DK158948B - Indolderivater samt anvendelsen heraf ved fremstilling af indol-carrier-konjugater eller affinitetsmatrixer - Google Patents

Description

i

DK 158948 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte indolderiva-ter med den i krav 1 angivne formel I samt anvendelsen heraf.

Mange indolforbindelser er biologisk aktive. Der kan enten 5 være tale om naturligt forekommende stoffer eller rent syntetiske derivater. Det er i kliniske og plantefysiologiske sammenhænge vigtigt i biologiske systemer in vivo og in vitro at kunne bestemme koncentrationerne af disse forbindelser med en høj grad af præcision samt at udvikle standardiserede analyse-10 metoder til bestemmelse af disse forbindelser.

Inden for de sidste år er antallet af publicerede analysemetoder baseret på immunokemiske reaktioner vokset betydeligt. Blandt de vigtigste årsager hertil kan det nævnes, at disse 15 metoder er i besiddelse af en høj følsomhed og specificitet samtidig med, at metoderne har en høj kapacitet, hvilket gør det muligt at foretage mange analyser per dag. Ved at anvende monoklonale i stedet for polyklonale antistoffer er det i reglen muligt, ved passende ^selektion blandt de anti stofproduce-20 rende hydridomceller, ac øge antistofspecificiteten og hermed minimere uønsket krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Anvendelse af monoklonale antistoffer har tillige den store fordel, at disse analysemetoder kan standardiseres. Dette letter sammen!ignmger af analyseresultater fra forskellige labo-25 ratorier.

Indolforbindelser er lavmolekylære stoffer. I immunologiske sammenhænge fungerer disse forbindelser som haptener og er således ikke direkte immunogene. For at opnå et immunrespons 30 er det derfor nødvendigt at koble haptenet covalent til et højmolekylært carriermolekyle, typisk et protein. Herved ændres den oprindelige haptenstruktur, og ligheden med det frie hapten nedsættes. Dette forhold vil give sig udtryk i de producerede antistoffers specificitet over for det frie hapten samt 35 i antistoffernes krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Generelt gælder det, at antistofspecificiteten er mindst over for de bindingssteder på haptenmolekylet, hvor den covalente binding er indført.

2

DK 158948 B

Denne problematik kan illustreres ved sammenligning af to typer antistoffer mod det vigtige pi antehormon, auxinet indol-3-eddikesyre (IAA} med formlen:

_ _p. CH-COOH

Γ jTT

k i ndo1-3-eddikesyre 10 I litteraturen findes beskrevet to metoder til fremstilling af immunogene IAA-proteinkonjugater. Den ene metode bygger på en Mannich-reaktion mellem indolnitrogenatomet og en proteinamino-gruppe. Metoden blev anvendt af N.S. Ranadive og A.H. Sehon, 15 Canadian Journal of Biochemistry, 1967, bind 45, s. 1701-1710, i forbindelse med fremstilling af immunogene 5-hydroxytrypta-min-proteinkonjugater og senere af W. Pengelly og F.Jr. Meinz, Planta, 1977, bind 136, s. 173-180, til fremstilling af immunogene IAA-N-1-proteinkonjugater. Den formodede struktur af det-20 te konjugat er vist ved formlen: -- - ch2-cooh 2 5 1 CH- i Δ

. NH

i

Protein IAA-N-l-protein.

30

Den anden metode bygger på introduktion af en amidbinding mellem carboxyl syregruppen og en proteinaminogruppe. N.S. Ranadive og A.H. Sehon, Canadian Journal of Biochemistry, 1967, bind 45, s. 1681-1688, har benyttet sådanne immunogene indol-protein-35 konjugater, fremstillet ved en symmetrisk anhydridreaktion mellem 5-hydroxyindol-3-eddikesyre og et protein, til at producere antistoffer over for det frie hapten 5-hydroxyindol-3-eddikesyre. E.W.. Weiler, Planta, 1981, bind 153, s. 319-325, 3

DK 158948 B

har benyttet en blandet anhydridreaktion mellem indo!-3-eddike-syre og et protein til at indføre en tilsvarende amidbinding mellem liganden og en proteinaminogruppe. Strukturen af dette konjugat er vist ved formlen: 5 .0 -[- CH2-c-HH-protein y \

