JPH0390100A - ヒトオステオカルシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明はヒトの骨代謝、および老化の重要な指標となる
ヒトオステオカルシンの製造法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） オステオカルシン（ＢＧＰ）は、骨の非コラーゲン性タ
ンパク質の約１５〜２０％を占めるビタミンに依存性カ
ルシウム結合性クンバクであり、骨形成、骨吸収の双方
に密接に関係していると考えられている。［日本骨代謝
学会誌４．５６．１９８６］、Ｐｏ５ｅｒらは、ヒトオ
ステオカルシンについて、その１次構造を解析し、ヒト
オステオカルシンは次のアミノ酸配列を有する１７位が
グルタミン酸であるＧｌｕ”−オステオカルシンとγ−
カルボキシグルタミン酸であるＧｌａ”−オステオカル
シンが９１：９の割合で存在する混合物であることを報
告した。　　［Ｐｏ５ｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、、　ｅｔ。

ａム、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ
ｉ、　　Ｕ、Ｓ、、　　２５５．８６８５−８６９１　
（１９８０１１。

ｌ　　　　　　　　　　　　　Ｓ　　　　　　　　　　
　　　　　１０Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−ｌ５　　　　　　　　　　　２０ Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌａ−Ｖａｔ　−３５４０ Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｉ　１　ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−４５４９ Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　　　　　　
　　　　　　　（Ｉ　）（式中、Ｘはγ−カルボキシグ
ルタミン酸残基（Ｇｌａ）又はグルタミン酸残基（Ｇｌ
ｕ）を表わす、） しかしながら、これまで既に知られているウシ、メカジ
キ、ネコ、ニワトリ、ラット、ヤギ、ブタ及びラット等
のオステオカルシンは、対応する部位がすべてγ−カル
ボキシグルタミン酸である。この理由として、Ｐｏ５ｅ
ｒらはヒトオステオカルシンの抽出材料として、老人の
石灰化骨を用いたためであり、加齢により１７位のグル
タミン酸がγ−カルボキシグルタミン酸に変化すると推
定している。

このような賎点からヒトオステオカルシン測定系を確立
することは、ベージェット病、骨転移などの骨疾患診断
に臨床上有用であるだけでなく、さらに、ヒトオステオ
カルシンの１７位Ｇｌａ及びＧｌｕをそれぞれ個別に認
識する抗体及び抗血清を調製することにより、老化との
関連を調べることができると期待される。

しかしながらＧｌａ”ヒトオステオカルシン及びＧｌｕ
”ヒ）・オステオカルシンを分別定量する測定系はもと
より、標準品としてヒトオステオカルシンを用いるヒト
オステオカルシン測定系は存在しない、これは、特異抗
体又は抗血清作製用として、また、標準品としてのＧｌ
ａ”ヒトオステオカルシン、Ｇｌｕ”ヒトオステオカル
シンが人手できないことにある。

最近本発明者らは、ペプチド合成法においてγ−カルボ
キシグルタミン酸の導入に利用可能な式 （式中、ｎは０．１又は２を表す） で示される新規なＬ−γ−カルボキシグルタミン酸誘導
体を発明し、特願昭６３−５４８９２号として出願して
いる０本発明者らは、これを利用して１７位、２１位及
び２４位にＧｌａを導入してＧｌａ”オステオカルシン
を合成し、また２１位及び２４位にＧｌａを導入してＧ
ｌｕ”ヒトオステオカルシンを化学合成により製造する
方法につき鋭意検討した結果、本発明を完成するに至っ
た。

なお、本明細書において使用する略称、略号の意味、意
義は以下の通りである。

１、アミノ酸について Ａｆｆａ：アラニン、Ａｒｇ：アルギニン、Ａｓｎ：ア
スパラギン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｃｙｓニジステ
ィン、Ｇｌａ：γ−カルボキシグルタミン酸、Ｇｉｎ：
グルタミン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｇｌｙニゲリシン
、Ｈｆｓ：ヒスチジン、Ｉｌｅ：イソロイシン、Ｌｅｕ
：ロイシン、Ｐｈｅ　：フェニルアラニン、Ｐｒｏ　ニ
ブロリン、Ｔｒｐニトリブトファン、Ｔｙｒ：チロシン
、Ｖａｎ　：バリン。

