DK158224B

DK158224B - Fremgangsmaade til fremstilling indolderivater

Info

Publication number: DK158224B
Application number: DK384085A
Authority: DK
Inventors: Jan Marcussen; Peter Bjarne Ulvskov
Original assignee: Danske Sukkerfab
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1985-08-23
Publication date: 1990-04-16
Also published as: DE216162T1; AU590603B2; DK158224C; EP0216162A3; ES2002723A6; DK384085A; FI863417A; EP0216162A2; DK384085D0; FI87560C; AU6174786A; JPS62103064A; FI87560B; FI863417A0; ES2007265A6

Description

i

DK 158224 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af indolderivater med den i krav 1 angivne formel I.

5 Mange indolforbindelser er biologisk aktive. Der kan enten være tale om naturligt forekommende stoffer eller rent syntetiske derivater. Det er i kliniske og plantefysiologiske sammenhænge vigtigt i biologiske systemer in vivo og in vitro at kunne bestemme koncentrationerne af disse forbindelser med en 10 høj grad af præcision samt at udvikle standardiserede analysemetoder til bestemmelse af disse forbindelser.

Inden for de sidste år er antallet af publicerede analysemetoder baseret på immunokemiske reaktioner vokset betydeligt.

15 Blandt de vigtigste årsager hertil kan det nævnes, at disse metoder er i besiddelse af en høj følsomhed og specificitet samtidig med, at metoderne har en høj kapacitet, hvilket gør det muligt at foretage mange analyser per dag. Ved at anvende monoklonale i stedet for polyklonale antistoffer er det i reg-20 len muligt, ved passende selektion blandt de antistofproduce-rende hydridomceller, at øge antistofspecificiteten og hermed minimere uønsket krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Anvendelse af monoklonale antistoffer har tillige den store fordel, at disse analysemetoder kan standardiseres. Dette let-25 ter sammenligninger af analyseresultater fra forskellige laboratorier.

Indolforbindelser er lavmolekylære stoffer. I immunologiske samménhænge fungerer disse forbindelser som haptener og er 30 således ikke direkte immunogene. For at opnå et immunrespons er det derfor nødvendigt at koble haptenet covalent til et højmolekylært carriermolekyle, typisk et protein. Herved ændres den oprindelige haptenstruktur, og ligheden med det frie hapten nedsættes. Dette forhold vil give sig udtryk i de produ-35 cerede antistoffers specificitet over for det frie hapten samt i antistoffernes krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Generelt gælder det, at antistofspecificiteten er mindst over for de bindingssteder på haptenmolekylet, hvor den covalente binding er indført.

2

DK 158224 B

Denne problematik kan illustreres ved sammenligning af to typer antistoffer mod det vigtige piantehormon, auxinet indol-3-eddikesyre (IAA) med formlen:

5 -r- CH-COOH

[ I I

H

indol-3-eddikesyre 10 I litteraturen findes beskrevet to metoder til fremstilling af immunogene IAA-proteinkonjugater. Den ene metode bygger på en Mannich-reaktion mellem indolnitrogenatomet og en proteinamino-gruppe. Metoden blev anvendt af N.S. Ranadive og A.H. Sehon, 15 Canadian Journal of Biochemistry, 1967, bind 45, s. 1701-1710, i forbindelse med fremstilling af immunogene 5-hydroxytrypta-min-proteinkonjugater og senere af W. Pengelly og F.Jr. Meinz, Planta, 1977, bind 136, s. 173-180, til fremstilling af immunogene IAA-N-l-proteinkonjugater. Den formodede struktur af det-20 te konjugat er vist ved formlen:

Qj—J ch2-cooh

25 H

NH

Protein IAA-N-l-protei n.

