FI87560C - Indolderivat och deras anvaendning samt foerfarande foer framstaellning av dem - Google Patents

Description

1 37560

Indolijohdannaiset ja niiden käyttö sekä menetelmä niiden valmistamiseksi Tämä keksintö koskee uusia indolijohdannaisia ja niiden käyttöä sekä menetelmää niiden valmistamiseksi.

Monet ihdoliyhdisteet ovat biologisesti aktiivisia. Ne voivat olla joko luonnossa esiintyviä aineita tai puhtaasti kemiallisia johdannaisia. Kliinisissä ja kasvisfysiologisissa yhteyksissä on tärkeätä, että näiden yhdisteiden konsentraatio biologisissa järjestelmissä in vivo ja in vitro voidaan määrittää erittäin tarkasti ja että voidaan kehittää analyyttisiä standardimenetelmiä näitä yhdisteitä varten.

Viime vuosina on immunokemiallisiin reaktioihin perustuvien julkaistujen reaktioiden lukumäärä kasvanut huomattavasti. Tärkeimpinä syinä tähän voidaan mainita, että nämä menetelmät ovat hyvin herkkiä ja spesifisiä, samalla kun menetelmien kapasiteetti on suuri, minkä ansiosta on mahdollista suorittaa monta analyysia päivässä. Käyttämällä monokloonisia vasta-aineita polyklonaalisten asemesta on tavallisesti mahdollista, valitsemalla sopivalla tavalla hybridoomasoluja tuo_tava vasta-aine, lisätä vasta-aineen spesifisyyttä ja täten minimoida ei-halutut ristireaktiot läheisten yhdisteiden kanssa. Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö antaa lisäksi sen suuren edun, että nämä analyyttiset menetelmät voidaan standardisoida. Tämä helpottaa eri laboratorioiden analyyttisten tulosten vertailua.

Indoliyhdisteet ovat pienimolekyylisiä aineita. Immunologisessa yhteydessä nämä yhdisteet vaikuttavat hapteeneina, joten ne eivät ole suoi «maisenI i immunogoenisLä. Immuunivasteen saamiseksi on täten pakko kytkeä hapteeni kovalenttisesti suuren molekyylipainon omaavaan kantajamolekyyliin, tyypillisesti proteiiniin. Tällöin hapteenin alkuperäinen rakenne muuttuu, ja

2 8756G

samankaltaisuus vapaan hapteenin kanssa vähenee. Tämä seikka heijastuu tuotettujen vasta-aineiden spesifisyyteen vapaaseen hapteeniin nähden ja vasta-aineiden ristireaktioon läheisten yhdisteiden kanssa.

Yleisesti pätee, että vasta-aineen spesifisyys on heikoin niihin hapteeniraolekyylin kohtiin nähden, joihin kovalenttinen sidos liitetään.

Tätä ongelmaa voidaan havainnollista vertaamalla kahta vasta-ainetyyppiä tärkeätä kasvihormonia, auksiini-indoli-3-etikka-happoa (IAA) vastaan, jolla on kaava

-i—CH.COOH

J

H

Selostus kahdesta menetelmästä immunogeenisten IAA-proteiini-konjugaattien valmistamiseksi löytyy kirjallisuudesta. Toinen menetelmä perustuu indolin typpiatornin ja proteiinin aminoryh-män väliseen Mannich-reaktioon. Menetelmää käyttivät N.S. Ranadive ja A.H. Sehon, Canadian Journal of Biochemistry, 1967, voi. 45, s . 1701-1710 valmistaessaan immunogeenisiä 5-hydroksi-tryptamiiniproteiini-konjugaatteja ja myöhemmin W. Pengelly ja F.Jr. Meinz, Planta, 1977, voi. 136, s. 173-180, valmistaessaan immunogeenisiä ΙΛΑ-Ν-1-proteiini-konjugaatteja. Tämän kon-. . jugaatin oletettu kaava on

-[— CH..-COOH

ZJ

CH- I 2

NH

Proteiini

Toinen menetelmä perustuu amidisidoksen liittämiseen karbok-syylihapporyhmän ja proteiiniaminoryhmän väliin. N.S. Ranadive ja A.H. Sehon, Canadian Journal of Biochemistry, 1967, voi. 45, 3 87560 s. 1681-1688, käyttivät tällaisia immunogeenisiä indoli-pro-teiini-konjugaatteja, jotka oli valmistettu 5-hydroksi-indoli- 3-etikkähapon ja proteiinin välisellä symmetrisellä anhydridi-reaktiolla, tuottamaan vasta-aineita vapaata hapteenia 5-hyd-roksi-indoli-3-etikkahappoa vastaan. E.W. Weiler, Planta, 1981, voi. 153, s. 319-325, käytti indoli-3-etikkahapon ja proteiinin välistä seka-anhydridireaktiota samanlaisen amidisidoksen liittämiseksi ligandin ja proteiiniaminoryhmän väliin. Tämän konjugaatin rakenne ilmenee kaavasta

