JPH06502192A - 常磁性金属をキレート化でき、そして特異的細胞マーカー部位に応答する因子とカップリングするように企画された共役体成分を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 常磁性金属をキレート化でき、そして特異的細胞マーカ一部位に応答する因子と カンブリングするように企画された共役体成分を製造するための方法 本発明は、遺灰された器官又は組織に常磁性ＭＲＩコントラストエンハンサ−を 運ぶように標的化された投与可能な分子キャリヤーの分野に使用されるべき化合 物を製造するための新規方法に関する。

モノクローナル又はポリクローナル抗体（細胞選択性ホーミング因子）が常磁性 金属イオンを保持するアミノポリカルボン酸キレート化剤を担持する成分に共有 結合される分子共役体は知られている。

たとえば、Ｎ、　Ｔ、　ＡＮＤＥＩ？５ＯＩＪなど、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ 、　４５　（１９８５）、　２１５４〜２１５８においては、抗体活性及び特異 性を保持しながら、抗体１モル当たりＤＴＰＡ　８モルまでの結合が開示されて いる。　ＤＴＰＡ　（ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸）は、たとえばＧｄ、 　Ｆｅ、　Ｃｒ及びＮｉを含む常磁性金属性のための強力なキレート化剤であり 、従ってそれらは特異的細胞部位に直接的に標的化され、そしてプロトンスピン 緩和（Ｔ、及び／又はＴｔ）を変性し、そして像コントラストを増強することに よってＭＨＩ可視化を助けることができる。

また、ＷＯ−Ａ−９０／１４８８１においては、架橋官能基、たとえばイソシア ネート−、イソチオシアネート−、ブロモアセトアミド−、ジアゾ−１Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル及び分子間又は分子内無水物を用いることによっ てのホーミングタンパク質へのポリアミノカルボキシルキレート剤の結合が開示 されている。

しかしながら、キレート化剤：抗体の分子比は、効果的なＭＩ？Ｉコントラスト 増強のためには低く過ぎ、そしてコントラスト増強効率を改良する手段が開発さ れた。たとえば、Ｇｅｏｒｇｅ　Ｗ−ａｎｄ　ＣａｔｈｅｒｉｎｅＨ，ＭＯ（Ｎ ｏ−Ａ−９０１０１９００）ハ、一定タイフノ細胞ノ表面テ特定レセプターによ り認識されるべく暴露された末端ガラクトース残基を有する塘タンパクｆを包含 するリガンドがキレート化剤、たとえば常磁性種を結合できるＤＴＰＡ又はＤＯ ＴＡ　（１，４，７，１０−テトラインクロドデカン−Ｎ４−テトラ酢酸）に結 合され、そして安定した非毒性錯体を形成する共役体を開示した０選択的タンパ ク質はアジアロオロソムコイド（ＡｓＯＲ）であり、そしてＤＴＰＡは、５：１ 〜１５：ｌの範囲でのモル比のキレート化されたＧｄ　：　ＡｓＯＲを結果的に 達成するために、開示されていない手段によりそれらに結合された。もう１つの Ｂ様において、ポリリシン（ＰＬ）は、アシアログリコプロティンのラクトース 末端との及びその後、ＤＴＰＡとの反応により変性され、アジア−ＰＬ−キレー ト剤共役体が生成される。この共役体は、リレ２１モル当たりＧｄ　９０モルま での結合を達成することが見出された。

しかしながら、実験的な詳細はこの文献には欠乏している。

水物（ｃａＤＴＰＡ）とを反応せしめ、Ｎ−スクシンイミジル−５−（２−ピリ ジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応による２−ピリジルジスル フィド基の導入及び共有チア結合共役体を形成するためにチオール化されたＩｇ ＧとのカンプリングによりＤＴＰＡ結合ポリ（Ｌ−リジン）の製造を開示してい る。この合成に関与する反応は下記に要約される。

類似する技法が、Ｐ、　５ｈｒｅｖｅなど、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｎａｎ ｃｅ　１ｎＭｅｄｉｃｉｎｅ　３　（１９８６）、　３３６〜３４０により開示 されている５Ｐ、　Ｆ、　Ｓｉｅｖｉｎｇなど、、［ｌｉｏｃｏｎｊｎｇａＬａ 　Ｃｈｅｗ、　１　（１９９０）、　６５〜７１は１、・昆りされた無水物を包 含する技法によりポリリシンの側鎖末端−Ｎ１（７−１のボ°Ｊアミノカルボキ シルキレート化剤の結合を開示している。

後者は、を機アＳシ狐たとえばトリエチルアミン又はテトラメチルグアニジノ及 びイソブチルクロロホルメート　（ＩＢＣＦ）にすりそれらの塩の形でのキレー ト　（たとえばＤＴＰＡ及び［１ＯＴＡ）を処理することに起因した。その塩、 ポリリン７・を担持するキレート化剤は次のようにしてヒト血清アルブミン（Ｈ ５Ａ）　′、こ結合される：ポリ°ノノンの未反応Ｈ５アミン０！！１基は、ス クシンイミジルー４−（Ｎ−マレインイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ ルボキシレート（Ｓ門ＣＣ）により誘導体化され、マレインイミド活性化残基が 供給され、そして）ＩＳＡのいくつかの遊離アミノ基が２−イミノチオランによ り活性化され、少な（とも１つの反応性アルキルチオール基が供給される。