H

10 IAA-C-l^-protei n.

Ved sammenligning af antistoffer produceret over for de to typer IAA-proteinkonjugater iagttages en markant forskel med 15 hensyn til antistoffernes krydsreaktion med beslægtede forbindelser. Antistoffer produceret imod IAA-N-l-proteinkonjugater er meget specifikke over for indol-C-3-substitution, og der iagttages derfor kun en ringe krydsreaktion med beslægtede indol-C-3-forbindelser. Derimod er i ndolspec i ficiteten ri nge, 20 og der iagttages en betydelig grad af krydsreaktion med andre cykliske eddikesyrederivater, f.eks. naphthalen-l-eddikesyre. Antistoffer produceret imod IAA-C-ll-proteinkonjugater udviser det modsatte specificitetsmønster. Der iagttages således en betydeligt højere grad af krydsreaktion med de andre C-3-sub-25 stituerede indoler end med antistoffer produceret over for IAA-N-l-proteinkonjugater. Derimod er indolspecificiteten af disse antistoffer betydeligt højere sammenlignet med antistoffer produceret over for IAA-N-l-proteinkonjugater, og krydsreaktionsgraden med f.eks. naphthalen-l-eddikesyre er derfor betyde-30 ligt lavere.

Disse resultater viser, at både indolnitrogenatomet og carboxyl-syregruppen er en del af haptenets immunogene determinant. Resultaterne viser tydeligt, at antistofspecificiteten nedsæt-35 tes over for den funktionelle gruppe, der er maskeret af den covalente bi nding mel lem hapten og carriermolekyle. 1 forbindelse med fremstilling af et immunogent haptenkonjugat er det vigtigt at opnå en høj substitutionsgrad af det valgte

DK 158948 B

4 carriermolekyle. Mange indoler er labile. Det er derfor vigtigt, at alle reaktioner foregår under milde betingelser. Tillige er det vigtigt, at koblingen imellem hapten og carriermo-lekyle foregår i et opløsningsmiddelsystem, der er foreneligt 5 med carriermolekylets stabilitet. Dette er specielt vigtigt, når der som carriermolekyle anvendes et labilt eller funktionelt protein, f.eks. et enzym. Kobling ved hjælp af aktiverede estere i rent vandige systemer eller systemer, der indeholder vandblandbare organiske opløsningsmidler, er velegnede i dette 10 trin.

Formålet med denne opfindelse er at tilvejebringe hidtil ukendte indolcarrierkonjugater, hvor eventuelle indol-C-3-sub-stituenter fremtræder i optimalt analog form med den pågælden-15 de frie indolforbindelse, således at substituenterne som defineret nedenfor er bibeholdt i uforar-dret, aktiv form.

Den foreliggende opfindelse angår derfor hidtil ukendte indol-derivater, som er ejendommelige ved den almene formel I

2 0 D-A-0 ^ ----- R3 υζΧ 25 I . .

H‘ 0

II

hvor R3 betegner hydrogen eller -CH2C-OQ, idet Q sammen med 30 eddikesyreresten danner en ester, A betegner en koblingsrest valgt blandt -C- og -C-,

II II

0 S

og D betegner en nukleofil gruppe med formlen Y-X-D', hvor X betegner en direkte binding eller en ligekædet eller forgrenet, mættet eller umættet hydrocarbonkæde med 1-9 carbonato- 35 5

DK 158948 B

mer, D' betegner -ΝΉ-, -S- eller -O-, og Y betegner en car- boxylsyregruppe, en ester deraf, -OH eller tosylater eller tresylater deraf.

5 Foretrukne indolder i vater ifølge opfindelsen er sådanne, hvor A hidrører fra forbindelser valgt blandt 1,1'-carbonyldiimida-zol, 1,1' -carbonyldi-(1,2,4-triazol), di(N-succinimidyl)-car- bonat, 1,11-carbonyl-bi s(2-methylimidazol) og 1,11-thiocarbo-nylimidazol.

10

Yderligere foretrukne i ndo 1 der i vater ifølge opfindelsen er sådanne, hvor den nukleofile gruppe D hidrører fra forbindelser valgt blandt amino-Cj.g-alkansyrer og estere deraf, Ci_g-alkanthioler og tosylater eller tresylater deraf samt Cj_g-al-15 kanoler og tosylater eller tresylater deraf.