O

Oä-j—Ci^-C-NH-proteiini

H

Verrattaessa vasta-aineita, jotka on tuotettu kahta IAA-pro-teiini-konjugaattia vastaan, huomataan merkittävä ero vasta-aineiden ristireaktioihin nähden läheisten yhdisteiden kanssa. IAA-N-1-proteiini-konjugaatteja vastaan tuotetut vasta-aineet ovat erittäin spesifisiä indoli-C-3-substituoinnissa, ja täten todetaan vain pienehkö ristireagointi läheisten indoli-C-3-yhdisteiden kanssa. Indolispesifisyys on toisaalta pientä, ja todetaan huomattavan suuriasteinen ristireagointi muiden syklisten etikkahappojohdannaisten, esimerkiksi naftaleeni-1-etikkahapon kanssa. IAA-C-1^-proteiini-konjugaatteja vastaan tuotetut vasta-aineet osoittavat päinvastaisen spesifisyysku-vion. Täten todetaan huomattavasti korkeampi ristireagointi-aste muiden C-3-substituoitujen indolien kanssa kuin IAA-N-1-proteiini-konjugaatteja vastaan tuotetuilla vasta-aineilla. Näiden vasta-aineiden indolispesifisyys on kuitenkin huomattavasti korkeampi verrattuna IAA-N-1-proteiini-konjugaatteja vastaan tuotetuilla vasta-aineilla, ja ristireagointiaste esimerkiksi na Γ l .1 I eon i - 1 -el ikkahapon kanssa on näin olion huomattavasti pienempi.

4 87560 Nämä tulokset osoittavat, että indolin typpiatomi sekä kar-boksyylihapporyhmä muodostavat osan hapteenin immunogeenistä determinanttia. Tulokset osoittavat selvästi, että vasta-aineen spesifisyys vähenee funktionaaliseen ryhmään nähden, joka on hapteenin ja kantajamolekyyIin välisen kovalenttisen sidoksen peittämä.

Immunogeenisen hapteeni-konjugaatin valmistuksessa on tärkeätä saada aikaan valitun kantajamolekyylin korkea substituointi-aste. Monet indolit ovat labiileja. Täten on tärkeätä, että kaikki reaktiot tapahtuvat lievissä olosuhteissa. On myös tärkeätä, että hapteenin ja kantajamolekyylin välinen kytkentä suoritetaan liuotinjärjestelmässä, joka vastaa kantajamolekyylin stabiilisuutta. Tämä on erityisen tärkeätä kun labiilia tai funktionaalista proteiinia, esimerkiksi entsyymiä käytetään kantajamolekyyIina. Tässä vaiheessa suoritetaan edullisesti kytkentä aktivoitujen estereiden avulla puhtaasti vesijärjestelmissä tai järjestelmissä, jotka sisältävät veden kanssa sekoittuvia orgaanisia liuottimia.

Tämän keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusia indoli-johdannaisia, joita voidaan käyttää indoli-kantaja-konjugaat-tien valmistukseen, joissa mahdolliset indoli-C-3-substituen-tit esiintyvät optimaalisessa analogiamuodossa vapaaseen in-doliyhdisteeseen nähden niin, että jäljempänä määritellyt substituentit säilyvät muuttumattomassa, aktiivisessa muodossa. Keksinnön tarkoituksena on myös saada aikaan yleinen me-. . netelmä näiden indoli johdannaisten valmistamiseksi.

Keksintö koskee näin ollen uusia indoli johdannaisia, joilla on yleinen kaava I

D-A-0 to"' I i

H

5 8 7 5 6 Q

o jossa R3 on vety tai -CH2H-OQ, jossa Q on suojaryhmä, joka edullisesti on alempialkyyli tai alempialkoksikarbonyylime-tyyli, A on kytkentäjäännös, joka on -C- tai -C-, ja

0 S

D on kaavan Y-X-D'- mukainen nukleofiilinen ryhmä, jossa X on suora sidos tai suora- tai haaraketjuinen, tyydytetty tai tyydyttämätön hiilivetyryhmä, jossa 1-9 hiiliatomia, D' on -NH-, -S- tai -0- ja Y on karboksyylihapporyhmä tai sen aktivoitu esteriryhmä -C00E, jossa E edullisesti on sukkiini-imidyyli tai sulfosukkiini-imidyyli.

Keksinnön mukaiset edulliset indolijohdannaiset ovat yhdisteitä, joissa A on peräisin yhdisteestä, joka on l,l'-karb-onyylidi-imidatsoli tai 1,1'-tiokarbonyylidi-imidatsoli.

Muita edullisia keksinnön mukaisia indolijohdannaisia ovat sellaiset, joissa nukleofiilinen ryhmä D on peräisin yhdisteestä, joka on amino-Ci_6-alkaanihappo.

Erityisen edullisia indolijohdannaisia ovat yhdisteet, joilla on kaava —Λ-"·ί·” Qof ·Ιο-° (III)

H

jossa n on 0-9 ja Q on edellä määritelty suojaryhmä. Tällaisia suojaryhmiä on esitetty esimerkiksi teoksessa Theodora W. Greene: "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Inc., New York, 1981. Q on edullisesti -CH3, -CH2CH3 tai -CH2COOCH3.

Muita edullisia indolijohdannaisia ovat yhdisteet, joilla on kaava 6 8 7 δ 6 ϋ ο ο ο n n ϋ

E-0-C-(CH2 )n-NH-C-0 _CH2-C-0-Q

w I (V)

H

jossa n, Q ja -COOE tarkoittavat samaa kuin edellä.

Erityisen edulli nen keksinnön mukainen indoli johdannainen on yhdiste, jolla on kaava 8 ^ 8 IIOOC-CH2-CHz-NH-C-Ov^?\-p-CI^-C-O-CH^CH-j UJLJ ' tvi»

H

Toinen edullinen keksinnön mukainen indolijohdannainen on yhdiste, jolla on kaava 0 v II o o o I 1 11 N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0 _ch2-c-o-ch2-ch3 V ulj I (vii)

H

jossa V on H tai -S03H tai sen suola, etenkin alkalimetal-lisuola, kuten Li-, Na- tai K-suola.