30

Den anden metode bygger på introduktion· af en amidbinding mellem carboxyl syregruppen og en proteinaminogruppe. N.S. Ranadive og A.H. Sehon, Canadian Journal of Biochemistry, 1967, bind 45, s. 1681-1688, har benyttet sådanne immunogene indol-protein-35 konjugater, fremstillet ved en symmetrisk anhydridreaktion mellem 5-hydroxyindol-3-eddikesyre og et protein, til at producere antistoffer over for det frie hapten 5-hydroxyindol-3-eddikesyre. E.W.. Weiler, Planta, 1981, bind 153, s. 319-325, 3

DK 158224 B

har benyttet en blandet anhydridreakti on mellem indol-3-eddike-syre og et protein til at indføre en til svarende amidbinding mellem liganden og en proteinaminogruppe. Strukturen af dette konjugat er vist ved formlen: 5 .0 - T- CH,-C-NH-protein J) i

H

10 IAA-C-l^-protein.

Ved sammenligning af antistoffer produceret over for de to typer IAA-protei nkonjugater iagttages en markant forskel med 15 hensyn til antistoffernes krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Antistoffer produceret imod IAA-N-l-proteinkonjugater er meget specifikke over for indol-C-3-substitution, og der iagttages derfor kun en ringe krydsreakt ion med beslægtede indol-C-3-forbindel ser. Derimod er indolspecificiteten ringe, 20 og der iagttages en betydelig grad af krydsreaktion med andre cykliske eddikesyrederivater, f.eks. naphthalen-l-eddikesyre. Antistoffer produceret imod IAA-C-ll-proteinkonjugater udviser det modsatte specificitetsmønster. Der iagttages således en betydeligt højere grad af krydsreaktion med de andre C-3-sub-25 stituerede indoler end med antistoffer produceret over for IAA-N-l-proteinkonjugater. Derimod er indolspecificiteten af disse antistoffer betydeligt højere sammenlignet med antistoffer produceret over for IAA-N-l-proteinkonjugater, og krydsreaktionsgraden med f.eks. naphthalen-l-eddikesyre er derfor betyde-30 ligt lavere.

Disse resultater viser, at både indolnitrogenatomet og carboxyl-syregruppen er en del af haptenets immunogene determinant. Resultaterne viser tydeligt, at antistofspecificiteten nedsæt-35 tes over for den funktionelle gruppe, der er maskeret af den covalente binding mellem hapten og carriermolekyle.

I forbindelse med fremstilling af et immunogent haptenkonjugat er det vigtigt at opnå en høj substitutionsgrad af det valgte 4

DK 158224 B

carriermolekyle. Mange indoler er labile. Det er derfor vigtigt, at alle reaktioner foregår under milde betingelser. Tillige er det vigtigt, at koblingen imellem hapten og carriermolekyle foregår i et opløsningsmiddelsystem, der er foreneligt 5 med carriermolekylets stabilitet. Dette er specielt vigtigt, når der som carriermolekyle anvendes et labilt eller funktionelt protein, f.eks. et enzym. Kobling ved hjælp af aktiverede estere i rent vandige systemer eller systemer, der indeholder vandblandbare organiske opløsningsmidler, er velegnede i dette 10 trin.

Formålet med denne opfindelse er at tilvejebringe en generel metode, ifølge hvilken det er muligt at fremstille indolcar-rierkonjugater, hvor eventuelle indol-C-3-substituenter frem-15 træder i optimalt analog form med den pågældende frie indol-forbindelse, således at substituenterne som defineret nedenfor er bibeholdt i uforandret, aktiv form.

Den foreliggende opfindelse angår derfor en fremgangsmåde til 20 fremstilling af et indolderivat med formlen D-A-0 ο?-

H

0

H

hvor R3 betegner hydrogen eller -CH2C-OQ, idet Q sammen med 30 eddikesyreresten danner en ester, A betegner en koblingsrest valgt blandt 35 -c- og -C-,