最終カップリングは、ボリンランを担持するキレート化剤のマレインイミド末端 の二重結合へのＨ５Ａの前記チオールの付加に起因した。

得られた共役体は、標的タンパク質当たり平均的７Ｄのキレート部位を含んだ。

しかしながら、前記技法は、個々の段階が、退屈な操作を必要とし、そして低収 率を与える、中間生成物の注意したクロマトグラフィー精製を包含する欠点を有 する０本発明においては、選択された細胞マーカ一部位に対して特異的に応答す るタンパク質ホーミング因子に結合される常磁性金属イオンを錯化できる式Ｈの 共役成分を調製するための改良された方法が提供され、従ってインビボ及び組織 培養の両者において、予定された領域に高い割合の常磁性４Ｒ■コントラスト増 強種を選択的に担持することができ、そして運ぶことができる投与可能化合物を 特徴する 請求の範囲第１項に要約されるように、この方法は、合成の進行につれて出発材 料及び続いて、連続的な中間体を結合するために固体相の使用に基づかれている 。最後の段階においては、所望する生成物が、標的因子とカップリングするため に反応性最終機能を同時に生成する分裂段階により固定化相から開放される。固 定化相を用いることの利点は、それが単純な′ａ過又二：遠心分離によりもたら され得るので、特に中間体の分離において判明する０本発明のもう１つの利点は 、分離段階が分子当たりたった１つの末端活性化基を開放することであり、とこ ろが過去の方法においては、その対応する中間体が、ホーミング因子とのカップ リングに基づいて架橋を導びくいくつかの反応性末端をしばしば担持した。１つ の他の利点は、選択されたアシル化化合物が１つ以上のイミノジ酢酸環を有する 中間無水物である場合、特に段階−ａ）の実施に影響を及ぼすことであり、それ によってそのような二重官能性は架橋を導びくことができる。固相上に固定され た式■の化合物を用いる場合、多官能無水物によるアシル化の間、架橋が、立体 反応により妨害される。

本発明の方法においては、信号Ｒにより示された固定された固相シよ、ｌ又はそ れ以上の段階を必要とする方法において出発成分■を形成することができるグラ フトされた置＊ｉを供給された表面又は無機粒子（ガラス又はセラミックス）上 に残留反応性基を存するポリマー樹脂であり得る。たとえば、ポリアクリル酸樹 脂、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ポリオレフィン等 の樹脂が便利である。無機粒子においては、アルミナ、ソリ力、ルチル又は多孔 性ガラスのようなセラミックスの粒末又はビーズが便利である。ｓ機粒子、好ま しくは多孔性ガラスピーズは、反応性末端基、たとえばイソシアネート、アミン 、アミド、置換オキシカルボニル、ヒドロキシ、チオール及び同様のものを供給 されたトリアルコキンシランによるソラン化により反応性にされ得る９好ましい Ｂ樟においては、ビーズはチオアルキル−シランによりシラン化され（Ｈ，ＷＥ ＥＴＡＬＬ、　Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ 　Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ＳｕｐｐｏｒｔＭａｔｅｒｉａｌｓ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅ ｎｚｙｍ、　４４　（１９７６Ｌ　１３４を参照のこと）、そしてその生成物が 、分裂可能なジスルフィド結合（−ＸＸ−＝　Ｓ　Ｚ）を含む固定された中間体 アミンを供給するためにシステアミンと反応せしめうｈル（Ｌ、　ＦＪＥＬＤな ど、、　Ｊ、　Ａ、　Ｃ，Ｓ、　８３　（１９６１）、　４４１４を参照のこと 〕。他方、チオール化された樹脂、たとえばチオセファロース（Ｔｈ　１ｏｓｅ ｐｈａｒｏｓｅ）はまた、便利な出発材料である。

ある態様において、その後、固定されたアミンは、ｎがゼロでない出発化合物Ｉ を供給するために、アミノ酸Ｎ−カルボニル無水物（ＮＣＡ）のテレキレート重 合において開始剤として使用され得；そのような反応についての詳細はこの後に 与えられる。ハロアルキルにより誘導体化されたポリオレフィンは、適切な出発 材料をまた供給するために、ビス（アミノプロピル）アミンの存在下でチオ尿素 により硫化され得ることが注目されるべきである（ＷＡＲＤＥＬＬ、　ＴｈｅＣ ｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ　ｏｒ　Ｔｈ１ｏｌ　Ｇｒｏｕｐｓ、　Ｐａｒｔ　Ｉ、　Ｅ ｄ、　Ｐａｔａｉ、　Ｗｉｌｅｙ　（１９７４）Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋを参照のこと ）。また、チオメチル基により利用できる樹脂（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ樹脂） が、ジチオピリジンの中間作用を伴って又は伴わないで、システアミン（ＩＩＳ ＣＣｔ（ｚ）　ｚ　５ＩＮ）との同し反応によるアミノ−アルキルジチア置換基 により供給され得る（Ｉｌ、　Ｙへ旧ＭＡなど、。

Ｊ、　Ａｓ、　Ｃｈｅｓ、　Ｓｏｃ、　６３　（＋９４１）、　２２６３）。

ハロアルキル化された樹脂により開始する反応がこの後に要約される： チオ尿素　ビス（７ミノブＤビル）アミン本発明の他のＵ様においては、固相が オキシラングラフト化された材料を供給するためにエポキシプロピルーンランに よりシラン化され、この機能はいくつかの品種の市販のポリアクリルアミド樹脂 、すなわちＳＩＧＭＡ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓからのＥｕｐｅｒｇｉ　を樹脂上に 実際、すでに存在する。オキシラン誘導体化された固定比相が、隣位（ｖｉｃ） −ジオール担持中間体、すなわち−にＸ−が−ＣＩＩＯＩＩ　−ＣＲＯＨ−であ る化合物Ｉを次の反応により製造するために使用された：Ｒ−ＣＨ，ｄ；”ＣＭ 、　ＫＳＣＨ，・（ＣＨＯＨ）、−ＯＨ，ＳＨ（エリトリト−１１）　→次に、 化合物Ｂ及びへの末端アミノ基が、たとえば特にＬｉｕＹ［ＩＡＮＦＡＮになど 、、　Ｐｕｒｅ　＆　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｃｈｅｗ、　６３　（１９９１）、　４ ２７〜４６３の序論に言及される当業界において既知の手段に従って１、遊離状 態又はすてに常磁性金属イオンを有する錯体彫工のいづれかで、キレート他剤分 子との直接的な結合のために使用され得る。１つの手段は、選択されたポリアル キレンアミノ〜ポリカルボキシルキレート化剤のキレート他剤無水物（すなわち 少なくとも１つのイミノジ酢酸無水物環を供給された分子内無水物又は同しか又 は異なった種類の２つの分子を含む分子間無水物）の無水物を用いることによっ てアミンをアシル化することである。不均質分子間無水物を形成するための好ま しい試薬は、イソブチルクロロホルメートである（ｎｉｏｃｏｎｊＢａＬｅＣｈ ｅｍ、　１．　（１９９０）、６５〜７１を参＝ノコト＞　。