Edellä esitetyt kaavojen (VI) ja (VII) mukaiset johdannaiset ovat erityisen edullisia keksinnön mukaisia yhdisteitä, jotka mahdollistavat ligandin valmistuksen, joka rakenteeltaan muistuttaa läheisesti tärkeätä kasvihormonia, auksiini-indo-li-3-etikkahappoa.

Esillä oleva keksintö koskee edelleen kaavan (I) mukaisten indoli johdannaisten käyttöä indoli-kantaja-konjugaattien valmistukseen, jolloin etenkin suositeltavia ovat konjugaatit, 7 87560 joissa kantaja on proteiini. Täten on mahdollista valmistaa antigeeniä tai entsyymitunnistajaa, joka optimaalisesti muistuttaa vapaata kasvihormonia, auksiini-indoli-3-etikka-happoa.

Keksintö koskee myös kaavan (I) mukaisten indolijohdannaisten ja etenkin kaavojen (VI) ja (VII) mukaisten indoli johdannaisten käyttöä affiniteettimatriisin valmistukseen. Tuloksena saadaan affiniteettimatriisi edellä esitettyjen vasta-aineiden, jotka vastaavat edellä esitettyjä antigeenejä, puhdistamiseksi tai biologisesti tärkeiden hormonireseptorien puhdistamiseksi .

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan (I) mukaisten indoli johdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että yhdiste, jolla on yleinen kaava II

H

jossa R3 tarkoittaa samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan kytkentäreagenssin kanssa, joka on heterosyklinen 5- tai 6-jäseninen karbonyyli- tai tiokarbonyyliyhdiste, kytkentäjäännöksen A viemiseksi molekyyliin, ja sitten nukleofiilisen reagenssin kanssa, joka sisältää amino-, tioli- tai alkoholi-ryhmän, nukleofiilisen ryhmän liittämiseksi, jolloin muodostuu kaavan I mukainen yhdiste.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on yleislaatuinen. Täten on mahdollista sitoa kantajamolekyyli kovalenttisesti indoli johdannaisen asemassa 4, 5, 6 tai 7 olevaan hydroksi-ryhmään vastaavasta mahdollisesti substituoidusta hydroksi-indoliyhdisteestä. Hydroksi-indolit ovat erityisen edullisia

8 B 7 5 6 O

lähtöaineita, sillä ne ovat suhteellisen stabiileja, ja monet niistä ovat saatavissa markkinoilla.

Edellä esitetyt tarkoitukset saavutetaan täydellisesti esillä olevan keksinnön avulla. Liittämällä kovalenttinen sidos in-dolirakenteen C-4, C-5, C-6 tai C-7 ja kantajamolekyylin väliin saadaan aikaan haluttu optimaalinen analogia indoli-kantaja-konjugaatin ja vapaan indoliyhdisteen välillä mahdollisiin C-3-substituentteihin nähden ja itse heterosykli-seen indolisydämeen nähden. Keksinnön mukaan valmistetut ja asemassa 4, 5, 6 tai 7 aktivoidut indoliyhdisteet mahdollistavat kantajamolekyylin substituointiasteen säätämisen.

Säätämällä annostettua aktivoitua indoliyhdistettä keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan saada aikaan kyseisen kanta-jarakenteen kvantitatiivinen substituointi. Tässä yhteydessä on katsottu tärkeäksi kehittää menetelmiä, jotka mahdollistavat kytkentäreaktion suorittamisen lievissä olosuhteissa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään kytkentäreagens-sina edullisesti 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia tai l,l'-karb-onyylidi-imidatsolia, jolloin saadaan yhdisteitä, joissa A on -C- tai -C-.

A l

Jonkin näistä kytkentäreagensseista käytön tuloksena on, että peräkkäinen reaktio voi tapahtua olosuhteissa, joissa biologisesti merkittävät indolit tai indolianalogit ovat stabiileja.

Käytettäessä karbonyylidi-imidatsolia tai karbonyylitiodi-imidatsolia kvtkentäreagenssina keksinnön mukaisessa menetelmässä aktivoitu indolirakenne pestään keksinnön erityisen edullisen sovellutusmuodon mukaan kytkennän jälkeen puskurilla, jonka pH-arvo on alle neutraalin tai lähes neutraali pH. Tällöin hävitetään ylimäärin oleva kytkentäreagenssi, minkä takia ei-toivottujen sivureaktioiden mahdollisuus tulee mah- dollisimman pieneksi. Tällä käsittelyllä saadaan myös aikaan aktivoidun indolirakenteen tietty puhdistus.

9 S 7 560

Keksinnön mukaisen menetelmän erityisen edullisessa sovellu-tusmuodossa käytetään nukleofiilisena reagenssina yhdistettä, joka sisältää karboksyyliryhmän, minkä johdosta saadaan ryhmä, joka mahdollistaa jatkojohdannaistamisen, etenkin kytkennän .

Karboksyyliryhmän sisältäviä nukleofiilisia ryhmiä liitetään käyttämällä aminohappoa nukleofiilisena reagenssina, jolloin on mahdollista liittää biologisesti aktiivisia ryhmiä, nimittäin amidiryhmä, rakenteeseen.

Keksinnön mukaisen menetelmän erityisen edullisessa sovellu-tusmuodossa edellä mainittu karboksyylihapporyhmä muutetaan aktivoiduksi esteriryhmäksi, minkä johdosta jatkokytkentä voidaan suorittaa lievissä olosuhteissa, mikä on tärkeätä kytkettäessä labiileihin tai funktionaalisiin proteiineihin.

