JP2003531213A - 金属キレート化複合物 - Google Patents
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Abstract
Description
精製、検出または結合するためのその使用方法に向けられ、特に、向上した結合
特異性および安定性を有するニトリロ三酢酸誘導体、該ニトリロ三酢酸誘導体の
製造方法、およびタンパク質を精製、検出または結合するための該ニトリロ三酢
酸誘導体の使用方法に向けられている。
質を精製するための技術として使用されている。初期にこの方法で使用されてい
る樹脂は、単純キレート化剤、例えばアガロース支持物に連結されたイミノ二酢
酸(IDA)であった(Porath ら Nature, 258: p.598-599, 1975)。これは、
様々な金属、例えばCu2+、Zn2+およびNi2+で装填される。これらの樹脂は
、天然源からタンパク質およびペプチドを選択的に捕獲することが見出された(
Porath および Olin, Biochemistry, 22: 1621, 1983; Lonnerdal および Keen,
J. Appl. Biochem., 4: 203, 1983; Sulkowski, Protein Purification: Micro to Macro , p.149-162, R. Burgess 編, Liss New York より発行, NY, 1987)
。分子生物学技術の出現により、金属キレートクロマトグラフィーは、6-ヒス
チジン標識を使用するタンパク質の精製においてより重要な役割を帯びた。例え
ば Dobeli ら, 米国特許第5,284,933号を参照されたい。ポリヒスチジン標識は
、固定化ニッケルと非常に強く結合し、これらの組換分子の同定および精製のた
めに使用することができる。三座キレート化剤IDAは、これらの標識化タンパ
ク質に対し全く選択的であるが、ニッケルは、樹脂からゆっくりと浸出し、その
容量を減少させ、タンパク質のいくらかのダウンストリーム使用を妨げることが
見出された。
つの配位部位を有する金属との使用のために開発された。この樹脂は、タンパク
質含有ポリヒスチジンの精製のために好ましい樹脂となっている。なぜならそれ
は、非常に少ない金属浸出および良好な選択性を有するからである。しかしなが
らこの選択性を得るために、多量の努力が必要である。例えば、この樹脂が、タ
ンパク質と選択的に結合するかどうかを定めるために、イミダゾールの様々な量
を添加する必要があり、この樹脂のタンパク質に対する容量は、望ましい結果を
達成するために最適化されなければならない (Janknecht ら, Proc. Natl. Acad . Sci. , 88: p.8972-8976, 1991, Schmitt ら, Molecular Biology Reports, 88
: p.223-230, 1993)。
またはゲルクロマトグラフィーに使用されるマトリックス、例えば架橋デキスト
ラン、アガロースまたはポリアクリルアミドであり、スペーサーは、好ましくは
−O−CH2−CH(OH)−CH2−または−O−CO−である。〕により表され
る、タンパク質精製のために適当なニトリロ三酢酸樹脂を記載している。Dobeli
ら, 米国特許第4,877,830号第2欄第23〜27行。これらの樹脂は、次式:
せ、次いでこの保護基を開裂させ、該生成物と活性化樹脂とを反応させることに
より製造される。例えば Hochuli ら, Journal of Chromatography, 411 (1987)
p.177-184 を参照されたい。
子を有する金属放射性核種キレート化化合物を記載している。これらのキレート
化化合物は、2つの窒素原子および3つの硫黄原子、2つの窒素原子および4つ
の硫黄原子、または3つの窒素原子および3つの硫黄原子を組み込んでいる。 これらの化合物は、いくつかのニトリロ三酢酸誘導体含有樹脂に対する向上し
た特異性を提供するが、タンパク質含有ポリヒスチジンに対するより大きな結合
特異性を有するキレート化化合物の要求がまだ存在する。
あり、これは、比較的安定であり、タンパク質またはポリペプチドを精製、検出
または結合するために優れた結合特異性を与える。また本発明の目的は、そのよ
うな複合物の製造方法および使用方法を提供することである。
り、 Xは、−(CH2)kCH3、−(CH2)kCOOH、−(CH2)kSO3H、−(CH2 )kPO3H2、−(CH2)kN(J)2または−(CH2)kP(J)2であり、 kは、0〜2の整数であり、 Jは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Yは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 であり、 Zは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 であり、 iは、0〜4の整数である。〕 で示される金属キレート化複合物に向けられている。
ートに向けられている。 本発明は、さらに、金属キレートに対し親和力を有するポリペプチドまたは他
のコンパウンドの精製方法または検出方法に向けられている。この方法は、コン
パウンドと金属キレートとを接触させることを含み、この金属キレートは、金属
および本発明の金属キレート化複合物を含む。
方法に向けられている。この方法は、還元剤の存在下でアミンおよびオキソ酸を
組み合わせることを含む。このアミンは、式:R2R3NH〔式中、R2は、ヒド
ロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、R3は、水素、ヒドロカルビルま
