JPH0368542A - ヘテロ二官能性化合物、およびカルボキシル基含有化合物をアミノ基含有化合物と結合する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明の対象は、アミノ基含有化合物をカルボン酸含有
化合物と結合させるための特殊なヘテロ三官能性化合物
、その製造法および該化合物を用いて製造された接合体
である。

従来の技術 免疫学的に活性の化合物、例えばハプテンと、別の化合
物、例えば核酸との接合体は、公知である。この接合体
は、最近ますます、ヒト診断学において一定の分析物を
免疫学的に測定するための試薬成分として使用されてい
る。

ハプテンと別の化合物との結合を行なうような化合物と
して、ホモニ官能性化合物およびヘテロ三官能性化合物
は、公知である。例えば、欧州特許出願公開第０２５４
１７２号明細書または米国特許第４７６０１４２号明細
書の記載から公知であるようなホモニ官能性化合物は、
例えばハプテンおよび蛋白質から選択的に接合体を得る
ことが困難であるという欠点を有する。また、２個のハ
プテンもしくは２個の蛋白質からなる接合体も生成物と
して生じる。結合試薬としてのへテロ三官能性化合物は
、前記欠点を回避する。西ドイツ国特許出願公開第２６
３１６５６号明細書の記載から、片側で１つの蛋白質、
例えば腎臓アシラーゼに結合させることができ、かつ別
の側で同様に蛋白質、また固体担体と結合させることが
できるプロパン酸のヒドロキシスクシンイミドエステル
誘導体は、公知である。カルボキシル基含有化合物への
アミノ基含有化合物の選択的で注意深い形成は、前記化
合物を用いた場合には不可能である。

欧州特許出願公開第００４２６２６号明細書もしくは米
国特許第４３７２９７４号明細書には、医薬としての２
−アミノエトキシ酢酸の使用が記載されている。この化
合物の製造は、公知方法により行なわれる。前記方法に
よるアミノエトキシ酢酸の高級同族体の製造は、不可能
であることが判明した。

欧州特許出願公開第０１０２１１８号明細書には、アシ
ルアミノエトキシ酢酸の混合物の製造が記載されている
。この化合物は、添加剤として塩基添加剤に使用される
。この化合物は、結合試薬としては不適当である。それ
というのも、この化合物は、遊離アミ７基を全く有さす
その上混合物の使用により、特異的結合に対する要求が
高いことは不当になるからである。

発明が解決しようとする課題 従って、選択的にカルボキシル基含有化合物をアミノ基
含有化合物と、定められた長さの親木性橋により結合さ
せることができるような化合物を提供することが必要で
あった。

課題を解決するための手段 この課題は、一般式■ａ： れる化合物を提供することによって解決される同様に、
本発明の対象は、−紋穴Ｉｂ：〔式中、ｎはＯ〜１０の
自然数である１で示される化合物を特に有利に製造する
方法、カルボキシル基含有化合物とアミノ基含有化合物
とからの接合体の製造のための化合物の使用および該接
合体それ自体である。

式Ｉｂの本発明による化合物の製造は、新規の特に好ま
しい合皮によって行なわれる。従って、本発明の１つの
対象は、弐■： ［式中、ｍは１−１０の自然数である］で示さ［式中、
Ｘはフタルイミド基またはヘロゲン原子、有利に塩素原
子、臭素原子もしくは沃素原子であり、ｎは式Ｉｂの記
載と同じものを表わす］で示される化合物を、式■工 Ｎ２ＣＨ−ＣＯＯＲ（Ｉ［Ｉ） １式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、
有利にエチル基を表わす］で示される化合物と、金属塩
触媒、有利に銅塩、パラジウム塩もしくはロジウム塩、
特に有利にロジウム−ＩＦ−塩触媒の下で反応させ、場
合によってはＸがハロゲン原子を表わす場合には、生じ
た生成物をアミノ基の導入のために試薬、有利にフタル
イミドカリウムと、求核性置換条件の下で反応させ、引
続き有利にＨＣｌ中で、場合によっては存在する保護基
を分解するかもしくはエステルを加水分解することによ
って式Ｉｂの化合物を製造する方法である。