次に本発明の方法の段階（２）は、固定比相からキレート他側を分層することを 含んで成り、そして同時に、タンパク質標的因子に結合するための反応性基を生 成せしめ、ここで後者は、結合の前、活性化される必要があり、又は必要がない 。

上記タイプへの化合物の場合、分離は、隣位−ジオール結合の通常の手段による ＪＡ択的酸化又は過酸化によりもたらされ得、それ二こよって弐０ＨＣ−ＣＨｚ ＳＣＩｈ−ＣＨｚｆ讐Ｈ−ｈｙの反応性アルデヒド（ここてＭ及びＹは請求の範 囲に定義された意味を有する）が開放されるであろう。

タイプＢの化合物の場合、分離は、通常の手段により、すなわちチオエタノール 又はジチオトレイトールの存在下でジスルフィド結合でもたらされる。この場合 、典型的な式ｔｌＳ−（ＣＨｚ）　ｚ−Ｎ）Ｉ−ＭＹの開放されるキレート他剤 分子が、通常の手段（たとえば前記引用された文献に開示される技法）に従って 、スルフィド活性化タンパク質ボーミング因子とのカップリングのために使用さ れ得る。分離の後、固定比相が、たとえば濾過又は遠心分離にり回収され、そし て経済的に興味あるもう１つのサイクルに再使用され得る。アルデヒド−スルフ ィド置換基により開放される固定比相の場合、これは、他の合成に使用され得、 又は本発明の方法のもう１つのサイクルへの再使用のために従来の手段により再 生成され得る。

本発明のさらに１つの特に興味ある観点によれば、式Ａ又はＢの固定化されたア ミンが、ポリアミノ酸、すなわちキレート他剤分子を結合するための多くの部位 を有するポリマー主鎖を有する化合物を供給するために、アミノ酸無水物（ＮＣ Ａ）のテレキレート重合のための開始剤として使用され得る（Ｅ、　Ｊ、　ＧＯ ＥＴＨＡＬＳ、　ＴｅｌｅｃｈｅｌｉｃＰｏｌｙｍｅｒｓ、　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　（１９８９）＋ 　Ｎｅ＠−Ｙｏｒｋを参照のこと）。この技法によれば、カップリングの後、標 的分子当たりのキレート化された常磁性イオンの数を都合良く高めるであろう１ 本発明のある態様において、化合物Ｂは、Ｌ−グルタミン酸のいくつかのｒ−保 護された誘導体又はアスパラギン酸のそのシルから選択される。

エステル自体は、Ｖａｎ　ＨＥＥＳＷＩＪＫ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（１９８ ２）、　７４４に従って調製され、そしてＮＣＡはホスゲン（気体又は固体トリ ホスゲン）との反応により得られた。重合の後、それらに結合されるアミン開始 剤ヘッドを有するポリアミノ酸は、通常の手段、たとえばＨＢｒ又はトリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）　４こより保護解除され、そして第一アミンを末端にをする側 基を供給するために、遊離カルボキシル官能基がエチレンジアミン（又はいづれ かのアルキレンジアミン）によりアミド化された。キレート他側分子は、化合物 Ａ又はＢの場合において上記で説明されたようにして、すなわちアシル化により 又はポリアルキレンアミンーポリカルボキシルキレート化剤分子のアルキレン炭 素の１つからの反応性結合橋を直接的に使用することによって、前記アミン末端 側基に結合された０次に、ＸＸ結合が、その後、標的ホーミング因子に（常磁性 金属を有さない又はそれにより錯化されたカルボキシル基により）結合されるべ き活性化された遊離キレート化剤ポリマーを開始するために、前記ですでに言及 された条件に類似する条件下で分離された。

類似する反応が、Ｌ−リノンのＮＣＡを用いて行なわれ、ここでε−ＮＨｚ　１ には、フルオレニルオキシ力ルボニル（ＰＦＬ）基又はヘンシルオキシカルボニ ル（ＰＢＬ）　Ｍのいづれかにより保護されている。重合の後の保護解除は、Ｄ ＭＦ中、ピペリジン又はジオキサン中、ＴＦＡ及びメシル酸の混合物を用いるこ とによってもたろされた（実験部分を参照のこと）。

従って、上記のようにして得られたテレキレートポリアミノ酸器よ、その後、前 ですでに記載された同じ方法により、キレート他剤分子が結合され得る多くのア ミノ末端側基を供給される。たとえシｉ、固定された化合物Ａにより開始された し一すノンーＮＣＡの重合後ユニ得ろれた固定されたボリリランが、側基（ｓｉ ｄｅ　ａｒｍｓ）の有意な割合（６０〜８０％まで）がキレート他剤分子により 装備されてＩ、ｓるＤＰ約５０〜１１０のポリアミノ酸を供給するためにｃａＤ ＴＰＡと反応せしめられた。

次乙こ、前ですでユニ説明されたように、酸化による開放の後、−ＣＨＯヘッド 基を含む得られたポリキレート化剤がタンノぐり質ホーミング因子とのカップリ ングのために使用され、ここでカップリングが必要とされる前、タンパク質を活 性化する必要はなく；これは明らかに従来技術の技法に比較して本発明の強い利 点である。ホーミング因子として使用され得るタンパク質はひしように多く、そ してたとえばモノクローナル及びポリクローナル抗体、ヒト血清アルブミン（Ｈ ５Ａ）　、特異的及び非特異的１ｇ、α−２−マクログロブリン、インターロイ キン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）　、血小板由来増殖因子及び一般的に、特異的細 胞マーカ一部位を認識するタンパク質又は環タンパク質を包含する。

ヘンシルグルタメート−ＮＣＡを、Ｈ，ＢＬＯＣＫ、　”Ｒｉｎｇ　Ｏｐｅｎｉ ｎｇＰｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”　２　（１９６９）、　２３．　Ｋ、Ｃ， ＦＲＴＳＨ＆　Ｓ、Ｌ、ＲＥＥＧＥＮ　Ｅｄｓ、。

ＭＡＲＣＥＬ　ＤＥＫＫＥＲ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋに従って調製した。

γ−フェナシルグルタメートーＮＣＡを、ＴＩＩＦ　２５０ｄ中、グルタミン酸 エステル８．６ｇの懸濁液中でホスゲンを泡立てることによって得た。溶解が完 結した後、その溶液を窒素によりフラッシュし；次にそれを蒸発し、そして残留 固体を酢酸エチル及びヘキサンから結晶化し；無色の結晶を得た。