たは置換ヒドロカルビルである。〕で示される。 他の目的および特徴は、いくらかは明らかであり、いくらかは以下で示される
。
する樹脂の選択性のための重要なパラメーターであることを私達は見出した。通
常のニトリロ三酢酸樹脂は、正電荷アミン結合を有し、この結合は、固定化金属
により提供される配位部位へのタンパク質の結合を邪魔し得る、あらゆる負電荷
分子のための結合部位として機能する。酸素、硫黄、セレンおよびアミドは、向
上したキレート化性質を与え得る金属に対し親和力を有し、正電荷アミン結合を
有するありきたりの四座キレート化剤よりもしっかりと金属を結合する。さらに
、ニトリロ窒素および担体との間における非電荷原子の使用は、タンパク質の非
特異的結合を減少させると思われる。
成することができる。得られるキレートを、タンパク質、リンタンパク質、ペプ
チド、ホスホペプチド、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、薬、並びに金属
キレートに対し親和力を有する合成および天然生成物、例えばクラスター化ヒス
チジンまたはポリヒスチジンのような分子の分離または精製のために使用する場
合に、有利には、このキレート化複合物中のエーテル(−O−)、チオエーテル
(−S−)、セレノエーテル(−Se−)またはアミド(−NR1(C=O)−ま
たは−(C=O)NR1−〔式中R1は、水素またはヒドロカルビルである。〕)結
合の存在は、得られるキレートの特異性に寄与する。
り、 Xは、−(CH2)kCH3、−(CH2)kCOOH、−(CH2)kSO3H、−(CH2 )kPO3H2、−(CH2)kN(J)2または−(CH2)kP(J)2、好ましくは−(CH2 )kCOOHまたは−(CH2)kSO3Hであり、 kは、0〜2の整数であり、 Jは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Yは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 、好ましくは−COOHであり、 Zは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 、好ましくは−COOHであり、 iは、0〜4の整数、好ましくは1または2である。〕 で示される複合物(1)に相当する。
とができる化合物を含み得る。固体(または不溶性)担体を、アガロース、セル
ロース、メタクリレートコポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリ
アミド、ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロ
ース、ポリエステル、ポリエチレン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチッ
ク、金、酸化鉄およびポリアクリルアミドを含む群から選ぶことができる。しか
し担体Qは、複合物の残りを担体Qと連結させるために誘導化することができる
あらゆる不溶性または固体の化合物であり得る。好ましい固体担体は、アガロー
スまたは高処理量スクリーニングマイクロタイタープレート(microtiterplate
)である。溶解性担体は、タンパク質、核酸(DNA、RNAおよびオリゴヌク
レオチドを含む)、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリ
アミノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン(streptavidin)、ペプ
チド、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素または他のあらゆる検出分子、
薬、小さい有機化合物、多糖類、および複合物の残りを担体Qと連結させるため
に誘導化することができるあらゆる他の溶解性化合物を含む。タンパク質または
多糖類が、好ましい担体である。
、線状または環式、直鎖または分枝であり得る原子鎖を含む。典型的に、スペー
サーS1を定める原子鎖は、約25原子以下からなる。別の様式で述べれば、ス
ペーサーの主鎖は、約25原子以下からなる。スペーサーS1を定める原子鎖は
、より好ましくは約15原子以下、さらに好ましくは約12原子以下からなる。
スペーサーS1を定める原子鎖は、典型的に炭素、酸素、窒素、硫黄、セレン、
ケイ素およびリンからなる群、好ましくは炭素、酸素、窒素、硫黄およびセレン
からなる群から選ばれる。さらにこの鎖の原子は、水素原子以外、例えばヒドロ
キシ、ケト(=O)またはアシル、例えばアセチルにより置換されているか、ま
たは未置換であり得る。従って鎖は、任意に、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロ
カルビル領域の間に1つまたはそれ以上のエーテル、チオエーテル、セレノエー
テル、アミドまたはアミン結合を含み得る。例示のスペーサーS1は、メチレン
、アルキレンオキシ(−(CH2)aO−)、アルキレンチオエーテル(−(CH2)a S−)、アルキレンセレノエーテル(−(CH2)aSe−)、アルキレンアミド(
−(CH2)aNR1(C=O)−)、アルキレンカルボニル(−(CH2)aCO−)お
よびこれらの組合せ〔式中、aは、一般に1〜約20、R1は、水素またはヒド
ロカルビル、好ましくはアルキルである。〕を含む。1つの実施態様においてス
ペーサーS1は、親水性中性構造であり、ポリペプチドの精製中に帯電し得るア
ミン結合若しくは置換基または他の結合若しくは置換基を含有しない。
得る。Lが−A−T−CH(X)−である場合、キレート化複合物は、次式:
)、セレノエーテル(−Se−)またはアミド(−NR1(C=O)−または−(C