全反応工程は、有利には溶液中で行なわれる。有利には
、式Ｉ〜■の化合物は、その後加工の前に単離される。

同様に、本発明の対象は、一般式Ｉｂの化合物の塩、ま
た内部場である。この塩は、既に化合物の製造の際に生
じることができるか、または事後に一般に常用の酸また
は塩基との反応によって生じることができる。有利なの
は、カルボキシル基のアルカリ金属塩およびアンモニウ
ム基のハロゲン化物である。

本発明方法によれば、エチレンオキシ単位の予め定めら
れた数を有するアミノエトキシ酢酸の同族体を製造する
ことができる。このことは、式Ｉｂの製造された化合物
をノ・ブテンと蛋白質もしくは核酸との結合のために使
用する場合には、特に重要なことである。アミノ端部と
カルボキシル端部との間の鎖長は、接合体の後使用のた
めに重要である。また、ｎの大きさは、ハプテンが結合
される蛋白質の大きさにより左右される。特に有利なの
は、ｎが１〜６である場合である。すなわち、例えばハ
プテンの入手可能性は、ｎがＯである場合に、このハプ
テンに対する１つの抗体に若干減縮されている（２−ア
ミノエトキシ酢ｆｉ）。

カルボキシル基含有化合物とアミノ基含有化合物とから
なる接合体を式Ｉｂの化合物を用いて製造するために、
成分の反応の順序の点で互いに異なる数多くの方法があ
る。有利なのは、次の方法である： 差当たり、式Ｉｂの化合物を、カルボキシル基が例えば
反応性エステル、７′−ロゲン化物または無水物の形成
によって求核性置換基に対して活性化された１つの化合
物と反応させた。このような活性化カルボキシル基は、
公知である。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでエステル化されたカル
ボキシル基は、特に有利であることが判明した。

一弐１ｂの化合物をカルボキシル基含有化合物と反応さ
せることにより、式■： ［式中、 Ｙはカルボキシル基含有化合物の基であり、ｎは前記の
ものを表わす１で示される化合物が生皮される。結合１
本、カルボキシル基により行なわれる。

一更に、式■の前記化合物は、アミノ基含有化合物と反
応し、式Ｖ： ［式中、 Ｙおよびｎは前記のものを表わし、Ｚはアミノ基含有化
合物の基である］で示される化合物に変えられる。

このことは、カップリング試薬を用いて行なうことがで
きるか、または活性化された誘導体への式（ＩＶ）の化
合物の先行する変換後に行なうことができる。活性化の
ために、カルボキシル基含有化合物に対して記載された
のと同一の方法を使用することができる。

そのために、式（ＩＶ）の化合物のカルボキシル基は、
有利に活性化されたエステル、無水物等に変換される。

引続き、アミノ基含有化合物と、公知方法により反応さ
れる。

また、アミノ基含有化合物およびカルボキシル基含有化
合物を結合させるための方法は、例えばアミノ基が最初
に保護された形である場合には、反対の順序で実施する
ことができる。

また、ヘテロ三官能性化合物によって結合された前記接
合体の段階的な構造とともに、化合物Ｉの活性化された
誘導体も直接に使用することができる。そのｔ；めに、
公知技術水準と同様に反応性基は導入される。例えば、
アミノ基はインシアネート、インチオシアネートまたは
マレイミドに変換することができるか、もしくはアシル
酸基、ハロゲン化アセチル基またはマレイミドアルカン
酸基に導入することができる。マレイミド官能基もしく
はヨードアセチル基への変換／導入は、特に有利である
。カルボキシル基は、例えばエステル、ハロゲン化物ま
たは無水物への変換によって活性化することができ、特
に有利なの１本、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルまＩ；はｐ−ヒドロフェニルエステルである。式■： ［式中、−ＮＲ２Ｒ３基は活性アミノ基を表わし、ＧＯ
ＯＲＩは活性化されたカルボキシル基を表わし、ｎは前
記のものを表わす］で示される化合物は、有利に例えば
蛋白質−蛋白質接合体の直接の接合体合成に適当であり
、この場合特に有利なのは、抗体−酵素接合体である。

例えば、式■の化合物がマレイミド基およびＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル基を有する場合には、差当
たり公知技術水準と同様にアミノ基含有蛋白質をカップ
リングすることができ、かつ第２の過程でＳ）１基含有
蛋白質を力・ノブリングすることができる。