Ｔ−ビペロニルグルタメートのＮＣＡを、ジオキサン２Ｏｄ中、前記エステル１ ｇの懸濁液を固定トリホスゲン（Ｊａｎｓｓｅｎ）　３５０−により処理し、そ してその後、６０°Ｃで９０分間、さらに撹拌することによって得た。必要なら 、十分な熔解を、ひしように少量の追加のトリホスゲンの添加により行なう。そ の溶液をヘキサン４００ｄに注ぎ、そして−２０°Ｃで一晩、放置し、それによ って結晶を形成せしめた。それろを少量の酢酸エチルに溶解し、その溶液を４０ ゛Ｃで炭素により漂白−１そしてヘキサンニこより沈澱せしめた。白色結晶を、 くり返しこの精製の後に得た。

±土 Ａ）１４位ジオールスペーサーを通じてのグラフトされた第一アミンによるキャ リヤーの調製（アミノ−ジオール−誘導体化キャリヤー）。

Ｅｕｇｅｒｆ　ｉｃ　−Ｃビーズ（その上でグラフトされたグリンジル基を有す るポ°Ｊアクリルアミド樹脂−５ＩＧＭＡの製品）５ｇを、０．１Ｍのり７ｅｉ 　（ｌ　ｉＭ（７）ＥＤＴＡ）　緩衝Ｋ１．　（ｐＨ６，０）　１００ｄＣＱｉ し、そしてジチオ工°ノトリトール（ＤＴＥ）　１　ｇ　（６，５ｍモル）を撹 拌下で添加した。その不均質混合物を室温で２日間、撹拌し、その後、ビーズを 排水し、そじて同し°Ｊン酸緩衝液により洗浄−た。約５０１１ｇのアリコート を取り、そしてＤＭＦ中、２，２′−ジチオジピリジンの１０１（容４１０−と 共に室温で１時間、撹拌することによって洗浄した。ビーズを排水り、ＤＭＦに より、次にｃｏｚｃ＋□により洗浄し、ＤＭＦ　５−に再懸濁し、そして−３Ｓ −結合を１滴のメルカプトエタノール（ＥｔｓＨ）　Ｓこより分翻し；３０分間 の撹拌の後、ビーズを濾過により分離し、そして濾液にぢける２−チオピ°ノド ンの量を、門、　Ｃ，Ｍｉｌｌｏｔなど、、Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３５４　（１９８６）　１５５に従って３４３ ｎｍ　（ε＝　８０８０　）での吸光度により決定した。

ビーズ（主要部分）を０．５Ｍのトリス−ＨＣＬ　（０，５ｍＭのＥＤＴＡ）緩 衝液（ｐＨ８，５）　１００−に懸濁し、そして２−ブロモエチルアミン臭酸塩 の量（前記分析の結果から計算される）のブロモアミン／チオールのモル割合を ５０にし、これは、Ｋ、　０ｋａｚａｋｉなど、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

１４９　（１９８５）　５１６に従って行なわれた。室温で２日間の撹拌の後、 ビーズを排水巳、同′−緩衝液、次にＨ２Ｏにより洗浄し、そして真空下で乾燥 せしめた。

遊離アミノ基の分析をＣ，Ｃ，Ｙ、　Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｇ、　ｌ’ｌ、Ｌｏｕｄ ｏｎ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９４　（１９７９）　６０に従ってｊテない、そして平均値 （いくつかの実施の後）は、乾燥ピー１１ｇ当たり約５０μモルの−ＮＨｚであ った。

その反応は次の通りである（Ｒ＝キ→・リヤー）ニー社迄部Ｌ−Ｒ−ＣＨ２Ｃ） ｌＯＨｃＨ２−Ｓ−Ｃ）＋２　ｆｃＨＯＨ＋　２−Ｃ）＋２−５−　（ＣＨ２） ２−ＮＨ２７ミ八ン才−ルーキャリヤー　（Ａ） Ｂ）アルデヒド−誘　体化ＤＴＰＡの調ＪＤＴＰＡビス無水物（ｃａＤＴＰＡ） （Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｓｉｃａｌｓからの）Ｉｇ（２，３ｍモル）を無水ＤＭ Ｆ　１ｏａｄに溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）　１０ｍモルを添加し、そ してその後、ビーズ２ｇ（０，１ｍモル）を上記例１下二二おけるようにして誘 導体化した。懸濁液を室温で２４時間、撹拌し、その後、それらを排水し、ＤＭ Ｆにより洗浄し、そしてｃａＤＴＰＡ　Ｉ　ｇ（２，８ｍモル）及びＴＥＡ　１ ０ｍモルを含むＤＭＦ　１００ｄに再懸濁した。２４時間の撹拌の後、ビーズを 再び排水し、そしてＤＭＦ、ジメチルスルホキッド（ＤＭＳＯ）及びわずかに酸 性化された水（ＨＣＩ）により連続的に洗浄した。ビーズを０．１Ｍのリン酸（ ０，ＯＩＭのＮａ１０４）緩衝液（ρｈ７　）　ＩＯｄに懸濁Ｌ、そして暗室で ３０分間撹拌し、次にビーズを排水し、そして同じ緩衝液により洗浄した。濾液 及び洗浄画分をプールした。

ブールされた濾液及び洗浄画分をｐＨ２に酸性化＝（ｕｃ＋により）、そしてＲ ｏｔａｒａｐＯｒにより約２雄にｆＡ縮した。次に残留物を、２０×１ｃ１のカ ラムユニだけるイオン交換樹脂上にｊｆｆｉした（Ｄｏｗｅｘ　Ｉ　Ｘ　８、ア セテートに、２０〜５００ドライメノンユ）。７容出速度は一定の酢酸グラジェ ント　（ｐＨ−３）を用いて２．？＋１！／分であった。連続的百分からのアリ コート（２ｄ）を、ノクロヘキサノン及び炭酸アンモニウムによる処理の後ユニ 生成される蛍光を測定する、Ｊ、Ｂａｒｔｏｓなど、ＰｕｒｅＡｐｐｌｅ、　Ｃ ｈｅｗ、　５１　（１９７９＞　、　１８０３＊’）ノ）法によりアルテヒトシ 二ついて分析した。３計］ＴｏＴｈ画分に盾つけば、６及び７番目の画分かアル デ巳ドー誘導体化ＤＴｌ’Ａの主要部を含んだ。陽性のアルデヒドシグナルを付 与する画・ｔ？−パ−ルし、そして凍結乾燥せしめた。生成物を１！１Ｒ７こよ つツユ”Ｅａｒｔｏｓ　ｆｉｔｉｌ記）ユニ従ってアルデヒドについて分析した 。

