後に、この溶液をセファデック
ス(Sephadex)−G−25−カラム(V=50ml)上に載
せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l(pH5.5)で
溶離する(ν=403nmでの検知)。蛋白質含有画分を合
わせ、かつ例4からのヒドラジド2.7mgを添加する。室
温で16時間攪拌し、混合物をウルトロゲル(Ultrogel)
−AcA−202カラム(V=80ml)上に載せる。この混合物
を酢酸ナトリウム緩衝液0.03モル/l pH5.5で溶離する
(ν=403nmでの検知)。最終生成物を含有する画分を
合わせ、6時間水に対して透析し、かつ引続き親液性化
する。
収量:27mg(理論値の90%)。
POD接合体を製造するための前記例3および5に記載に
方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素、
例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)の使用下に相応
する接合体を製造することができる。
方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素、
例えばアルカリ性ホスファターゼ(AP)の使用下に相応
する接合体を製造することができる。
例6: シアノコバラミン−d−モノカルボン酸−POD−接合体
(比較化合物)の製造 製造は、Clin.Chim.Acta.56(1974)、143−149の記載
のように行なう。
(比較化合物)の製造 製造は、Clin.Chim.Acta.56(1974)、143−149の記載
のように行なう。
そのために、B12−モノカルボン酸をジャーナル・オブ
・ズィ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ(J.Am.Che
m.Soc.)102(1980)2215の記載のように製造する。
・ズィ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ(J.Am.Che
m.Soc.)102(1980)2215の記載のように製造する。
POD100mgおよびビタミンB12 10mgを燐酸塩緩衝液2.5ml
(0.07モル/l、pH8.2)に溶解し、この溶液にカルボジ
イミド25mgを添加する。この溶液を4℃で72時間攪拌
し、引続き脱イオン水に対して72時間透析する。
(0.07モル/l、pH8.2)に溶解し、この溶液にカルボジ
イミド25mgを添加する。この溶液を4℃で72時間攪拌
し、引続き脱イオン水に対して72時間透析する。
接合体の精製は、例5の記載のように行なわれる。
例7: ビタミンB12 a)試料の調製 ヒト血清250μを分解試薬125μ(NaOH 0.5モル/l
に溶解したリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlか
らなる)と混合し、かつ室温で15分間恒温保持する。引
続き燐酸塩緩衝液125μ、200ミリモル/l、pH4.1を添
加する。
に溶解したリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlか
らなる)と混合し、かつ室温で15分間恒温保持する。引
続き燐酸塩緩衝液125μ、200ミリモル/l、pH4.1を添
加する。
b)試薬 テルモ(Thermo)−RSAストレプタビジン(Streptavidi
n)で被覆されたポリスチロール小管(欧州特許出願公
開第0269092号明細書の記載により製造) 試薬1 ビタミンB12に対するビオチニル化されたモノクロナー
ル抗体95ng/ml(JACS100(1978)3585−3590の記載によ
るビオチニル化)。
n)で被覆されたポリスチロール小管(欧州特許出願公
開第0269092号明細書の記載により製造) 試薬1 ビタミンB12に対するビオチニル化されたモノクロナー
ル抗体95ng/ml(JACS100(1978)3585−3590の記載によ
るビオチニル化)。
適当なモノクロナール抗体を生産するツェリニーンは、
European Collection of Animal Ce11 Culture(ECAC
C)Porton Down,GBに番号EC ACC 88101301およびECAC
C88101302で寄託されている。
European Collection of Animal Ce11 Culture(ECAC
C)Porton Down,GBに番号EC ACC 88101301およびECAC
C88101302で寄託されている。
燐酸塩緩衝液40イリモル/l、pH7.2。
試薬2 B12−d−CO−NH−NH−CO−CH2O−CH2−CH2 3O−CH
2−CO−NH−N=POD(活性約20mU/ml) 燐酸塩緩衝液40ミリモル/l、pH7.2 試薬3 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液100ミリモル/l、pH4.4。
2−CO−NH−N=POD(活性約20mU/ml) 燐酸塩緩衝液40ミリモル/l、pH7.2 試薬3 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液100ミリモル/l、pH4.4。
ABTS(2,2″−アジノ−ジ[3−エチル−ベンズチアゾ
リン−スルホネート])1.9ミリモル/l ペルオキシ硼酸ナトリウム3.2ミリモル/l。
リン−スルホネート])1.9ミリモル/l ペルオキシ硼酸ナトリウム3.2ミリモル/l。
c)測定の実施 測定を実施するために、試料200μを試薬800μと一
緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温で60分間恒
温保持する。引続き、洗浄液(塩化ナトリウム250mg/m
l、硫酸銅1mg/ml)で洗浄し、試薬2 1000μを添加
し、かつ室温で30分間恒温保持する。洗浄液(塩化ナト
リウム250mg/ml、硫酸銅1mg/100ml)で洗浄し、かつ試
薬3 1000μを添加し、室温で30分間恒温保持し、形
成された色を420nmでのビタミンB12含量のための尺度と
して定める。
緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温で60分間恒
温保持する。引続き、洗浄液(塩化ナトリウム250mg/m
l、硫酸銅1mg/ml)で洗浄し、試薬2 1000μを添加
し、かつ室温で30分間恒温保持する。洗浄液(塩化ナト
リウム250mg/ml、硫酸銅1mg/100ml)で洗浄し、かつ試
薬3 1000μを添加し、室温で30分間恒温保持し、形
成された色を420nmでのビタミンB12含量のための尺度と
して定める。
第1図は、この場合に得られた校正曲線を例6による試
験のための校正曲線と比較して示す。校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム0.9%、
クロテインC0.9%および塩化カリウム0.1%と一緒の燐
酸塩緩衝液40ミリモル/1、pH7.2中のシアノコバラミン
からなる標準を使用する。
験のための校正曲線と比較して示す。校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム0.9%、
クロテインC0.9%および塩化カリウム0.1%と一緒の燐
酸塩緩衝液40ミリモル/1、pH7.2中のシアノコバラミン
からなる標準を使用する。
例8: ビタミンB12の測定(比較例) ビタミンB12の測定を例7の記載と同様にして実施し、
この場合には例7に記載の標準を使用する。試薬2で使
用した本発明による接合体の代わりに、約90mU/mlの活
性を有する例6によるPOD接合体を使用する。第1図
は、例7と例8によるビタミンB12を測定した校正曲線
の比較を示す。それによれば、例6による接合体を用い
た場合には高い活性にも拘束わらず本発明による接合体
を用いた場合よりも平らな校正曲線が得られることが判
明する。
この場合には例7に記載の標準を使用する。試薬2で使
用した本発明による接合体の代わりに、約90mU/mlの活
性を有する例6によるPOD接合体を使用する。第1図
は、例7と例8によるビタミンB12を測定した校正曲線
の比較を示す。それによれば、例6による接合体を用い
た場合には高い活性にも拘束わらず本発明による接合体
を用いた場合よりも平らな校正曲線が得られることが判
明する。
第1図は、例5に記載の本発明によるB12−酵素接合体
の使用下でのビタミンB12の酵素イムノアッセイ(曲線
2、活性20mU/ml)と、例6に記載の接合体の使用下で
の試験(曲線1、活性90mU/ml)の校正曲線の比較を示
す。測定波長:425nm、E:吸光度。
の使用下でのビタミンB12の酵素イムノアッセイ(曲線
2、活性20mU/ml)と、例6に記載の接合体の使用下で
の試験(曲線1、活性90mU/ml)の校正曲線の比較を示
す。測定波長:425nm、E:吸光度。
フロントページの続き (72)発明者 クリスチアン・クライン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・ブリユ ーテンシユトラーセ 16 (72)発明者 コンラート・キユルツインガー ドイツ連邦共和国トウツチング・グレーバ ーヴエーク 5
Claims (4)
- 【請求項1】式(I): B−CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH (I) 〔式中、Bはコバラミンから−CONH2−基の分解によっ
て形成された基を表わし、Rは1個またはそれ以上のヘ
テロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラルキレ
ン基またはアリーレン基を表わし、xは0または1であ
る〕で示されるコバラミン−酸ヒドラジド。 - 【請求項2】請求項1記載の式(I)のコバラミン−酸
ヒドラジドを製造する方法において、式:B−COOHのコバ
ラミン−カルボン酸中でカルボキシル基を自体公知の方
法でヒドラジドとの反応によって基 −CO−NH−NHR−CO−NH−NHxH に変換し、その際Xが1である場合には、前記の基変換
の構成はB−COOH→B−CO−NH−NH−R−COOH→B−CO
−NH−NH−R−C−NH−NH2の順序で行なうこともでき
ることを特徴とする、式(I)のコバラミン−酸ヒドラ
ジドの製造法。 - 【請求項3】式(III): B−CO−NHNH−R−CO−NHxN=GP (III) 〔式中、B、Rおよびxは請求項1記載のものを表わ
し、GPはグリコシル基を介して−NH−N=−基に結合し
ているグリコキル基含有蛋白質の基を表わす〕で示され
るコバラミン接合体。 - 【請求項4】トリエチレングリコール−ジ酢酸−ビスヒ
ドラジド(TEDEH)がスペーサー基として導入されてい
る、請求項3記載のコバラミン接合体。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3900648A DE3900648A1 (de) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | Neue cobalamin-saeurehydrazide und davon abgeleitete cobalamin-konjugate |
DE3900648.4 | 1989-01-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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JPH0717672B2 true JPH0717672B2 (ja) | 1995-03-01 |
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JP2002635A Expired - Lifetime JPH0717672B2 (ja) | 1989-01-11 | 1990-01-11 | コバラミン―酸ヒドラジド,その製造法およびコバラミン接合体 |
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DE4239815A1 (de) * | 1992-11-26 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate |
US5548064A (en) * | 1993-05-24 | 1996-08-20 | Biotech Australia Pty Limited | Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions |
US5840880A (en) * | 1994-04-08 | 1998-11-24 | Receptagen Corporation | Receptor modulating agents |
KR100361075B1 (ko) * | 1994-04-08 | 2003-04-10 | 리셉타겐 코포레이션 | 리셉터조절제및그와관련된방법 |
US5739287A (en) * | 1994-04-08 | 1998-04-14 | University Of Washington | Biotinylated cobalamins |
US5869465A (en) * | 1994-04-08 | 1999-02-09 | Receptagen Corporation | Methods of receptor modulation and uses therefor |
NZ323127A (en) * | 1995-10-19 | 2001-03-30 | Receptagen Corp | Vitamin B12 receptor modulating agents and methods related thereto |
US6326479B1 (en) | 1998-01-27 | 2001-12-04 | Boston Probes, Inc. | Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same |
JP4927560B2 (ja) * | 2003-12-22 | 2012-05-09 | ソリダゴ・アーゲー | 異常な細胞の増殖の診断および治療に有効なコバラミン誘導体 |
US9120858B2 (en) | 2011-07-22 | 2015-09-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antibodies to the B12-transcobalamin receptor |
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---|---|---|---|---|
IT1044233B (it) * | 1973-04-04 | 1980-03-20 | Zambelletti L S P A | Derivati della vitamina bi2 ad azione vitaminica di lunga durata |
US3981863A (en) * | 1975-02-25 | 1976-09-21 | Micromedic Diagonistics, Inc. | Cyanocobalamin derivatives |
US4334069A (en) * | 1978-07-24 | 1982-06-08 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates |
US4550163A (en) * | 1979-02-05 | 1985-10-29 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates |
EP0069450B1 (en) * | 1981-06-22 | 1985-04-10 | TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION (a New York corporation) | Labelled vitamin b12 derivatives, their preparation and use |
US4925931A (en) * | 1988-07-14 | 1990-05-15 | Mccully Kilmer S | N-homocysteine thiolactonyl retinamido cobalamin and methods of use thereof |
-
1989
- 1989-01-11 DE DE3900648A patent/DE3900648A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-05 US US07/461,215 patent/US5171679A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-10 EP EP90100462A patent/EP0378203B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-10 DE DE59010462T patent/DE59010462D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-10 AT AT90100462T patent/ATE141926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-11 JP JP2002635A patent/JPH0717672B2/ja not_active Expired - Lifetime
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EP0378203A3 (de) | 1992-10-14 |
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ATE141926T1 (de) | 1996-09-15 |
DE59010462D1 (de) | 1996-10-02 |
EP0378203A2 (de) | 1990-07-18 |
JPH02233693A (ja) | 1990-09-17 |
US5171679A (en) | 1992-12-15 |
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