=O)NR1−〔式中R1は、水素またはヒドロカルビルである。〕)結合は、置
換または未置換アルキルまたはアルケニル領域により分子のキレート化位置から
離されている。化学結合以外の場合にTは、好ましくは、置換若しくは未置換C1 〜C6アルキル、または置換若しくは未置換C2〜C6アルケニルである。より好
ましくは、Aは−S−であり、Tは−(CH2)−であり、nは、0〜6、典型的
に0〜4の整数、より典型的に0、1または2である。
酸素、硫黄、セレン、窒素、ケイ素およびリンからなる群、より好ましくは炭素
、酸素、硫黄および窒素のみからなる群、さらに好ましくは炭素、酸素および硫
黄のみからなる群から選ばれる約35原子以下の鎖である。非特異的結合の公算
を減少させるために、存在する場合に窒素は、好ましくはアミド部分の形態であ
る。さらに、炭素鎖の原子が水素以外のもので置換されている場合、炭素鎖原子
は、好ましくはヒドロキシまたはケトで置換されている。好ましい実施態様にお
いてLは、アミノ酸、例えばシスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステ
イン、アスパラギン酸、システイン酸、またはこれらのエステル、例えばこれら
のメチル若しくはエチルエステルから誘導される部分(時おり、断片または残基
と称される。)を含む。
、セレノエーテルまたはアミド結合を使用することにより、好結果が得られる。
酸素、硫黄およびセレン原子およびアミドは、向上したキレート化性質を提供し
得る金属に対し親和力を有し、正電荷のアミン結合を有するありきたりの四座キ
レート化剤よりもしっかりと金属を結合する。さらに、ニトリロ窒素および担体
の間における非電荷原子の使用は、タンパク質の非特異的結合を減少させると思
われる。結合部分L中において、アミンまたは他の帯電部分の代わりにS、O、
Seまたはアミドを使用することは、タンパク質精製用の複合物の安定性および
特異性を向上させる傾向がある。
に相当する複合物を、アミンの還元アルキル化により製造することができる。一
般にモノカルボキシル化およびジカルボキシル化アミンを、式:R2R3NH〔式
中、R2は、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、R3は、水素、ヒ
ドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルである。〕で示されるアミンと、オキソ
酸、例えばグリオキシル酸とを、還元剤、例えばピリジン-ボランコンプレック
ス、ジメチルボラン、トリメチルボランまたはナトリウムシアノボロハイドライ
ドの存在下で反応させることにより製造することができる。アミンが、アミノ酸
、例えばシスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン
酸、システイン酸、またはこれらのエステル、例えばこれらのメチル若しくはエ
チルエステルである場合、反応は、都合よくニトリロ三酢酸誘導体を生ずる。例
えばシスチンのニトリロ酢酸誘導体を、シスチン、オキソ酸、例えばグリオキシ
ル酸、および穏やかな還元剤を組み合せることにより製造することができる。ア
ルコールを、好ましくは溶液の浄化を助けるために含めることができる。代わり
に該技術分野で知られている他の方法を、複合物(2)の製造のために使用する
ことができ、これはハロアルキル酸を含む。
で化学スペーサーS1をリンカーLに共有的に結合させ、次いで担体をスペーサ
ーS1と反応させることにより固定化し、複合物(1)の担体-スペーサーキレー
トコンプレックスを形成することができる。別の実施態様では担体Qを、まずス
ペーサーS1と反応させて、担体-スペーサーコンプレックスを形成する。その後
に担体-スペーサーコンプレックスを、リンカーLを通じてキレートコンプレッ
クスに結合させ、複合物(1)を形成する。 いくつかの場合で、分子のキレート化部分に結合させる前に担体QをS1で活
性化することが有利である。Qがアガロース樹脂である場合、Qを、エピクロロ
ヒドリン、テトラブチルジグリシジルエーテルまたは担体を活性化することがで
きるあらゆる物質を使用して活性化することができる。
または金属酸化物を添加することにより形成することができる。例えば本発明の
金属キレート(固定化形態)は、次式:
であり、Mは、キレートを形成することができるあらゆる金属または金属酸化物
を含む。〕 により表される。好ましい金属および金属酸化物は、Ni、Hg、Ga、Cu、
Ru、Co、Cd、Mg、Mn、Ti、In、Zn、Tc、Rh、Pd、Re、
Fe、Au、PbおよびBiを含む。Fe、Cu、Co、AuおよびNiは、ほ
とんどの用途のために好ましい。一般に、所定の用途のために好ましい金属Mは
、複合物(1)または(2)のキレート化部分の特異的結合能力、および結合ま
たは精製されるコンパウンドに依存している。例えばX、YおよびZが−COO
Hである場合にMは、ポリヒスチジン連鎖でタンパク質を精製するために最適に
は、Niである。コンパウンドが、リンタンパク質、ホスホペプチド質またはホ
スフェート含有分子である場合、Mは、最適にはFeまたはGaである。
水素元素のみからなる有機化合物または基である。これらの部分は、アルキル、
アルケニル、アルキニルおよびアリール部分を含む。これらの部分は、置換また
は未置換であっても良く、好ましくは置換または未置換アルキルである。これら
の部分は、他の脂肪族または環式ヒドロカルビル基、例えばアルクアリール(al
karyl)、アルケンアリールおよびアルキンアリールにより置換されているアル
キル、アルケニル、アルキニルおよびアリール部分も含む。他の明記が無い限り
、これらの部分は、1〜20個の炭素原子を含む。