Særligt foretrukne indolderivater er forbindelser med formlen 0 0 20 11 11 H00C-(CH2)n-NH-C-0-j^^-—jpCH2-C-0-Q (III)

H

25 hvori n er 0-9 og Q har den ovenfor anførte betydning, nemlig en beskyttelsesgruppe som anført i f.eks.: Theodora W. Greene: "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons Inc, New York, 1981. Q kan således f.eks. være -CH3, -CH2CH3 eller -CH2C00CH3.

30

Yderligere foretrukne indolderivater er forbindelser med form-1 en 35 6

DK 158948 B

O O O

li II II

E-0-C-(CH2)n-NH-C-0--^^j__jCH2-C-0-Q (V) Ϊ

5 H

hvori n og Q har de ovenfor angivne betydninger, og -COOE er en estergruppe.

Et specielt foretrukket indolderivat ifølge opfindelsen er forbindelsen med formlen 0 0

II II

H00C-CH2-CH2-NH-C-0>^N_^CH2"C-0-CH2-CH3 (VI) 15

H

Et andet specielt foretrukket indolderivat ifølge opfindelsen er forbindelsen med formlen 20 V 0 0 0 0

W II II II

[^IJ-0-C-CH2-CH2-NH-C-0-^J^__^CH2-C-0-CH2-CH3 (VII)

26 I

hvori V er H eller -SO3H eller et salt heraf, særligt foretrukket et alkalimetalsalt, såsom et Li-, Na- eller K-salt.

30 De ovenstående derivater med formlen VI og VII er særligt foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen, idet de muliggør fremstilling af en ligand med stor strukturel lighed med det vigtige piantehormon, auxinet indo!-3-eddikesyre. 1

Den foreliggende opfindelse angår derudover anvendelse af in-dolderivaterne ifølge opfindelsen ved fremstilling af indol-carrier-konjugater, særligt foretrukket konjugater, hvori car-rieren er et protein. Det er herved muligt at fremstille et 7

DK 158948 B

antigen eller et enzymrøbe- eller enzymsporestof med optimal lighed med det frie piantehormon, auxinet indol-3-eddikesyre.

Opfindelsen angår desuden anvendelse af i ndolder i vaterne med 5 formlen I som tidligere defineret, særligt foretrukket indol-derivaterne med formlen VI eller VII ved fremstilling af en affi nitetsmatrix. Herved kan opnås en affi ni titsmatrix til oprensning af de til ovennævnte antigener svarende antistoffer eller til oprensning af biologiske vigtige hormonreceptorer.

10

Opfindelsen vil således finde anvendelse til fremstilling af immunogene indol-carrier-konjugater med henblik på antistofproduktion samt til fremstilling af enzymrøbe- eller enzymsporestoffer, der vil blive benyttet i analytiske sammenhænge.

15 Videre vil disse i ndo 1 der i vater finde anvendelse ved fremstilling af affinitetsgeler i forbindelse med oprensning af indol-specifikke antistoffer og biologisk vigtige indolreceptorer.

20 25 30 35

DK 158948 B

8

Eksempel 1

Syntese af 5-(N-(3-sulfosuccinimidoxycarbonvlethv1) carbamovl)-oxv-indolvl-3-eddikesvreethvlester, Na-salt med formlen (4).

5

HO

-rrCH2-COOH ->

10 L JJ

t U) * ν-=^ o 0 ch2-c-o-ch2-ch3 (21 -> o 9 _r-Cao-C-0-CH7~CHq (3)~> HOOC“ CH 2" CH 2**NH- - 2 2

Na03S^^O Q ^ O

|^-0-C-CH2-CH2-NH-C-0y^s-jj-CH2-å-0-CH2-CH3 (4), 30 ° - 35 9

DK 158948 B

5-hydroxy-indoly1-3-eddikesyreethylester med formlen (1)

O

CH2-C-0-CH2-CH3 5 mmol 5-hydroxy-indolyl-3-eddikesyre opløses i 100 ml absolut ethanol, og der tilsættes 0,5 ml koncentreret 37% HC1.