相応するアミノ基またはカルボン酸基により規定される
化合物の例は、ノ＼ブテン、ビオチン、染料、殊に蛍光
染料、核酸、蛋白質であり、例えばまた（ストレプト）
アビジンおよび抗体、酵素、グリコ接合体、ペプチド等
でもある。

有利なのは、第一アミノ基を有するアミノ基含有化合物
である。好ましい化合物は、核酸および蛋白質である。

蛋白質は、その機能につき種々の種類に分けることがで
きる：酵素、構造蛋白質、抗体等。アルカリ性ホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはペルオキシダーゼ
との結合は、特に有利である。

好ましいカルボキシル基含有化合物は、ハプテンおよび
蛍光染料である。特に有利なのは、ハプテンである。ハ
プテンは、それ自体生体内で免疫応答を誘起しない状態
にある全ての化合物であるが：、シかし、適当な担体分
子と結合した場合には、ハプテンに対する抗体を生じさ
せることができる。それには、例えばビオチン、ジゴキ
シゲニン、コルチン−ルー３−カルボキシメチルオキシ
ム等が属する。このハプテンは、活性化されたカルボキ
シル基と反応することができる、付加的な保護されてい
ない強い求核性基を有しないのが有利である。保護され
た求核性基を有するハプテンの例としては、Ｎ−ＢＯＣ
チロキシンを記載することができる。活性化されたカル
ボキシル基を有する蛍光染料は、例えばカルボキシフル
オレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル
である。

本発明による方法は、それぞれアミノ基もしくはカルボ
キシル基によりハプテンと、蛋白質とを結合させるのに
特に十分に好適である。

弐１ｂの化合物を使用する場合には、アミノ基含有化合
物の生物学的機能、例えば酵素活性、相応する免疫成分
に対する結合能力またはハイブリッド化能力が十分にそ
のままであるような式Ｖの接合体を得ることができる。

他面、意外なことに、遊離ハプテンに対する抗体の親和
性は、ハプテンおよび弐■に記載のリンカ−を用いて製
造された免８２原の場合と全く同じ高さであるか、また
はその場合よりも非本質的にのみ僅かであることが判明
した。それに応じて、式■のリンカ−は、免疫原性を全
く示さない。また、ビオチンとアビジンまたはストレプ
トアビジンとの場合と同様に、ハプテンと、生物特異性
結合成分との反応は、不可能にはならない。

弐１ｂ８よび■の化合物ならびにそれらの活性化された
誘導体は、該化合物ならびにその誘導体が極性溶剤、殊
に水溶液中で良好に可溶性であるという利点を有する。

このことは、水溶性化合物、例えば蛋白質のカップリン
グを有利なものにする。また、式Ｖの化合物は、水溶液
中で良好に可溶性である。このことは、直接に生理学的
試料中で免疫検定またはハイブリッド化試験を実施する
のに特に重要である。例えば２個よりも多い隣接したメ
チレン基を有する架橋員（１、疎水性すぎることが判明
した。

しかし、また本発明による接合体中での結合は、十分に
堅固である。それというのも、ハプテンもしくは蛋白質
と、橋との結合は、共有結合、殊にアミド結合であるか
らである。従ってアミノ基およびカルボキシル基を介す
る化合物の２１１類の結合１才、特Ｉこ有利であること
が判明した。

実施例 次に、本発明を実施例につきさらに詳説する例１ ２　（２（２−アミノエトキシ−）エトキシ−）エトキ
シ−酢酸塩酸塩Ｉの合成、ｎ＝２゜ ａ）テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４００ｍ１２中のト
リエチレングリコール−モノ−クロリド８４．２５ｇに
、ＴＨＦ　　１５０ｍＱ中に溶解されたジアゾ酢酸エス
テル１０５ｒｒｌを３時間で滴加する。３０分間隔でそ
のつどロジウム−■−アセテート５０ｍｇを添加する。

引続き、メタノールを添加し、真空中で蒸発濃縮し、か
つ高真空下で蒸留する。

沸点（０，１３ミリバール）−１２０〜１２５℃；収量
−４５，５ｇ ｂ）ａ）で得られｔ；生成物１２．７ｙをＤＭＦｌｏｏ
ｍＱに溶解し、かつカリウム−フタルイミド９．２５ｇ
および触媒量の１８〜クラウン−６を添加する。１００
℃で２．５時間撹拌し、ＤＭＦを高真空下で除去し、酢
酸エステルに入れ、濾過し、かつ２回Ｈ２０で洗浄する
。乾燥および蒸発濃縮の後、油状残留物が得られる。