中に1〜6個の炭素原子、および20個までの炭素原子を有する低級アルキルで
ある。これらは、直鎖、分枝鎖または環式であり得、メチル、エチル、プロピル
、イソプロピル、ブチル、ヘキシルなどを含む。これらは、脂肪族または環式ヒ
ドロカルビル基により置換されていても良い。 他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアルケニル基は、好ましくは主
鎖中に2〜6個の炭素原子、および20個までの炭素原子を有する低級アルケニ
ルである。これらは、直鎖または分枝鎖であり得、エテニル、プロペニル、イソ
プロペニル、ブテニル、イソブテニル、ヘキセニルなどを含む。これらは、脂肪
族または環式ヒドロカルビル基により置換されていても良い。
鎖中に2〜6個の炭素原子、および20個までの炭素原子を有する低級アルキニ
ルである。これらは、直鎖または分枝鎖であり得、エチニル、プロピニル、ブチ
ニル、イソブチニル、ヘキシニルなどを含む。これらは、脂肪族または環式ヒド
ロカルビル基により置換されていても良い。 他の明記が無い限り、本明細書中で記載されるアリール部分は、6〜20個の
炭素原子を有し、フェニルを含む、これらは、本明細書中で定義した様々な置換
基により置換されているヒドロカルビルであり得る。フェニルが、より好ましい
アリールである。
の原子により置換されているヒドロカルビル部分であり、炭素鎖の原子が、ヘテ
ロ原子、例えば窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素、硫黄またはハロゲン原子に
より置換されている部分を含む。これらの置換基は、ヒドロキシ以外であり、低
級アルコキシ(例えばメトキシ、エトキシ、ブトキシ)、ハロゲン(例えばクロ
ロまたはフルオロ)、エーテル、アセタール、ケタール、エステル、ヘテロアリ
ール(例えばフリルまたはチエニル)、アルカンオキシ、アシル、アシルオキシ
、ニトロ、アミノおよびアミドを含む
ビルまたはヘテロアリール部分を含む。これらは、一般式:−C(O)X〔式中、
Xは、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルオキシ、ヒドロカルビルアミノまたはヒ
ドロカルビルチオを含み得る。〕で示される。 本発明で使用されるタンパク質は、抗体、酵素、ヘモグロビン、ホルモン、ポ
リペプチドおよびペプチドを含み、無傷の分子、その断片またはその機能同等物
であり得、遺伝子処理されていても良い。 本発明で使用される抗体は、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体の両方
を含み、無傷の分子、その断片であり得、遺伝子処理されていても良い。
ボキシメチル)-L-システインの製造 エピクロロヒドロリン活性化 Sepharose(商標) の製造: Sepharose(商標) CL 4B (Pharmacia Biotech) 50mlを、ガラス吸込フィル
ター内で水100mlにより3回洗浄した。それを、攪拌機および温度計を取り
付けた3つ口フラスコ内に移した。水30mlおよび10Nの水酸化ナトリウム
4mlを攪拌しながら添加し、次いでエピクロロヒドリン8mlを添加した。混
合物を、46℃で2時間加熱した。活性化樹脂を、脱イオン水800mlを使用
して中性pHに洗浄した。
フラスコ内のエピクロロヒドリン活性化樹脂48mlに添加し、22℃で18時
間穏やかに混合した。混合物を、水200mlで5回洗浄した。遊離アミンに対
する Kaiser 試験 [Kaiser, E. ら, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)] は、深
い青色を与えた。三角フラスコ内の上記湿潤樹脂47.6mlを、1Nの水酸化
ナトリウム50mlおよび1Nの炭酸水素ナトリウム25ml中ブロモ酢酸8.
0gの溶液と、22℃で72時間穏やかに混合した。次いでこの樹脂を、脱イオ
ン水100mlで3回洗浄した。湿潤樹脂16gを、0.2Mの酢酸ナトリウム
50mlおよび無水酢酸2.5mlと、22℃で45分間穏やかに攪拌した。こ
の樹脂を、水100mlで3回洗浄した。Kaiser 試験は、かすかな青色を与え
た。この樹脂を、同じ体積の30%エタノール中4℃で貯蔵した。
ずニッケルをキレート化する樹脂の能力を測定して試験した。樹脂約2.5ml
を、10mg/mlの硫酸ニッケル10mlを用い、50rpmで振盪させなが
ら4℃で一晩、定温放置した。この樹脂を、よく混合し、1×10cmのカラム
内に入れ、余分のニッケル溶液を樹脂から流れ出させた。結合していない硫酸ニ
ッケルを、20〜30倍カラム体積の脱イオン水を使用して樹脂から洗い落とし
た。残っている水を樹脂から排出させた。同じ体積の水を、樹脂に添加し、よく
混合し、次いでこのスラリーを、4℃での貯蔵のためにカラムから取り出した。
充填床樹脂の1ml当量物を、酸加水分解し、次いでICPによりニッケル含有
量について分析した。この樹脂は、樹脂1mlあたりニッケル5.2μmolを
結合した。
充填床樹脂1.5mlを含有する0.5×7.6cmのカラムで行った。樹脂を、
リン酸ナトリウム50mM、塩化ナトリウム0.5Mおよびイミダゾール10m
M(pH8.0)(平衡緩衝液)で平衡させた。ポリヒスチジン標識を有する細菌
性アルカリ性ホスファターゼ含有未加工大腸菌抽出物5mlを、カラムに装填し
た。この未加工抽出物を、CelLytic-B (Sigma Chemical Company) を使用して、
凍結大腸菌細胞ペーストから新しく製造した。カラムを、10倍カラム体積(1
5ml)の平衡緩衝液で洗浄し、未結合タンパク質を除去した。結合物質を、1
0倍カラム体積(15ml)のリン酸ナトリウム50mM、塩化ナトリウム0.