10 Reaktionsblandingen lukkes under Ar og henstår i 24 timer ved stuetemperatur under omrøring. Herefter reduceres volumenet til ca. 50 ml med rotationsfordamper ved 40°C, og der tilsættes H2O, indtil reaktionsblandingen bliver mælket. Efter nedfrysning til -200C og optøning til stuetemperatur isoleres (1) 15 i krystallinsk form.

iH-nmr. (90 MHz) 5 7,2 (dd, IH), 7,04 (d, IH), 6,9 (dd, IH), 6,68 (dd, IH), 4,07 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 3,63 (d(allylisk), 2H), 2,89 (OH), 2,85 (NH), 1,20 (t, J = 7,3 Hz, 3H).

20

Massespektrum m/e 146 (base peak), 219 5(N-(carboxyethyl) carbamoyl)-oxy-indoly1-3-eddikesyreethyl ester med formlen (3) 25

O

H00C-CH2-CH2-NH-?-0^|^j|- J* Ctt2-C“0-CH2-CH3 30 5 mmol (1) opløses i 10 ml tør dioxan, og der tilsættes 10 mmol carbonyldiimidazol. Reaktionsblandingen lukkes under Ar og omrøres i 1 time. Herefter fjernes opløsningsmidlet i rotationsfordamper ved 40°C. Inddampningsresten, der indeholder 35 (2), vaskes med kold 0,1 M natriumphosphatpuffer, pH 7,0, og omsættes straks med 7,5 mmol 3-aminopropansyre, opløst i 10 ml 50% H20-dioxan, pH 8,0. Reaktionsblandingen lukkes under Ar og omrøres i 24 timer. Herefter reduceres volumenet til ca 2 ml

DK 158948 B

10 på rotationsfordamper ved 40°C, og der tilsættes 10 ml ethanol. Efter afkøling filtreres de dannede udfældninger fra. Filtratet oprenses ved ionbytningskromatografi på QAE-Sephadex® G-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i 50% H20-ethanol, 5 pH 7,0. Eluering foretages med NaCl-mættet 50% H20-ethanol, idet pH-værdien indstilles på 4,0 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Ethanolen fjernes fra eluatet ved behandling i rotationsfordamper ved 40°C, og (3) tages op i ethylacetat. Efter tørring over magnesiumsulfat inddampes fraktionen til en olie.

10 lH-nmr. (90 MHz) 5 7,61 (NH, IH), 7,34 (d, IH), 7,26 (s, IH), 7,14 (d, IH), 6,78 (dd, IH), 4,07 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,30 (m, 2H), 2,45 (m, 2H), 1,18 (t, J = 7,1 Hz, 3H). Massespektrum m/e 146 (base peak), 219, 261, 334.

15

Fremstilling af 5-(N-(3-sulfonsuccinimidoxycarbonylethyl) carbamoyl )-oxy-i ndo 1y1-3-eddikesyreethy1 ester, Na-salt med formlen (4) .

20 O

Na0 -j|-CH2-?-0-CH2-CH3 25 1 mmol (3) opløses i ΙΟΟμΙ dimethylformamid og 900 μΐ vand tilsættes sammen med 1 mmol N-hydroxysulfosuccinimid Na-salt.

Til denne blanding tilsættes, under omrøring 1,2 mmol N-(3-di-30 methylaminopropyl)-N1-ethyl carbod iimidhydrochlorid. Produktet omrøres endnu 15 minutter ved stuetemperatur. Det anvendes uden yderligere oprensning.

35 11

DK 158948 B

Eksempel 2

Fremstilling af et hapten-carrierkoniuqat med indol-3-eddike-svreethvlester eller indol-3-eddikesvre som ligand og et pro-5 tein som carrier.

Bovint serumalbumin (Cohn fraction V) opløses i 0,2 M kalium-phosphatpuffer, pH 7,4, koncentration 100 mg/ml. Til 100 μΐ af denne opløsning tilsættes to portioner å 8 mg 5-(N-(3-sulfosuc-10 c i n i mi doxy-carbony1ethy1) carbamoyl)-oxy-indolyl-3-eddikesyre- ethylester, Na-salt med 2 timers mellemrum. Reaktionsblandingen omrøres i 16 timer ved stuetemperatur. Herefter dialyseres reaktionsblandingen i 5 døgn ved 4°C under omrøring mod 5x2 1 10 mM kaliumpfros^hat, 0,15 M NaCl, pH 7,ft, med daglige skift 15 af ydervæsken.