各々、対応するアミノ酸残基な示す場合もある。

２、保護基について Ｂｏａ　：　ｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｂｕ’：ｔ
−ブチル、ＢｚＩ２：ベンジル、ＯＢｚβ：ベンジルエ
ステル、ＯＢｕ’：ｔ−ブチルエステル、０ｃＨｅｘ　
；シクロヘキシルエステル、Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベン
ジルオキシカルボニル、４ＣＨ，・ＢＺＪ２　：　４−
メチルベンジル、Ｄｎｐ　ニジニトロフェニル、ＭＢＺ
Ｉ２；メトキシベンジル、Ｃβ＊Ｂｚｆｆ：２，６−ジ
クロロベンジル、Ｍｔｒ：４−メトキシ−２，３，６−
、トリメチルベンゼンスルホニル、Ｍｔｓ　：メシチレ
ンー２−スルホニル、Ａｃｍ　：アセトアミドメチル、
Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルホニル、Ｆｍｏｃ：９−フル
オレニルメチルオキシカルボニル。

３、試薬について ＤＣＣ＋ジシクロへキシルカルボジイミド、ＨＯＢｔ：
ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＴＴ　ニジチオ
スレイトール、ＤＣＭニジクロロメタン、ＤＭＦニジメ
チルホルムアミド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＤＩＥＡニ
ジイソプロピルエチルアミン、ＴＨＦ：テトラヒドロフ
ラン、ＴＦＡニトリフルオロ酢酸、ＨＦ：フッ化水素、
ＣＨ、ＣＮ　ニアセトニトリル、ＮＭＰ　：　Ｎ−メチ
ルピロリドン、ＤＭＳＯニジメチルスルホキシド。

本発明は、ヒトオステオカルシンのペプチド合成法にお
いて。

式 （式中、ｎは０．１又は２を表す） で示される保護り一γ−カルボキシグルタミン酸又はそ
の塩を用いてγ−力ルボキシグルタミン酸を導入するこ
とを特徴とするＧｌａ”オステオカルシン及びＧｌｕ′
？オステオカルシン又はこれらの塩の製造法である。

ペプチド合成は、例えば、矢島治明、榊原俊平著、日本
生化学会編、生化学実験講座（Ｉ）；“蛋白質の化学”
４巻、東京化学同人発行（１９７７）：及び、泉谷信夫
ばか著“ペプチド合成の基礎と実験”丸善■発行（１９
８５）に記載されている方法に準じて液相法又は固相法
で行うことができる０本発明のヒトオステオカルシンの
合成法としては、固相法が好ましい。

以下、同相法により本発明のＧｌａ′７ヒトオステオカ
ルシン及びその塩を合成する場合について説明する。

まず、目的とするヒトオステオカルシンのＣ末端アミノ
酸、すなわちＶａβを保護アミノ酸として不溶性樹脂に
結合させる。このようなＣ末端保護アミノ酸を不溶性樹
脂に結合させた保護アミノ酸樹脂は市販品を購入して用
いることら可能である０次いで、ヒトオステオカルシン
のアミノ酸配列に従ってＣ末端側から保護アミノ酸を順
次結合させ、保護ペプチド樹脂を得る。不溶性樹脂とし
ては、当該技術分野で知られたもののいずれであっても
よく、例えば、）ＩＦで脱離可能なりロロメチル樹脂、
オキシメチル樹脂、４−（オキシメチル）フェニルアセ
タミドメチル樹脂（以下Ｐａｎ樹脂と呼ぶ）等が挙げら
れる。

「保護アミノ酸」とは、官能基を公知の方法により保護
したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されて
いる０本発明のヒトオステオカルシンを合成する場合に
は、以下に示す保護アミノ酸のいずれかを選択するのが
好ましい、まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はＢ
ｏｃ又はＦｍｏｃである。Ａｒｇのグアニジノ基の保護
基は、Ｔｏｓ、Ｎｏｔ　、Ｍｔｒである。Ａｓｐ、Ｇｌ
ｕのカルボキシル基の保護基は、０ＢｚＩ２゜ＯＢｕ　
’、０ｃＨｅｘである。Ｃｙｓのメルカプト基の保護基
は４ＣＨｓ　　・Ｂｚｆｆ、ＭＢｚＩ２、Ａｃｍである
。Ｈｉｓのイミダゾリル基の保護基はＴｏｓ、Ｄｎｐ、
Ｆｍｏｃである。Ｔｒｐのインドリル保護基は、ＨＣＯ
か、あるいは保護しなくてちよい。Ｔｙｒの水酸基の保
護基は、Ｂｒ−Ｚ、Ｃｎ　ｓ　・Ｂｚｇ、Ｂｚｊ２．Ｂ
ｕｔであるか。

