JPH02233693A - コバラミン―酸ヒドラジド，その製造法およびコバラミン接合体 - Google Patents
コバラミン―酸ヒドラジド，その製造法およびコバラミン接合体Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明は、新規のコバラミンー酸ヒドラジド、殊にシア
ノコバラミンー酸ヒドラジドおよびそれから誘導された
コバラミン接合体に関する従来の技術 コバラミン（ビタミンＢｌ２）の免疫学的測定は、通常
、試料のコバラミンおよび放射性標識サレるコバラミン
をコバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質（内因子
）について協同させる（ＲＩＡ試験）競合的試験で行な
われる。 固体相を液状相と分離した後、２つの相の一方の中でそ
の中に含有されている放射性標識物質の量から試料中に
含有されているコバラミンの量を測定することができる
。 ＲＩＡ試験の公知の欠点（例えば、放射能の員荷、廃棄
）のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代える
ことが望まれている。 例えば、免疫原としての蛋白質−ビタミンＢｌ２接合体
を製造することが記載されている公知のカップリング技
術（ Ｈ．Ｇｅｒｓｈｍａｎ．他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃｓ ｌ ５ ３、（１９７２）、４ ０ ７
； Ｄ．Ｆ．Ｍ．ｖ．ｄ．Ｗｉｅｌ他、ＣＩｉｎ．Ｃ
ｈｉ＋＊．Ａｃｔａ ５ ６ （ １ ９ ７ ４
）、ｌ ４ ３ ； Ｄ．Ｂ．Ｅｎｄｒｅｓ他、 Ｃ１
ｉｎ．Ｃｈｅａ＋．２ ４ ／３ （１ ９ ７
８ ）、 ４ ６ ０；米国特許第３９８ １８
６３号明細書参照）によれば、安定なＢｌ２誘導体は導
かれない。また、Ｂｌ２−酵素接合体を製造するための
相応する方法も記載されている。 このようにして得られたＢｌ２誘導体は、加水分解に敏
感であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能
である。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。 発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、前記欠点を示さず、かつ簡単で再現可
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミンー酸誘導体を提供することである。 課題を解決するための手段 この課題は、本発明により設定された新規のコバラミン
酸−ヒドラジドで解決される。 本発明の対象は、式（Ｉ）： Ｂ−Ｇ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ＋Ｒ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ
Ｈ＋−ＨＸ （Ｉ） Ｅ式中、Ｂはコバラミンから一〇〇ＮＨＩ一基の分解に
よって形成された基を表わし、Ｒは結合基（スペーサー
）を表わし、Ｘは０またはｌである１で示されるコバラ
ミンー酸ヒドラジドである。 有利に、Ｂはシアノーコバラミンから誘導された基Ｂｌ
２であり、特に有利には、このヒドラジドは、式（■）
： Ｂ−ｄ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ＋Ｒ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ
−Ｎ Ｈ→ｉＨ （ｕ）
ノコバラミンー酸ヒドラジドおよびそれから誘導された
コバラミン接合体に関する従来の技術 コバラミン（ビタミンＢｌ２）の免疫学的測定は、通常
、試料のコバラミンおよび放射性標識サレるコバラミン
をコバラミンに対し固体相結合した結合蛋白質（内因子
）について協同させる（ＲＩＡ試験）競合的試験で行な
われる。 固体相を液状相と分離した後、２つの相の一方の中でそ
の中に含有されている放射性標識物質の量から試料中に
含有されているコバラミンの量を測定することができる
。 ＲＩＡ試験の公知の欠点（例えば、放射能の員荷、廃棄
）のために、放射性標識物質を酵素性標識物質に代える
ことが望まれている。 例えば、免疫原としての蛋白質−ビタミンＢｌ２接合体
を製造することが記載されている公知のカップリング技
術（ Ｈ．Ｇｅｒｓｈｍａｎ．他、Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃｓ ｌ ５ ３、（１９７２）、４ ０ ７
； Ｄ．Ｆ．Ｍ．ｖ．ｄ．Ｗｉｅｌ他、ＣＩｉｎ．Ｃ
ｈｉ＋＊．Ａｃｔａ ５ ６ （ １ ９ ７ ４
）、ｌ ４ ３ ； Ｄ．Ｂ．Ｅｎｄｒｅｓ他、 Ｃ１
ｉｎ．Ｃｈｅａ＋．２ ４ ／３ （１ ９ ７
８ ）、 ４ ６ ０；米国特許第３９８ １８
６３号明細書参照）によれば、安定なＢｌ２誘導体は導
かれない。また、Ｂｌ２−酵素接合体を製造するための
相応する方法も記載されている。 このようにして得られたＢｌ２誘導体は、加水分解に敏
感であり、かつ不安定な中間生成物としてのみ処方可能
である。従って、カップリング収量は、比較的僅かであ
り、概して再現するのが困難である。その上、酵素の支
障ある重合が副反応として起こる。 発明が解決しようとする課題 本発明の課題は、前記欠点を示さず、かつ簡単で再現可
能な方法で得ることができる、単離可能の安定なコバラ
ミンー酸誘導体を提供することである。 課題を解決するための手段 この課題は、本発明により設定された新規のコバラミン
酸−ヒドラジドで解決される。 本発明の対象は、式（Ｉ）： Ｂ−Ｇ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ＋Ｒ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ
Ｈ＋−ＨＸ （Ｉ） Ｅ式中、Ｂはコバラミンから一〇〇ＮＨＩ一基の分解に
よって形成された基を表わし、Ｒは結合基（スペーサー
）を表わし、Ｘは０またはｌである１で示されるコバラ
ミンー酸ヒドラジドである。 有利に、Ｂはシアノーコバラミンから誘導された基Ｂｌ
２であり、特に有利には、このヒドラジドは、式（■）
： Ｂ−ｄ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ＋Ｒ−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ
−Ｎ Ｈ→ｉＨ （ｕ）
【式中、Ｂ，ＲおよびＸは前
記のものを表わしｄはーＣｏ−ＮＨ−ＮＨ−を表わす】
を有する。 この化合物の場合、−Ｒ −Ｃ Ｏ−は、基−ｃｏ−Ｃ
Ｈ ２＋Ｏ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２鳶７０−Ｃ
Ｈ２−Ｃ Ｏ−（但し、ｎはｌ、２または３である）を
表わし、殊にこれは、式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｇｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨｉＥ式中、Ｂｌ．２およびｄは前記のものを表
わす１に相当するか、または式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＧＯ−ＣＨ２＋０−ＣＨ２−Ｃ．ｌ−
１２→『０−Ｃ Ｈ２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ２ ［
式中、Ｂｌ２およびｄは前記のものを表わし、ｎはｌ，
２または３である１に相当する。 本発明によれば、次式： ［式中、Ｒｌは個々のコバラミンを区別する種々の基を
表わす（但し、シアノコバラミンに対しては、Ｒ！はＣ
Ｎである；例えば、Ｒ６ｍｐｐｓ， Ｃｈｅｍｉｓ−Ｌ
ｅｘｉｋｏｎ，第２巻、第８版、ｌ ９ ８ １ ，
Ｆｒａｎｃｋｈ’ｓｃｈｅ Ｖａｒｌａｇｓｈａｎｄｌ
ｕｎｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，第７８４頁参照）］で示
されるコバラミンの酸アミド基−Ｃｏ−ＮＨ２から得ら
れた遊離力ルボキシル基、は、一般式（１）のヒドラジ
ドに変換される。 遊離力ルボキシル基への酸アミド基−ＣＯ−ＮＨ２の変
換は、自体公知の方法で酸酸化および遊離カルポン酸の
単離によって行なわれる（Ｒ．ＹａｍａｄａおよびＨ．
Ｐ．Ｃ．Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．１９７２（２４７）６２６６〜６２７０ ；Ｄ．
Ｌ．Ａｎｔｏｎ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
ｌ ０ ２ （ １ ９ ８ ０ ）、２２ｌ５参照
）。有利には、相応するカルボキシル基の１個のみかま
たは若干の数が遊離されるようにするために、コバラミ
ン分子中に存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成され
るように作業する。次に、こうして得られた混合物から
自体公知の方法で、遊離力ルボキシル基が一定の位置に
存在しているような化合物を単離することができる。特
に、遊離力ルボキシル基を有する化合物は、ｄ位（コバ
ラミンの前記式参照）で単離される。更に、この遊離カ
ルボン厳は、後反応によって一般式（Ｉ）の相応するヒ
ドラジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混
合物の形成下にコバラミンーカルボン酸の混合物から出
発することも可能である。しかし、イミノアッセイに使
用するためのコバラミン接合体を製造するＩ；めに、測
定法の感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯
１つの精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルポ
ン酸を相応する定義された純粋なヒドラジドに変換する
のが好ましい。 相応するヒドラジドへの遊離カルポン酸の変換は、自体
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミンーモノカルボン酸は、例えばＮ一エチル