II II

0 S

5

DK 158224 B

og D betegner en nukleofil gruppe med formlen Y-X-D', hvor X betegner en direkte binding eller en ligekædet eller forgrenet, mættet eller umættet hydrocarbonkæde med 1-9 carbonato-mer, D' betegner -NH-, -S- eller -0-, og Y betegner en car-5 boxylsyregruppe, en ester deraf, -OH eller tosylater eller tresylater deraf; hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en forbindelse med formlen H0 10 \ r3 iuu

15 H

hvor r3 har den ovenfor angivne betydning, omsættes med et koblingsmiddel valgt blandt heterocykliske 5- eller 6-leddede carbonyl- og thiocarbonylforbindelser til indførelse af kob-i 20 lingsresten A i molekylet, og efterfølgende med et nukleofilt middel valgt blandt amino-Cj-g-alkansyrer og estere deraf, Cj.g-alkanthioler og tosylater eller tresylater deraf, Ci_g-alkanoler og tosylater eller tresylater deraf,til indførelse af den nukleofile gruppe 0 til opnåelse af en forbindelse med 25 formlen (I).

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har generel karakter. Det er således muligt at binde carriermolekylet covalent til hydroxygruppen i indolderivatet i stilling 4, 5, 6 30 eller 7 ud fra den tilsvarende eventuelt substituerede hydroxy-indolforbindelse. Hydroxyindoler er særligt fordelagtige udgangsmaterialer, idet de er relativt stabile, og en stor del af dem er kommercielt tilgængelige.

35 Endvidere er den omhandlede fremgangsmåde overraskende enkel og kan udføres under meget milde reaktionsbetingelser, hvilket er vigtigt, da mange indoler er labile.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udmærker sig i øvrigt ved, at der udelukkende anvendes ufarlige stoffer, der alle er på fast form og er lette at håndtere.

DK 158224B

6 5 Endelig muliggøres ved den omhandlede fremgangsmåde, at koblingen mellem hapten og carriermolekyle kan foregå i et opløsningsmiddelsystem, hvori carriermolekylet er stabilt. Dette er især vigtigt, når der sammen med carriermolekylet anvendes et labilt eller funktionelt protein, dvs. et protein med en spe-10 cifik funktion.

De ovenfor anførte formål opfyldes fuldt ud af den foreliggende opfindelse. Ved at indføre en covalent binding mellem C-4, C-5, C-6 eller C-7 på indolstrukturen og carriermolekylet op-15 nås den ønskede optimale analogi mellem indolcarrierkonjugatet og den frie indolforbi ndel se med hensyn til eventuelle C-3-substituenter samt med hensyn til selve den heterocykliske in-dolkerne. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede i 4-, 5-, 6- eller 7-stillingen aktiverede indolforbindel-20 ser gør det muligt at styre carriermolekylets substitutionsgrad .

Ved i forbindelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen at variere mængden af den doserede, aktiverede indolforbindelse, 25 kan der opnås en kvantitativ substitution af den pågældende carrierstruktur. Der er i denne forbindelse lagt vægt på at udvikle metoder, hvorved det er muligt at foretage koblingsreaktionen under milde betingelser.

30 Ved en særlig foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er koblingsmidlet valgt blandt l,l'-carbo-nyldiimidazol, l,l'-carbonyldi-(l,2,4-triazol), di(N-succin-imidyl)carbonat, 1,11-carbonyl-bis(2-methylimidazol) og 1,1'- thiocarbonylimidazol.

35 I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omsættes den hydroxylsubstituerede indol med formlen II med et koblingsmiddel valgt blandt carbonyldiimidazol og

DK 158224B

7 carbonylthiodiimidazol til opnåelse af forbindelser, hvor A har betydningen henholdsvis 5 -C- eller -C-.

II II

0 S

Ved anvendelse af et af disse koblingsmidler opnås, at den successive reaktion kan foregå under betingelser, hvor biolo-10 gisk betydende indoler og indolanaloger er stabile.