あるいは保護しなくてちよい。

各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適切なものを選
択する必要がある。

Ｇｌａヒトオステオカルシンにおける１７位、２１位及
び２４位のＧｌａ及びＧｌｕヒトオステオカルシンにお
ける２１位及び２４位のＧｌａは、前記式（！■）の保
護”Ｇｌａとして導入することができる。この保１ｉＧ
１ａの合成は、特願昭８３−５４８９２に記載の次の方
法により行うことができる。

（ＸＩ） の光学活性体 （Ｌ体） （Ｘｌｌ） （上記反応式中、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル
基、Ｂｚｊ２はベンジル基、Ｔｓはトシル基、Ｅｔはエ
チル基を表わし、ｎはＯｌｌ又は２を表わす） すなわち先ず、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルセリン
（ｒＶ）とハロゲン化ベンジルとを反応させてベンジル
エステル（Ｖ）を合威しく工程ａ）、次にこれをｐ−）
ルエンスルホニルクロリドと反応させてエステル誘導体
（Ｖｌ）としく工程ｂ）、これにジエチルアミン等の塩
基を作用させてＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニルデヒド
ロアラニンベンジルエステル（■）を合成する（工程ｃ
）。

一方、マロン酸ジメチル（■）をエステル交換してマロ
ン酸ジシクロアルキルエステル（ＩＸ）を生成させる（
工程ｄ）、この化合物（ＩＸ）を、塩基として水素化ナ
トリウムの存在下で、工程Ｃで得られた化合物（■）と
反応させて化合物（Ｘ）を合成する（工程ｅ）、更にこ
れを還元して、目的とするγ−カルボキシグルタミン酸
誘導体（ＸＩ）を製造する（工程ｆ）、所望の場合は、
この得られた化合物（ＸＩ）を、キニーネ等の光学分割
剤を用いたジアステレオマー塩法によって光学分割して
式（ＸＩ）の光学活性体（Ｌ体）　　（ＸＩｉ）を製造
する（工程ｇ）ｅ 前記工程ａは、ｔ−ブチルオキシカルボニルセリン（Ｔ
Ｖ）のアセトン溶液に、ベンジルプロミド及びトリエチ
ルアミン等の塩基を添加し、室温〜ｉｏｏ℃、好ましく
は４０℃〜７０℃の温度で、５時間以上、好ましくは２
０〜６０時間加熱還流することによって実施することが
できる０反応終了後、生成物をエーテルによって抽出し
５溶媒を減圧留去すると化合物（Ｖ）が得られる。

工程すは、工程ａで得られた化合物（Ｖ）をピリジン等
の溶媒に溶解し、これにｐ−）ルエンスルホニルクロリ
ドを加えて一２０℃〜４０℃、好ましくは一１０℃〜１
０℃の温度で、０．５〜２０時間、好ましくは２〜８時
間撹拌することによって実施することができる０反応終
了後、生成混合物に冷水を加えて撹拌し、生じた結晶を
濾取すると化合物（Ｖｌ）が得られる。

工程Ｃは、得られた化合物（Ｖｌ）を酢酸エチル／ジエ
チルエーテル混合溶液に溶解し、これにジエチルアミン
等の塩基を加え、−２０℃〜４０℃、好ましくはＯ℃〜
３０℃の温度で、０．５〜２０時間、好ましくは２〜６
時間撹拌することによって実施することができる０反応
終了後、反応液を濾過し、溶媒を減圧留去すると化合物
（■）が得られる。