On mahdollista käyttää tässä esitettyä menetelmää indolijohdannaisten valmistamiseksi yleisenä menetelmänä rengaskytket-tyjen konjugaattien valmistamiseksi. Keksinnön mukaisia indoli johdannaisia voidaan näin ollen käyttää immunogeenisten indoli-kantaja-konjugaattien valmistamiseksi vasta-aineiden tuottamisen yhteydessä ja entsyymitunnistajien valmistamiseksi, jotka ovat hyödyllisiä analyyttisessä yhteydessä. Näitä indoli johdannaisia voidaan lisäksi käyttää affiniteettigeeli-en valmistamiseen indolispesifisten vasta-aineiden ja biologisesti tärkeiden indolireseptorien puhdistamisen yhteydessä.

Keksintöä kuvataan seuraavassa lähemmin esimerkkien avulla. Esimerkit 1 ja 3 kuvaavat keksinnön mukaisten indoli johdannaisten valmistusta ja esimerkit 2, 4 ja 5 kuvaavat keksinnön mukaisten indoli johdannaisten käyttöä.

10 37560

Esimerkki 1 5-[N-(3-sulfosukkiini-imidoksikarbonyylietyyli)karbamoyyli]-oksi-indolyyli-3-etikkahappoetyyliesterin synteesi, kaavan (4) mukaisena Na-suolana.

^ -j|-CH2-COOH —>

H

no.. li , , .

Jjj——-jj—ch2-c-o-cii2-Cii3 (1) —>

H

Lv '°Y^|l-j|~CH2-"-°-C,12-C,13 t2’ -*· _ Il ii 0 hooc-ch2-ch2 -NU-C-O ^-rCll,-i-0-CII--CBs (31 —► 11 1 2 23 o n N a O S ft o 1 il _ il I N-0-C-CH2-CH2-NH-C-Q^i^\-pClU-C-O-OU-CH, (4) ,

V U^J

5-hydroksi-indolyyli-3-etikkahappoetyyliesteri, jolla on kaava (1) ^ H0'Y^'Nst----r-CH-.-C-O-CH^-CH^ XX.1

H

5 mmoolia 5-hydroksi-indolyyli-3-etikkahappoa liuotetaan 100 ml:an absoluuttista etanolia, ja lisätään 0,5 ml väkevää 37 % HC1. Roaktiosoos suljetaan aryonikchään ja pidetään häm- n 8 7 56 ϋ mennettynä 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen tilavuus vähennetään noin 50 ml:ksi pyörivän haihduttimen avulla 40°C:ssa ja lisätään H20 kunnes reaktioseos tulee maitomaiseksi. Jäähdyttämisen jälkeen -20°C:en ja huoneenlämpötilaan sulattamisen jälkeen (1) eristetään kiteisenä.

1H-nmr. (90 MHz) 6 7,2 (dd, 1H) , 7,04 (d, 1H) , 6,9 (dd, 1H) , 6,68 (dd, 1H), 4,07 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 3,63 (d(allyylinen), 2H), 2,89 (OH), 2,85 (NH), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

Massaspektri m/e 146 (emäspiikki), 219.

5- (N-(k arboksietoksi)karbamoyyli)-oksi-indolyyli-3-etikka-happoetyyliesteri, jolla on kaava (3)

° O

H00C-L3l2-ui(2-NH-C-0vVv^r\ —— CU -C-0-CI1 -C1I

i il i N s

H

5 mmoolia (1) liuotetaan 10 ml:an kuivaa dioksaania ja lisätään 10 mmoolia karbonyylidi-imidatsolia. Reaktioseos suljetaan argonkehään ja sitä hämmennetään tunnin ajan. Tämän jälkeen liuotin poistetaan pyörivässä haihduttimessa 40°C:ssa. Haihdutusjäännös, joka sisältää (2), pestään kylmällä 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,0, ja saatetaan välittömästi reagoimaan 7,5 mmoolin kanssa 3-aminopropaanihappoa liuotettuna 10 ml:an 50 % H20-dioksaania, pH 8,0. Reaktioseos suljetaan argonkehään ja sitä hämmennetään 24 tuntia. Tämän jälkeen tilavuus vähennetään noin 2 ml:ksi pyörivässä haihduttimessa 40°C:ssa, ja lisätään 10 ml etanolia. Jäähdyttämisen jälkeen syntyneet saostumat suodatetaan. Suodos puhdiste-taan ioninvaihtokromatografiällä käyttäen QAE-Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemicals) 50 %:sessa H20-etanolissa, pH 7,0. Eluointi suoritetaan NaCl-tyydytetyllä 50%:sella H20-etanolilla, jolloin pH säädetään arvoon 4,0 lisäämällä 1N kloorivetyhappoa. Etanoli poistetaan eluaatista käsittelemällä pyörivässä haihduttimessa 40°C:ssa, ja (3) liuotetaan etyyliasetaattiin.Kuivaamisen jälkeen magnesiumsulfaatilla jae haihdutetaan öljyksi.

12 6 7 5 60 1H-nmr. (90 MHz) 6 7,61 (NH, 1H), 7,34 (d, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,14 (d, 1H), 6,78 (dd, 1H), 4,07 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,30 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 1,18 (t, J - 7,1 Hz, 3H).

Massaspektri m/e 146 (emäspiikki), 219, 261, 334.

