CN113735954A - 一种手动固相合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽合成的方法，涉及使用缩合试剂DIC/Oxyma手动高效合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4。本发明发现过量的Oxyma能显著增加合成效率，且能有效降低外消旋等副反应。本发明通过分析型反相高效液相色谱、质谱和圆二色谱对合成多肽进行验证，发现1当量树脂(Rink Amide AM树脂或Wang树脂)，4当量的氨基酸，4当量的DIC，8当量的Oxyma缩合体系，在50℃条件下，通过手动固相合成方法，可以避免前人技术的缺点(如反应效率低、反应条件苛刻、氨基酸消旋、氨基酸氧化等)，实现了蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效、经济、温和制备。本发明为多肽的产业化制备提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及多肽制药领域，具体是指一种采用过量Oxyma对一种蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效手动合成方法。
背景技术
肽类分子在疾病治疗、生物成像和诊断等领域得到广泛应用。基于Fmoc的固相多肽合成是制备多肽类分子的常用方法。偶联试剂介导一个氨基酸的羧酸和另一个氨基酸的氨基形成酰胺键，在SPPS过程中发挥关键作用。常用偶联试剂为碳二亚胺类化合物(如N,N'-二异丙基碳二亚胺，DIC)，受保护的氨基直接与经DIC活化的氨基酸反应会发生较高的消旋率，增加分离纯化的难度且影响产物的合成效率和产率。且DIC酯会消耗变为没有反应活性的酰基脲，浪费反应物。为了减少传统偶联试剂引起的外消旋化等副反应，化学家开发了一系列外消旋抑制剂，如广泛使用的1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。基于HOBt结构的消旋抑制剂在使用过程中存在着潜在的爆炸风险，已被多个国家禁用。2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)是一种新型的外消旋抑制剂，可以抑制碳二亚胺法形成肽键过程中的外消旋化。Oxyma具有强吸电子基团氰基肟，能够与DIC活化的羧酸发生酰基转移，碳二亚胺离去，然后Oxyma活性酯与氨基酸反应，Oxyma离去，生成酰胺键。与传统的HOBt和HOAt等外消旋抑制剂相比，Oxyma具有廉价、安全、缩合效率高、兼容手动和微波固相多肽合成等优势。
新型缩合剂Oxyma目前是多肽固相合成与DIC常用的缩合试剂。本发明发现加入过量Oxyma能显著提高合成速率，且能有效降低消旋体。本发明公开了一种多肽合成的方法，涉及使用缩合试剂DIC/Oxyma手动高效合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4。
蜈蚣毒素RhTx和RhTx毒素的价值：RhTx毒素来自于具有攻击性的中国红头蜈蚣。RhTx是一种小型紧凑的多肽毒素，含有27个氨基酸残基。RhTx分子中含有两对二硫键，第5位的Cys(半胱氨酸)和第16位的Cys形成一对二硫键，第10位的Cys和第23位的Cys形成另一对二硫键。RhTx多肽的N-端比较灵活多变，而多肽近C-端的一半片段中几乎聚集着所有的富电荷残基。正是由于富电荷残基聚集在多肽分子的一端，使得RhTx毒素成为一个极性分子。RhTx毒素选择性作用于TRPV1离子通道，是非常有效的TRPV1通道激活剂，能够特异性激活TRPV1的胞外区，通过诱导构象重排，干扰离子渗透，产生剧烈的疼痛，具有高效亲和力和高度特异性。然而，RhTx在自然界中的含量较低，因此人工合成RhTx来弥补天然毒素来源不足的问题是非常有必要的。
GsMTx4蜘蛛毒素和GsMTx4蜘蛛毒素的价值：GsMTx4毒素是从Grammostolaspatulata蜘蛛的毒素中提取得到的。GsMTx4毒素含有34个氨基酸以及三对二硫键。GsMTx4第2位的Cys和第17位的Cys形成第一对二硫键，第9位的Cys和第23位的Cys形成第二对二硫键，第16位的Cys和第30位的Cys形成第三对二硫键。Piezo通道作为一个多功能的机械敏感的阳离子通道，能够介导触觉，血管发育和本体感觉。更重要的是Piezo的突变与涉及机械传导的多种遗传性人类疾病有关。所以Piezo通道可以作为一个重要的潜在治疗靶点。GsMTx4毒素是目前报道的唯一的特异性靶向Piezo通道的抑制剂。GsMTx4的自然丰度较低，传统的蛋白质重组表达等方法难以获取足量的目标多肽，化学方法是获取足量GsMTx4的有效途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种手动高效化学合成蜈蚣毒素RhTx毒素和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，选择DIC/Oxyma作为缩合剂，在50℃条件下，手动高效固相合成蜈蚣毒素RhTx毒素和蜘蛛毒素GsMTx4。本发明发现过量的Oxyma能显著增加合成速率，且有效降低外消旋化等副反应。
基于上述目的，本发明所涉及的技术方案如下：
1)合成树脂处理：取0.32mmol/g Rink Amide AM树脂180mg置于多肽合成管。首先，分别用如下溶剂在多肽合成管中对树脂进行清洗，DMF洗两次，DCM洗两次，DMF洗一次，DCM洗一次，DMF洗三次，抽干溶剂(标准洗)。然后，加入4mL DMF，在室温下浸泡溶胀1h，再按上述标准洗的方法洗一次。最后，4mL DMF/DCM(1:1，v/v)的混合溶剂加入含有树脂的合成管中，28℃恒温振荡器，80-100转/分钟，活化树脂30min，再按上述标准洗方法洗一次。