工程ｄは、マロン酸ジメチル（■）のトルエン溶液に、
シクロアルカノールおよびｐ−）ルエンスルホン酸のよ
うな触媒を加えて、５０〜２００℃、好ましくは９０〜
１２０℃の温度で、生成するメタノールを留去しながら
５時間以上、好ましくは２０〜６０時間加熱撹拌するこ
とによって実施することができる０反応終了後、生成物
を炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、溶媒を減圧留去し
た後に、蒸留によって化合物（ＩＸ）が得られる。

工程ｅは、水素化ナトリウムをＴＨＦ等の溶媒に懸濁し
た溶液に化合物（ＩＸ）を添加し、−４０〜７０℃、好
ましくは−ｉｏ〜４０℃の温度で０．１〜ｌＯ時間、好
ましくは０．５〜２時間撹拌し、続いて化合物（■）を
同じ溶媒に溶解した溶液を滴下し、−４０〜７０℃、好
ましくは一１０〜２５℃の温度で０．１〜２０時間、好
ましくは０．５〜ｌＯ時間撹拌することによって実施す
ることができる。ここで用いることのできる溶媒として
は、ＴＨＦの他には、トルエン、エチルエーテル、ジオ
キサン等を挙げることができる。反応終了後、抽出、カ
ラムクロマトグラフィー等のような通常の単離精製操作
によって化合物（Ｘ）が得られる。

工程ｆは、得られた化合物（Ｘ）を触媒の存在下、０〜
８０℃、好ましくは１０〜４０℃の温度で０．１〜２０
時間、好ましくは０．５〜ｌＯ時間還元することによっ
て実施することができる。ここで用いることのできる還
元触媒としては、パラジウム−炭素、白金−炭素等を挙
げることができる。反応終了後、溶媒を減圧留去すると
化合物（ＸＩ）が得られる。

工程ｇは、化合物（ＸＩ）を酢酸エチルに溶解し、これ
に、光学分割試薬を添加した後に、炉取、メタノールに
よる再結晶を繰り返すことによって実施することができ
る。ここで用いることのできる光学分割試薬としては、
キニーネ、ブルシン、シンコニジン、シンコニン等のよ
うなアルカロイド類、（Ｒ）　−（＋）−１−フェネチ
ルアミン、（Ｓ）−（−）−１−フェネチルアミン、（
Ｒ）−（＋）　−１−（１−ナフチル）エチルアミン、
（Ｓ）−（−）−１−（１−ナフチル）エチルアミン等
のようなアミン類、チロシンヒドラジド等のようなヒド
ラジド類等を挙げることができる０反応後、生成物を脱
塩をしてｎ−ヘキサンによって結晶化した後に炉取する
と、化合物（ＸＩ）の光学活性体（Ｌ体）　　（ＸＯ）
が得られる。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、ＤＣＣ
法、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カ
ルボニルイミダゾール法、ＤＣＣ−）１０Ｂｔ法、ジフ
ェニルホスホリルアジド法等にて行うことができるが、
ＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ま
しい、これらの縮合反応は、通常、ＤＣＭ。

ＤＭＦ、ＮＭＰ、クロロホルム、ＤＭＳＯ，ベンゼン等
の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行うが、ＤＣＭ％
ＤＭＦ又はこれらの混合溶媒中で行うのが好ましい、α
−アミノ基の保護基の脱離試薬としては、ＴＦＡ／ＤＣ
Ｍ、ＨＣｌ２／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦ等が用
いられ、該保護基の種類により適宜選択する。また、合
成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ、カイザ
ーらの方法［Ａｎａｆ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　、　３４
．５９５（１９７０）］　　にンセンヒドリン反応法に
よって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペ
プチド樹脂を得るがその具体的な例を以下に示す。

Ｐａ＋ｗ 保護ペプチド樹脂は、ペプチドを樹脂から脱離させ、更
に各アミノ酸の側鎖保護基を脱離させる試薬、例えば、
ＨＦ、ＴＦＡ等で処理すること（最終脱保護反応）によ
り、Ｃｙｓのメルカプト基が遊離したペプチドとして得
られる。