収量：ＩＶ　　１６ｇｎ−２ ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３／ＴＭＳ　　ｐｐｍ）ニーＣＨ３１
，２１−１，３５ −ＣＨ２−３，５９〜４，３１ フタリル　７．６６〜７．９０ ｃ）Ｉの脅威（ｎ＝２）： ＩＶ３．６ｇ（ｎ＝２）を２０％のＨＣＩ　　　ｔ。

ＯｍＱ中で還流下に撹拌し、１．５時間後に真空中で蒸
発濃縮し、残留物をＨ２Ｏ１００ｍＱ中に入れ、かつ濾
別する。この濾液を３回酢酸エステルで抽出し、かつ蒸
発濃縮する。生成物をセファデックス（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ）／　Ｈ２０により精製する。

収量：１　１．１ｙＣｎ−２） ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６／ＴＭＳ　　ｐｐｍ）ニーＣＨ
３−ＣＨ２−３，５７ −ＣＨ２−４，０３ ＮＨ２＋　　　　　　　４．１４ 後処理は、ＢＯＣ保護された生成物への変換および引続
くカラムクロマドグ５フイーおよび分解によって行なう
ことができる。

例２ Ｉ（ｎ＝１）とビオチンとの反応 Ｉ　　３７０ｍｇ　　（ｎ−１）をビオチン−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、７７５ｍｇおよびトリ
エチルアミノ３ミリモルと一緒にＤＭＦ　　ｌＯｍＱに
溶解し、かつ室温で２４時間撹拌する。溶剤を除去し、
残留物をアセトン中に入れ、濾別し、かつ改めて蒸発濃
縮する。粗製生成物約８００ｍｇを得、これを珪酸での
クロマトグラフィーによって後処理する。（溶離剤：ク
ロロホルム：メタノール：酢酸９：１：０．１）。

Ｒｆ−０，２（ＣＭＡ９　：　３　：　０．５）。

例３ １（ｎ＝２）と、ジゴキシヶニンー３−カルボキシメチ
ルエーテル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと
の反応 １　０．３６９　（ｎ−２）を無水ＤＭＦ　　１０ｍ０
に溶解し、かつトリエチルアミノｏ、ａｍＱを添加する
。引続き、ジブキシゲニン−３−カルボキシメチルエー
テル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．５４
９を添加し、かつ室温で１６時間撹拌する。溶剤を除去
し、残留物を２回シリカゲル酸（溶離剤メタノール：テ
トラヒドロフラン１：１＋０．５％の酢酸）により精製
する。

収量：０．３８９、Ｒｆ＝０．５８　（酢酸エステル：
酢酸９：１） 例４ ２（２−アミノエトキシ−）エトキシ−酢酸塩酸塩Ｉ、
ｎ＝１・ ａ）テトラヒドロフラン１５０ｍｇ（ＴＨＦ）中のジエ
チレングリコール−モノ−クロリド６２．２５ｇにＴＨ
Ｆ１５０ｍＱ中に溶解されたジアゾ酢酸エステル１０５
ｍ１２を３時間で滴加する３０分間隔でそのつどロジウ
ム−■−アセテート５０ｍ９を添加する。引続き、メタ
ノールを添加し、真空中で蒸発濃縮し、かつ高真空中で
蒸留する。

沸点（０，１ミリバール）−８０〜８８°Ｃ；収量＝４
５．６９ ｂ）ａ）で得られた生成物２１．０７９をＤＭＦ２００
ｍＱに溶解し、かつカリウム−７タルイミド１８．５ｇ
および触媒量１８−クラウン−６を添加する。１００℃
で２．５時間撹拌し、濾過し、かつ２回Ｈ２０で洗浄す
る。乾燥および蒸発濃縮の後、油状残留物が得られる。