5Mおよびイミダゾール320mM(pH8.0)で溶出した。溶出物質のピー
ク画分をプールした。溶出物質を、ナトリウムドデシルスルフェートポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による精製、アルカリ性ホスファタ
ーゼ活性化および Bradford タンパク質検定によるタンパク質含有量について検
定した。検定結果は、このユニークなキレート樹脂を使用するこの一工程分離手
順からの溶出タンパク質は、本質的に均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを
与えることを示した。
pH9.0)2.0Lを含有するビーカーに入れ、磁気攪拌バーで混合した。グリ
オキシル酸(一水和物)(368.2g、4mol)を、この溶液に混合しなが
ら添加した。この溶液は、シスチン1mmolあたり緩衝液20mlおよびシス
チン1molあたり40molのグリオキシル酸を含有した。氷水浴を、ビーカ
ーのまわりに置き、溶液を15〜25℃の間に冷却した。混合物のpHを、5N
の水酸化ナトリウムで9.0に調節した。氷浴を取り外し、ビーカーを室温に放
置した。8Mのボラン-ピリジンコンプレックス(250ml)を添加した(シ
スチン1molあたり20mol)。エタノールを、20〜50%の間の最終濃
度まで添加し、溶液を浄化した。溶液を、室温で2時間攪拌して反応を完了させ
た。反応が完了するまで、HPLCにより反応を監視した。反応混合物を、より
大きな容器に注ぎ、3倍体積の水で希釈した。塩酸(10N)をゆっくりと添加
し、pHを1.0未満に調節した。反応混合物を30〜60分攪拌した。次いで
反応混合物のpHを、5Nの水酸化ナトリウムを使用して約6.5に調節した。
で希釈して、導電率を5mmho未満に低下させた。pHを、1Nの水酸化ナト
リウムで7.0〜8.5の間に調節した。次いで混合物を、脱イオン水中シスチン
出発物質1mmolあたり10mlの樹脂を使用して平衡させている DEAE-Seph
adex(商標)-HCO3 (Pharmacia Biotech) カラムに適用した。カラム装填が完了し
た時に、カラムを、4倍カラム体積の脱イオン水で洗浄した。次いでカラムを、
4倍カラム体積の0.1M炭酸水素トリエチルアンモニウム(TEAB)で洗浄
した。精製生成物を、カラムから0.5MのTEABで溶出した。プール物質を
、粘着性固体が形成されるまで、Rotovap 内で乾燥した。次いでそれを、最小体
積の水中に溶解させた。それからこの物質を完全に乾燥した。次いで水再懸濁お
よび乾燥工程を、もう一度繰返した。最終固体を、水400mlに溶解させた。
チン1mmolあたり樹脂25ml)。pHを、pH紙により監視した。遊離酸
の転化後、樹脂を濾過により取り出した。濾液を、完全に乾燥するまで、Rotova
p 内で乾燥した。
ボキシメチル)-L-システイン テトラキス(カルボキシメチル)シスチンへの還元
: 粗テトラキス(カルボキシメチル)-L-シスチン(23.65g、0.05mol
)を、1gあたり水5mlで水中に溶解させた。溶液のpHを、1Nの水酸化ナ
トリウムで9.0〜9.2に調節した。次いでトリス(カルボキシエチル)ホスフィ
ン(TCEP)14.34g(0.05mol)を添加し、全てのTCEPが溶解
するまで攪拌した。次いでこれを、10分間定温放置した。還元を、HPLCに
より追跡した。完全還元(一般に20分未満)後にpHを、1Nの塩酸で5.0
〜6.0に調節した。この時点で、生成物を使用することができ、または生成物
を凍結乾燥することができる。収率は、シスチンの出発量に基づき50〜75%
の間であった。
ンの製造および分析 樹脂のエピクロロヒドリン活性化: Sepharose(商標) 6B (Pharmica Biotech) 1Lを、脱イオン水で良く洗浄した
。樹脂を、同じ体積の0.8M水酸化ナトリウム中に懸濁させた。それを、混合
しながらエピクロロヒドリン100mlと組み合わせた。物質を、混合しながら
室温で2時間定温放置した。樹脂を、3倍体積の0.1Mリン酸ナトリウム(p
H7)、次いで6倍体積の脱イオン水で洗浄した。
ニウム中に懸濁させ、室温で一晩穏やかに混合することにより、アミノ Sepharo
se(商標) 6B を製造した。この樹脂を、3倍体積の0.1Mリン酸ナトリウム(
pH7)で洗浄した。この樹脂を、6倍体積の脱イオン水で洗浄した。
ーを製造した。pHを、1NのHClで約5.8〜6.0に調節した。この樹脂ス
ラリーを、室温で維持し、次の反応を低減光条件で行った。0.2Mのイミダゾ
ール中ブロモ酢酸0.15mol(pH5.8)を、スラリーに添加した。次いで
樹脂を穏やかに混合しながら、固体1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド(EDAC)0.75molを添加した。この樹脂スラリーを、
pH6.0を維持しながら室温で4時間穏やかに混合した。未反応アミンを、ア
セチル化によりブロックした。無水酢酸6.5mlを樹脂スラリーに添加し、次
いで30分間穏やかに混合した。次いでこの樹脂を、5倍体積のリン酸ナトリウ
ム(pH7.5)で洗浄した。
樹脂体積の0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.5)中に懸濁させ、50%の樹脂
スラリーを製造した。このスラリーを、窒素で10分間泡立たせ、脱気した。実
施例2に記載するように製造したビス(カルボキシメチル)システイン15mmo
lを添加し、pHを、1Nの水酸化ナトリウムで7.5に調節した。次いでそれ
を、室温で少なくとも2時間混合した。β-メルカプトエタノール(14.3M、
樹脂1Lあたり1.5ml)をスラリーに添加し、定温放置を室温で少なくとも
30分間続けて、未反応ブロモアセチル基をブロックした。次いで樹脂を、3倍
体積のリン酸塩緩衝化塩水、次いで5倍体積の脱イオン水で洗浄した。
例1に記載するように、ニッケルをキレート化する物質の能力をまず測定して試
験した。この樹脂は、樹脂1mlあたりニッケル12.0μmolを結合した。 タンパク質結合および特異性の試験: この樹脂によるポリヒスチジン含有タンパク質の特異的タンパク質結合のため
の使用試験を、実施例1に記載するように行った。検定結果は、このユニークな
キレート樹脂を使用するこの一工程分離手順からの溶出タンパク質は、本質的に
均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを与えることを示した。
ルボキシエチル)-L-システイン酸の製造および分析 L-システイン酸メチルエステルの製造: L-システイン酸1g、ジオキサン中4Nの塩酸8mlおよび乾燥メタノール3
0mlの混合物を、瓶に入れた。この瓶に蓋をし、室温で約96時間貯蔵した。
この透明溶液の薄層クロマトグラフィー[Analtech シリカゲルプレート、n-ブ