このペプチドを緩衝溶液中で酸化し１分子内ジスルフィ
ド結合を形成させることにより、粗ヒトオステオカルシ
ンを得ることができる。すなわち、Ｃｙｓのメルカプト
基遊離の粗ヒト才ステオカルジンなｌＯ″”〜１０−’
　ｖａｏｌ／　１２、好ましくは１０−’〜１０−’　
ｍｏｌ／　Ｉ２の濃度になるように緩衝液に溶解し、ｐ
Ｈを６゜０〜８．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０に
調整後、４〜５０℃、好ましくは４℃〜室温で４時間〜
３０時間撹拌することにより粗ヒトオステオカルシンを
得ることができる。この反応に用いられる緩衝液は公知
のもので、例えば、酢酸アンモニウム、Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ２等が挙げられる。また本反応促進剤としてフェリシ
アン酸塩（フェリシアン化カリウムなど）を加えること
ができる。

このようにして得られたペプチドは、ペプチド製造の常
套的手段１例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフ
ィー（ゲル濾過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電
気泳動、向流分配等により単離精製することができるが
、逆相高速クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による
方法がもっとも効果的である。

（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれらの実施例により制限されるものではない。

実施例１ 次式 ％式％ で示されるＧｌａ′？ヒトオステオカルシンの合成 、（１）Ｂｏｃ−ＶａＩ２−Ｐａｍへの４８位Ｐｒｏの
導入 ｌ）脱保護及び中和 Ｂｏｃ−Ｖａｆｆ−Ｐａｍ　（０，６７ｍｍｏｉ’／ｇ
）０．７４６ｇをＤＣＭで２回洗浄した。この樹脂に３
３％ＴＦＡ溶液（溶媒：ＤＣＭ）８−を加えて８０秒間
攪拌後、濾過した。更に５０％ＴＦＡ溶液（溶媒、ＤＣ
Ｍ）８−を加え、１８．５分間撹拌後濾過してＢｏｃ基
を脱離させた。得られた樹脂を下記の溶媒で順次処理し
、各々の処理後にｉ濾過した。

ＤＣＭ　（３回、各３０秒） ｌＯ％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ　（２回、各１分）ＤＭＦ　（
５回、各３０秒） ２）Ｂｏｃ−Ｐｒｏ対称酸無水物の調製Ｂ　ｏ　ｃ　−
Ｐ　ｒ　ｏ　２　ｍｍｏｆをＤＣＭ３ｄに溶解後、これ
に０．５ＭＤＣＣ溶液（溶媒：ＤＣＭ）２−を加え、８
分間反応させ、対称酸無水物を形成させた。副生ずるジ
シクロへキシルウレアを炉別して除いた後、４−のＤＭ
Ｆを加え、つづいて反応液中のＤＣＭを留去した。

３）縮合反応 ２）で調製したＢｏｃ−Ｐｒｏ対称酸無水物のＤＭＦ溶
液を１）で調製したＶａＩ２−Ｐａｍに加え、室温で１
８分反応させた０反応終了後ＤＣＭで５回洗浄した。

（２）４７〜１位の各アミノ酸の導入 （１）と同様にして、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｖａｊ２−Ｐａ
ｍに、Ｇｌａ”ヒトオステオカルシンの４７位から１位
までの各構成アミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カ
ップリングさせた１表１に各反応段階で用いた保護アミ
ノ酸、合成方法等を示す。

表中１合成サイクルに関し、方法■、方法■、方法■は
それぞれ次の手順で脱保護、中和及び縮合反応を行うこ
とを意味する。

〈方法■〉 １）３３％ＴＦＡ　（溶媒：ＤｃＭ）にょる脱係１１８
０秒 ２）５０％ＴＦＡ　（溶媒：ＤｃＭ）にょる脱係！１１
８．５分 ３）ＤＣＭ洗浄３回、各３０秒 ４）１０％ＤＩ　ＥＡ／ＤＭＦによる中和２回各１分 ５）ＤＭＦ、洗浄５回、各３０秒 ６）縮合反応１８分 ７）ＤＣＭ洗浄５回、各３０秒 く方法■〉 ｌ）〜５）方法のに同じ ６）縮合反応２６分 ７）方法■に同じ 〈方法■〉 ｌ）〜５）方法■に同じ ６）縮合反応４２分 ７）ＤＭＦ洗浄３回、各３０秒 ８）１０％ＤＩ　ＥＡ／ＤＭＦによる中和４５秒 ９）ＤＭＦ洗浄３０秒 １０）ＤＣＭ洗浄３回、各３０秒 １１）縮合反応４２分 １２）ＤＭＦ洗浄３０秒 １３）ＤＣＭ洗浄５回、各３０秒 また、表中、対称酸無水物又はＨＯＢｔエステルの合成
に関し、方法■、方法■、方法■、方法■、方法■はそ
れぞれ次の手順により対称酸無水物又はＨＯＢｔエステ
ルの合成を行うことを意味する。