−Ｎ′＝（ジメチルアミノプロピノレ）一カノレポジイ
ミドのようなカルポジイミドおよび相応するヒドラジン
化合物との反応によって式（１）のカルポン酸ヒドラジ
ドに変換することができる。Ｘが１であるような一般式
（１）の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Ｂに結合した基を段階的に、例えばＢ−ＣＯＯＨ−
Ｂ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ−ＣｏＯＨ−４Ｂ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨ−Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ２の順序で構成させる
ことによって行なうことができるか、または化合物Ｈ２
Ｎ−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２、例えばトリエチレ
ングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジド（ＴＥＤＥＨ
）との反応によって行なうことができる。この場合、反
応条件は、このような反応のために知られた常用の条件
に相応する。 従って、本発明の対象は、式（１）の本発明にヨルコバ
ラミンー酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式：Ｂ−ＣＯＯＨのコバラミンーカノレボン酸中
でカノレポキシノレ基を自体公知の方法でヒドラジドと
の反応によって基−ＣＯ一ＮＨ−ＮＨ＋ＣＯ−ＮＨ−Ｎ
Ｈ＋−Ｈに変換し、その際Ｘが１である場合には、前記
の基変換の構成は段階的に行なうこともできることを特
徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に有利なもの
として記載した式（Ｉ）の本発明による化合物が得られ
る。 式−ＣＩ）の本発明によるカルポン酸ヒドラジドは、良
好に単離可能で特性決定可能の安定な化金物であり、こ
の化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定
性を有する。 式（Ｉ）の本発明によるコバラミンヒドラジドの中、コ
バラミン基Ｂがメチルコバラミンまたは殊にシアノコバ
ラミンＢｌ２の基を表わすようなものが有利である。厳
ヒドラジド基−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−は、特にｂ位、ｅ位
および殊にｄ位（コリン基本骨格中の−Ｃ Ｈ２−Ｃ
Ｈ２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ２基の３位、１３位および殊に８
位に相当する）に存在する。 結合基（スペーサー）Ｒは、例えば１個またはそれ以上
のへテロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラル
キレン基またはアリーレン基であることができる。特に
、基−Ｒ−ＧＯ−はアルキレン基が１個まｔ；はそれ以
上のへテロ原子、殊にＮＨ基またはＯ原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルポン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−Ｒ−ＣＯは、ポリア
ルキレングリコールージカルポン酸、川リエーテノレポ
リオールージカノレボン酸またはポリエステルポリオー
ルージカルボン酸から誘導されたジアシル基および第１
にトリエチレングリコールージ酢酸（Ｔ Ｅ Ｄ Ｅ
）から誘導された式： −ＣＨ＜Ｈ２−←０−ＣＨ２−ＣＨ２→ｉｏ−ＣＨ２−
ＣＯ一Ｅ式中、ｎは３であるｌで示されるジアシル基で
あり、但し、ｎが１または２であるジアシル基であうて
もよい。 式（１）の本発明による化合物の中、殊にコバラミン／
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第ｌにＢｌ２−ｄ−ｃｏＮＨ−ＮＨ２およびＢ ｌ
２−ｄ−ＧＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ Ｏ −Ｃ Ｈ ２＋
０ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２増７０−ＣＨ２−ＣＯ−
ＮＨ−ＮＨ２（但し、ｎはｌまたは２および殊に３であ
る）を挙げることができる。 式（Ｉ）の本発明によるコバラミンー酸ヒドラジドは、
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわち
、式（１）のコバラミンは、例えば直接に高い収量で、
例えばベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）のようなグリコ蛋白
質の酸化されたグリコシル基にカップリングすることが
できる。この場合には、加水分解安定性である良好に特
性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合に
は、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免疫
学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の場
合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Ｒで延長させる
ことによってなお高めることができる（式１１Ｉ，ｘｘ
ｌ参照）。こうして、例えば抗体へのコバラミンーヒド
ラジド（ハプテン成分）の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。 従ってζ本発明の対象は、一般式（■）：Ｂ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ｅ−ＮＨ−Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−＋−Ｎ−ＧＰ （
１１）Ｌ式中、Ｂ，ＲおよびＸは請求項ｌ記載のものを
表わし、ＧＰはグリコシル基を介して一ＮＨ−Ｎ−一基
に結合しているグリコシル基含有蛋白質の基を表わす］
で示されるコバラミン接合体でもある。 特に、Ｂは、シアノ基−コバラミンから誘導された基Ｂ
ｌ２であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式（■
）： Ｂ−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ＋ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ＋−Ｎ−Ｇ
Ｐ （ＩＶ）を有する。 この化合物の楊合、−Ｒ −Ｃ Ｏ−は、基：一ＣＯ−
ＣＨ２ナ０−ＣＨ２−ＣＨ２づｒｏ −ＣＨ２ −ＣＯ
【但し、ｎはｌ，２または３であるｌを意味し、殊にこ
れは、式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｎ−ＧＰまたは式：Ｂ１
２−ｄ−ω−Ｎｕ−ＮＨ−ω−ｃｔｔ２＋ｏ−ｃｎ２−
ｃＨｇラ；７０−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＧＰ［但し
、ｉはｌ，２または３である］に相当する。 グリコ蛋白質基ＧＰは、とにかく適当なグリコ蛋白質ま
たはグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質
、グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導するこ
とができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は
、前記に有利に記載したコバラミンー酸ヒドラジドから
誘導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標
識化酵素、例えばアルカリ性ホス７アターゼ（ＡＰ）お
よび殊にベロキシダーゼ（ＰＯＤ）が使用される。イム
ノアッセイーに使用するための適性に関連して、第１に
は次のものが記載される： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−Ｎ＝ＧＰおよび Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨｇ＋Ｏ
−ＣＨｒＣＨ２升Ｏｎ −ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＧＰ 但し、ｎはｌまたは２および殊に３である。 式（ＩＩＩ）の本発明によるコバラミン接合体の製造は
、式（１）のコバラミンー酸ヒドラジドをグリコ蛋白質
のグリコシル基のＯＨ基と、酸化およびヒドラゾン基−
ＮＨ−Ｎ−ＣＨ−グリコ蛋白質の形成の後にカップリン
グ（縮合）することによって行なうことができる。この
場合、反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造に
とって常用の条件に相当する。 従って、本発明の対象は、一般式（１）の本発明による
コバラミンー酸ヒドラジドをグリコ蛋白質と、酸化され
た形で自体公知の方法でヒドラゾンの形成下に反応させ
ることを特徴とする、式（ＩＩＩ）のコバラミン接合体
の製造法でもある式（１）の本発明によるコバラミン接
合体は、ビタミンＢｌ２の免疫学的測定の際に使用する
のに特に適当である。殊に、Ｂｌ２−ｄ−ＣＯ−ＮＨ−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２＋Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２方０−Ｃ Ｈ
２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ − Ｇ Ｐの本発明によるシ
アノーコバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンＢ
１２を再現可能に迅速で簡単に実施すべき測定（ビタミ
ンＢｌ２−イムノアッセイ）は、高い感度および正確さ
をもって可能である。この種の測定法は、本願と同一の
出１日で本願と同一人の西ドイツ国特許出願第３９００
６５０号明細書（発明の名称：ビタミンーＢｌ２の測定
法）に記載の対象であり、その内容は、本願の対象であ
る。 しかし、本発明によるコバラミン接合体を、ビタミンＢ
ｌ２を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンＢｌ
２の代わりに使用することも可能である。この種の適当
なラジオイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオ
ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）上８ （１９８５）２６１−２６６、米国特許
第３９８ １８６３号明細書、クリ二カ・シミ力・アク
タ（ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ）５６
（１９７４） １４３ １４９、Ｌｉｔ
．ＣＩｉｎ．Ｐａｔｈ． ２ ０ （ １ ９ ６ ７
） ６ ８ ３一６８６、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｍａｔ
．２ ２ （ １ ９ ７ ２ ）、２１−３１に記載
されている。 次の実施例および特徴は、本発明をさらに詳説するもの
である。 実施例 例ｌ： トリエチレングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジド（
ＴＥＤＥＨ）の製造 ＴＥＤＥＨを次の反応工程により製造した弓ａ）トリエ
チレングリコールージ酢酸一ビスー第三ブチルエステル
（２） 無水トリエチレングリコール（１）３３９ （０．２
２モル）を無水ジオキサン３００ｍｉ２に溶解し、この
溶液に撹拌しながら室温で滴下法で水素化ナトリウム１
２ｇ（０．４モル）（パラフィン油２０％を含有する
）を添加する。この場合には、約４５℃への弱い昇温が
起こる。この懸濁液を室温で３時間撹拌する。その後に
、氷冷却下に１時間で臭化酢酸一第三ブチルエステル７
８９ （０．４モル）を滴加させる。この懸濁液を室
温でさらに１６時間撹拌する。引続き、沈澱し／：Ｎａ
Ｂｒを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプによる
真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステル０．
５Ｑに溶解し、この溶液を水０．５ａで洗浄し、有機相
をＮａ２ＳＯ４ ３０ｇで乾燥する。この溶液を約１０
０ｍＱ の残存容量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲ
ル力ラム（８．５Ｘ５５ｃｍ）上に載せる。酢酸エステ
ルで溶離し、個々の画分を分析薄層クロマトグラフィー
によって試験する（珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル）
．ポリエチレングリコール誘導体含有画分をドラーゲン
ドルフ（ Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ）試薬（Ｋ．Ｔｈｏ
ｍａ他、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．３ ２ （ １９６４）
、２１６参照）を用いる噴霧によって目で見ることがで
きるようにする。生成物（２）（Ｒｆ−０．６０）を含
有する両分を合わせかつ水ポンプで蒸発濃縮する。 収量：無色の油状物１９．２９ （理論値の２３％）
。 ｂ）｝リエチレングリコールージ酢酸（３）エステル（
２）１ ８．９９ （５ ０ミリモル）を室温でトリ
フルオル酢酸３０ｍＱに溶解し、かつ２時間撹拌する。 この溶液を水流ポンプによる真空中で３５゜Ｃで蒸発濃
縮し、残留物を３回それぞれジエチルエーテルｌ００ｒ
ｒｌ宛で蒸解し、かつ４５℃で高真空中で乾燥する。生
成物（３）を後生成することなしにさらに使用する。 収量．：無色の油状物１１．２＋；＋（理論値の８４％
）。 ＤＣ：珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール−
４／ｌ；Ｒｆ−０．０８。 ｃ）トリエチレングリコールージ酢酸−ビス−（ＢＯＣ
−ヒドラジド）（４） ジカルボン酸（３）８．０９ （３０ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド８．２８ｇ （７２ミリモル
）と一緒に無水テトラヒド口フラン２００ｍｌ２に溶解
し、この溶液に無水テトラヒド口７ラン５０ｍｆｆ中の
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシノレ力Ｊレポジイミド１４．
８ｇ （７２ミリモル）を水浴による冷却下に２０℃で
添加する。 この溶液ｆ室温で２０時間撹拌させ、その後に沈澱した
ジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真空中で蒸発濃縮
する。粘稠な残留物を酢酸エステル１００ｍ４に溶解し
、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮する。この最後
の過程をなお２回繰り返し、次に残留物をイソプロパノ
ール５０ｍｆｆで蒸解し、引続き高真空中で乾燥する。 得られた粘稠な油状物（約９９）を無水クロロホルム６
０ｍ（＋に溶解し、この溶液に撹拌しながら室温で第三
ブチルカルバザート（ＢＯＣ−ヒドラジン）７．９９
（６０ミリモル）を添加する。最初に少し昇温する反
応混合物を室温で２０時間撹拌させる。その後に、２回
それぞれ水１００ｍｌ２宛で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ ５
ｇで乾燥し、この溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発
濃縮する。 収量：粘稠な淡黄色の油状物９．２ｇ （理論値の６０
％）。 ＤＣ：珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール−
４／ｌ；Ｒｆ−０．５２。 ｄ）トリエチレングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジ
ド塩酸塩（５） 化合物（４）５．１ｇ （１０ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸２０ｍＱに溶解し、この溶液を室温で２時間撹拌
する。その後に、この溶液を３５℃で水流ポンプによる
真空中で蒸発濃縮し、残留物を無水酢酸３ＱｍＭに溶解
し、かつＯ゜Ｃで冷却下にＩＯ分間ＭＣＩガスを溶液に
導通する。この場合には、固体のカルボン酸ヒドラジド
塩酸塩（５）の沈澱物が形成する。この懸濁液を０゜０
で２時間放置させ、引続き吸引濾過し、かつ得られた吸
湿性塩を無水酢酸４０ｍＱで洗浄する。この塩を乾燥器
中で高真空下にＣａｃｌ２上で乾燥する。 収量：淡褐色の粉末２．８９ （理論値の７５％）。 ＤＣ：珪酸ゲル、ｎ−プタノール／氷酢酸／水−５０／
１５／２５ ；Ｒｆ−ｏ．４５。 例２： シアノコバラミンーｄ一酸ヒドラジド（Ｂ ｌ ２−ｄ
−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２） シアノコバラミンーｄ一酸１３５ｍｇ（０．１ミリモル
）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド４６ｍｙ （ ０
．４ミリモル）と一緒にジメチルホルムアミド／水＝ｌ
：ｌの混合物に溶解し、この溶液にＮａＣＮ９８ｍｇを
添加する。この溶液をＮａＯＨ ｌモル／ｌでｐＨ６
に調節する。この溶液にＮ一エチル−Ｎ′−ジメチルア
ミノプロピルー力ルポジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）７７ｍ
ｇ（０．４ミリモル）およびヒドラジニウムスルフ工一
ト６５０ｍｇ（５ミリモル）を添加する。 ｐＨ価をＮａＯＨでさらに調節し、引続き反応容器を暗
くし、溶液を室温で撹拌する。６〜１４時間の間隔をも
って、全部で５回それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇおよびＥＤＣ７７ｍｇを反応溶液に添加し、
この場合には、そのつどｐＨ価を６に後調節する。４日
間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、残留物を
テトラヒド口７ランｌＯｍｌ２で蒸解し、かつ吸引漏斗
により吸引濾過する。固体の残留物を水１０ｍＱに溶解
し、この溶液をクロマトグラ７イー力ラム（物質：スチ
ロールジビニルベンゾール共重合体）アンバーライト（
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）−ＸＡＤ−２（Ｖ− １ ０ ０
ｍｌ２ ）上に載せる。塩の形の不純物を水３００ｍｆ
ｆでカラムから洗浄し、引続き粗製生成物をメタノール
３００ｍｌ２で溶離する。溶液を水流ポンプによる真空
中で蒸発援縮し、残留物を水１００ｍｌ２に溶解し、こ
の溶液をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ）−１ ｘ ２一
カラム（酸性イオン交換体、アセテート形、８０ｍ（２
）上に与える。最終生成物を水２５０ｍαで溶離し、こ
の場合には、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢
酸ナトリウム緩衝液０．０４モル／ｌ（ｐＨ４．７）で
溶離する。生成物を含有する画分を合わせ、かつ親液性
化する。 収量：桜色の粉末８４ｍｇ（理論値の６０％）。 同様にして、メチルコバラミンーｄ一酸から出発し、メ
チルコバラミンーｄ一酸ヒドラジドが得られる。 例３： シアノコバラミンーｄ一酸ヒドラジドーＰＯＤ−接合体
（Ｂ ｌ ２−ｄ−ＧＯ−ＮＨ−Ｎ−ＰＯＤ）の製造 オランダガラシーペルオキシダーゼ３０ｍｇ（ＰＯＤ％
ＥＣ ｌ．ｌ１．１．７）を酢酸ナトリウム緩衝液４