ＮＭＲ（ＣＤＣＩａ／ＴＭＳ　　ｐｐｍ）ニーＣＨ３１
，２１〜１．３５； −ＣＨ２−３，５９〜４．３１； フタリル　　７．６６〜７．９０ Ｒｆ（酢酸エチル／石油エーテル　２／Ｉ）＝０．５３ ｃ）Ｉの合＋ｆｆ１（ｎ−１） ＩＶ　　２５．２４ｇ　（ｎ−１）を２０％のＨＣｌ　
　５００ｍ４中で還流下に撹拌し、１．５時間抜に真空
中で蒸発濃縮し、残留物をＨ２Ｏ１００ｍ１２中に入れ
、かつ濾別する。濾液を３回酢酸エステルで抽出し、か
つ蒸発濃縮する。

生成物をセフ７デツクス（５ｅｐｈａｄｅｘ）／　Ｈ２
０により精製する。

収量：　Ｉ　　９．３７９　　（ｎ＝１）ＮＭＲ（ＤＭ
ＳＯ−ｄ６／ＴＭＳ　　ｐｐｍ）ニーＣＨ２−ＣＨ２−
３，５７１ −ＣＨ２−４，０３； ＮＨ３＋　　　　　　　　４．１４ Ｒｆ（メチルエチルケトン／ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ３／ｌ／
１）−０，５６ 後処理は、ＢＯＣ保護された生成物への変換ならびに引
続くカラムクロマトグラフィーおよび分解によって行な
うことができる。

例５ １　（ｎ＝２）とビオチンとの反応 Ｉ　　１．６９　　（ｎ−２）をビオチン−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル６４２ｍｇおよびトリエチ
ルアミノ１．５ｍ１２と一緒にＤＭＦ　３０ｍＩ２に溶
解し、かつ室温で２時間撹拌する。

溶剤を除去し、残留物をアセトン中に入れ、濾別し、か
つ再び蒸発濃縮する。

Ｒｆ（氷酢酸／酢酸エステル／水　５１５／２）−０，
５３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ａ： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｍは１〜１０の自然数である］で示される化合
   物およびその塩。 ２、一般式VI： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ＾１は水素原子、ｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−スクシ
   ンイミド基、ハロゲン化物基またはＣ＿１〜Ｃ＿６−ア
   ルキルカルボニル基であり、Ｒ＾２およびＲ＾３は、同
   一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン化アセ
   チル基、アクリル酸基またはマレイミドアルカン酸基で
   あるか、或いは −ＮＲ＾２Ｒ＾３基はマレイミド基、イソシアネート基
   またはイソチオシアネート基であり、但し、Ｒ＾２およ
   びＲ＾３は同時に水素原子を表わさないものとし、 ｎは０〜１０の自然数である］で示される 化合物。 ３、一般式 I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは０〜１０の自然数である］で示される化合
   物を製造する方法において、式II▲数式、化学式、表等
   があります▼ ［式中、ｎは前記のものを表わし、 Ｘはハロゲン原子またはフタルイミド基で ある］で示される化合物を、式III Ｎ＿２ＣＨ−ＣＯＯＲ（III） ［式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を
   表わす］で示される化合物と反応させ、Ｘがハロゲン原
   子を表わす場合には、この生成物をアミノ基の導入のた
   めに試薬と反応させ、エステル官能基および場合によっ
   ては存在するアミノ保護基を加水分解することを特徴と
   する、式 I ｂの化合物の製造法。 ４、カルボキシル基含有化合物をアミノ基含有化合物と
   結合させる方法において、式 I ｂ：▲数式、化学式、
   表等があります▼（ I ｂ） ［式中、ｎは０〜１０の自然数である］で示される化合
   物またはその塩を使用することを特徴とする、カルボキ
   シル基含有化合物をアミノ基含有化合物と結合させる方
   法。 ５、式Ｖ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） ［式中、 Ｙはカルボキシル基含有ハプテン、染料、 ペプチドまたは蛋白質の基、または核酸もしくはビオチ
   ンの基であり、 Ｚはアミノ基含有ハプテン、染料、蛋白質 、ペプチドまたは核酸の基であり、 ｎは０〜１０の自然数である］で示される 化合物。 ６、式IV： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） ［式中、 Ｙはカルボキシル基含有ハプテン、染料、 ペプチドまたは蛋白質の基、または核酸もしくはビオチ
   ンの基であり、 ｎは０〜１０の自然数である］で示される 化合物。