乾燥された生成物の重量は約１００％の結果物からの開放の収率を示すとで、わ れ、そしてその得られたＤＴＰＡがアルデヒド−置換されているように思える。

なぜならば、マトリックス網状構造による立体的妨害つ・たぶん、同相への二重 のＤＴＰＡ結合を阻害するからである６二か′−なから、アルデヒＩ゛の測定は 、理論的な置換のたった半分か１乙たことを示しているようζこ思える。その矛 盾は、カルホキ７・ルべへの可能な部分的転換を伴っての開放の間、ある程度の Ｘ８酸化によりたぶん説明され得る。

その反応は下記に図示される（Ａはアミノージオールーキヤ′Ｊヤーである：上 記パートＡを参照のこと）：青仝　アルデヒド末端基（ｈｅａｄｒｎｇ　Ｂｒｏ ｕρ）を供給されりＤＴＰＡ　−グラフト化水’Ｊ＜Ｌ−リジン・）のｔ周製。

ａ）アルキルオキシ力ルボニルー保護されたりシンのＮ−力ルボキノ無水物（Ｎ ＣＡ）の組合を、例１　（Ａ）に開示されるアミノ−７：オール誘導体化Ｅｕｐ ｅｒｇｉＬキャリヤーのアミン基により開始した。保Ｊされたりノンモノ？−１ すなわちε−ベンジルオキシカルボニル−し−リジン（ＢＬ）及びε−フルオレ ニルメチル−オキシカルボニル−Ｌ−゛ノ、／ン（ＦＬ）を、Ｂａｃｈｅｍ（Ｓ ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）がら購入した。

その対応するＮＣＡを、Ｔ肝における固体トリホスゲンとの反応により、Ｗ、　 Ｉｆ、　Ｄａｖｙなど、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４５　（１ ９８８）　５８５９に従って調製した。

ｂ　）　１０ｍモルの８Ｌ−又はＦＬ４ＣＡを、上記例１Ｔ：調製されたアミノ −ジオール誘導体化キャリヤー２ｇ（０，１ｍモル）と共に、Ｒｏｔａｖａｐｏ ｒ装置を用いて４０１ｄノジオキサ：／　（ＢＬ−ＮＣＡ）又はＤＭＦ　（Ｆｌ 、４ＣＡ）　ニおいて室温で３０間、撹拌した。ビーズを排水し、そしてジオキ サン又はＤ肝、次にＣＬＣｌｚにより連続的に洗浄し；最後に、それらを真空下 で乾燥せしめ、そして重量を計った。得られたポリマーの量を、キャリヤーの重 量の上昇により決定した。収率９０％（ＢＬ）、　４０％（ＰＬ）。

ポリ−（ε−フルオレニルメチルオキシカルボニル−し−リジン）（ＰＦＬ）　 Ｍ導体化支持体（５ｇ）のメチルフルオレニル基を、ＤＭＦ中、ピペリノンの２ ０％溶液５０−中で３０分間、撹拌することによって除去しな、次にヒーズをＤ ＭＦ及びＣＨ，Ｃ＋、により返復して洗浄し、そして真空下で乾燥せしめた。保 護解除の収率は１００％近くであった。

対応するポリ　（ε−ヘンジルオキシヵルボニルーし一リジン）（ＰＢＬ）−ｉ 導体化ビーズ（１ｇ）を、ＨＢｒ　：　ＡｃＯＨの３３　：　６７混合物５゜− 中で６０分間、撹拌し、次シこＨ２Ｏ，εＬＯＨ及びＣＨ，Ｃ！２Ｓこより返復 的に洗浄することユニよって保護解除し、そじて真空下で乾燥せしめた。

この場合、ニンヒドリン試Ｍは、不完全である保護解除及び追加の操作がＦＬの 除去ユニよる１００％近くの保護解除ユニ起因する、誘導体化物を好ましくは用 いて実施されたことを示した。

Ｃ）保護解除されたポリ゛Ｊラン（ＰＬ）　ｇ導体化Ｅｕｐｅｒｇｉ【ｌ　ｇを 、ｃａＤＴＰＡ　１　ｇを含むＤＭＳＯ２０−に室温で２４時間、懸濁した。次 に、１ｇのｃａＤＴＰＡを添加し、そじてその混合物をさろに２４時間、撹拌し た。これを、残存する遊離アミノ基の不在がニンヒドリンにより確かめられるま で（＠色）、＜り返じた。次ユニ、ビーズを再び分離し、そして洗浄し、ＤＩＩ ＳＯを除いた。

ｄ　）　ＤＴＰＡ−グラフトされたＰＬ−キャリヤーを、Ｏ，１Ｍのリン酸（０ ，０ＩＭの過ヨウ素酸ナトリウム）緩衝液（ｐＨ７，０）　２０−に懸濁し、そ して暗室で３０分間、撹拌した。キャリヤーを排水じ、そじて同し緩衝液により 洗浄した。濾液及び洗浄液を再結合じ、そして水に対する透析により精製した（ ５００００Ｍ−カットオフ膜）、残留物を凍結乾燥せしめ、約５０％の収率のポ リマーを得た。アルデヒド基の分析は、約１５％のポリマー鎮が反応性−Ｃ８４ 基を供給されたことを示した。この収率：よ、キャリヤーの開放のために適度な 酸化条件を用いて高められ得る二重が推定される。その反応は下記に例示される （単にＦＬ態欅が示されている）： 炎ユ、チオール前基（ｌｅａｄｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）を供給されたＤＴＰＡ−グ ラフト化されたポリ＝（Ｌ−リジン）の調製。