Når der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som koblingsmiddel anvendes carbonyldiimidazol eller carbonylthiodiimidazol, vaskes den koblede indol med formlen II ved en særlig fore-15 trukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen efter koblingen med en puffer ved en pH-værdi under eller omkring neutralt pH. Herved destrueres overskydende koblingsmiddel, hvorved muligheden for uønskede sidereaktioner minimeres. Tillige opnås der en vis oprensning af den aktiverede 20 indolstruktur ved denne behandling.

Ved en specielt foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som nukleofilt middel en forbindelse, der indeholder en carboxylsyregruppe, hvorved der ind-25 føres en gruppe, der tillader yderligere derivatisering, især kobl i ng.

Nukleofile grupper, som indeholder en carboxylsyregruppe, indføres fordelagtigt ved hjælp af en aminosyre som det nukleo-30 file middel, idet det herved er muligt at indføre de biologisk vigtige amidgrupper i strukturen, således at der opnås en lighed eller forligelighed med naturligt forekommende proteiner.

Ved en særligt fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen omdannes den ovennævnte carboxylsyregruppe til en estergruppe, hvorved yderligere kobling kan foregå un der milde betingelser, hvilket er af betydning for en kobling til labile eller funktionelle proteiner.

DK 158224 B

3

Den her beskrevne metode til fremstilling af indolder ivater vil kunne anvendes som en generel fremgangsmåde til fremstilling af ringkoblede indolkonjugater. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede indolderivater vil således 5 finde anvendelse til fremstilling af immunogene indol-carrier-konjugater med henblik på antistofproduktion samt til fremstilling af enzymrøbe- eller enzymsporestoffer, der vil blive benyttet i analytiske sammenhænge. Videre vil disse indolforbin-delser finde anvendelse ved fremstilling af affinitetsgeler i 10 forbindelse med oprensning af indolspecifikke antistoffer og biologisk vigtige indo!receptorer.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. Eksempel 1 og 3 illustrerer fremgangsmåden ifølge 15 opfindelsen, og eksemplerne 2 og 4 illustrerer anvendelsen af de fremstillede forbindelser.

20 25 30 35 9

DK 158224 B

Eksempel 1

Syntese af 5-(N-(3-sulfosuccinimidoxvcarbonv1ethvl) carbamoyl)-oxv-indolvl-3-eddikesyreethvlester, Na-salt med formlen (4).

5

HO

-rrCH--COOH

h 10 o HO || |>-j- cH2”C-0-CH2-CH3 (i) ^Sr 15 Γ 0

Du o CH2-C-0-CH2-CH3 I (2) 20

O

HOOC-Ca2-CH2-NE-?-0^^^j~—j” Cil2~C"°"CH2"CH3 (3)-» 25 ?

Ha03V\ ? ? 9 o c CH2 ch2 m c ch2-(!:-o-ch2-ch3 (4), o 30 35 10

DK 158224 B

5-hydroxy-i ndo 1y1-3-eddikesyreethy1 ester med formlen (1)

O

ho''Oct 5 mmol 5-hydroxy-i ndo 1y1-3-eddikesyre opløses i 100 ml absolut ethanol, og der tilsættes 0,5 ml koncentreret 37% HCl.

10 Reaktionsblandingen lukkes under Ar og henstår i 24 timer ved stuetemperatur under omrøring. Herefter reduceres volumenet til ca. 50 ml med rotationsfordamper ved 40°C, og der ti Isættes H2O, indtil reaktionsblandingen bliver mælket. Efter nedfrysning til -20°C og optøning til stuetemperatur isoleres (1) 15 i krystallinsk form.

lH-nmr. (90 MHz) δ 7,2 (dd, IH), 7,04 (d, IH), 6,9 (dd, IH), 6,68 (dd, IH), 4,07 (q, J = 7,3 Hz, 2H)., 3,63 (d(al 1 y 1 isk) , 2H) , 2,89 (OH), 2,85 (NH), 1,20 (t,, 3 = 7,3 Hz, 3H).