Det færdige indol-3-Qddikesyreethylesterkonjugat analyseres ved UV-spektroskopi.

20 Det fremstillede indo|^3-eddikesyreethylesterkonjugat kan omdannes til det tilsvarende indol-3-eddikesyrekonjugat ved til sidst at fjerne ethylgruppen fra det i øvrigt færdige konju-gat. Dette kan opnås ved at behandle indol-3-eddikesyreethyl-esterkonjugatet med en ethylesterase. I spektret, jf. fig.

25 la, iagttages en indolskulder med vendetangent ved 294-295 nm.

Fig. Ib viser et UV-spektrum af bovint serumalbumin (.....) og indo!-3-eddikesyrekonjugat (-). Fig. la viser et diffe rensspektrum af konjugat og carrierprotein.

30 Koncentrationerne er justeret ved Xmax, således at A(278)= 0,45.

35

Eksempel 3 12

DK 158948 B

Syntese af 5-(N-succinimidoxycarbonylethyl)carbamoyl)-oxy-indolyl-3-acetoxyacetatmethylester med formlen (4).

5 HC)^^_ .CH2-C00H -►

10 H

0 o

i! II

HO .. CH2-C-0-CH<?-C-0-CH3 (1) - y · CX/ «

H

9Π ν=Λ 0 0 0

20 \ 11 II II

N-C-O,^^^ CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (2)--£ υςί

L H -J

25 .... ... · o 0 0 II II 11 hooc-ch2-ch2-nh-c-o^ CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (3)_£

30 I

H

CO O o 0 0 < t ir 11 li N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0^^ CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (4) * ¢0

H

13

DK 158948 B

5-hydroxy-i ndo 1y1-3-acetoxyacetatmethy1 ester med formlen (1) 0 0 η η HO CH2-C-0-CH2-C-0-CH3 (1) w

H

5 mmol 5~hydroxyindolyl-3-eddikesyre opløses i 12 ml tørt di-10 methylsu 1 foxid (resterende vandindhold < 0,03%),. og der tilsættes 1 ml triethylamin, hvorefter reaktionsbeholderen lukkes under Ar. Under kraftig omrøring ved stuetemperatur tilsættes 6 mmol bromeddikesyremethylester i løbet af 10 min. Efter endt tilsætning omrøres endnu 30 min ved stuetemperatur. Herefter 15 fortyndes reaktionsblandingen med 25 ml ethylacetat og vaskes med 4 x 50 ml 0,1 M NaHC03 efterfulgt af vask med 50 ml mættet vandig NaCl samt til slut med 50 ml vand. Den organiske fase tørres over vandfrit MgS04, hvorefter tørremidlet filtreres fra. Ethylacetat fjernes i rotationsfordamper ved 40°C, hvor-20 ved produktet krystalliserer. Det krystallinske produkt vaskes med kold ether.

iHnmr (90 MHz) : 7,30-6,62 (m, 4H), 4,65 (s, 2H), 3,77 (d, J = 0,6Hz, 2H), 3,70 .2,5 (s, 3H ) ,

Massespektrum m/e: 263 M+ (15,7), 173 (9,8), 146 (100), 117 (5,3).

3 0 5-(N-(carboxyethyl) carbamoyl)-oxyi ndoly1-3-acetoxyacetatmeth- ylester med formlen (3).

0 0 0

II II II

hooc-ch2-ch2-nh-c-o ch2-c-o~ch9-c-o-ch3

H

Molforhold og reaktionsbetingelser for fremstilling af denne forbindelse er identiske med dc i eksempel 1 angivne.

DK 158948 B

14 lH-nmr (90 MHz): 7,45-6,72 (m), 4,66 (s), 3,85 (d, J = 0,61), 3,69 (s), 2,66 (q).

Kvartet ved ca. 3,4 kan ikke ses for vandtop.

5

Massespektrum m/e: 378 M+ (0,08), 277 (1,8), 263 (22,3), 173 (13,7), 146 (100), 117 (6,6).