Kaavan (4) mukaisen 5-[N-(3-sulfosukkiini-imidoksikarbonyy-lietyyli)-karbamoyyli]-oksi-indolyyli-3-etikkahappoetyylies-terin Na-suolan

O

NaOoS II 0 0 0

II II II

N-0-C-CH2-NH-C-0v>^r\ _CH2-C-0-CH2-CH3

Sr XXj

O N

H

valmistus suoritetaan (3):n ja N-hydroksisulfosukkiini-imidin natriumsuolan välisellä karbodi-imidikondensaatiolla James V. Staros'in, Biochemistry, 1982, vol. 21, s. 3950-3955 esittämällä tavalla seuraavasti: 2,0 mmoolia yhdistettä (3) liuotetaan yhdessä 2,0 mmoolin kanssa N-N-hydroksisulfosukkiini-imidin natriumsuolaa 5,0 ml:aan kuivaa dimetyyliformamidia. Lisätään 2,2 mmoolia disykloheksyylikarbodi-imidia ja reaktioseosta sekoitetaan yön yli. Reaktioseos jäähdytetään lämpötilaan 3eC, jossa se pidetään 3 tuntia, minkä jälkeen saostunut disykloheksyy-liurea poistetaan suodattamalla. Suodokseen lisätään 100 ml kuivaa etyyliasetaattia ja saostunut tuote (4) erotetaan suodattamalla ja kuivataan vakiopainoon tyhjössä.

Esimerkki 2

Hapteeni-kantaja-konjugaatin valmistus indoli-3-etikkahap-poetyyliesteri ligandina ja proteiini kantajana.

Naudan seerumialbumiinia (Cohn-jae V) liuotetaan 0,2 M ka-liumfosfaattipuskuriin, pH 7,4, väkevyys 100 mg/ml. 100 pl:aan tätä liuosta lisätään kaksi 8 mg:n erää 5-[N-(3-sul~

13 7 S 6 O

fosukkiini-imidoksikarbonyylietyyli)-karbamoyyli]-oksi-indolyyli-3-e-tikkahappoetyylies-terin Na-suolaa 2 tunnin välein. Reaktioseosta hämmennetään 16 tuntia huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen dialysoidaan reaktioseos 5 päivää 4°C:ssa hämmentäen 5 x 2 1 10 mM kaliumfosfaattia, 0,15 M NaCl:a, pH 7, vastaan vaihtaen päivittäin ulompi neste.

Valmis indoli-3-etikkahappoetyyliesteri-konjugaatti analysoidaan UV-spektroskopialla.

Spektrissä, katso oheista kuvaa 1, todetaan indolipiikki, joka taittuu 294-295 nmrssä.

14 87560

Kuvassa 1 esitetään alhaalla naudan seerumialbumiinin ja indoli-3-etikkahappokonjugaatin (-) UV-spektrit. Yl häällä esitetään konjugaatin ja kantajaproteiinin erotus-spektri.

Väkevyyksiä säädetään ^max:n kohdalla niin, että A(278) = 0,45. Esimerkki 3

Kaavan-(4) mukaisen 5-/N-(sukkiini-imidoksikarbonyylietyyli}-karbamoyy 1 i.7-oks i-indolyy 1 i-3-e tikkahappoester ime tyy lies terin synteesi ----r— C1U-COOII ->

H

O O

ho Π II

nvJV^^j-r—CH0“C-O-CH0-C-O-CH- U) -> i Γ 2

N S H

·' N^\ S O O

' c^-c-ok:h2-c-o-ch3 (2)-> L » il o p H00C-CH2-CH2-NH-C-0^^nv^- CH,-<!-0-CH--(!-0-CH, (3)->

;·; UJ

' 0 H

: ΐ H 0 0 I N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0^\-r—CH,-i“0-CH,-C-0-CH, (4)

V MJ

II

Kaavan (1) mukainen 5-hydroksi-indolyyli-3-asetoksiase- taattimetyy1iesteri is 37560

O P

HO II '1 VV' "I-r— CH„-C-0-CH„—C-O-CH-, (1) il Γ

Ijl ^

H

5 mmoolia 5-hydroksi-indolyyli-3-etikkahappoa liuotetaan 12 ml:an kuivaa dimetyylisulfoksidia (jäännösvesipitoisuus < 0,03 %) ja lisätään 1 ml trietyyliamiinia, ja sitten reak-tioastia suljetaan argonkehään. Voimakkaasti hämmentäen huoneenlämpötilassa lisätään 6 mmoolia bromietikkahappometyyli-esteriä 10 minuutin kuluessa. Kun lisääminen on päättynyt, jatketaan hämmentämistä vielä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten reaktioseosta laimennetaan 25 ml :11a etyyliasetaattia ja pestään 4 x 50 ml :11a 0,1 M NaHCO^, sen jälkeen 50 ml:11a tyydytettyä NaCl-vesiliuosta ja lopuksi 50 ml :11a vettä. Orgaaninen faasi kuivataan vedettömällä MgSO^:lla, minkä jälkeen : " sekkatiivi suodatetaan. Etyyliasetaatti poistetaan pyörivässä ’ haihduttimessa 40°C:ssa, jolloin tuote kiteytyy. Kiteinen tuote pestään kylmällä eetterillä.

^H-nmr (90 MHz): I" 7,30-6,62 (m, 4H), 4,65 (s, 2H), 3,77 (d, J = 0,6Hz, 2H) , 3,70 (s, 3H) .

Massaspektri m/e 263 M+ (15,7), 173 (9,8), 146 (100), 117 (5,3).