20

Massespektrum m/e 146 (base peak), 219 5(N-(carboxyethyl)carbamoyl)-oxy-indolyl-3-eddikesyreethylester med formlen (3) 25

' O

HOOC-CH2“CH2-NH-?-O^J^jj^ jj“ Cil2”C ° CH2 CH3 30 5 mmol (1) opløses i 10 ml tør dioxan-, og der tilsættes 10 mmol carbonyldiimidazol . Reaktionsblandingen lukkes under Ar og omrøres i l time. Herefter fjernes opløsningsmidlet i rotationsfordamper ved 400 C. Inddampningsresten, der indeholder 35 (2), vaskes med kold 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH 7,0, og omsættes straks med 7,5 mmol 3-aminopropansyre, opløst i 10 ml 50% H20-dioxan, pH 8,0. Reaktionsblandingen lukkes under Ar og 11

DK 158224 B

omrøres i 24 timer. Herefter reduceres volumenet til ca 2 ml på rotationsfordamper ved 40°C, og der tilsættes 10 ml ethanol. Efter afkøling filtreres de dannede udfældninger fra. Filtratet oprenses ved ionbytningskromatografi på QAE-Sephadex 5 ® 6-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i 50% H20-ethanol, pH 7,0.

Eluering foretages med NaCl-mættet 50% H20-ethanol, idet pH-værdien indstilles på 4,0 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Et-hanolen fjernes fra éluatet ved behandling i rotationsfordamper ved 40°C, og (3) tages op i ethylacetat. Efter tørring 10 over magnesiumsulfat inddampes fraktionen til en olie.

iH-nmr. (90 MHz) 6 7,61 (NH, IH), 7,34 (d, IH), 7,26 (s, IH), 7,14 (d, IH), 6,78 (dd, IH), 4,07 (q, J * 7,1 Hz, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,30 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 1,18 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

15 Massespektrum m/e 146 (base peak), 219, 261, 334.

Fremstilling af 5-(N-(3-sulfonsuccinimidoxycarbonylethyl) carbamoyl )-oxy-indolyl-3-eddikesyreethylester, Na-salt med formlen (4) foretages ved en carbodiimidkondensation imellem (3) 20 og natriumsaltet af N-hydroxysulfosuccinimid som beskrevet af James V.Staros, Biochemistry, 1982, bind 21, s. 3950-3955, nemlig ved, at 2,0 mmol (3) opløses sammen med 2,0 mmol N-hy-droxysulfosuccinimidnatriumsalt i 5,0 ml tørt dimethyl formamid. Der tilsættes 2,2 mmol dicyklohexylcarbodiimid, og reak-25 tionsblandingen omrøres natten over. Efter afkøling til 3eC i 2 timer filtreres det udfældede dicyklohexylurinstof fra. Der tilsættes 100 ml tørt ethylacetat til filtratet, og det udfældede produkt (4) filtreres fra og tørres til konstant vægt under vakuum.

30 0

NaCuS.^' 9 ϊ Λ _ 9 ^Qn-0-1:-ck2-ch2-nk-c-0v^^ 35 0 ^

DK 158224B

12

Eksempel 2

Fremstilling af et hapten-carrierkonjugat med indol-3-eddike-svreethylester eller indol-3-eddikesyre som ligand og et pro-5 tein som carrier.

Bovint serumalbumin (Cohn fraction V) opløses i 0,2 M kalium-phosphatpuffer, pH 7,4, koncentration 100 mg/ml. Til 100 μΐ af denne opløsning tilsættes to portioner å 8 mg 5-(N-(3-sulfosuc-10 c i n imidoxy-carbony1 ethyl} carbamoyl)-oxy-indolyl-3-eddikesyre-ethylester, Na-salt med 2 timers mellemrum. Reaktionsblandingen omrøres i 16 timer ved stuetemperatur. Herefter dialyseres reaktionsblandingen i 5 døgn ved 4°C under omrøring mod 5x2 1 10 mM ka1 iumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,0, med daglige skift 15 af ydervæsken.

Det således færdige indol-3-eddikesyreethylesterkonjugat analyseres ved UV-spektroskopi.