ａ）プロパン−チオールのグラフト化 水、及び熱い硝酸により洗浄された、リン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ７。

１１のＥＤＴＡ）　５０ｄ中、ガラスチップ（Ｆｌｕｋａ　ＡＧがらのＩＪ４節 された多孔性ガラス（ＰＧ−１０−１０００）　４．２４ｇノ懸濁液に、１：１ の酢酸緩衝ン＆／エタノールンｇ液（ｐＨ４）　２０紙中、３−メルヵフ′トブ ロピルトリメト牛シフラン（３，７ｔｌりの撹拌された（２時間）溶液４．２４ ｄを添加した。ガラスチップを一晩、撹拌し、ｌ：１の水／エタノール溶液によ り洗浄し、そしてヅチオノビリジン１．２ｇ　（ＩＯｍモルンを含むエタノール （２（ｌｄ）に再悲屓した。２時間後、ガラスチップを除き、そしてエタノール により洗浄し、次２こ乾燥せしめた。収率は、ガラスＩｇ当たりチオール基７μ モＪしであった。４１４以する技法を、シリカ粒子（Ａｅｒｏｓｉｌ　−Ａ３０ ０）　、アルミナ及び二酸化チタン（Ｐ２５）をチオール化するために適用した 。

ｂ）開始剤のグラフト化 チオール化されたガラスチップ（１，７５ｇ　）を、ＤＭＦ　２０−に懸濁し、 そしてび−ように過剰のスンテアミン（２５０ｍｇ、３　ｍモル）を添加した。

その懸Ｊｌ液を一晩撹拌し、そしてガラスチップを分離し、そして連続的にＤＭ Ｆ、クロロホルム、エタノール、希釈水性酸、ＶｉａＨｃＯｚ及び最後にＤ！’ ＩＦにより洗浄した。

Ｃ）ε−保護されたりシンの重合 この方法は、例２に開示される方法に類イ以した。ＦＬ−ＮＣＡ　１０ｍモルを 、微量のアミン不′に物を排除するために新しく遺留されたＤ１Ｆ５梢において 上記に示されるように巳で調製されたアミン−置換キャリヤー１ｍモルと共に室 温で４８時間、撹拌し、その後、それらを分離し、そしてＤＭＦ及び次２こＣＨ ｚＣｈにより洗浄した。保護解除二よ、ＤｈＦ中、ピペリジン溶液を用いて、例 ２に記載されるようムこしてもたちされた。

ｄ）保護解除されたε−ＮＨ，基に基づ＜　ｃａＤＴＰＡのり゛ラフｌ−（ヒこ の方法は例２に開示される方法に正確に同じであった。（旦し、過剰のｃａＤＴ ＰＡを用い、そして遊離山基の実質的な消耗力く達成されるまで反応の進行を可 能にした。次に、力′ラスチップを分ｍＬ、そしてジオキサン及びＣＨ、Ｃｌ□ 二ユニり洗浄し、ＤＭＳＯを解除した。

ｅ　）　ＤＴＰＡ−グラフト化ポリマーの開放固定されたＤＴＰＡ−誘導体化ボ リ°Ｊシンを有する力゛ラスチ、ブを、リン酸緩衝ａ（０，１Ｍ、ｐＨ７，１ｍ ＭのＥＤＴＡ）　２０ｄｋ二懸濁し、そしてジチオトレイトール１００ｍｇを添 加した。−晩の撹拌の後、力″ラスチ。

ブを濾過により除き、そして同じ緩衝液により洗浄し；濾液は、真空下での蒸発 の後、チオール末端基を有するポリマーの形で生成物を供給した（収率７６％） 。

その反応は下記に要約され、ここでＲは固定ガラスキャリヤーを示す。キャリヤ ーの表面は、シラン誘導体との縮合を可能にする高い密度のヒドロキシ基（吸着 された湿気又はシリカの）を供給される。

３−ｇ−５の亜２ゝ２−１２ ＲＯ−５ｉ−（ＣＨ２１ＲＱ−５ｉ（ＣＨ２ｂ−５−５−（ｃ）１２＋２−？Ｊ Ｍ２の共役体ヘククーにおけるホーミング成分としてアルデヒド官能基を有する ＤＴＰＡ−グラフト化ポリマーの使用。

０．９ｍｇ（約６ｎモル）の非特異的ヒト免疫グロブリンｎ１ｇ　（Ｓｉｇｍａ ）を、１％酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）　０．９ｍに溶解し；次Ｓこある量のアル デヒド末端を有するポリマー（例２を参照のこと）及び水２０μｌ二二溶解され たある量のノアノ硼水素化ナトリウムを添加し、ここで前記量は、１／１０１５ のモル比の抗体／アルデヒド／還元剤を供給するような量である。室温で８時間 の撹拌の後、新たにノアノ硼水素化物の一部を添加−１そして撹拌を１６時間統 一すだ。その後、その混合物を、過剰の還元剤及び未反応ポリマーを除去するた めＳこ、１０ｍＭ（０，１５Ｍの〜ａｃｌ）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）　（ｐＨ ７，２）により　１００，０００Ｍ１ｖカツトオフ膜を通してダイアフィルトレ ートした。

次に、その？８液を、Ｂｅｃｋｉａｎかろ入手でき、そしてＰＢＳ　５こより平 衡化されたケ°ル透過カラム上でクロマトグラフィー処理した。次の２つのピー クを得た：　ｎ１ｇを含む第１の画分及びポリマーにより結合された所望するｎ ｌμを含む第２の画分。この後者の画分を、常磁性イオンを錯化するために直接 的に使用され、そＬでその後、インビボ′ＩＲＩ実験のためシこ注入され得る生 成物を得るために１０．１００１カフ・トオフ膜を用いて限外濾過により濃縮し た。二の材料は、Ｉｇ　１モル当たり約５０〜約１００のＧｄ−”を錯化するこ とができた。他の実験においては、ｎ１ｇが他の標的因子により置換され、そし て類似する結果が得られた。

１＝インビボにδける選択された領域乙こ′ＩＲＩコントラストエンノ八ンサへ を選択的に運ぶだめの注入可能な共役体におけるホーミング成分として千オール 官能基を存するＤＴＰＡ−グラフト化ポリマーの使用。