5-/N- (karboksietyyli) karbamoyyli7-oksi-indolyyli-3-asetoksi-asetaattimetyyliesteri, jolla on kaava (3): S o o : HOOC-CH2-CH2-NH-C-<Y^-CH^-O-C^-C-O-C^ N ^

Moolisuhteet ja reaktio-olosuhteet tämän yhdisteen valmis- 16 h 7 560 tuksessa ovat samoja Kuin esimerkissä 1 esitetyt.

^H-nmr (90 MHz): 7,45-6,72 (m), 4,66 (s), 3,85 (d, J = 0,61), 3,69 (s), 2,66 (q).

Kvartettia noin 3,4 ei voida nähdä vesipeitteen takia. Massaspektri m/e: 378 M+ (0,08), 277 (1,8), 263 (22,3), 173 (13,7), 146 (100) , 1 17 (6,6) .

5-/N-(sukkiini-imidoksikarbonyylietyyli)karbamoyyli7“oksi-indolyyli-3-asetoksiasetaattimetyyliesteri, jolla on kaava (4).

Ϊ S 0 0 f N-0-C-CH2-CH2-NI1-C-0n^\ -^H2-£-0-CH2-i-0-CH3

T N S

El 1 mxnooli (3) :a liuotetaan yhdessä 1 mmoolin kanssa N-hydroksi-sukkiini-imidiä 2,5 ml:an kuivaa peroksidista vapaata diok-saania. Sen jälkeen lisätään 1,2 mmoolia N,N’-disykloheksyyli-karbodi-imidia. Reaktioseos suljetaan argonkehään ja sitä hämmennetään 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Syntynyt N,N '-disyklo-’· heksyyliurea suodatetaan ja dioksaani poistetaan pyörivässä haihduttimessa 40°C:ssa. Tällöin muodostunut öljy liuotetaan 1,5 ml saan asetonia ja viimeinen jäännös N,N'-disykloheksyy-li-ureaa poistetaan suodattamalla. Asetoni poistetaan pyöri-: vässä haihduttimessa 40°C:ssa. Haihdutusjäännöstä, joka si sältää (4), käytetään ilman lisäpuhdistusta.

Esimerkki 4

Hapteeni-kantaja-konjugaatin valmistus käyttäen indoli-3-etikkahappoa ligandina ja proteiinia kantajana.

i

17 H 7 S 6 O

"] — s-s —(/ V

^ XN -7' 1 .

V

2.

V

Zoo 00

Γ n II 'I

•JH-C-CHo-CHo-NH-C-0-r / --I-CH2-C-0”CH2_C 0-CH3 2 2 1 ii r

^ Ijl x H

3 .

Ill % ^ Il - + NH-C-CH^-CH^-NH-C-0·^^ "v-CH2-C-0 Na

T T

Γ H 4 .

V

HS— Äh Ϊ /- Ϊ - .

^^-NH-C-CHo-CHo-NH-C-0-^ --t— CH2-C-0 Na W 2 2 |! | ^^ n7

H

18 B 7 560

Vaihe 1. BSÄ-geelin valmistus 0,5 g naudan seerumialbumiinia (Cohn-jae V) (BSA) liuotetaan 0,1 M NaHCCUiin, 1 mM Na2EDTA:an. Proteiiniliuos reagoi yli yön 5 g:n kanssa Thiopropyl Sepharose 6B (Pharmacia Fine Chemicals), joka on etukäteen pesty 0,1 M NaHCO^rlla, 1 mM Na2CO^:lla. Reaktio tapahtuu hämmentäen varovasti mekaanisesti huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen geeli pestään 0,1 M NaHCO^rlla, 1 mM Na2EDTA:lla, kunnes pesuvesi ei enää osoita absorptiota 280 nm:ssä. Sitten pestään vielä 5 tila vuudella H20. Reagoimattomat glutationi-2-pyridyylidisulfidi-ryhmät pelkistetään käsittelemällä pestyä geeliä 20 ml :11a 50 mM merkaptoetanolia 0,1 M etikkahapossa, pH-arvo 4,5. Geeli pestään tämän jälkeen 0,1 M etikkahapolla, pH-arvo 4,5 ja tätä seuraa pesu 0,1 M karbonaattipuskurilla, 1 mM Na2EDTA:lla, pH-arvo 8,0. Kummassakin tapauksessa käytetään 10-kertaista ylimäärää.

Vaihe 2. Ligandin kytkentä BSA-geeliin 5 g BSA-geeliä suspendoidaan 50 ml:an 0,1 M karbonaattipusku-ria, 1 mM EDTA:a, pH-arvo 8,0. 0,1 mmoolia 5-/N-(sukkiini-imidoksikarbonyylietyyli)karbamoyyli/-oksi-indolyy1i-3-asetoksi-asetaattimetyyliesteriä liuotetaan 1 ml:an dimetyyliformami-dia. Joka toinen tunti lisätään 0,2 ml tätä liuosta geelisus-pensioon hämmentäen mekaanisesti huoneenlämpötilassa. Puoli tuntia ligandin viimeisen lisäyksen jälkeen geeli pestään ensin tasapainottavalla puskurilla ja sitten 50 mM boraatti-puskurilla, ja 1 mM Na2EDTA:lla, pH-arvo 8,6. Pesuun käytetään 100 ml kumpaakin puskuria.

Vaihe 3. Ligandin esteriryhmän poistaminen käsittelemällä esteraasilla

Geeli (2) suspendoidaan 50 ml:an 500 mM boraattipuskuria, 1 mM Na2EDTA:a, ja lisätään 1300 U esteraasia (karboksyyli-esterihydrolaasi EC 3.1.1.1.) liuotettuna 2 ml:an edellä mainittua puskuria.

