JP5713602B2 - チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法 - Google Patents
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Description
(1) アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンにおける上記カルボキシル基を活性エステル化させた後、上記チロキシンとアルブミンとを反応させて、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製する工程(a);及び、
上記のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンが溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、前記結合体を精製する工程(b)
を含む、チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法。
(2) 工程(b)において、未反応のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有する未反応のチロキシンを前記水性混合溶媒に溶出させることにより、前記結合体を精製する、(1)に記載の方法。
(3) 工程(b)において、工程(a)で得られた反応産物を前記水性混合溶媒中で透析することにより、前記結合体を精製する、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 工程(b)において、ゲル濾過法により前記結合体を精製する、(1)又は(2)に記載の方法。
(5) 前記水性混合溶媒が、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合物である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 工程(a)を、中性又は塩基性の条件下で行う、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) (1)〜(6)のいずれかに記載の方法により得られる、チロキシンとアルブミンとの結合体。
本発明の酸性の水性混合溶媒において、「アルブミンが沈殿しない」とは、言い換えると、「アルブミンが溶解又は懸濁する」ことを意味する。
なお、本明細書で言うチロキシンとアルブミンとの結合体とは、好ましくは、チロキシンとアルブミンとが共有結合により結合している結合体である。
Lが示すリンカーは好ましくは、−O−、−NH−、−CO−、及び低級アルキレン(好ましくは、炭素数1〜4のアルキレン)から選ばれる基の組合せからなる。
上記一般式(1)で表される化合物のカルボキシル基を活性エステル化した後、該化合物とアルブミンとを反応させて、本発明のチロキシンとアルブミンとの結合体を調製することができる。
<チロキシン及び牛血清アルブミンの結合体の調製>
以下、スキーム1に従って、T4誘導体1からT4誘導体2を合成した。
反応終了後、白色の沈殿物を、遠心分離(3,300g、30 min、4℃)により除去し、上清を回収した。回収した上清を0.22μmのフィルターで濾過し、濾液を、以下に説明の通り、透析による精製に供した。
上記得られた濾液を透析膜チューブ(品名:SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing, 10,000 MWCO, 22 mm×35フィート乾燥直径;プロダクト#:68100;Thermo Scientific社製)に投入した。5Lビーカーに0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含有するイオン交換水(H2O)及びアセトニトリル(AR)(1:1)の混合溶媒5Lを投入した。テックジャム社製リール式pH試験紙(カタログ番号:商品コードNO:KN3138095)を用いて上記混合溶媒のpHを測定したところ1であった。上記濾液の入った透析膜チューブを該混合溶媒中に投入して、室温でゆっくりと攪拌した。
BSA一分子当たりに結合しているT4分子の数を、T4/BSA値として測定した。
測定は、MALDI−TOF−MS測定により行った。マトリックスとしてシナピン酸(シグマアルドリッチ社製)を用いた。0.1%TFAを含む水及びアセトニトリル(1:1)の混合液に、シナピン酸を10mg/mLの濃度で溶解してマトリックス溶液を調製した。該マトリックス溶液とT4−BSA水溶液(精製水)とを、1:1(各5μL)で混合し、マイクロチューブ中で十分ピペッテインングした。その後、MSの基盤プレート上に、該混合液を5μL滴下し、室温で自然乾燥させ、MS測定を行った。測定モードは、liner mode、positive modeで行い、分子量60,000〜100,000で測定した。
上記で得られたT4-BSA試料(凍結乾燥品)中に残存する未反応のT4誘導体を、以下に説明の通り、高速液体クロマトグラフィー法により測定した。以下、測定した値をT4残量(wt%)とする。
測定条件は以下の通りである。
・カラム:東ソー社製 TSKgelODS−100Z(4.6*250mm;ロット番号:P0103)
・ガードカラム:Waters C18
・溶離液A:H2O=100(0.1%TFA)
溶離液B:アセトニトリル=100(0.1%TFA)
※TFAは揮発性であるため、溶離液は用時調製した。
・リンス液:アセトニトリル/H2O=9/1 vol.
・タイムプログラム:
・流量:1.0mL/min
・カラム温度:40℃
・波長:検出器A 254nm
・感度:AUX 2
・注入量:10μL
・サンプル濃度:T4−BSA(凍結乾燥品)10mgをAR/H2O(1/1)の混合溶媒に溶解させた。
(プレートの作成)
150mM NaClで、上記で得られた精製試料(凍結乾燥品)を50μg/mLに調製した。該溶液100μLを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、96ウェルプレートを、室温で、700rpm、1時間、振とうした。反応後、上澄み液を捨て、ブロッキング試薬N102(日油社製)を350μL添加し、96ウェルプレートを、室温で、700rpm、1時間、振とうした。反応終了後、上澄み液を捨て、イムノアッセイスタビライザー(ABI社製)を350μL添加し、96ウェルプレートを、室温で、700rpm、0.5時間、振とうした。その後、上澄み液を捨て、乾燥させた。
T4抗体標識蛍光粒子1%solid(1%BSA、1×PBS水溶液)を1×PBSで0.0025%に希釈した。この分散液を、上記96ウェルプレートの各ウェルに100μL添加し、96ウェルプレートを、室温で、700rpm、1時間、振とうした。反応終了後、上澄み液を捨て、PBST300μLで4回洗浄し、蛍光プレートリーダーで測定(Ex=660nm、Em=680nm)した。なお、「抗体標識蛍光粒子1%solid」とは、ラテックス粒子の固形分濃度が1wt%(1wt%=1gラテックス粒子/100mL水)を意味する。
上記実施例において、透析による精製において表2の精製条件に示す溶媒を用いた以外は、実施例と同様にして結合体を製造した。製造した結合体は、実施例と同様に、上記の各種分析に供試し、評価を行った。
以下の表2及び表3に、実施例及び比較例において製造した結合体の各ロットについて、各種分析結果を示す。また、表2に示す各ロットについて、蛍光粒子法による評価の結果を図1に示す。なお、表2における蛍光粒子法における相対シグナル値(%)は、ロットAを100%とした相対値である。さらに、表3に示す各ロットについて、T4残量(wt%)と蛍光粒子法における平均シグナル値の相関関係を図2に示す。
Claims (3)
- アルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンにおける上記カルボキシル基を活性エステル化させた後、上記チロキシンとアルブミンとを反応させて、チロキシンとアルブミンとの結合体を調製する工程(a);及び、
上記のアルブミンと結合するためのカルボキシル基を有するチロキシンが溶解し、かつアルブミンが沈殿しない酸性の水性混合溶媒を用いて、前記結合体を精製する工程(b)
を含む、チロキシンとアルブミンとの結合体を製造する方法であって、
工程(b)において、工程(a)で得られた反応産物を前記水性混合溶媒中で透析することにより、前記結合体を精製し、
前記酸性の水性混合溶媒が、水、酸、及び有機溶媒から構成され、酸がトリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸、酢酸又はトリクロロ酢酸であり、有機溶媒がアセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド又はメタノールであり、水と有機溶媒との比率は30:70〜70:30であり、水性混合溶媒中の酸の濃度は0.001〜5重量%であり、前記酸性の水性混合溶媒のpHは1〜3である、上記の方法。 - 前記水性混合溶媒が、水、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸の混合物である、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)を、中性又は塩基性の条件下で行う、請求項1又は2に記載の方法。
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