．５ｍＱ０．０３モル／１ｐＨ５．５に溶解する。ナト
リウムペリオダート溶液０ ．６ ｍＱ ０ ．２モ
ル／ｌ（酢酸ナトリウム緩衝液０．０３モル／ｌ ｐ
Ｈ５．５中）を添加しかつ室温で１時間撹拌させる。そ
の後に、この溶液をセ７アデツクス（ Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘｌＧ − ２ ５ −カラム（モレキュラーシーブ、
Ｖ＝５０ｍａ）上に載せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液０
．０３モル／ｌ （ｐＨ５．５）で溶離する（４ ０
３ ｎｍでの検知）。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例
２からのＢ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ・−ＭＨＩを添加
する。室温で１６時間撹拌し、混合物をウルトロゲル（
Ｉｌｌｔｒｏｇｅｌ）−ＡｃＡ−２ ０ ２カラム（モ
レキュラーシーブ、Ｖ−８０ｍｌ２）上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液０．０３モル／１ ｐ
Ｈ５．５で溶離する（検知ν−４０３ｎｍ）。最終生成
物を含有する画分を合わせ、６時間水に対して透析し、
かつ引続き親液性化する。 収量：２６ｍｇ（理論値の８７％）。 例４： シアンコバラミンーｄ一酸一ＴＥＤＥＨ （Ｂ １ ２
−ｄ −Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ−Ｃ Ｏ−Ｃ Ｈ２賢
一０−ＣＨ２−ＣＨ２ ｈ Ｏ−ＣＨ２−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨ２）の製造シアンコバラミンーｄ一酸１３．５
ｍ９（０．１ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇ（０．４ミリモル）と一緒にジメチルホルム
アミドー水 ｌ：ｌの混合物１０ｍＱに溶解しこの溶液
にＮａＣＮ９８ｍ９を添加する。この溶液をＮａＯＨｌ
モル／１でｐ Ｈ ５ ．５に調節する。この溶液にＮ
一エチルーＮ′−ジメチルアミノブロビルー力ルポジイ
ミド塩酸塩（ＥＤＣ）７７ｍｇ（０．４ミリモル）およ
びＴＥＤＥＨ塩酸塩１．８４９ （５ミリモル）を添加
する。 ｐＨ価をＮａＯＨで後調節し、引続き反応容器を暗くし
、この溶液を室温で撹拌する。６〜１４時間の間隔をも
って、全部で５回それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇおよびＥＤＣ７７ｍ９を反応溶液に添加し、
この場合には、そのつとｐＨ価を５．５に後調節する。 ・４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、残
留物をアセトンｌＯｍ（Ｉで蒸解し、溶剤をデカントす
る。殆ど固体の残留物を水１０ｍＱに溶解し、この溶液
をアンバーライト（Ａａ＋ｂｅｒｌｉｔａ）−ＸＡＤ−
２カ５ム（Ｖ− １ ０ ０ｍｆｆ ）上に載せる。塩
の形の不純物を水３００ｍＱでカラムから洗浄し、引続
き粗製生成物をメタノール３００ｍａで溶離する。溶液
を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水１
００ｍ＜１に溶解し、この溶液をダウエックス（ Ｄｏ
ｗｅｘ ）− １ｘ２一カラム（アセテート形、８０ｍ
ｌ２）上に与える。最終生成物を水２５０ｍＱで溶離し
、この場合には、未反応の酸がカラム上に残存し、引続
き酢酸ナトリウム緩衝液０．０４モル／ｌ（ｐＨ４．７
）で溶離する。生成物を含有する両分を合わせ、かつ親
液性化する。 収量：桜色の易吸湿性粉末７５ｍｇ（理論値の４６％）
。 同様にして、メチルコバラミンーｄ一酸から出発し、メ
チルコバラミンーｄ一酸が得られる。 例５： シアノコバラミンーｄ一酸−ＴＥＤＥＨ−ＰＯＤ−接合
体（Ｂ ｌ ２ −ｄ −Ｇ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ−Ｃ
Ｏ−Ｃ Ｈｌ＋ ０ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２一つ
丁一〇−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ−ＰＯＤ）の製造 オランダガラシーベルオキシダーゼ３０ｍｇを酢酸ナト
リウム緩衝液４．５ｍＱ０．０３モル／ｐＨ５．５に溶
解する。ナトリウムペルヨーダート溶液０ ．６ ｍＱ
９ ．２モル／１ （酢酸ナトリウム緩衝液０．０
３モル／ｌ ｐＨ５．５中）を添加し、かつ室温で１
時間撹拌させる。 その後に、この溶液をセ７アデックス（ Ｓｅｐｈａｄ
ａｘ）−Ｇ−２５一カラム（Ｖ−５０ｍｌ２）上に載せ
、かつ酢最ナトリウム緩衝液０．０３モル／ｌ（ｐＨ５
．５）で溶離する（ｙ−４０３ｎｍでの検知）。蛋白質
含有画分を合わせ、かつ例４からのヒドラジド２ ．７
ｍ９を添加する。室温で１６時間撹拌し、混合物をウ
ルトロゲル（旧ｔ『ｏｇｅｌ）−ＡｃＡ−２ ０ ２カ
ラム（Ｖ＝８０ｍＱ）上に載せる。この混合物を酢酸ナ
トリウム緩衝液０．０３モル／Ｉ ｐＨ５．５で溶離
する（ν−４０３ｎｍでの検知）。最終生成物を含有す
る画分を合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き
親液性化する。 収量：２７ｍｇ（理論値の９０％）。 ＰＯＤ接合体を製造するための前記例３および５に記載
に方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素
、例えばアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の使用下に
相応する接合体を製造することができる。 例６： シアノコバラミンーｄ−モノ力ノレポン酸−ＰＯＤ−接
合体（比較化合物）の製造 製造は、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５ ６ （
１ ９ ７ ４ ）１４３−１４９の記載のように行な
う。 そのために，Ｂｌ２−モノカルポン酸をジャーナル・オ
ブ・ズイ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ｛ （Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）ｌ ０ ２ （ １ ９
８０）２２１５の記載のように製造する。 ＰＯＤ１００ｍｇおよびビタミンＢｌ２ １０ｍｇを
燐酸塩緩衝液２．５ｒｎＱ （０．０７モル／ｌ、ｐ
Ｈ８．２）に溶解し、この溶液にカルポジイミド２５ｍ
９を添加する。この溶液を４℃で７２時間撹拌し、引続
き脱イオン水に対して７２時間透析する。 接合体の精製は、例５の記載のように行なわれる。 例７： ビタミンＢｌ２ ａ）試料の調製 ヒト血清２５０μＱを分解試薬１２５μＱ （ＮａＯＨ
Ｏ．５モル／Ｉに溶解しｔ；リポン酸８ｍ９／ｍ１
２、シアン化カリウムＩｍｇ／ｒｒｌからなる）と混合
し、かつ室温で１５分間恒温保持する。引続き燐酸塩緩
衝液１２５μａ１２００ミリモル／１、ＰＨ４．１を添
加する。 ｂ）試薬 テノレモ（Ｔｈｅｒｍｏ）−Ｒ Ｓ Ａストレプタビジ
ン（Ｓｃｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で被覆されたポリスチ
ロール小管（欧州特許出願公開第０２６９０９２号明細
書の記載により製造） 試薬ｌ ビタミンＢｌ２に対するビオチニル化されたモノクロナ
ール抗体９ ５ ｎ ｇ／ ｍＱ （ＪＡＣＳＩ ０
０ （１９７８）３５８５−３５９０の記載によるビオ
チニル化）。 適当なモノクロナール抗体を生産するツエリニーンは、
Ｅｕｒｏｐｅａｎ ＣｏｌｌｅｃＬｉｏｎ ｏｒ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅ１１ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）Ｐ
ｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ．ＧＢに番号ＥＣＡＣＣ ８８
１０１３０１およびＥＣＡＣＣ８８ＪＯｌ３０２で寄託
されている。 燐酸塩緩衝液４０イリモル／１、ｐ Ｈ ７ ．２。 試薬２ Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２士〇
一ＣＨ２−ＣＨ２つ”−０−ＣＨ２〜Ｃｏ−ＮＨ−Ｎ＝
ＰＯＤ（活性約２０ｍＵ／ｍＱ） 燐酸塩緩衝液４０ミリモル／Ｉ，ｐＨ７．２試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液１００ミリモル／１ｐＨ４．
４。 ＡＢＴＳ （２．２’−アジノージ ［３−エチル
ーベンズチアゾリンースルホネート］）１．９ミリモル
／ｌ ペルオキシ硼酸ナトリウム３．２ミリモル／ｌＣ）測定
の実施 測定を実施するために、試料２００／Ｊｉ２を試薬８０
０μａと一緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温
で６０分間恒温保持する。引続き、洗浄液（塩化ナトリ
ウム２５０ｍｇ／ｍ（１、硫酸銅１ｍｇ／ｍｌ２）で洗
浄し、試薬２ １０００μＱを添加し、かつ室温で３
０分間恒温保持する。洗浄液（塩化ナトリウム２５０ｍ
ｓ／ｍＱ，硫酸銅１ ｍ９／ ｌ ０ ０ ｍｆｆ）で
洗浄し、がつ試薬３ １０００μＱを添加し、室温で
３０分間恒温保持し、形成された色を４２０ｎｍでのビ
タミンＢｌ２含量のための尺度として定める。 第ｌ図は、この場合に得られた校正曲線を例６による試
験のための校正曲線と比較して示す．校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム０．９％
、クロテインＣＯ．９％および塩化カリウム０．１％と
一緒の燐酸塩緩衝液４０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．２中の
シアノコバラミンからなる標準を使用する。 例８： ビタミンＢ１２の測定（比較例） ビタミンＢｌ２の測定を例７の記載と同様にして実施し