タノール:酢酸エチル:酢酸:水(1:1:1:1)、塩素/ヨウ化カリウム-
デンプン試薬(Stewart. J. M および Young. J. D、Solid Phase Peptide Synt
hesis, Pierce Chemical Company, p.120 (1984))]は、95%を超えるシステ
イン酸からエステルへの転化率を示した。溶媒を減圧下で除去し、粘着性固体1
.05gを得た。質量分析は、主要M1+イオンに対し184.3のm/zを与えた
。このイオンの断片化は、123.9のM1+イオンを与えた。これは、カルボキ
シメチル基1つの損失を表す。この固体を、さらなる精製無しで次の工程に使用
した。
: トリエチルアミン(10ml)を、瓶内のDMF12.5ml中上記システイ
ン酸メチルエステル0.8gの混合物に添加し、透明溶液を得た。この混合物に
、ブロモ酢酸4.4gを添加し、次いでpHが約10になるまでトリエチルアミ
ン約15mlを添加した。溶液は、固体塊になった。室温で1ヶ月後、追加のブ
ロモ酢酸1.5gおよびDMF15mlを混合物に添加した。混合物のpHを、
トリエチルアミンで約10に調節した。質量分析は、298.2である主要M-1
イオンのm/zを与えた。
で洗浄した。エチレンジアミン(35ml)を、茶色濾液に添加し、溶液を60
℃で18時間加熱した。透明茶色溶液を、オイル状にまで減圧下で蒸発させた。
水50mlを添加し、再びオイル状に蒸発させた。最後の工程をもう1度繰返し
た。次いで水6.1Lを茶色オイルに添加し、溶液を、DEAE Sephadex(商標) (Ph
armica Biotech) カラム100mlに装填した。このカラムを、水800mlで
洗浄した。生成物を、水および0.1Nの塩酸それぞれ1Lを用いる線状勾配で
溶出した。流量は1分あたり2mlであった。5mlの画分を集めた。黄色生成
物含有画分を検定した。薄層クロマトグラフィー[Analtech シリカゲルプレー
ト、n-ブタノール:酢酸エチル:酢酸:水(1:1:1:1)、塩素/ヨウ化
カリウム-デンプン]を基礎にして、生成物含有画分をプールし、減圧下で乾燥
状態に蒸発させて、淡黄色泡沫固体295mgを得た。質量分析は、328.5
である主要M+1のm/zを与えた。
ースの製造: 上記のように製造したアミノエチルアミド-N-ビスカルボキシメチルシステイ
ン酸を、水3mlに溶解させ、ガラス瓶に移した。この瓶に、0.5Mの炭酸ナ
トリウム10ml、次いで実施例3に記載するように製造した湿潤エピクロロヒ
ドリン活性化 Sepharose(商標) CL 4B 8gを添加した。混合物を、60℃で2
4時間穏やかに振盪した。樹脂を濾過し、水50mlで5回洗浄した。この樹脂
を、30%の200プルーフエタノール20ml中に4℃で貯蔵した。
-システイン酸樹脂を、実施例1に記載するように試験した。この樹脂は、樹脂
1mlあたりニッケル15.6μmolを結合した。 タンパク質結合および特異性の試験: この樹脂によるポリヒスチジン含有タンパク質の特異的タンパク質結合のため
の使用試験を、実施例1に記載するように行った。検定結果は、このユニークな
キレート樹脂を使用するこの一工程分離手順からの溶出タンパク質は、本質的に
均一な細菌性アルカリ性ホスファターゼを与えることを示した。
シメチル)システインの製造および試験 溶解性キレートの製造: ウシ血清アルブミン(272mg、BSA)を、10mg/mlで、0.1M
のリン酸ナトリウム(pH7.2)に溶解させた。ジメチルホルムアミド(DM
F)0.5ml中のブロモ酢酸NHSエステル(57mg、0.24mmol)を
、この溶液に添加し、攪拌しながら室温で2時間定温放置した。反応混合物を、
平衡させた Sephadex(商標) G-50 (Pharmacia Biotech) カラムで脱塩し、0.1
Mのリン酸ナトリウム(pH7.2)中で流した。カラムを、280nmの吸収
により監視した。280nmの吸収を有する画分を組み合わせた。次いでそれら
を、アルゴンで3分間穏やかに泡立たせた。N,N-ビス(カルボキシメチル)シス
テイン(39mg、0.12mmol)を、0.1Mのリン酸ナトリウム(pH8
.0)中に溶解させ(実施例3のように製造)、次いでBSA溶液に添加し、次
いでこの溶液を、アルゴンで泡立たせた。反応混合物を、4℃で一晩定温放置し
た。カップリング効率を、5,5'-ジチオ-ビス-2-ニトロ安息香酸(DTNB)
の反応により監視し、効率は、少なくとも95%であると測定された。混合物を
、10mMの3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)および0.1
5Mの塩化ナトリウムを含有する緩衝液(pH7.0)で溶出した、Sephadex(商
標) G-50 (Pharmacia Biotech) カラムで脱塩した。溶解性BSAキレートを、
10mMのMOPSおよび0.15Mの塩化ナトリウムの緩衝液(pH7.0)中
の0.01Mの硫酸ニッケルで装填した。最終溶液を、Sephadex(商標) G-50 (Ph
armacia Biotech) カラムで脱塩した。脱塩した青色BSAニッケルキレートは
、280nmおよび390nmで吸収ピークを有した。これは、ニッケルが、共
役にキレート化されていることを示す。
清アルブミン担体の使用試験: 上記のように製造したBSAキレートを、0.1Mの炭酸水素ナトリウム(p
H9.6)中で一晩、5μg/mlを使用して、ポリスチレンマイクロタイター
ウェルに吸着させた。マイクロタイタープレートを、PBSを用いて、0.05
%の Tween 20 により3回洗浄した。このプレートをMOPS中0.01Mの硫
酸ニッケル(pH7.0)を用いて室温で30分間定温放置することにより、結
合BSAキレートをニッケルで装填した。このプレートを、水で3回洗浄した。
モデル融合タンパク質、N-末端ポリヒスチジン標識含有細菌性アルカリ性ホス
ファターゼを、MOPS緩衝液中の様々な濃度のBSAニッケルキレートマイク
ロタイターウェル内で定温放置した。このプレートを、MOPS緩衝液で3回洗
浄して、未結合タンパク質を除去した。アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク
質を、アルカリ性ホスファターゼ酵素基質を用いるマイクロタイターウェルの定
温放置により検出した。検定は、アルブミンニッケルキレートに対するポリヒス
チジン融合タンパク質の、キレート特異的結合のかなりの量を示した。
Claims (46)
- 【請求項1】 次式: 【化1】 〔式中、 Qは、担体であり、 S1は、スペーサーであり、 Lは、−A−T−CH(X)−または−C(=O)−であり、 Aは、エーテル、チオエーテル、セレノエーテルまたはアミド結合であり、 Tは、化学結合または置換若しくは未置換のアルキル若しくはアルケニルであ