20 Det fremstillede indol-3-eddikesyreethyl esterkonjugat kan omdannes til det tilsvarende indol-3-eddikesyrekonjugat ved ti 1 sidst at fjerne ethylgruppen fra det i øvrigt færdige konju-gat. Dette kan opnås ved at behandle indol-3-eddikesyreethyl-esterkonjugatet med en ethylesterase. I spektret, jf. den 25 efterfølgende f i g. 1, iagttages en indolskulder med vendetangent ved 294-295 nm.

På den efterfølgende figur 1 er nederst vist et UV-spektrum af bovint serumalbumin (.....) og indol-3-eddikesyrekonjugat 30 (-). Øverst er vist et differensspektrum af konjugat og carrierprotein.

Koncentrationerne er justeret ved Xmax, således at A(2 7 8} = 0,45.

35

Eksempel 3

DK 158224 B

13

Syntese af 5-(N-succirnmidoxycarbonvlethvl)carbamoyl)-oxv-indolvl-3-acetoxyacetatmethvlester med formlen (4).

5 HO ,CH2-C00H -k Όζί i

H

10 0 o

li II

HQ .. CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (1) ---^ 15 (, 0 0 0

\ » »II

N-C-0^^ CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (2)--—

” u ICO

L H -J

25 o 0 0

II II H

HOOC-CH2-CH2-NH-C-Q CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (3)_{► fr

H

30

O

Λ 0 0 0 0

I il II II

N-0-C-CH2-CHo-NH-C-0^sx CH2-C-0-CH9-C-0-CH3 (4) .. Y ' Ogr

u I

H

14

DK 158224 B

5-hydroxy-indolyl-3-aeetoxyacetatmethylester med formlen (1) 0 0 hoV#v^_/h2-c-o-ch2-c-o-ch3 (1)

XX

H

5 mmol 5-hydroxyindolyl-3-eddikesyre opløses i 12 ml tørt di-10 methylsulfoxid (resterende vandindhold < 0,03%), og der tilsættes 1 ml triethylamin, hvorefter reaktionsbeholderen lukkes under Ar. Under kraftig omrøring ved stuetemperatur tilsættes 6 mmol bromeddikesyremethylester i løbet af 10 min. Efter endt tilsætning omrøres endnu 30 min ved stuetemperatur. Herefter 15 fortyndes reaktionsblandingen med 25 ml ethylacetat og vaskes med 4 x 50 ml 0,1 M NaHCC>3 efterfulgt af vask med 50 ml mættet vandig NaCl samt til slut med 50 ml vand. Den organiske fase tørres over vandfrit MgS04, hvorefter tørremidlet filtreres fra. Ethylacetat fjernes i rotationsfordamper ved 40°C, hvor-20 ved produktet krystal!i serer. Det krystallinske produkt vaskes med kold ether.

iHnmr (90 MHz) : 7,30-6,62 (m, 4H), 4,65 (s, 2H), 3,77 (d, J = 0,6Hz, 2H), 3,70 25 (s, 3H).

Massespektrum m/e: 263 M+ (15,7), 173 (9,8), 146 (100), 117 (5,3).

30 5-(N-(carboxyethyl) carbamoyl)-oxyi ndolyl-3-acetoxyacetatmeth ylester med formlen (3).

0 0 0 li H ff H00C-CH2“CH2-NH"C'"0\ ___ CH2-C-O-CH2-C-O-CH3

XX

H

Molforhold og reaktionsbetingelser for fremstilling af denne forbindelse er identiske med de i eksempel 1 angivne.

DK 158224 B

15 1H-nmr (90 MHz): 7,45-6,72 (m), 4,66 (s), 3,85 (d, J = 0,61), 3,69 (s), 2,66 (q)·

Kvartet ved ca. 3,4 kan ikke ses for vandtop.

5

Massespektrum m/e: 378 M+ (0,08), 277 (1,8), 263 (22,3), 173 (13,7), 146 (100), 117 (6,6).