2)氨基酸缩合：本发明多肽合成过程中每个氨基酸(除缩合精氨酸之外)缩合过程如下：采用Fmoc保护基的氨基酸(4当量)，DIC(4当量)，缩合剂Oxyma(8当量)，溶于DMF配成缩合试剂，在室温下活化4分钟后，加入合成管，在50℃恒温振荡缩合两次，根据Kaiser检验结果，第一次反应时间为10-15min，第二次反应时间为15-30min。
3)氨基酸连接完成后脱除Fmoc保护基的方法：在50℃恒温振荡的条件下，20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团。反应两次，反应时间分别为3min和6min。取少量树脂，通过Kaiser测试检测脱除的程度。
4)精氨酸缩合：Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4当量)，HCTU(3.7当量)，DIEA(8当量)，先后溶于DMF中配成缩合试剂，摇匀。然后，将反应液迅速加入合成管中，28℃恒温振荡条件下缩合两次，反应时间分别是30min和50min。最后，在28℃恒温振荡条件下，用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，脱除2次，反应时间分别为5min和10min。
5)全部氨基酸连接完成，将多肽从树脂切除的过程：首先将反应后的树脂按上述标准洗方法洗一次，然后在28℃恒温振荡的条件下用含有20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基两次，每次反应时间分别为5min和10min。使用DMF和DCM交替清洗六次，然后使用DCM冲洗树脂至少5次，用水泵和油泵分别抽真空6分钟。最后加入切肽试剂(三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1，2-乙二硫醇，82.5:5:5:5:2.5，v/v/v/v/v，提前预冷至大约4℃)，在28℃恒温振荡器条件下反应2.5-3小时。
6)沉淀方法收集毒素沉淀：用氮气将上述切肽溶液进行鼓泡浓缩至2-3mL，然后用预冷的冰乙醚将多肽沉淀。然后，3200r/min离心1min，弃去上清液，保留沉淀。上述步骤重复三次，最后将提取的线性粗产品在通风橱中室温干燥。
7)制备型反相高效液相色谱对粗肽分离纯化：首先使用乙腈-水的混合溶液溶解上述多肽，用低温冷冻干燥的方法得到絮状的粗肽。然后使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化系统对粗肽进行分离纯化，得到纯的线性多肽溶液。通过冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到纯的线性多肽(即线性RhTx或线性GsMTx4)。
8)蜈蚣毒素RhTx的体外折叠：首先用pH 7.5的0.1M Tris缓冲盐溶液溶解线性RhTx(终浓度30μM)、还原型谷胱甘肽(终浓度5mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度0.1mM)。然后25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱和质谱监测复性进程。最后，使用半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到纯肽溶液。使用冷冻干燥机对纯肽溶液进行冷冻干燥处理，得到固体形式的目标多肽RhTx。
9)蜘蛛毒素GsMTx4的体外折叠：首先用pH7.8的0.1M Tris缓冲盐溶液溶解线性GsMTx4(终浓度10μM)、还原型谷胱甘肽(终浓度1mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度0.1mM)。然后，25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱和质谱检测复性进行。复性完毕后，用三氟乙酸调节pH到2-3后冷冻干燥。用超纯水重新溶解复性产物，在4℃的条件下离心，保留上清液。使用半制备型反相高效液相色谱对上清液分离纯化，得到纯肽溶液。通过冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到固体形式的目标多肽GsMTx4。
10)所述步骤8)和9)中的线性多肽和目标毒素多肽均经过分析型反相高效液相色谱，质谱和圆二色谱等对其纯度，分子量，二级结构进行了验证。
作为改进，所述Kaiser试剂是含有80％苯酚的乙醇溶液(w/v)和5％茚三酮的乙醇溶液(w/v)。
采用以上方法后，本发明具有如下优点：
本发明公开了一种手动多肽合成的方法，涉及使用缩合试剂DIC/Oxyma手动高效合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4。通过加入过量Oxyma，能显著提高合成速率，单个氨基酸的缩合反应时间大约是常温法的30％-40％。反应条件温和，对仪器和操作人员均友好，氨基酸消旋较少。综上，本项目使用1当量树脂(Rink Amide AM树脂或Wang树脂)，4当量的氨基酸，4当量的DIC，8当量的Oxyma缩合体系，50℃条件下，可以避免前人技术的缺点(反应效率低、反应条件苛刻、氨基酸消旋等)，实现线性多肽的手动、高效、经济、温和制备。本发明公布了基于DIC/Oxyma缩合体系的快速、稳健、安全的多肽高效合成方法，为固相多肽合成特别是手动固相多肽合成提供了重要方法参考.