り、 Xは、−(CH2)kCH3、−(CH2)kCOOH、−(CH2)kSO3H、−(CH2 )kPO3H2、−(CH2)kN(J)2または−(CH2)kP(J)2であり、 kは、0〜2の整数であり、 Jは、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビルであり、 Yは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 であり、 Zは、−COOH、−H、−SO3H、−PO3H2、−N(J)2または−P(J)2 であり、 iは、0〜4の整数である。〕 で示される金属キレート化複合物。 - 【請求項2】 Lが、−A−T−CH(X)−であり、Aが、チオエーテル結
合であり、TおよびXが、請求項1における定義と同じである請求項1に記載の
金属キレート化複合物。 - 【請求項3】 担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリマ
ー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル、
ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチレ
ン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄、ポリアクリルア
ミド、核酸、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミノ
酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン(streptavidin)、ペプチド、
ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素および多糖類からなる群から選択する
請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項4】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、水素または−CO
OHであり、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義
と同じである請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項5】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであり
、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じであ
る請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項6】 S1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ばれ
る約25原子以下の鎖からなる請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項7】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約2
5原子以下の鎖からなる請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項8】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約1
5原子以下の鎖により定義され、Tが、−(CH2)n−〔式中nは、0〜6である
。〕である請求項2に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項9】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、水素または−CO
OHであり、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義
と同じである請求項8に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項10】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項8に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項11】 Lが、−A−T−CH(X)−であり、Aが、エーテル結合
であり、TおよびXが、請求項1における定義と同じである請求項1に記載の金
属キレート化複合物。 - 【請求項12】 S1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ば
れる約25原子以下の鎖からなる請求項11に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項13】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約
25原子以下の鎖からなる請求項11に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項14】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約
15原子以下の鎖からなり、Tが、−(CH2)n−〔式中nは、0〜6である。〕
である請求項11に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項15】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、水素または−C
OOHであり、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定
義と同じである請求項14に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項16】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項14に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項17】 Aが、セレノエーテル結合である請求項1に記載の金属キ
レート化複合物。 - 【請求項18】 Aが、アミド結合である請求項1に記載の金属キレート化
複合物。 - 【請求項19】 担体を、アガロース、セルロース、メタクリレートコポリ
マー、ポリスチレン、ポリプロピレン、紙、ポリアミド、ポリアクリロニトリル
、ポリビニリデン、ポリスルホン、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエチ
レン、シリカ、ガラス、ラテックス、プラスチック、金、酸化鉄、ポリアクリル