10 5-(N-(sued ni midoxycarbonylethyl) carbamoyl)-oxyi ndolyl-3-acet- oxyacetatmethylester med formlen (4).

CO 0 0 00

< β Η II II

N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0n_^^ CH2-C-O-CH2-C-O-CH3 ” XX/

H

1 mmol (3) opløses sammen med 1 mmol N-hydroxysuccinimid i 2,5 20 ml tør, peroxidfri dioxan. Herefter tilsættes 1,2 mmol N,N'-dicyklohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen lukkes under Ar og omrøres i 12 timer ved stuetemperatur. Det dannede N,N'-dicyklohexylurinstof frafiltreres, og dioxanen fjernes i rotationsfordamper ved 40°C. Den herved dannede olie tages op i 25 1,5 ml acetone, og den sidste rest Ν,Ν'-dicyklohexylurinstof fjernes ved filtrering. Acetone fjernes i rotationsfordamper ved 40°C. Inddampningsresten, der indeholder (4), anvendes uden yderligere oprensning.

30 35 15

DK 158948 B

Eksempel 4

Fremstilling af et hapten-carrierkonjugat med i ndol-3-edch'ke-syre som ligand og et protein som carrier 5 j-s-s-f) N——-' 10 1.

V

2 .

" h!"# o o o o tf" K (i il V4^/-NH-C-CH2-CH2-NH-C-0 CH2-C-0-CH9-C-0-CHo W '

ψ H

3 .

30 ϋ?/ i

35 H

4.

16

DK 158948 B

N/ hs— 5 w ÆL o o o iML 11 11 W/_NH-C-CH2-CH2-NH-C-0/v^ ^ CH2-C-0“, Na+

Ogr 10 li 1. trin. Fremstilling af BSA-qel 0,5 g bovint serumalbumin (Cohn fraction V) (BSA) opløses i 15 0,1 M NaHC03 og 1 mM Na2EDTA. Proteinopløsningen reagerer nat ten over med 5 g Thiopropyl Sepharose® (Pharmacia Fine Chemicals), der forinden er vasket med 0,1 M NaHC03 og 1 mM Na2C03. Reaktionen finder sted under forsigtig mekanisk omrøring ved stuetemperatur. Herefter vaskes gelen med 0,1 M NaHC03 og 1 mM 20 Na2EDTA, indtil vaskevandet ikke længere viser absorption ved 280 nm. Der vaskes nu med yderligere 5 volumener H20. Ikke-omsatte gluthathion-2-pyridyldisulfidgrupper reduceres ved at behandle den vaskede gel med 20 ml 50 mM mercaptoethanol i 0,1 M eddikesyre, pH-værdi 4,5. Gelen vaskes herefter med 0,1 M 25 eddikesyre med pH-værdi 4,5 efterfulgt af vask med 0,1 M car-bonatpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,0. Der anvendes i begge tilfælde et 10 ganges overskud.

2. trin. Kobling af ligand til BSA-qel 30 5 g BSA-gel suspenderes i 50 ml 0,1 M carbonatpuffer og 1 mM EDTA, pH-værdi 8,0. 0,1 mmol 5-(N-(succinimidoxycarbonylet- hyl)carbamoyl)-oxyindoly1-3-acetoxyacetatmethylester opløses i 1 ml dimethylformamid. Hver halve time tilsættes 0,2 ml af 35 denne opløsning til gelsuspensionen under mekanisk omrøring ved stuetemperatur. En halv time efter sidste tilsætning af ligand vaskes gelen først med ækvi1ibreringspuffer og dernæst med 50 mM boratpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,6. Til vask anvendes 100 ml af hver puffer.

17

DK 158948 B

3. trin. Fjernelse af ligandens esterqruppe ved behandling med esterase

Gelen (2) suspenderes i 50 ml 50 mM boratpuffer og 1 mM 5 Na2EDTA, og der tilsættes 1300 U esterase (carboxylsyreester-hydrolase EC 3.1.1.1.) opløst i 2 ml af ovennævnte puffer. Reaktionsblandingen omrystes i 48 timer.