附图说明
图1是本发明专利的固相多肽合成的基本流程。
图2是本发明专利纯化后的线性RhTx的反相高效液相色谱图。
图3是本发明专利纯化后的线性RhTx的ESI-MS质谱图。
图4是本发明专利纯化后的线性GsMTx4的反相高效液相色谱图。
图5是本发明专利纯化后的线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图6是本发明专利复性纯化后的RhTx的反相高效液相色谱图。
图7是本发明专利复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。
图8是本发明专利复性纯化后的GsMTx4的反相高效液相色谱图。
图9是本发明专利复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图10是本发明专利复性纯化后的RhTx的CD谱图。
图11是本发明专利复性纯化后的GsMTx4的CD谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
1)合成树脂处理：取0.32mmol/g Rink Amide AM树脂180mg置于多肽合成管。首先，分别用如下溶剂在多肽合成管中对树脂进行清洗，DMF洗两次，DCM洗两次，DMF洗一次，DCM洗一次，DMF洗三次，抽干溶剂(标准洗)。然后，加入4mL DMF，在室温下浸泡溶胀1h，再按上述标准洗的方法洗一次。最后，4mL DMF/DCM(1:1，v/v)的混合溶剂加入含有树脂的合成管中，28℃恒温振荡器，80-100转/分钟，活化树脂30min，再按上述标准洗方法洗一次。
2)脱除树脂上的Fmoc基团：在28℃恒温振荡条件下，将多肽合成管中加入含有20％哌啶的DMF溶液(v/v)，在恒温振荡器中反应5min，抽干反应液，加入DMF洗两次。再加入20％哌啶的DMF溶液，在28℃下，放入恒温振荡器中反应10min，抽干反应液，标准洗一次，抽干溶剂。使用Kaiser测试监测Fmoc的脱除程度。
3)氨基酸缩合：本发明多肽合成过程中每个氨基酸(除缩合精氨酸之外)缩合过程如下，采用Fmoc保护基的氨基酸(4当量)，DIC(4当量)，缩合剂Oxyma(8当量)，溶剂为DMF，配制成缩合溶液，上述反应体系在室温下活化4分钟后，加入合成管，在50℃恒温振荡缩合两次，根据Kaiser检验结果，第一次反应时间为10-15min，第二次反应时间为15-30min。
4)脱除氨基酸上Fmoc基团：在50℃恒温振荡的条件下，20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团。反应两次，反应时间分别为3min和6min。取少量树脂，通过Kaiser测试检测脱除的程度。
5)精氨酸缩合：DMF溶液中4mL溶液中加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4当量)，HCTU(3.7当量)，DIEA(8当量)，摇匀。然后，将反应也迅速倒入合成管中，28℃恒温振荡条件下缩合两次，反应时间分别是30min和50min。最后，在28℃恒温振荡条件下，用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，脱除2次，反应时间分别为5min和10min。
6)全部连接完成的氨基酸从树脂切除过程：首先将反应后的树脂按上述标准洗方法洗一次，然后在28℃恒温振荡的条件下用含有20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基两次，每次反应时间分别为5min和10min。使用DMF和DCM交替清洗六次，然后使用DCM冲洗树脂至少5次，用水泵和油泵分别抽真空6分钟。最后加入切肽试剂(三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1,2-乙二硫醇,82.5:5:5:5:2.5,v/v/v/v/v，提前预冷至大约4℃)，在28℃恒温振荡器中反应2.5-3h。
7)沉淀方法收集毒素沉淀：用氮气将上述切肽溶液进行鼓泡浓缩至2-3mL，并用预冷的冰乙醚将多肽沉淀，然后，3200r/min离心1min，弃去上清液，保留沉淀。上述步骤重复三次，最后将提取的线性粗产品在通风橱中室温干燥。
8)制备型反相高效液相色谱对粗肽分离纯化：首先使用乙腈-水的混合溶液溶解上述多肽沉淀，用低温冷冻干燥的方法得到絮状的粗肽。然后使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化系统对粗肽进行分离纯化，得到纯的线性多肽溶液。通过冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到纯的线性多肽(即线性RhTx或线性GsMTx4)。
如图2所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过分离纯化后得到线性RhTx的反相高效液相色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，分离梯度为：首先10％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)1min，然后10％-60％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图3所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)，和Oxyma(8当量)经过分离纯化后，得到线性RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2969.48，实际测定分子量：2968.44。
如图4所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过分离纯化后，得到线性GsMTx4的反相高效液相色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，分离梯度为：首先5％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)2min，然后5％-60％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图5所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过分离纯化后，得到合成的线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4101.95，实际测定分子量：4101.00。