ｐＢｓｌｌ衝ｉｉ０．９ｍ中、ｎｉｇ　＜又：：１ｎｓｔｉｔｕｔｅＯｆ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｌａｕｓａｎｎｅかるの抗−マウスＣＥＡ　３５）　０．９ｍｇ、’こ、ＤＭＦ 　５０ｇ　ｌ　Ｓこ溶解されたＳｉｇｍａからのＮ−スクシンイミジル−４−（ Ｎ−アレインイミド）ブチレート（ＳＭＢＬＩ）　６０ｎモルを添加した。室温 で１時間放置した後、その溶液を、ＰＢＳにより１０．０Ｏｏｑｈカット−オフ 膜を通してダイアフィルトレートし、過剰のＳＭＢＬＩを除去した。

次に、ＰＢＳ　４０μ！中、ＳＨ−官能基を存するＤＴＰＡ−ポリリシン（例３ を参照のこと）１６ｎモルを添加した。室温で２時間放置した後、その共役体を 精製しく上記例４におけるようにして）、インヒ゛ボｉＲ■　コントラスト増強 試験のために使用される注入可能溶液を供給した。

拠旦 マクロ−架橋されたポリスチレン樹脂のビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ力） らの）を、ＴＦＡ中で４８時間、エツチングし、次ＧこそれらをＤＩＩＦ、ジオ キサン及びＭｅＯＨにより連続的に洗浄した。そのビーズ１５．５　ｇを、８０ −のＣＨＣｌ３にｇ４し、そして臭化第二錫（１，８ｍ、１３．７ｍモル）及び ブロモメチル−メチル−エーテル（１８，６ｄ、２２８ｍモル）の混合物を、窒 素下でＯ′Ｃで撹拌された前記懸濁液に滴下した。ししｆらく放１巳だ後、樹脂 を、ジオキサン−）１ｃ１　３Ｎ　（３：　１）　、ジオキサン、メタノール及 びクロロホルムにより連続的シこ洗浄した。乾燥させたビーズをＤ？１Ｆ　９（ ｌｄに、ｔ！濁し、そしてその懸濁液をＮ２下で１００゛Ｃユこ加熱しく還流コ ンデンサー）、その後、少々のＤＭＦ中、チオ尿素２．１　ｇ　（２７，９ｍモ ル）の溶液を添加し、そしてその混合物を１００゛Ｃで一晩、放置した。ＤＩＩ Ｆにより洗浄した後、支持体を、ビス（３−アミノプロピルアミン）３．６ｇを 含むＤＭＦ　９０ｄに再び懸濁し、そして窒素下で１００’Ｃで一晩加熱した０ 次に、ビーズを、ＤＭＦ、ジオキサン及びクロロホルムにより連続的−二洗浄し 、次にそれ６を真空下で乾燥せしめた。

樹脂＜１５．５　ｇ　、５１２μ当量の一３Ｈ）を、システアミン０．８　ｇ　 （１０，４ｍモル）を含む５０％水性エタノール１４０−に懸濁し、そして混合 物のアリコートによるＩｆ／Ｋｌ溶液の追加の還元が観察されなくなるまで３％ Ｈ，Ｏ□をそれらに添加した。−晩の撹拌の後、ビーズを水性エタノール、次に 水により洗浄した。それらを１：１のモル比のＭｅＯＨ：クロロホルムにより５ ｏｘｈｌｅｔ装置で一晩さａに抽出し、次にそれらを真空下で乾燥せしめた。

アミノ化されたジスルフィドグラフト固相８ｇの部分を、ジオキサン３Ｉｄにｇ ｌし、そしてジオキサン２０！Ｒｉ中、Ｔ−ヘンシルグルタメートのＮ−カルボ キン無水物（ＢＧ−ＮＣＡ）　５．２ｇの溶液を添加した。

３日間の撹拌の後、樹脂を排水し、そしてジオキサン、ＭｅＯＨ及びＣＨＣＩ　 ３により連続的に洗浄した。ベンゼン３５−に懸濁された固定化ポリグルタメー トを有する上記ビーズ４ｇの部分をＨＢｒ！、Ｈより飽和されたベンゼン４０ｍ に置き、そして１時間撹拌し、ＨＢｒ泡立てを行なった０次に、ガスの導入を停 止し、そして撹拌を一晩続け、その後、ビーズを集め、そして通常のようにして すすぎ、ここで最後の溶媒はジクロロメタンであった。その後、固定化されたポ リグルタメートのｉｎカルボキシル官能基を、通常の条件下でエチレンジアミン によりアミン化し、そして遊離アミンを末端に有する側鎖とｃａＤＴＰＡとの反 応を前の例に開示されているようにして生ぜしめた。

最後に、ビーズをＤ？ＩＰに懸濁し、そしてチオール活性化ポリキレート止剤分 子を、３％（溶媒の体積に基づいて）のチオエタノールを添加することによって 開放した。開放性の収率は、１２０°Ｃで７２時間後、５０％を越えた。最終生 成物を、濾過による固相の分離及び減圧下でのａ？ａの蒸発の後に得た。

本発明のＬ！様においては、εＤＴＡ又はＤＴＰＡの構造により例示される一般 的な線状主鎖のポリアルキレンアミノポリカルボキシルキレート化剤が主に使用 された。本来、他の構造を有するキレート化剤、すなわち星形化合物、たとえば ニトリロトリ酢酸及びトリエチレンアミノヒキサ酢酸相同体、並びにミクロテト ラザドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）のような高分子環状キレート化剤及び他の 類似する構造体がまた使用され得る　（たとえばＤＥ−Ａ−３４０１０５２を参 照のこと）。ヒドロキシ、アルコキシ又はアミド基により置換されるｌ又は複数 のカルボキシル基によるポリアルキレンアミノポリカルボン酸の誘導体がまた本 発明の方法において使用でき；アルコキン側基を有するキレート化剤の典型的な 例は、１つの末端力ルボキソがヘンシルオキシ基（ＢＯＰＴＡ）により置換され ているＤＴＰＡ類似体である。