10 5-(N-(succinimidoxycarbonylethyl) carbamoyl)-oxyindoly 1-3-acet- oxyacetatmethylester med formlen (4).

O

A o o 0 0

r \ ff H II II

I N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0 CH2-C-O-CH2-OO-CH3 “ V w

o I

H

1 mmol (3) opløses sammen med 1 mmol N-tjydroxysuccinimid i 2,5 20 ml tør, peroxidfrii dioxain. Herefter tilsættes 1,2 mmol M,M'-dicyklohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen lukkes under Ar og omrøres i 12 timer ved stuetemperatur. Det dannede N,N'-dicyklohexylurinstof frafiltreres, og dioxanen fjernes i rotationsfordamper ved 40®C. Den herved dannede olie tages op i 25 1,5 ml acetone, og den sidste rest Ν,Ν'-dicyklohexylurinstof fjernes ved filtrering. Acetone fjernes i rotationsfordamper ved 40°C. Inddampningsresten, der indeholder (4), anvendes uden yderligere oprensning.

30 35 16

DK 158224 B

Eksempel 4

Fremstilling af et hapten-carrierkonjugat med indol-3-eddike-svre som ligand og et protein som carrier j—s-s —^ \ N==' 10 1.

l·3'3« ΐΙΡ—nh2 2.

Ψ o o o o * Il II il vw-nh-c-ch2-ch2-nh-c-o ch2-c-o-ch9-c-o-ch3 'Ct/ V η 3.

s-sm 30 J ml o o o fK " H il W^NH-C-CH2-CH2-NH-C-0 /CH2-C-0-Na + Ό&

35 H

4.

17

DK 158224 B

N/' s "Tf A 0 0 0

Kl 11 11 11 v^^-NH-C-CH2-CH2-NH-C-0/. ^CH2-C-0-, Na +

Oj 10 ^ 1. trin. Fremstilling af BSA-gel 0,5 g bovint serumalbumin (Cohn fraction V) (BSA) opløses i 15 0,1 M NaHC03 og 1 mM Na2EDTA. Proteinopløsningen reagerer nat ten over med 5 g Thiopropyl Sepharose® (Pharmacia Fine Chemicals), der forinden er vasket med 0,1 M NaHC03 og 1 mM Na2C03· Reaktionen finder sted under forsigtig mekanisk omrøring ved stuetemperatur. Herefter vaskes gelen med 0,1 M NaHC03 og 1 mM 20 Na2EDTA, indtil vaskevandet ikke længere viser absorption ved 280 nm. Der vaskes nu med yderligere 5 volumener H20. Ikke-omsatte gluthathion-2-pyridyldisulfidgrupper reduceres ved at behandle den vaskede gel med 20 ml 50 mM mercaptoethanol i 0,1

M eddikesyre, pH-værdi 4,5. Gelen vaskes herefter med 0,1 M

25 eddikesyre med pH-værdi 4,5 efterfulgt af vask med 0,1 M car-bonatpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,0. Der anvendes i begge tilfælde et 10 ganges overskud.

2. trin. Kobling af ligand til BSA-gel 30 5 g BSA-gel suspenderes i 50 ml 0,1 M carbonatpuffer og 1 mM EDTA, pH-værdi 8,0. 0,1 mmol 5-{N-(succinimidoxycarbonylet- hyl)carbamoyl)-oxyindolyl-3-acetoxyacetatmethylester opløses i 1 ml dimethylformamid. Hver halve time tilsættes 0,2 ml af 35 denne opløsning til ge1 suspens ionen under mekanisk omrøring ved stuetemperatur. En halv time efter sidste tilsætning af ligand vaskes gelen først med ækvi1ibreringspuffer og dernæst med 50 mM boratpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,6. Til vask anvendes 100 ml af hver puffer.