4. trin. Reduktion af disulfidbinding imellem gel og hapten-10 carrierkon iuqat

Den esterasebehandlede gel overføres til en søjle og vaskes med 0,1 M natriumphosphatpuffer og 1 mM Na2EDTA, pH-værdi 8,2, indtil vaskevandet ikke længere viser absorption ved 280 nm.

15 Herefter vaskes med yderligere 5 søjlevolumener af samme puffer. Søjlen elueres med 50 mM mercaptoethanol og 0,1 M natri-umphosphatpuffer, pH-værdi 8,2, indtil eluatet ikke længere viser absorption ved 280 nm. Eluatet, der indeholder indol-3-eddikesyre-BSA-konjugatet, dialyseres i 2 timer mod rindende 20 postevand efterfulgt af dialyse mod 2 gange 2 1 50 mM natrium-phosphatpuffer, pH-værdi 7,0.

På fig. 2 er vist et UV-spektrum af dette konjugat (A) samt af BSA (B). Proteinkoncentrationen er i begge tilfælde 0,23 mg 25 BSA per ml 0,1 M ka1 iumphosphatpuffer, pH-værdi 7,0 {proteinbestemmelse efter Lowry's metode).

1%

Idet der anvendes E28O nm = 10 som ekstinktionskoefficient for 3 0 BSA og 6280 = 5200 M_1 som don molære ekstinktionskoefficient for liganden, kan der beregnes en substitutionsgrad på 34,4 mol ligand per mol carrier-BSA. Opmærksomheden henledes særligt på skulderen i området 290-295 nm, der viser en vendetangent som tegn på, at den ekstra UV-absorpti on stammer fra 35 en indolstruktur, jf. fig. la.

18

DK 158948 B

Fremstilling af en IIA-C5-aqaroseqel.

10 g Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Sverige) overføres til en BUchner-tragt og vaskes således: 5 1) 100 ml 0,9% NaCl.

2) 100 ml 0,4 M NaOH.

Overskydende væske fjernes, og gelen overføres til en behol-10 der, hvor den suspenderes i 12 ml 0,1 M NaOH. Under mekanisk omrøring ved 40°C tilsættes 1 ml epichlorhydrin (l-chlor-2,3-epoxypropan). Omrøring fortsættes ved 200 o/m i endnu 2 timer.

Den epoxidaktiverende gel vaskes på en BUchner-tragt efter følgende fremgangsmåde: 15 1) 100 ml 0,9% NaCl.

2) 100 ml vand/acetone 80/20.

3) 100 ml vand/acetone 50/50.

4) 100 ml vand/acetone 20/80.

20 5) 100 ml acetone.

6) 100 ml vand/acetone 20/80.

7) 100 ml vand/acetone 50/50.

8) 100 ml vand/acetone 80/20.

9) 100 ml 0,9% NaCl.

25

To prøver å 0,5 g udtages og analyseres for epoxidindhold i henhold til Sundberg, L. og J. Porath, J. Chromatogr., 1974 90 87. Resultat: 37 pmol epoxid pr. g våd gel. Denne struktur er vist som (1) nedenfor.

30

Under mekanisk omrøring omsættes den epoxidaktiverende gel med 20 ml 10% ammoniakvand. Efter omrøring i 8 timer overføres gelen til en BUchner-tragt og vaskes efter følgende fremgangsmåde : 35 1) 100 ml 0,1 M HC1.

2) 100 ml vand.

3) 100 ml 0,1 M NaOH.

4) 100 ml vand.

DK 158948 B

19

To prøver udtages til bestemmelse af aminostruktur ved titrering med 0,025 M HC1. Resultat: 35 μιηοΐ aminostruktur pr. g våd gel. Denne struktur er vist som (2) nedenfor.

5 5 g aminogel suspenderes i 10 ml 0,1 M NaHC03 og 1,75 x 10“4 mol 5-(N-(succinimidoxy-carbonylethyl)carbamoyl)-oxyindolyl-3-acetoxyacetatmethylester opløst i 10 ml dioxan tilsættes over 1 time. Efter yderligere 1 time under mekanisk omrøring, overføres gelen til en BUchner-tragt og vaskes således: 10 1) 100 ml 0,1 M NaHC03.

2) 100 ml vand.

3) 100 ml vand/acetone 80/20.

4) 100 ml vand/acetone 50/50.