、この場合には例７に記載の標準を使用する。試薬２で
使用した本発明による接合体の代わりに、約９０ｍＵ／
ｍＱの活性を有する例６によるＰＯＤ接合体を使用する
。第１図は、例７と例８によるビタミンＢ１２を測定し
た校正曲線の比較を示す。それによれば、例６による接
合体を用いた場合には高い活性にも拘わらず本発明によ
る接合体を用いｔ；場合よりも平らな校正曲線が得られ
ることが判明する。
記のものを表わしｄはーＣｏ−ＮＨ−ＮＨ−を表わす】
を有する。 この化合物の場合、−Ｒ −Ｃ Ｏ−は、基−ｃｏ−Ｃ
Ｈ ２＋Ｏ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２鳶７０−Ｃ
Ｈ２−Ｃ Ｏ−（但し、ｎはｌ、２または３である）を
表わし、殊にこれは、式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｇｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨｉＥ式中、Ｂｌ．２およびｄは前記のものを表
わす１に相当するか、または式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＧＯ−ＣＨ２＋０−ＣＨ２−Ｃ．ｌ−
１２→『０−Ｃ Ｈ２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ２ ［
式中、Ｂｌ２およびｄは前記のものを表わし、ｎはｌ，
２または３である１に相当する。 本発明によれば、次式： ［式中、Ｒｌは個々のコバラミンを区別する種々の基を
表わす（但し、シアノコバラミンに対しては、Ｒ！はＣ
Ｎである；例えば、Ｒ６ｍｐｐｓ， Ｃｈｅｍｉｓ−Ｌ
ｅｘｉｋｏｎ，第２巻、第８版、ｌ ９ ８ １ ，
Ｆｒａｎｃｋｈ’ｓｃｈｅ Ｖａｒｌａｇｓｈａｎｄｌ
ｕｎｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，第７８４頁参照）］で示
されるコバラミンの酸アミド基−Ｃｏ−ＮＨ２から得ら
れた遊離力ルボキシル基、は、一般式（１）のヒドラジ
ドに変換される。 遊離力ルボキシル基への酸アミド基−ＣＯ−ＮＨ２の変
換は、自体公知の方法で酸酸化および遊離カルポン酸の
単離によって行なわれる（Ｒ．ＹａｍａｄａおよびＨ．
Ｐ．Ｃ．Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．１９７２（２４７）６２６６〜６２７０ ；Ｄ．
Ｌ．Ａｎｔｏｎ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
ｌ ０ ２ （ １ ９ ８ ０ ）、２２ｌ５参照
）。有利には、相応するカルボキシル基の１個のみかま
たは若干の数が遊離されるようにするために、コバラミ
ン分子中に存在する酸アミドの不完全な鹸化が達成され
るように作業する。次に、こうして得られた混合物から
自体公知の方法で、遊離力ルボキシル基が一定の位置に
存在しているような化合物を単離することができる。特
に、遊離力ルボキシル基を有する化合物は、ｄ位（コバ
ラミンの前記式参照）で単離される。更に、この遊離カ
ルボン厳は、後反応によって一般式（Ｉ）の相応するヒ
ドラジドに変換される。また、相応するヒドラジドの混
合物の形成下にコバラミンーカルボン酸の混合物から出
発することも可能である。しかし、イミノアッセイに使
用するためのコバラミン接合体を製造するＩ；めに、測
定法の感度、しかも有利には全ての場合に関連して、唯
１つの精製されたカルボン酸から出発しかつこのカルポ
ン酸を相応する定義された純粋なヒドラジドに変換する
のが好ましい。 相応するヒドラジドへの遊離カルポン酸の変換は、自体
公知の処理方法を使用しながら行なうことができる。特
に、コバラミンーモノカルボン酸は、例えばＮ一エチル
−Ｎ′＝（ジメチルアミノプロピノレ）一カノレポジイ
ミドのようなカルポジイミドおよび相応するヒドラジン
化合物との反応によって式（１）のカルポン酸ヒドラジ
ドに変換することができる。Ｘが１であるような一般式
（１）の化合物の製造は、自体公知の方法を使用しなが
ら、Ｂに結合した基を段階的に、例えばＢ−ＣＯＯＨ−
Ｂ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ−ＣｏＯＨ−４Ｂ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨ−Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ２の順序で構成させる
ことによって行なうことができるか、または化合物Ｈ２
Ｎ−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２、例えばトリエチレ
ングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジド（ＴＥＤＥＨ
）との反応によって行なうことができる。この場合、反
応条件は、このような反応のために知られた常用の条件
に相応する。 従って、本発明の対象は、式（１）の本発明にヨルコバ
ラミンー酸ヒドラジドを製造する方法でもあり、この方
法は、式：Ｂ−ＣＯＯＨのコバラミンーカノレボン酸中
でカノレポキシノレ基を自体公知の方法でヒドラジドと
の反応によって基−ＣＯ一ＮＨ−ＮＨ＋ＣＯ−ＮＨ−Ｎ
Ｈ＋−Ｈに変換し、その際Ｘが１である場合には、前記
の基変換の構成は段階的に行なうこともできることを特
徴とする。殊に、本発明方法によれば、次に有利なもの
として記載した式（Ｉ）の本発明による化合物が得られ
る。 式−ＣＩ）の本発明によるカルポン酸ヒドラジドは、良
好に単離可能で特性決定可能の安定な化金物であり、こ
の化合物は、耐久性であり、したがって良好な貯蔵安定
性を有する。 式（Ｉ）の本発明によるコバラミンヒドラジドの中、コ
バラミン基Ｂがメチルコバラミンまたは殊にシアノコバ
ラミンＢｌ２の基を表わすようなものが有利である。厳
ヒドラジド基−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−は、特にｂ位、ｅ位
および殊にｄ位（コリン基本骨格中の−Ｃ Ｈ２−Ｃ
Ｈ２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ２基の３位、１３位および殊に８
位に相当する）に存在する。 結合基（スペーサー）Ｒは、例えば１個またはそれ以上
のへテロ原子を有していてもよいアルキレン基、アラル
キレン基またはアリーレン基であることができる。特に
、基−Ｒ−ＧＯ−はアルキレン基が１個まｔ；はそれ以
上のへテロ原子、殊にＮＨ基またはＯ原子によって中断
されていてもよいアルキレンジカルポン酸から誘導され
たジアシル基を表わす。殊に、基−Ｒ−ＣＯは、ポリア
ルキレングリコールージカルポン酸、川リエーテノレポ
リオールージカノレボン酸またはポリエステルポリオー
ルージカルボン酸から誘導されたジアシル基および第１
にトリエチレングリコールージ酢酸（Ｔ Ｅ Ｄ Ｅ
）から誘導された式： −ＣＨ＜Ｈ２−←０−ＣＨ２−ＣＨ２→ｉｏ−ＣＨ２−
ＣＯ一Ｅ式中、ｎは３であるｌで示されるジアシル基で
あり、但し、ｎが１または２であるジアシル基であうて
もよい。 式（１）の本発明による化合物の中、殊にコバラミン／
蛋白質接合体を製造するための該化合物の使用に関連し
て、第ｌにＢｌ２−ｄ−ｃｏＮＨ−ＮＨ２およびＢ ｌ
２−ｄ−ＧＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ Ｏ −Ｃ Ｈ ２＋
０ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２増７０−ＣＨ２−ＣＯ−
ＮＨ−ＮＨ２（但し、ｎはｌまたは２および殊に３であ
る）を挙げることができる。 式（Ｉ）の本発明によるコバラミンー酸ヒドラジドは、
活性化されたコバラミンの新規の形を表わす。すなわち
、式（１）のコバラミンは、例えば直接に高い収量で、
例えばベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）のようなグリコ蛋白
質の酸化されたグリコシル基にカップリングすることが
できる。この場合には、加水分解安定性である良好に特
性決定可能の定義された接合体が得られる。この場合に
は、同時に免疫学的入手可能性は極めて高い。この免疫
学的入手可能性は、本発明によるコバラミン接合体の場
合には、ヒドラゾ官能基をスペーサー基Ｒで延長させる
ことによってなお高めることができる（式１１Ｉ，ｘｘ
ｌ参照）。こうして、例えば抗体へのコバラミンーヒド
ラジド（ハプテン成分）の結合能は、なおさらに上昇さ
せることができる。 従ってζ本発明の対象は、一般式（■）：Ｂ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ｅ−ＮＨ−Ｒ−Ｃｏ−ＮＨ−＋−Ｎ−ＧＰ （
１１）Ｌ式中、Ｂ，ＲおよびＸは請求項ｌ記載のものを
表わし、ＧＰはグリコシル基を介して一ＮＨ−Ｎ−一基
に結合しているグリコシル基含有蛋白質の基を表わす］
で示されるコバラミン接合体でもある。 特に、Ｂは、シアノ基−コバラミンから誘導された基Ｂ
ｌ２であり、殊に有利には、このヒドラジドは、式（■
）： Ｂ−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ＋ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−ＮＨ＋−Ｎ−Ｇ
Ｐ （ＩＶ）を有する。 この化合物の楊合、−Ｒ −Ｃ Ｏ−は、基：一ＣＯ−
ＣＨ２ナ０−ＣＨ２−ＣＨ２づｒｏ −ＣＨ２ −ＣＯ
【但し、ｎはｌ，２または３であるｌを意味し、殊にこ
れは、式： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｎ−ＧＰまたは式：Ｂ１
２−ｄ−ω−Ｎｕ−ＮＨ−ω−ｃｔｔ２＋ｏ−ｃｎ２−
ｃＨｇラ；７０−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＧＰ［但し
、ｉはｌ，２または３である］に相当する。 グリコ蛋白質基ＧＰは、とにかく適当なグリコ蛋白質ま
たはグリコプロテイド、例えば血清蛋白質、血漿蛋白質