DK 158224 B

18 3. trin. Fjernelse af ligandens estergruppe ved behandling med esterase

Gelen (2) suspenderes i 50 ml 50 mM boratpuffer og 1 mM 5 Na2EDTA, og der tilsættes 1300 U esterase (carboxylsyreester-hydrolase EC 3.1.1.1.) opløst i 2 ml af ovennævnte puffer. Reaktionsblandingen omrystes i 48 timer.

4. trin. Reduktion af di sulfi db inding imellem gel og hapten-10 carrierkoniugat

Den esterasebehandlede gel overføres til en søjle og vaskes med 0,1 M natriumphosphatpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,2, indtil vaskevandet ikke længere viser absorption ved 280 nm.

15 Herefter vaskes med yderligere 5 søjlevolumener af samme puffer. Søjlen elueres med 50 mM mercaptoethanol og 0,1 M natri-umphosphatpuffer, pH-værdi 8,2, indtil eluatet ikke længere viser absorption ved 280 nm. Eluatet, der indeholder indol-3-eddikesyre-BSA-konjugatet, dialyseres i 2 timer mod rindende 20 postevand efterfulgt af dialyse mod 2 gange 2 1 50 mM natrium-phosphatpuffer, pH-værdi 7,0.

På fig. 2 er vist et UV-spektrum af dette konjugat (A) samt af BSA (B). Proteinkoncentrationen er i begge tilfælde 0,23 mg 25 BSA per ml 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,0 (proteinbestemmelse efter Lowry's metode).

1%

Idet der anvendes E28O nm = 1° sora ekstinktionskoefficient for 3 0 BSA og €280 = 5200 M_1 som den molære ekstinktionskoefficient for liganden, kan der beregnes en substitutionsgrad på 34,4 mol ligand per mol carrier-BSA.

35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et indolderivat med 5 formlen D-A-0 . XX?* H 0 II hvor R3 betegner hydrogen eller -CH2C-OQ, idet Q sammen med 15 eddikesyreresten danner en ester, A betegner en koblingsrest valgt blandt 20 -c- og -C-, II II

0 S og D betegner en nukleofil gruppe med formlen Y-X-D'" hvor X 25 betegner en direkte binding eller en ligekædet eller forgrenet, mættet eller umættet hydrocarbonkæde med 1-9 carbonato-mer, 0' betegner -NH-, -S- eller -0-, og Y betegner en car-boxylsyregruppe, en ester deraf, -OH eller tosylater eller tresylater deraf, kendetegnet ved, at en forbindel-30 se med formlen 35 DK 158224 B H0 \ R3 bgr H hvor R3 har den ovenfor angivne betydning, omsættes med et 10 koblingsmiddel valgt blandt heterocykliske 5- eller 6-leddede carbonyl- og thiocarbonylforbindelser til indførelse af koblingsresten A i molekylet, og efterfølgende med et nukleofilt middel valgt blandt amino-Ci-g-alkansyrer °9 estere deraf, Cj-g-alkanthioler og tosylater eller tresylater deraf, Cj-g-15 alkanoler og tosylater eller tresylater deraf, til indførelse af den nukleofile gruppe D til opnåelse af en forbindelse med formlen (I).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at koblingsmidlet er valgt blandt 1,1·-carbonyIdiimidazol, 1,1 1carbonyldi-(l,2,4-triazol), di (N-succinimidyl )-carbonat, 1,1'-carbonyl-bis(2-methylimidazol) og 1,1'-thiocarbonylimidazol .

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at koblingsmidlet er valgt blandt carbonyldiimidazol og carbonylthiodiimidazol.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 30 at der som koblingsmiddel anvendes carbonyldiimidazol eller carbonylthiodiimidazol, og at den koblede indolforbindelse vaskes med en puffer ved en pH-værdi under eller omkring neutralt pH.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at der som nukleofilt middel anvendes en forbindelse, der indeholder en carboxylsyregruppe. DK 158224 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der som nukleofilt middel anvendes en aminosyre.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, 5 at carboxylgruppen omdannes til en ester. 10 15 20 25 30 35