国際ｖ４食報告 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．対象の器官又は組織に選択的に運ばれる常磁性ＭＲＩコントラストエンハン サー種を担持することができる投与可能な標的共役体を供給するために、生存組 織の生物活性細胞マーカー部位に特異的に応答し、そして／又は結合する標的因 子とのカップリングのために使用されるべき共役体成分ＩＩＩを調製するための 方法であって、ここで前記共役体成分ＩＩＩが少なくとも１つのポリアルキルア ミノポリカルボキシルキレート化剤を担持し、そして下記式：▲数式、化学式、 表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中、Ｘ１は−ＣＨＯ又は−ＳＨ基であり；Ａｌ Ｋは−Ｓ−結合により任意に中断されているＣ１〜Ｃ４のアルキレンてあり；Ｚ は−ＣＯＯ−結合により任意に中断されているＣ１〜Ｃ４のアルキレであり；少 なくとも１つのＹはその遊離酸形で又は常磁性イオンとの錯体としてポリアルキ レンアミノポリカルボン酸キレート化剤分子を表わし（もし存在するなら、他の ＹはＨである）、ｎは０〜約１００の整数であり、そしてＭは−ＮＨとＹとの間 の結合を表わし、前記結合はＹの−ＣＯ及びＩＩＩの前記−ＮＨを含むアミド結 合又はＹのアルキレン炭素に結合する有機架橋置換基のいづれかである］を有し ；下記段階： １ａ）下記式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、Ｘは−Ｓ−又は−ＣＨＯＨ− であり、そしてＡＩＫ，Ｚ及びｎは前記で定義された通りである］で表わされる 化合物を、キレート化剤Ｙのアシル化誘導体ＩＩａ（ここでそのカルボキシル官 能基の少なくとも１つがアシル化誘導体形、すなわち分子間又は分子内無水物、 ハリド、反応性アミド又は反応性エステル形で存在する）によりアシル化し；又 は １ｂ）ベンゼンジアゾニウム、ハロアセトアミド−フェニル、ハロアセトアミド −ベンジル、イソシアネートフェニル、イソチオシアネートフェニル及びアゾイ ミデートが選択された反応性架橋官能基によりアルキレン炭素上で置換された前 記ポリアルキレンアミンポリカルボキシルキレート化剤の誘導体ＩＩｂと前記化 合物Ｉとを反応せしめ、ここで前記段階（Ｉａ）又は（Ｉｂ）は、下記式：▲数 式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）で表わされる中間体ＩＶを供給すること であり、次に２）成分ＩＩＩを供給するためにＩＶの−ＸＸ−結合を分離するこ とを含んで成り； ここで式Ｉ及びＩＶにおけるＲが、化合物Ｉ及びＩＶにおける分子の残りが直接 的に又は前記固相の表面上に前もってグラフトされたリンカーの中間手段により 共有結合される固定化固相を定義し、ここで後者が段階（２）における分離の後 、回収可能であり、そしてその後、もう１つの予備サイクルに再使用され得るこ とを特徴とする方法。
2. ２．ポリアルキレンアミノポリカルボン酸キレート化剤の前記誘導体ＩＩａが、 下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を伴って、少なくとも２つのｇｅｍ−アセトキシ基がイミノジ酢酸無水物環の形 で存在する分子間無水物の構造を有する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．Ｒで示される前記固相が多孔性又は非多孔性有機又は無機粒子又はビーズか ら構成される請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記有機相が、ポリスチレン、セファロース、アガロース、チオセファロー ス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリアミド、ポリ イミド及び同様のものから選択されたポリマー樹脂であり、そして前記無機棺が 、ガラス、シリカ、アルミナ、ＺｒＯｚ１，ＴｉＯｚ及び同様のものの多孔性及 び非多孔性濾過ビーズ又は粉末から選択されたガラス、金属酸化物又はセラミッ クである請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．式Ｉ及びＩＶにおいて、Ｘ１が−ＳＨであり、Ｘが−Ｓ−であり、ＡＩＫが エチレンであり、Ｚがテトラメチレンであり、ｎが約５０〜１１０であり、そし てｍが２である請求の範囲第２項記載の方法。
6. ６．式Ｉ及びＩＶにおいて、Ｘ１が−ＳＨであり、Ｘが−Ｓ−であり、ＡＩＫが エチレンであり、Ｚが−（ＣＨ２）−ＣＯＯ（ＣＨ２）２−であり、ｎが５０〜 １１０であり、そしてｍが２である請求の範囲第２項記載の方法。
7. ７．前記分離段階（２）が加水分解によりもたらされる請求の範囲第５又は５項 記載の方法。
8. ８．式Ｉ及びＩＶにおいて、Ｘ１が−ＣＨＯてあり、ＡｌＫが−ＣＨ２Ｓ（ＣＨ ２）２てあり、Ｚが（ＣＨ２）４であり、ｎが５０〜１１０であり、そしてｍが ２である請求の範囲第２項記載の方法。
9. ９．式Ｉ及びＩＶにおいて、Ｘ１がＣＨＯであり、ＸがＣＨＯＨであり、ＡｌＫ が−ＣＨ２Ｓ（ＣＨ２）２であり、Ｚが（ＣＨ２）４であり、ｎがゼロであり、 そしてｍが２である請求の範囲第２項記載の方法。
10. １０．前記分離段階（２）が酸化によりもたらされる請求の範囲第８又は９項記 載の方法。
11. １１．タンパク質へのカップリングのための反応性末端基Ｘ１を有し、そして下 記式ＩＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）〔式中、Ｘ１は−ＣＨＯ又は−Ｓ Ｈ基であり；ＡＩＫは−Ｓ−結合により任意に中断されているＣ１〜Ｃ４のアル キレンであり；Ｚは−ＣＯＯ−結合により任意に中断されているＣ１〜Ｃ４のア ルキレであり；少なくとも１つのＹはその遊離酸形で又は常磁性イオンとの錯体 としてポリアルキレンアミノポリカルボン酸キレート化剤分子を表わし（もし存 在するなら、他のＹはＨである）、ｎは０〜約１００の整数であり、そしてＭは −ＮＨとＹとの間の結合を表わし、前記結合はＹの−ＣＯ及びＩＩＩの前記−Ｎ Ｈを含むアミド結合又はＹのアルキレン炭素に結合する有機架橋置換基のいづれ かである］を有しするポリアルキルアミノポリカルボキシルキレート化剤。
12. １２．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 及び ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求の範囲第１１項記載のキレート化剤。