、グリコ酵素、抗体、ムコプロテイド等から誘導するこ
とができる。好ましい本発明によるコバラミン接合体は
、前記に有利に記載したコバラミンー酸ヒドラジドから
誘導されたものである。グリコ蛋白質としては、特に標
識化酵素、例えばアルカリ性ホス７アターゼ（ＡＰ）お
よび殊にベロキシダーゼ（ＰＯＤ）が使用される。イム
ノアッセイーに使用するための適性に関連して、第１に
は次のものが記載される： Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−Ｎ＝ＧＰおよび Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨｇ＋Ｏ
−ＣＨｒＣＨ２升Ｏｎ −ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＧＰ 但し、ｎはｌまたは２および殊に３である。 式（ＩＩＩ）の本発明によるコバラミン接合体の製造は
、式（１）のコバラミンー酸ヒドラジドをグリコ蛋白質
のグリコシル基のＯＨ基と、酸化およびヒドラゾン基−
ＮＨ−Ｎ−ＣＨ−グリコ蛋白質の形成の後にカップリン
グ（縮合）することによって行なうことができる。この
場合、反応条件は、縮合反応によるヒドラゾンの製造に
とって常用の条件に相当する。 従って、本発明の対象は、一般式（１）の本発明による
コバラミンー酸ヒドラジドをグリコ蛋白質と、酸化され
た形で自体公知の方法でヒドラゾンの形成下に反応させ
ることを特徴とする、式（ＩＩＩ）のコバラミン接合体
の製造法でもある式（１）の本発明によるコバラミン接
合体は、ビタミンＢｌ２の免疫学的測定の際に使用する
のに特に適当である。殊に、Ｂｌ２−ｄ−ＣＯ−ＮＨ−
ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２＋Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２方０−Ｃ Ｈ
２−Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ − Ｇ Ｐの本発明によるシ
アノーコバラミン接合体の使用下で、例えばビタミンＢ
１２を再現可能に迅速で簡単に実施すべき測定（ビタミ
ンＢｌ２−イムノアッセイ）は、高い感度および正確さ
をもって可能である。この種の測定法は、本願と同一の
出１日で本願と同一人の西ドイツ国特許出願第３９００
６５０号明細書（発明の名称：ビタミンーＢｌ２の測定
法）に記載の対象であり、その内容は、本願の対象であ
る。 しかし、本発明によるコバラミン接合体を、ビタミンＢ
ｌ２を測定する公知方法で放射線活性標識ビタミンＢｌ
２の代わりに使用することも可能である。この種の適当
なラジオイムノアッセイは、例えばクリニカル・バイオ
ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）上８ （１９８５）２６１−２６６、米国特許
第３９８ １８６３号明細書、クリ二カ・シミ力・アク
タ（ＣｌｉｎｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ）５６
（１９７４） １４３ １４９、Ｌｉｔ
．ＣＩｉｎ．Ｐａｔｈ． ２ ０ （ １ ９ ６ ７
） ６ ８ ３一６８６、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｍａｔ
．２ ２ （ １ ９ ７ ２ ）、２１−３１に記載
されている。 次の実施例および特徴は、本発明をさらに詳説するもの
である。 実施例 例ｌ： トリエチレングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジド（
ＴＥＤＥＨ）の製造 ＴＥＤＥＨを次の反応工程により製造した弓ａ）トリエ
チレングリコールージ酢酸一ビスー第三ブチルエステル
（２） 無水トリエチレングリコール（１）３３９ （０．２
２モル）を無水ジオキサン３００ｍｉ２に溶解し、この
溶液に撹拌しながら室温で滴下法で水素化ナトリウム１
２ｇ（０．４モル）（パラフィン油２０％を含有する
）を添加する。この場合には、約４５℃への弱い昇温が
起こる。この懸濁液を室温で３時間撹拌する。その後に
、氷冷却下に１時間で臭化酢酸一第三ブチルエステル７
８９ （０．４モル）を滴加させる。この懸濁液を室
温でさらに１６時間撹拌する。引続き、沈澱し／：Ｎａ
Ｂｒを吸引漏斗により分離し、濾液を水流ポンプによる
真空中で蒸発濃縮する。油状残留物を酢酸エステル０．
５Ｑに溶解し、この溶液を水０．５ａで洗浄し、有機相
をＮａ２ＳＯ４ ３０ｇで乾燥する。この溶液を約１０
０ｍＱ の残存容量になるまで蒸発濃縮し、かつ珪酸ゲ
ル力ラム（８．５Ｘ５５ｃｍ）上に載せる。酢酸エステ
ルで溶離し、個々の画分を分析薄層クロマトグラフィー
によって試験する（珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル）
．ポリエチレングリコール誘導体含有画分をドラーゲン
ドルフ（ Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ）試薬（Ｋ．Ｔｈｏ
ｍａ他、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．３ ２ （ １９６４）
、２１６参照）を用いる噴霧によって目で見ることがで
きるようにする。生成物（２）（Ｒｆ−０．６０）を含
有する両分を合わせかつ水ポンプで蒸発濃縮する。 収量：無色の油状物１９．２９ （理論値の２３％）
。 ｂ）｝リエチレングリコールージ酢酸（３）エステル（
２）１ ８．９９ （５ ０ミリモル）を室温でトリ
フルオル酢酸３０ｍＱに溶解し、かつ２時間撹拌する。 この溶液を水流ポンプによる真空中で３５゜Ｃで蒸発濃
縮し、残留物を３回それぞれジエチルエーテルｌ００ｒ
ｒｌ宛で蒸解し、かつ４５℃で高真空中で乾燥する。生
成物（３）を後生成することなしにさらに使用する。 収量．：無色の油状物１１．２＋；＋（理論値の８４％
）。 ＤＣ：珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール−
４／ｌ；Ｒｆ−０．０８。 ｃ）トリエチレングリコールージ酢酸−ビス−（ＢＯＣ
−ヒドラジド）（４） ジカルボン酸（３）８．０９ （３０ミリモル）をＮ−
ヒドロキシスクシンイミド８．２８ｇ （７２ミリモル
）と一緒に無水テトラヒド口フラン２００ｍｌ２に溶解
し、この溶液に無水テトラヒド口７ラン５０ｍｆｆ中の
Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシノレ力Ｊレポジイミド１４．
８ｇ （７２ミリモル）を水浴による冷却下に２０℃で
添加する。 この溶液ｆ室温で２０時間撹拌させ、その後に沈澱した
ジシクロヘキシル尿素を濾別し、かつ真空中で蒸発濃縮
する。粘稠な残留物を酢酸エステル１００ｍ４に溶解し
、この溶液を濾過し、かつ再び蒸発濃縮する。この最後
の過程をなお２回繰り返し、次に残留物をイソプロパノ
ール５０ｍｆｆで蒸解し、引続き高真空中で乾燥する。 得られた粘稠な油状物（約９９）を無水クロロホルム６
０ｍ（＋に溶解し、この溶液に撹拌しながら室温で第三
ブチルカルバザート（ＢＯＣ−ヒドラジン）７．９９
（６０ミリモル）を添加する。最初に少し昇温する反
応混合物を室温で２０時間撹拌させる。その後に、２回
それぞれ水１００ｍｌ２宛で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４ ５
ｇで乾燥し、この溶液を水流ポンプによる真空中で蒸発
濃縮する。 収量：粘稠な淡黄色の油状物９．２ｇ （理論値の６０
％）。 ＤＣ：珪酸ゲル、流展剤：酢酸エステル／メタノール−
４／ｌ；Ｒｆ−０．５２。 ｄ）トリエチレングリコールージ酢酸−ビスーヒドラジ
ド塩酸塩（５） 化合物（４）５．１ｇ （１０ミリモル）をトリフルオ
ル酢酸２０ｍＱに溶解し、この溶液を室温で２時間撹拌
する。その後に、この溶液を３５℃で水流ポンプによる
真空中で蒸発濃縮し、残留物を無水酢酸３ＱｍＭに溶解
し、かつＯ゜Ｃで冷却下にＩＯ分間ＭＣＩガスを溶液に
導通する。この場合には、固体のカルボン酸ヒドラジド
塩酸塩（５）の沈澱物が形成する。この懸濁液を０゜０
で２時間放置させ、引続き吸引濾過し、かつ得られた吸
湿性塩を無水酢酸４０ｍＱで洗浄する。この塩を乾燥器
中で高真空下にＣａｃｌ２上で乾燥する。 収量：淡褐色の粉末２．８９ （理論値の７５％）。 ＤＣ：珪酸ゲル、ｎ−プタノール／氷酢酸／水−５０／
１５／２５ ；Ｒｆ−ｏ．４５。 例２： シアノコバラミンーｄ一酸ヒドラジド（Ｂ ｌ ２−ｄ
−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２） シアノコバラミンーｄ一酸１３５ｍｇ（０．１ミリモル
）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド４６ｍｙ （ ０
．４ミリモル）と一緒にジメチルホルムアミド／水＝ｌ
：ｌの混合物に溶解し、この溶液にＮａＣＮ９８ｍｇを
添加する。この溶液をＮａＯＨ ｌモル／ｌでｐＨ６
に調節する。この溶液にＮ一エチル−Ｎ′−ジメチルア
ミノプロピルー力ルポジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）７７ｍ
ｇ（０．４ミリモル）およびヒドラジニウムスルフ工一
ト６５０ｍｇ（５ミリモル）を添加する。 ｐＨ価をＮａＯＨでさらに調節し、引続き反応容器を暗
くし、溶液を室温で撹拌する。６〜１４時間の間隔をも
って、全部で５回それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇおよびＥＤＣ７７ｍｇを反応溶液に添加し、
この場合には、そのつどｐＨ価を６に後調節する。４日
間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、残留物を
テトラヒド口７ランｌＯｍｌ２で蒸解し、かつ吸引漏斗
により吸引濾過する。固体の残留物を水１０ｍＱに溶解
し、この溶液をクロマトグラ７イー力ラム（物質：スチ
ロールジビニルベンゾール共重合体）アンバーライト（
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）−ＸＡＤ−２（Ｖ− １ ０ ０