Roaktiosoosta ravistellaan 48 tuntia.

i

19 H 7 5 6 O

Vaihe 4. Geelin ja hapteeni-kantaja-konjugaatin välisen disulfidisidoksen pelkistys

Esteraasilla käsitelty geeli siirretään kolonniin ja pestään 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla ja 1 mM Na2EDTA:lla, pH-arvo 8,2, kunnes pesuvesi ei enää osoita absorptiota 280 nm:ssä. Tämän jälkeen pestään vielä 5:llä kolonnin tilavuudella samaa puskuria. Kolonni eluoidaan 50 mM merkaptoetanolaalilla, 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla, pH-arvo 8,2, kunnes eluaatti ei enää osoita absorptiota 280 nm:ssä. Indoli-3-etikkahappo-BSA-konjugaattia sisältävä eluaatti dialysoidaan 2 tuntia juoksevaa vesijohtovettä vastaan, mitä seuraa dialyysi vastaan 2 kertaa 2 1 50 mM natriumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7,0.

Kuvassa 2 esitetään tämän konjugaatin (A) sekä BSA:n (B) UV-spektrit. Proteiinikonsentraatio on kummassakin tapauksessa 0,23 mg BSA millilitraa kohti 0,1 M kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 8,1 (proteiini määritetty Lowry'n menetelmällä).

1% Käyttämällä E2^o nm = ^ ekstinktiokertoimena BSA:lie ja e28o = 5200 M molaarisena ekstinktiokertoimena ligandille, voidaan laskea substituointiasteeksi 34,4 moolia ligandia moolia kantaja-BSA kohti. Huomioidaan etenkin aluetta 290-295 nm, jossa esiintyy sisäänpainuma merkkinä siitä, että UV-1isäabsorptio on peräisin indolirakenteesta.

Esimerkki 5 IIA-C5-agaroosigeelin valmistus 10 g Sepharose 4B:tä (Pharmacia Fine Chemicals, Ruotsi) siirretään Buchner-suppiloon ja pestään seuraavasti: 1) 100 ml :11a 0,8 % NaCl

2) 100 ml:11a 0,4 M NaOH

20 87560

Ylimääräinen neste poistetaan ja geeli siirretään säiliöön, jossa se suspendoidaan 12 ml:aan 0,1 M NaOH. Mekaanisesti sekoittaen lämpötilassa 40°C lisätään 1 ml epikloorihydriiniä (l-kloori-2,3-epoksipropaani). Sekoittamista jatketaan kierrosluvulla 200 kierr./min vielä kaksi tuntia. Epoksidiakti-voitu geeli pestään Buchner-suppilolla seuraavasti: 1) 100 ml:lla 0,9 % NaCl 2) 100 ml :11a vesi/asetonia 80/20 3) 100 mlilla vesi/asetonia 50/50 4) 100 mlslla vesi/asetonia 20/80 5) 100 ml:11a asetonia 6) 100 ml:lla vesi/asetonia 20/80 7) 100 ml:lla vesi/asetonia 50/50 8) 100 mlslla vesi/asetonia 80/20 9) 100 mlslla 0,9 % NaCl.

Otetaan kaksi 0,5 gsn näytettä, jotka analysoidaan epoksidi-sisällön suhteen seuraavassa julkaisussa esitetyllä tavalla: Sundberg, L. ja J. Porath, J. Chromatogr., 1974 90 87. Tulokset: 37 μπιοο1Ϊ3 epoksidia/g märkää geeliä. Tämä rakenne on esitetty jäljempänä kaavalla (1).

Mekaanisesti sekoittaen epoksidiaktivoitu geeli saatetaan reagoimaan 20 ml:n kanssa 10-%:ista ammoniakkivettä. Sekoittamista jatketaan 8 tuntia, minkä jälkeen geeli siirretään Buchner-suppiloon ja pestään seuraavasti: 1) 100 mlslla 0,1 M HC1 2) 100 mlslla vettä

3) 100 mlslla 0,1 M NaOH

4) 100 mlslla vettä

Otetaan kaksi näytettä aminorakenteen määrittämiseksi titraa-malla 0,025 M:llä HClsää. Tulos: 35 μπιοοϋβ aminorakennetta/g märkää geeliä. Tämä rakenne on esitetty jäljempänä kaavalla (2).

21 '37560 5 g aminogeeliä suspendoidaan 10 mlsaan 0,1 M NaHC03 ja siihen lisätään yhden tunnin aikana 1,75 x 10"* moolia 5-(N-(sukkii-ni-imidoksikarbonyylietyyli)karbamoyyli)-oksi-indolyyli-3-asetoksiasetaattimetyyliesteriä liuotettuna 10 ml:aan diok-saania. Mekaanista sekoittamista jatketaan vielä yhden tunnin ajan, minkä jälkeen geeli siirretään Biicher-suppiloon ja pestään seuraavasti: 1) 100 ml :11a 0,1 M NaHC03 2) 100 ml:lla vettä 3) 100 ml:lla vesi/asetonia 80/20 4) 100 ml:lla vesi/asetonia 50/50 5) 100 ml:lla vesi/asetonia 20/80 6) 100 ml :11a asetonia 7) 100 ml :11a vesi/asetonia 20/80 8) 100 ml :11a vesi/asetonia 50/50 9) 100 mltlla vesi/asetonia 80/20 10) 100 ml :11a 50 mM booraksia, 1 mM Na2EDTA.