'15 5) 100 ml vand/acetone 20/80.

6) 100 ml acetone.

7) 100 ml vand/acetone 20/80.

8) 100 ml vand/acetone 50/50.

9) 100 ml vand/acetone 80/20.

20 10) 100 ml 50 mM borax, 1 mM Na2EDTA.

, Gelen (3) suspenderes i 10 ml 50 mM borax, 1 mM Na2EDTA og behandles med 1500 U esterase (carboxylesterhydrolase EC 3.1.1.1.) i 48 timer under omrystning. Gelen overføres til en 25 BUchner-tragt og vaskes med 200 ml 50 mM borax. Den opnåede struktur er vist som (4) nedenfor. Under anvendelse af en e280 = 5200 M“1 for liganden, er det beregnet, at gelen indeholder 28 μπιοί ligand pr. g våd gel.

30 35

Claims (10)

1. 20 DK 158948 B |-OH |“0-ch2-ch -ch2 ίΟΗ -0-CH2-CH-CH2“nh2 (2) O ίημ O O II T Π * rH2-C-0-CHrCH3 -O-CH^CH -CH2“nh“c“ch2“CH2-NH- vo H O ίΟΗ 0 0 « I Η II ^ -CH2”C“OH -O-CHa-CH -CH2“NH-C-CH2-CH2-NH- C-Ov/^w^( 03 <*> H Patentkrav. 1. indolderivater, kendetegnet ved den almene formel I, D-A-0 fVxR3 (i’· H 0 „ 11 hvor R3 betegner hydrogen eller -CHaC-OQ, idet Q sammen med eddikesyreresten danner en ester, A betegner en koblingsrest valgt blandt 21 DK 158948 B -C- og -C-, II II

   0 S og D betegner en nukleofil gruppe med formlen Y-X-D', hvor X 5 betegner en direkte binding eller en ligekædet eller forgrenet, mættet eller umættet hydrocarbonkæde med 1-9 carbonato-mer, D' betegner -NH-, -S- eller -0-, og Y betegner en car boxyl syregruppe, en ester deraf, -OH eller tosylater eller tresylater deraf. 10
2. 2. Indolderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koblingsresten A hidrører fra forbindelser valgt blandt Ι,Ι'-carbonyldiimidazol, 1,1'carbonyIdi-(1,2,4-triazol), di - ' (N-succinimidyl)-carbonat, l,l,-carbonyl-bis{2-methylimida- 15 zol) og 1,1'-thiocarbonylimidazol.
3. 3. Indolderivater ifølge krav 1 eller 2, kend et egnet ved, at den nukleofile gruppe D hidrører fra forbindelser valgt blandt am i no-Cj.ø-alkansyrer og estere deraf,

   20 Cj_6-a1kanthio1 er og tosylater eller tresylater deraf samt Cj.g-alkanoler og tosylater eller tresylater deraf.
4. 4. Indolderivater ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at de har formlen III 25 0 0 II II H00C-(CH2)n-NH-c-0~^^Jj—-j|'CH2--c“0"Q (111) f

   30 H hvori n er 0-9 og Q har den ovenfor angivne betydning.
5. 5 H hvori n og Q har den ovenfor angivn.e betydning, og -C00E er en estergruppe. „ Λ
6. 6. Indolderivat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at 10 det har formlen VI 0 0 II II H00C-CH2-CH2-NH-C-0^^n^_^CH2-C-0-CH2-CH3 (VI) 15 H

   5. Indolderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, 35 at de har formlen V 22 DK 158948 B 0 0 0 II II II E-0-C-(CH2)n“NH‘c_0^^Jj---^CH2-c-0"Q (V)
7. 7. Indolderivat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det har formlen VII 20 V 0 0 0 0 \A » 11 11 ]^^N-0-C-CH2-CH2-NH-C-0'^^j—jpCH2-C-0-CH2-CH3 (VII)

   25 I hvori V er H eller -SO3H eller et salt heraf.
8. 8. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav 1 ved fremstil-30 ling af indol-carrier-konjugater eller affinitetsmatrixer.
9. 9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor carrieren er et protein.
10. 10. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav 6 eller 7 ved 35 fremstilling af affinitetsmatrixer.