ｍｌ２ ）上に載せる。塩の形の不純物を水３００ｍｆ
ｆでカラムから洗浄し、引続き粗製生成物をメタノール
３００ｍｌ２で溶離する。溶液を水流ポンプによる真空
中で蒸発援縮し、残留物を水１００ｍｌ２に溶解し、こ
の溶液をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ ）−１ ｘ ２一
カラム（酸性イオン交換体、アセテート形、８０ｍ（２
）上に与える。最終生成物を水２５０ｍαで溶離し、こ
の場合には、未反応の酸がカラム上に残存し、引続き酢
酸ナトリウム緩衝液０．０４モル／ｌ（ｐＨ４．７）で
溶離する。生成物を含有する画分を合わせ、かつ親液性
化する。 収量：桜色の粉末８４ｍｇ（理論値の６０％）。 同様にして、メチルコバラミンーｄ一酸から出発し、メ
チルコバラミンーｄ一酸ヒドラジドが得られる。 例３： シアノコバラミンーｄ一酸ヒドラジドーＰＯＤ−接合体
（Ｂ ｌ ２−ｄ−ＧＯ−ＮＨ−Ｎ−ＰＯＤ）の製造 オランダガラシーペルオキシダーゼ３０ｍｇ（ＰＯＤ％
ＥＣ ｌ．ｌ１．１．７）を酢酸ナトリウム緩衝液４
．５ｍＱ０．０３モル／１ｐＨ５．５に溶解する。ナト
リウムペリオダート溶液０ ．６ ｍＱ ０ ．２モ
ル／ｌ（酢酸ナトリウム緩衝液０．０３モル／ｌ ｐ
Ｈ５．５中）を添加しかつ室温で１時間撹拌させる。そ
の後に、この溶液をセ７アデツクス（ Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘｌＧ − ２ ５ −カラム（モレキュラーシーブ、
Ｖ＝５０ｍａ）上に載せ、かつ酢酸ナトリウム緩衝液０
．０３モル／ｌ （ｐＨ５．５）で溶離する（４ ０
３ ｎｍでの検知）。蛋白質含有画分を合わせ、かつ例
２からのＢ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ・−ＭＨＩを添加
する。室温で１６時間撹拌し、混合物をウルトロゲル（
Ｉｌｌｔｒｏｇｅｌ）−ＡｃＡ−２ ０ ２カラム（モ
レキュラーシーブ、Ｖ−８０ｍｌ２）上に載せる。この
混合物を酢酸ナトリウム緩衝液０．０３モル／１ ｐ
Ｈ５．５で溶離する（検知ν−４０３ｎｍ）。最終生成
物を含有する画分を合わせ、６時間水に対して透析し、
かつ引続き親液性化する。 収量：２６ｍｇ（理論値の８７％）。 例４： シアンコバラミンーｄ一酸一ＴＥＤＥＨ （Ｂ １ ２
−ｄ −Ｃ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ−Ｃ Ｏ−Ｃ Ｈ２賢
一０−ＣＨ２−ＣＨ２ ｈ Ｏ−ＣＨ２−Ｃｏ−Ｎ
Ｈ−ＮＨ２）の製造シアンコバラミンーｄ一酸１３．５
ｍ９（０．１ミリモル）をＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇ（０．４ミリモル）と一緒にジメチルホルム
アミドー水 ｌ：ｌの混合物１０ｍＱに溶解しこの溶液
にＮａＣＮ９８ｍ９を添加する。この溶液をＮａＯＨｌ
モル／１でｐ Ｈ ５ ．５に調節する。この溶液にＮ
一エチルーＮ′−ジメチルアミノブロビルー力ルポジイ
ミド塩酸塩（ＥＤＣ）７７ｍｇ（０．４ミリモル）およ
びＴＥＤＥＨ塩酸塩１．８４９ （５ミリモル）を添加
する。 ｐＨ価をＮａＯＨで後調節し、引続き反応容器を暗くし
、この溶液を室温で撹拌する。６〜１４時間の間隔をも
って、全部で５回それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド４６ｍｇおよびＥＤＣ７７ｍ９を反応溶液に添加し、
この場合には、そのつとｐＨ価を５．５に後調節する。 ・４日間の全反応時間の後、高真空下で蒸発濃縮し、残
留物をアセトンｌＯｍ（Ｉで蒸解し、溶剤をデカントす
る。殆ど固体の残留物を水１０ｍＱに溶解し、この溶液
をアンバーライト（Ａａ＋ｂｅｒｌｉｔａ）−ＸＡＤ−
２カ５ム（Ｖ− １ ０ ０ｍｆｆ ）上に載せる。塩
の形の不純物を水３００ｍＱでカラムから洗浄し、引続
き粗製生成物をメタノール３００ｍａで溶離する。溶液
を水流ポンプによる真空中で蒸発濃縮し、残留物を水１
００ｍ＜１に溶解し、この溶液をダウエックス（ Ｄｏ
ｗｅｘ ）− １ｘ２一カラム（アセテート形、８０ｍ
ｌ２）上に与える。最終生成物を水２５０ｍＱで溶離し
、この場合には、未反応の酸がカラム上に残存し、引続
き酢酸ナトリウム緩衝液０．０４モル／ｌ（ｐＨ４．７
）で溶離する。生成物を含有する両分を合わせ、かつ親
液性化する。 収量：桜色の易吸湿性粉末７５ｍｇ（理論値の４６％）
。 同様にして、メチルコバラミンーｄ一酸から出発し、メ
チルコバラミンーｄ一酸が得られる。 例５： シアノコバラミンーｄ一酸−ＴＥＤＥＨ−ＰＯＤ−接合
体（Ｂ ｌ ２ −ｄ −Ｇ Ｏ−Ｎ Ｈ−Ｎ Ｈ−Ｃ
Ｏ−Ｃ Ｈｌ＋ ０ −Ｃ Ｈ ２−Ｃ Ｈ ２一つ
丁一〇−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ−ＰＯＤ）の製造 オランダガラシーベルオキシダーゼ３０ｍｇを酢酸ナト
リウム緩衝液４．５ｍＱ０．０３モル／ｐＨ５．５に溶
解する。ナトリウムペルヨーダート溶液０ ．６ ｍＱ
９ ．２モル／１ （酢酸ナトリウム緩衝液０．０
３モル／ｌ ｐＨ５．５中）を添加し、かつ室温で１
時間撹拌させる。 その後に、この溶液をセ７アデックス（ Ｓｅｐｈａｄ
ａｘ）−Ｇ−２５一カラム（Ｖ−５０ｍｌ２）上に載せ
、かつ酢最ナトリウム緩衝液０．０３モル／ｌ（ｐＨ５
．５）で溶離する（ｙ−４０３ｎｍでの検知）。蛋白質
含有画分を合わせ、かつ例４からのヒドラジド２ ．７
ｍ９を添加する。室温で１６時間撹拌し、混合物をウ
ルトロゲル（旧ｔ『ｏｇｅｌ）−ＡｃＡ−２ ０ ２カ
ラム（Ｖ＝８０ｍＱ）上に載せる。この混合物を酢酸ナ
トリウム緩衝液０．０３モル／Ｉ ｐＨ５．５で溶離
する（ν−４０３ｎｍでの検知）。最終生成物を含有す
る画分を合わせ、６時間水に対して透析し、かつ引続き
親液性化する。 収量：２７ｍｇ（理論値の９０％）。 ＰＯＤ接合体を製造するための前記例３および５に記載
に方法と同様にして、別のグリコシル化された標識酵素
、例えばアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の使用下に
相応する接合体を製造することができる。 例６： シアノコバラミンーｄ−モノ力ノレポン酸−ＰＯＤ−接
合体（比較化合物）の製造 製造は、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５ ６ （
１ ９ ７ ４ ）１４３−１４９の記載のように行な
う。 そのために，Ｂｌ２−モノカルポン酸をジャーナル・オ
ブ・ズイ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ｛ （Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）ｌ ０ ２ （ １ ９
８０）２２１５の記載のように製造する。 ＰＯＤ１００ｍｇおよびビタミンＢｌ２ １０ｍｇを
燐酸塩緩衝液２．５ｒｎＱ （０．０７モル／ｌ、ｐ
Ｈ８．２）に溶解し、この溶液にカルポジイミド２５ｍ
９を添加する。この溶液を４℃で７２時間撹拌し、引続
き脱イオン水に対して７２時間透析する。 接合体の精製は、例５の記載のように行なわれる。 例７： ビタミンＢｌ２ ａ）試料の調製 ヒト血清２５０μＱを分解試薬１２５μＱ （ＮａＯＨ
Ｏ．５モル／Ｉに溶解しｔ；リポン酸８ｍ９／ｍ１
２、シアン化カリウムＩｍｇ／ｒｒｌからなる）と混合
し、かつ室温で１５分間恒温保持する。引続き燐酸塩緩
衝液１２５μａ１２００ミリモル／１、ＰＨ４．１を添
加する。 ｂ）試薬 テノレモ（Ｔｈｅｒｍｏ）−Ｒ Ｓ Ａストレプタビジ
ン（Ｓｃｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で被覆されたポリスチ
ロール小管（欧州特許出願公開第０２６９０９２号明細
書の記載により製造） 試薬ｌ ビタミンＢｌ２に対するビオチニル化されたモノクロナ
ール抗体９ ５ ｎ ｇ／ ｍＱ （ＪＡＣＳＩ ０
０ （１９７８）３５８５−３５９０の記載によるビオ
チニル化）。 適当なモノクロナール抗体を生産するツエリニーンは、
Ｅｕｒｏｐｅａｎ ＣｏｌｌｅｃＬｉｏｎ ｏｒ Ａｎ
ｉｍａｌ Ｃｅ１１ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）Ｐ
ｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ．ＧＢに番号ＥＣＡＣＣ ８８
１０１３０１およびＥＣＡＣＣ８８ＪＯｌ３０２で寄託
されている。 燐酸塩緩衝液４０イリモル／１、ｐ Ｈ ７ ．２。 試薬２ Ｂ ｌ ２−ｄ−Ｃｏ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２士〇
一ＣＨ２−ＣＨ２つ”−０−ＣＨ２〜Ｃｏ−ＮＨ−Ｎ＝
ＰＯＤ（活性約２０ｍＵ／ｍＱ） 燐酸塩緩衝液４０ミリモル／Ｉ，ｐＨ７．２試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液１００ミリモル／１ｐＨ４．
４。 ＡＢＴＳ （２．２’−アジノージ ［３−エチル
ーベンズチアゾリンースルホネート］）１．９ミリモル
／ｌ ペルオキシ硼酸ナトリウム３．２ミリモル／ｌＣ）測定
の実施 測定を実施するために、試料２００／Ｊｉ２を試薬８０
０μａと一緒にストレプタビジン管中に入れ、かつ室温
で６０分間恒温保持する。引続き、洗浄液（塩化ナトリ
ウム２５０ｍｇ／ｍ（１、硫酸銅１ｍｇ／ｍｌ２）で洗
浄し、試薬２ １０００μＱを添加し、かつ室温で３
０分間恒温保持する。洗浄液（塩化ナトリウム２５０ｍ
ｓ／ｍＱ，硫酸銅１ ｍ９／ ｌ ０ ０ ｍｆｆ）で
洗浄し、がつ試薬３ １０００μＱを添加し、室温で
３０分間恒温保持し、形成された色を４２０ｎｍでのビ
タミンＢｌ２含量のための尺度として定める。 第ｌ図は、この場合に得られた校正曲線を例６による試
験のための校正曲線と比較して示す．校正曲線を定める
ために、血清試料の代わりに、塩化ナトリウム０．９％
、クロテインＣＯ．９％および塩化カリウム０．１％と
一緒の燐酸塩緩衝液４０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．２中の