く方法■〉 Ｂｏｃ−アミノ酸２　ｍｍｏｌをＤＣＭ３−に溶解後、
これに０．５ＭＤＣＣ溶液（溶媒：ＤＣＭ）２−を加え
、８分間反応させ、対称酸無水物を形成させた。副生ず
るジシクロへキシルウレアを炉別して除いた後、４−の
ＤＭＦを加え、つづいて反応液中のＤＣＭを留去した。

く方法■〉 Ｂｏｃ−アミノ酸２　ｍｍｏｌ’をＤＣＭ３−に溶解後
、これに０．５ＭＤＣＣ溶液（溶媒；ＤＣＭ）２ｍｉｌ
を加え、８分間反応させ、対称酸無水物を形成させた。

副生ずるジシクロへキシルウレアをｔ戸別して除いた後
、ｌ−のＤＭＦを加え、つづいて反応液中のＤＣＭを留
去した。

く方法■〉 Ｂｏｃ−アミノ酸２　ｍｏｏｌをＤＭＦｏ、３ｔＡ’、
ＤＣＭ２．５−に溶解後、これに０．５ＭＤＣＣ溶液（
溶媒：ＤＣＭ）２−を加え、８分間反応させ、対称酸無
水物を形成させた。副生ずるジシクロへキシルウレアを
炉別して除いた後、４−のＤＭＦを加え、つづいて反応
液中のＤＣＭを留去した。

く方法■〉 Ｂｏｃ−アミノ酸２　ｍｍｏＩに０．５Ｍ　　）（ＯＢ
ｔ４−及びＤＣＭｏ、３−を加え溶解後、これに０．５
ＭＤＣＣ溶液（溶媒；ＤＣＭ）４−を加え、３３分間反
応させ、ＨＯＢｔエステルを形成させた。副生ずるジシ
クロへキシルウレアを炉別して除いた後、反応液中のＤ
ＣＭ３−を留去した６本操作による）］ＯＢｔエステル
の調製は１残基につき２回行った。

く方法■〉 Ｂｏｃ−アミノ酸２　ｍｍｏｆに０．５Ｍ　　ＨＯＢｔ
４−及びＤＣＭｌ、５Ｔｄを加え溶解後、これに０．５
ＭＤＣＣ溶液（溶媒：ＤＣＭ）４−を加え、３３分間反
応させ、ＨＯＢｔエステルを形成させた。副生ずるジシ
クロへキシルウレアを炉別して除いた後、反応液中のＤ
ＣＭ３ｍｔ’を留去した０本操作によるＨＯＢｔエステ
ルの調製はｌ残基につき２回行った。

１位のアミノ酸導入後、この樹脂ペプチドに３３％ＴＦ
Ａ溶液（溶媒：ＤＣＭ）２０−を加え、８０秒間撹拌後
、濾過した。更に５ｏ％ＴＦＡ溶液（溶媒；ＤＣＭ）２
０−を加え、１８．５分間撹拌後、？濾過してＢｏｃ基
を脱離させた。得られた樹脂を下記の溶媒で順次処理し
、各々の処理後に濾過した。

ＤＣＭ　（３回、各３０秒） ｌＯ％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ　（２回、各１分）ＤＣＭ　（
５回、各３０秒） 次に、本樹脂ペプチドを一昼夜減圧乾燥して乾燥樹脂ペ
プチドを得た。