Geeli (3) suspendoidaan 10 ml:aan 50 mM booraksia, 1 mM Na2EDTA:ta ja käsitellään 1500 U:lla esteraasia (karboksylaa-siesterihydrolaasi EC 3.1.1.1.) 48 tunnin aikana ravistaen. Geeli siirretään Buchner-suppiloon ja pestään 200 ml :11a 50 mM booraksia. Saatu rakenne on esitetty alla kaavalla (4). Käyttäen ligandille ε280 = 5200 M’1 on arvioitu, että geeli sisältää 28 nmoolia ligandia / g märkää geeliä.

|-oh

Vo-CHj-CH -CH, <1)

\ OH

VO-CHfCH -CH2-NHj (2) \ OH O O °

( t ^ H - Γ-O - CH.I-CM

)-0-CH2-CH-CH2-NH-C-CH,-CH,-NH-CO^-^s. 1

> CO

\ OH o O H *U

< 1 " 11 γη-C-OH

Vo-CHfCH-CHj-NH-C-CHj-CHj-NH-CO(/VVCHl > CO -

H

Claims (16)

22 b 7 6 ί;

1. Indolijohdannaiset, joilla on yleinen kaava I D-A-0 to'' I I H 0 3 1 jossa R° on vety tai -CH2C-OQ, jossa Q on suojaryhmä, joka edullisesti on alempialkyyli tai alempialkoksikarbonyylime-tyyli, A on kytkentä jäännös, joka on -C- tai -C-, ja « Il

0 S D on kaavan Y-X-D'- mukainen nukleofiilinen ryhmä, jossa X on suora sidos tai suora- tai haaraketjuinen, tyydytetty tai tyydyttämätön hiilivetyryhmä, jossa on 1-9 hiiliatomia, D' on -NH-, -S- tai -0- ja Y on karboksyylihapporyhmä tai sen aktivoitu esteriryhmä -C00E, jossa E edullisesti on sukkiini-imidyyli tai sulfosukkiini-imidyyli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset indoli johdannaiset, tunnetut siitä, että A on peräisin yhdisteestä, joka on 1,1'-karbonyylidi-imidatsoli tai 1,1'-tiokarbo-nyylidi-imidatsoli.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset indolijohdannaiset, tunnetut siitä, että nukleofiilinen ryhmä D on peräisin yhdisteestä, joka on amino-C^.g-alkaanihappo.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaiset indoli johdannaiset, tunnetut siitä, että niillä on yleinen kaava III 0 0 1 1 H00C-(CH9)n-NH-C-C^ CH?-C-0-Q xu H jossa n on 0-9 ja Q tarkoittaa samaa kuin edellä. 23 -3 7 560

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset indolijohdannaiset, tunnetut siitä, että niillä on yleinen kaava V I v H jossa n on 0-9, Q ja -COOE tarkoittavat samaa kuin edellä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen indolijohdannainen, tunnettu siitä, että sillä on kaava VI O O Il II hooc-ch2-ch2-nh-c-o_^\ _ch2-c-o-ch2-ch3 H

7. Patenttivaatimuksen 5 mukaiset indolijohdannaiset, tunnetut siitä, että niillä on yleinen kaava VII ° O 0 'f' ,,-.,4-00,-0.,->«4-0 -0--01,4-0-™,-«» V w

0. VII H jossa V on H tai -SO3H tai sen suola.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen käyttö indoli-kantaja-konjugaattien tai affiniteettimatriisien valmistukseen .

24 L

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnet-t u siitä, että kantaja on proteiini.

10. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen yhdisteen käyttö affiniteettimatriisien valmistukseen.

11. Menetelmä indoli johdannaisen valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava I D-A-0 I I H 0 jossa on vety tai -CH2^-0Q, jossa Q on suojaryhmä, joka edullisesti on alempialkyyli tai alempialkoksikarbonyylime-tyyli, A on kytkentä jäännös, joka on -C- tai -C-, ja Il II o s D on kaavan Y-X-D'- mukainen nukleofiilinen ryhmä, jossa X on suora sidos tai suora- tai haaraketjuinen, tyydytetty tai tyydyttämätön hiilivetyryhmä, jossa on 1-9 hiiliatomia, D' on -NH-, -S- tai -0- ja Y on karboksyylihapporyhmä tai sen aktivoitu esteriryhmä -C00E, jossa E edullisesti on sukkiini-imidyyli tai sulfosukkiini-imidyyli, tunnettu siitä, että yhdiste, jolla on yleinen kaava II HO to" H jossa tarkoittaa samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan kytkentäreagenssin kanssa, joka on heterosyklinen 5-tai 6-jäseninen karbonyyli- tai tiokarbonyyliyhdiste, kytkentä jäännöksen A viemiseksi molekyyliin, ja sitten nuk- 25 " 7 5 6 O leofiilisen reagenssin kanssa, joka sisältää amino-, tioli-tai alkoholiryhmän, nukleofiilisen ryhmän liittämiseksi, jolloin muodostuu kaavan I mukainen yhdiste.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, t u n -nettu siitä, että kytkentäreagenssi on 1,1'-karbonyylidi-imidatsoli tai 1,1'-tiokarbonyylidi-imidatsoli.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kytkentäreagenssina käytetään 1,1'-karbonyylidi-imidatsolia tai 1,1'-tiokarbonyylidi-imid-atsolia, ja että saatu kytketty indoliyhdiste pestään puskurilla pH-arvossa, joka on alle neutraalin tai noin neutraa li.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 11-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleofiilisena reagenssina käytetään yhdistettä, joka sisältää karboksyylihapporyhmän.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleofiilisena reagenssina käytetään aminohappoa.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että karboksyylihapporyhmä muutetaan mainituksi aktivoiduksi esteriryhmäksi -COOE.