シアノコバラミンからなる標準を使用する。 例８： ビタミンＢ１２の測定（比較例） ビタミンＢｌ２の測定を例７の記載と同様にして実施し
、この場合には例７に記載の標準を使用する。試薬２で
使用した本発明による接合体の代わりに、約９０ｍＵ／
ｍＱの活性を有する例６によるＰＯＤ接合体を使用する
。第１図は、例７と例８によるビタミンＢ１２を測定し
た校正曲線の比較を示す。それによれば、例６による接
合体を用いた場合には高い活性にも拘わらず本発明によ
る接合体を用いｔ；場合よりも平らな校正曲線が得られ
ることが判明する。
第１図は、例５に記載の本発明によるＢｌ２＝酵素接合
体の使用下でのビタミンＢ１２の酵素イムノアッセイ（
曲線２、活性２０ｍＵ／ｍ＜１）と、例６に記載の接合
体の使用下での試験（曲線ｌ１活性９０ｍＵ／ｍｌ２）
の校正曲線の比較を示す。測定波長：４２５ｎｍ％Ｅ：
吸光度。 第１図 Ｂ１２ １ｐｇ／ｍｌｌ
体の使用下でのビタミンＢ１２の酵素イムノアッセイ（
曲線２、活性２０ｍＵ／ｍ＜１）と、例６に記載の接合
体の使用下での試験（曲線ｌ１活性９０ｍＵ／ｍｌ２）
の校正曲線の比較を示す。測定波長：４２５ｎｍ％Ｅ：
吸光度。 第１図 Ｂ１２ １ｐｇ／ｍｌｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ｂはコバラミンから−ＣＯＮＨ＿２−基の分解
によって形成された基を表わし、Ｒは結合基（スペーサ
ー）を表わし、ｘは０または１である］で示されるコバ
ラミン−酸ヒドラジド。 ２、請求項１記載の式（ I ）のコバラミン−酸ヒドラ
ジドを製造する方法において、式：Ｂ−ＣＯＯＨのコバ
ラミン−カルボン酸中でカルボキシル基を自体公知の方
法でヒドラジドとの反応によって基 ▲数式、化学式、表等があります▼ に変換し、その際ｘが１である場合には、前記の基変換
の構成は段階的に行なうこともできることを特徴とする
、式（ I ）のコバラミン−酸ヒドラジドの製造法。 ３、式（III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ［式中、Ｂ、Ｒおよびｘは請求項１記載のものを表わし
、ＧＰはグリコシル基を介して−ＮＨ−Ｎ＝−基に結合
しているグリコシル基含有蛋白質の基を表わす］で示さ
れるコバラミン接合体。 ４、請求項３記載の式（III）のコバラミン接合体中へ
スペーサー基を導入する方法において、トリエチレング
リコール−ジ酢酸−ビスヒドラジド（ＴＥＤＥＨ）を使
用することを特徴とする、コバラミン接合体中へのスペ
ーサー基の導入法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3900648.4 | 1989-01-11 | ||
| DE3900648A DE3900648A1 (de) | 1989-01-11 | 1989-01-11 | Neue cobalamin-saeurehydrazide und davon abgeleitete cobalamin-konjugate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02233693A true JPH02233693A (ja) | 1990-09-17 |
| JPH0717672B2 JPH0717672B2 (ja) | 1995-03-01 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002635A Expired - Lifetime JPH0717672B2 (ja) | 1989-01-11 | 1990-01-11 | コバラミン―酸ヒドラジド，その製造法およびコバラミン接合体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5171679A (ja) |
| EP (1) | EP0378203B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0717672B2 (ja) |
| AT (1) | ATE141926T1 (ja) |
| DE (2) | DE3900648A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007515457A (ja) * | 2003-12-22 | 2007-06-14 | ソリダゴ・アーゲー | 異常な細胞の増殖の診断および治療に有効なコバラミン誘導体 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3900650A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vitamin-b12-bestimmung |
| JP2778304B2 (ja) * | 1991-09-17 | 1998-07-23 | 三菱電機株式会社 | 有機電子素子材料 |
| DE4239815A1 (de) * | 1992-11-26 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate |
| US5548064A (en) * | 1993-05-24 | 1996-08-20 | Biotech Australia Pty Limited | Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions |
| US5739287A (en) * | 1994-04-08 | 1998-04-14 | University Of Washington | Biotinylated cobalamins |
| ATE225799T1 (de) * | 1994-04-08 | 2002-10-15 | Receptagen Corp | Rezeptor modulierendes mitteln und entsprechendes verfahren |
| US5869465A (en) * | 1994-04-08 | 1999-02-09 | Receptagen Corporation | Methods of receptor modulation and uses therefor |
| US5840880A (en) * | 1994-04-08 | 1998-11-24 | Receptagen Corporation | Receptor modulating agents |
| EP1015475A1 (en) * | 1995-10-19 | 2000-07-05 | Receptagen Corporation | Vitamin b 12? receptor modulating agents and methods related thereto |
| US6326479B1 (en) | 1998-01-27 | 2001-12-04 | Boston Probes, Inc. | Synthetic polymers and methods, kits or compositions for modulating the solubility of same |
| US9120858B2 (en) | 2011-07-22 | 2015-09-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antibodies to the B12-transcobalamin receptor |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1044233B (it) * | 1973-04-04 | 1980-03-20 | Zambelletti L S P A | Derivati della vitamina bi2 ad azione vitaminica di lunga durata |
| US3981863A (en) * | 1975-02-25 | 1976-09-21 | Micromedic Diagonistics, Inc. | Cyanocobalamin derivatives |
| US4334069A (en) * | 1978-07-24 | 1982-06-08 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent phthalhydrazide-labeled hapten conjugates |
| US4550163A (en) * | 1979-02-05 | 1985-10-29 | Abbott Laboratories | Ligand analog-irreversible enzyme inhibitor conjugates |
| CA1180273A (en) * | 1981-06-22 | 1985-01-02 | Technicon Instruments Corporation | Assay of vitamin b in12 xx |
| US4925931A (en) * | 1988-07-14 | 1990-05-15 | Mccully Kilmer S | N-homocysteine thiolactonyl retinamido cobalamin and methods of use thereof |
-
1989
- 1989-01-11 DE DE3900648A patent/DE3900648A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-05 US US07/461,215 patent/US5171679A/en not_active Expired - Fee Related
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007515457A (ja) * | 2003-12-22 | 2007-06-14 | ソリダゴ・アーゲー | 異常な細胞の増殖の診断および治療に有効なコバラミン誘導体 |
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