アミド、核酸、脂質、リポソーム、合成溶解性ポリマー、タンパク質、ポリアミ
ノ酸、アルブミン、抗体、酵素、ストレプタビジン(streptavidin)、ペプチド
、ホルモン、色素染料、蛍光染料、蛍光色素および多糖類からなる群から選択す
る請求項18に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項20】 S1が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群から選ば
れる約25原子以下の鎖からなる請求項18に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項21】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約
25原子以下の鎖からなる請求項18に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項22】 S1が、炭素、酸素および硫黄からなる群から選ばれる約
15原子以下の鎖からなり、Tが、−(CH2)n−〔式中nは、0〜6である。〕
である請求項18に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項23】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、水素または−C
OOHであり、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定
義と同じである請求項22に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項24】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項22に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項25】 Lが、−A−T−CH(X)−であり、AおよびTが、アミ
ノ酸から誘導されている請求項1に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項26】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項25に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項27】 Lが、−A−T−CH(X)−であり、AおよびTが、シス
チン、ホモシスチン、システイン、ホモシステイン、アスパラギン酸、システイ
ン酸からなる群から選ばれるアミノ酸、またはこれらのエステルから誘導されて
いる請求項1に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項28】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項27に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項29】 Lが、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシステ
イン、アスパラギン酸およびシステイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸部分
を含む請求項1に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項30】 Xが、−(CH2)kCOOHであり、Yが、−COOHであ
り、Zが、水素または−COOHであり、kが、請求項1における定義と同じで
ある請求項29に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項31】 Lが、−C(=O)−である請求項1に記載の金属キレート
化複合物。 - 【請求項32】 次式: 【化2】 【化3】 【化4】 【化5】 【化6】 【化7】 【化8】 〔式中、Qは、請求項1における定義と同じであり、Acは、アセチルである。
〕 からなる群から選ばれる請求項1に記載の金属キレート化複合物。 - 【請求項33】 金属および請求項1に記載の金属キレート化複合物を含む
金属キレート。 - 【請求項34】 金属を、Ni、Hg、Ga、Cu、Ru、Co、Cd、M
g、Mn、Ti、In、Zn、Tc、Rh、Pd、Re、Fe、Au、Pbおよ
びBiからなる群から選択する請求項33に記載の金属キレート。 - 【請求項35】 金属を、Fe、Cu、Co、AuおよびNiからなる群か
ら選択する請求項33に記載の金属キレート。 - 【請求項36】 金属が、ニッケルである請求項33に記載の金属キレート
。 - 【請求項37】 コンパウンドの精製または検出方法であって、該方法は、
コンパウンドと金属キレートとを接触させることを含み、該金属キレートは、金
属および請求項1に記載のキレート化複合物を含む方法。 - 【請求項38】 コンパウンドが、少なくとも2つのヒスチジン残基を有す
るポリペプチドである請求項37に記載の方法。 - 【請求項39】 コンパウンドが、少なくとも6つのヒスチジン残基を有す
るポリペプチドである請求項37に記載の方法。 - 【請求項40】 コンパウンドが、タンパク質、リンタンパク質、ペプチド
、ホスホペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、薬、または金属キレートに対し
親和力を有する合成若しくは天然生成物である請求項37に記載の方法。 - 【請求項41】 モノカルボキシル化またはジカルボキシル化アミンの製造
方法であって、該方法は、還元剤の存在下でアミンおよびオキソ酸を組み合わせ
ることを含み、該アミンは、式:R2R3NH〔式中、R2は、ヒドロカルビルま
たは置換ヒドロカルビルであり、R3は、水素、ヒドロカルビルまたは置換ヒド
ロカルビルである。〕で示される方法。 - 【請求項42】 オキソ酸が、グリオキシル酸である請求項41に記載の方
法。 - 【請求項43】 還元剤が、ピリジン-ボランコンプレックス、ジメチルボ
ラン、トリメチルボランまたはナトリウムシアノボロハイドライドである請求項
41に記載の方法。 - 【請求項44】 アミンが、アミノ酸である請求項41に記載の方法。
- 【請求項45】 アミンが、シスチン、ホモシスチン、システイン、ホモシ
ステイン、アスパラギン酸、システイン酸からなる群から選ばれるアミノ酸、ま
たはこれらのエステルである請求項41に記載の方法。 - 【請求項46】 アミンが、シスチン、システイン、システイン酸またはこ
れらのエステルである請求項41に記載の方法。
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