（３）ＨＦによる分解 乾燥した樹脂ペプチドの一部（８１５ｍｇ）を秤量し、
ＨＦ分解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール
２−を加え、−夜装置し、樹脂を膨潤させた。撹拌子を
入れた前記反応容器をＨＦ分解装置（ペプチド研究新製
）に取り付け、ドライアイス−エタノール洛中に置き、
ＨＦ１８１ｄを反応容器中に導入した。この混合物を水
浴中において１時間、０℃で撹拌した。減圧下にＨＦを
徐々に留去した。３時間後１反応容器を取りはずし、無
水ジエチルエーテルを用いて反応容器から樹脂ペプチド
分解物を取出し、無水ジエチルエーテルで洗浄した。３
０％酢酸５０１ｄ！中に樹脂ペプチド分解物を加え、脱
保護されたペプチドを溶解した。これを、塩交換の目的
で予め酢酸型に置換し、・Ｄｏｗｅｘ　Ｉ　Ｘ　２イオ
ン交換樹脂カラムを通した。素通り画分に水を加えて酢
酸濃度をＩＮに調節した後、凍結乾燥して還元型組Ｇｌ
ａ”ヒトオステオカルシン４７５ｍｇを得た。

（４）空気酸化によるジスルフィド結合の形（３〉で得
られた還元型粗ヒトオステオカルシンのうち、２８７ｍ
ｇをＯ，１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ８，５）に溶
解し、１００当量のＤＴＴを加え、４０℃で５時間還元
した。この還元操作で、メルカプト基の酸化によって生
成する可能性がある二量体が単量体にもどる。

この反応液に酢酸を加え、ｐＨ４，０に調節後、遠心し
た。上清を除去した後、沈殿物に３０％酢酸を加え再溶
解した。つづいてセファデックスＧ２５（ファルマシア
社製）を用いたゲルクロマトグラフィーによりＤＴＴ及
び塩を除去した６次に還元型組Ｇｌａ”ヒトオステオカ
ルシンを含む画分を、０．１Ｍ酢酸アンモニウム溶液（
ｐ）１７．５）にｐＨを一定に保ちながら徐々に滴下し
た。このときのペプチド濃度は約１．５×１０”’Ｍと
した。室温で１５日間撹拌してジスルフィド結合を形成
させた後、この反応液をオクタデシルシリカを充填した
カラム（ＯＤＳカラム、φ２ｘ３０ｃｍ）に吸着させ、
０．１％ＴＦＡで洗浄後、６０％アセトニトリル溶液で
ペプチドを溶出した。アセトニトリルを減圧留去後、凍
結乾燥して粗Ｇｌａ”ヒトオステオカルシンを得た。ジ
スルフィド形成反応は５．５′−ジチオビス（２ニトロ
安息香酸〉を用いる公知のエルマンテストにて追跡し、
最終的に得られた反応物は９５％の酸化率であった。

（５）逆相ＨＰＬＣによるＧｌａ”ヒトオステオカルシ
ンの精製 （４）で得られた粗Ｇｌａ”ヒトオステオカルシンを３
０％酢酸に溶解（１０ｍｇ／ｄ）　Ｌ／、高速液体クロ
マトグラフィーアイソクラティック溶出法により精製し
た。カラムはＹＭＣ−Ｄ　（ワイ・エム・シイ社製、φ
２Ｘ３０ｃｍ）を用い、溶離液はＡ液として水（１００
）−１０％ＴＦＡ（１）、Ｂ液として水（４０）−アセ
トニトリル（６０）−１０％ＴＦＡ　（１）を用い、Ａ
（４８）−Ｂ　（５２）の条件下で溶出させた。ここで
、（）内は溶媒の体積比である。Ｇｌａ”ヒトオステオ
カルシンに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白色粉
末を得た。

さらに上記の白色粉末を３０％酢酸に溶解（１０ｍｇ／
−）　シ、前記と同様にして再精製した。溶出液はＡ／
Ｂ＝５１／４９を用いた＊Ｇｌａ”ヒトオステオカルシ
ンに相当する画分を分取し、凍結乾燥して白色粉末を得
た。

再精製して得た白色粉末をさらに３０％酢酸に溶解しく
１０ｍｇ／ｗＩ）、再精製と同一条件にて再々精製した
＊Ｇｌａ１？ヒトオステオカルシンに相当する画分を分
取し、凍結乾燥して白色粉末を得た０本品を３０％酢酸
に溶解し、セファデックスＧ２５ゲルクロマトグラフイ
ーにより脱塩した後、Ｇｌａ”ヒトオステオカルシン画
分に水を加えて酢酸濃度をＩＮに調節し、凍結乾燥して
目的とするＧｌａ”ヒトオステオカルシン６．６ｍｇを
得た。

（６）精製Ｇｌａ”ヒトオステオカルシンの構造確認と
純度検定。

精製Ｇｌａ′？ヒトオステオカルシンのアミノ酸分析値
を表２に示す。

本島１１００ｕを１％Ｎ　Ｈ−ＨＣＯｓに溶解し、１／
１０当量のトリプシン−ＴＰＣＫ　（ワーシントン社製
）を加え、２５℃で２時間消化した。本消化物を下記測
定条件■の逆相ＨＰＬＣにて分析した結果、クロマトグ
ラム上１８．９分、４７．６分、及び６６．８分に３本
の主要ピークを認め、かつアミノ酸分析及びＦａｂ質量
分析の結果からそれぞれＧｌａ′７ヒトオステオカルシ
ンの４５−４９位、２０−４３位及び１−１９位に相当
するペプチドであることが判明した。

表２ 精製Ｇｌａ１？ヒトオステオカルシンのアミノ酸組成 ２゜ Ｎ ＮａＯＨ１ １０℃、 ２２時間 加水分解 Ａｓｎ及びＡｓｐ Ｇｉｎ及びＧｌｕ ２゜ Ｎ ＮａＯＨ。

１０℃、 ２２時間 加水分解 ＄＊０８−カルボキシメチルシスティンとして定測定条
件■ カラム、ＭＭＣ−Ｒ （φ４．６Ｘ２５０＋１１１１１） 流速；　１　ｄ／ｗｉｎ 溶離液；Ａ液（水ニアセトニトリル；１０％ＴＦＡ＝１
００：０：　ｌ） Ｂ液（水ニアセトニトリル：ｌＯ％ ＴＦＡ＝４０＝６０：ｌ） 濃度勾配；Ａ／Ｂ＝８０／２０　（０分）→４５１５５
　（７０分）−０／１００ （７０分）−〇／１００　（７３分） 測定波長；　２２０　ｎｍ 一方１、精製Ｇｌａ”ヒトオステオカルシンを下記の測
定条件■の逆相ＨＰＬＣで純度検定した。

測定条件■ カラム、ＭＭＣ−Ｒ （φ４．６Ｘ２５０ｍｍ） 流速；　ｌ　ｄ　／　ｌ１１１ｎ 溶離液：Ａ液（水；アセトニトリル：ｌＯ％ＴＦＡ＝１
００：Ｏ：　　Ｌ） Ｂ液（水ニアセトニトリル：ｌＯ％ ＴＦＡ＝４０：　６０　：　１） 濃度勾配；Ａ／Ｂ＝１００１０　（０分）→１００１０
（５分）→Ｏ／１００ （３５分）−〇／ｌｏｏ　（４０分） 測定波長；２２０ｎｍ その結果、保持時間３０，７分にペプチドに基づく単一
の強い吸収を認め、これが本発明のＧｌａ”ヒトオステ
オカルシンであった。

東五斑ユ 次式 ％式％ で示されるＧｌｕ′？ヒトオステオカルシンの合ｌ７位
のアミノ酸の導入において、Ｂｏｃ−Ｇｌａ　（ＯｃＨ
ｅｘ）ｍを用いるかわりに、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ　（ＯＢｚ
ｌを用いた以外は、実施例１と同様の条件にて内相合成
を行い、保護ペプチド樹脂を得た。保護ペプチド樹脂の
一部（５００＋ｍｇ）を実施例１と同様にしてＨＦ分解
した。得られた還元型組Ｇｌｕ′７ヒトオステオカルシ
ンを実施例１と同様の方法で酸化、精製し、Ｇｌｕ”ヒ
トオステオカルシン３．２ｍｇを得た。

［発明の効果］ 本発明の方法によれば、Ｇｌａ”ヒトオステオカルシン
及びＧｌｕ”ヒトオステオカルシンにおいて、Ｇｌａの
導入が容易となり、化学合成が可能になった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ヒトオステオカルシンのペプチド合成法において、 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは０、１又は２を表す） で示される保護Ｌ−γ−カルボキシグルタミン酸又はそ
   の塩を用いてγ−カルボキシグルタミン酸を導入するこ
   とを特徴とするＧｌａ＾１＾７ヒトオステオカルシン及
   びＧｌｕ＾１＾７ヒトオステオカルシン又はこれらの塩
   の製造法。