9)蜈蚣毒素RhTx的体外折叠：首先用pH 7.5的0.1M Tris缓冲盐溶液溶解线性RhTx(终浓度30μM)、还原型谷胱甘肽(终浓度5mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度0.1mM)。然后25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱和质谱监测复性进程。最后，使用半制备型反相高效液相色谱进行分离纯化，得到纯肽溶液。使用冷冻干燥机对纯肽溶液进行冷冻干燥处理，得到固体形式的目标多肽RhTx。
如图6所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过复性和色谱分离，得到复性纯化后的RhTx的反相高效液相色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，分离梯度为：首先10％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)1min，然后10％-60％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图7所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过分离纯化后，得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2965.48，实际测定分子量：2964.66。
10)蜘蛛毒素GsMTx4的体外折叠：首先用pH7.8的0.1M Tris缓冲盐溶液溶解线性GsMTx4(终浓度10μM)、还原型谷胱甘肽(终浓度：1mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度：0.1mM)。然后，25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱和质谱检测复性进行。复性完毕后，用三氟乙酸调节pH到2-3后冷冻干燥。用超纯水重新溶解复性产物，在4℃的条件下离心，保留上清液。使用半制备型反相高效液相色谱对上清液分离纯化，得到纯肽溶液。通过冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到固体形式的目标多肽GsMTx4。
11)所述步骤8)和9)中的目标线性多肽和目标毒素多肽均经过分析型反相高效液相色谱，质谱和圆二色谱等对其纯度，分子量，CD谱图进行了验证。
如图8所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过复性和色谱纯化，得到复性纯化后的GsMTx4的反相高效液相色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，分离梯度为：首先5％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)2min，然后5％-60％乙腈(含0.08％-0.1％TFA)30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图9所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，经过复性和色谱纯化，得到复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4095.95，实际测定分子量：4094.93。
RhTx的CD谱图测定的基本流程：将RhTx溶解于1×PBS中，最终浓度1.5mg/mL，使用J-815CD光谱仪，在170-260nm范围内记录三次CD光谱数据。所有的数据均采用100nm/min的扫描速度采集，所有校正和处理均采用Jasco标准分析程序进行。
如图10所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，得到目标RhTx的CD(圆二色谱)谱图。合成的目标RhTx与RhTx标准品的CD谱图进行对比可以得出，合成的目标RhTx与RhTx标准品具有相同得二级结构。
GsMTx4的CD谱图测定的基本流程：将多肽GsMTx4溶解于dd H2O中，最终浓度1mg/mL，使用J-815CD光谱仪，在195-260nm范围内记录三次CD光谱数据。所有的数据均采用100nm/min的扫描速度采集，所有校正和处理均采用Jasco标准分析程序进行。
如图11所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，在50℃条件下，使用的缩合体系为Fmoc-氨基酸(4当量)、DIC(4当量)和Oxyma(8当量)，得到目标GsMTx4的CD谱图。合成的目标GsMTx4与GsMTx4标准品的CD谱图进行对比可以得出，合成的目标GsMTx4与GsMTx4标准品具有相同得二级结构。
Claims (2)
1.一种采用过量Oxyma对蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素多肽GsMTx4的高效手动固相合成方法，其特征在于：
1)使用过量Oxyma对一种蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素多肽GsMTx4的温和、经济、高效、手动合成方法。
2)固相树脂为1摩尔当量，精氨酸之外的其它氨基酸缩合使用的缩合体系是Fmoc保护基的氨基酸(4摩尔当量)、DIC(4摩尔当量)、Oxyma(8摩尔当量)，在50℃气浴恒温振荡条件下缩合两次，第一次反应5-15分钟，第二次根据氨基酸连接的难易程度和Kaiser检测情况反应10-35分钟。
3)Fmoc脱除的反应条件为：在50℃气浴恒温振荡的条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，第一次脱除反应时间为3-5分钟，第二次脱除反应时间为5-8分钟。
2.根据权利要求1所述的一种新的合成蜈蚣毒素多肽RhTx和蜘蛛毒素多肽GsMTx4的方法，其特征在于50℃条件下的手动固相合成，所述步骤1)包含固相缩合试剂的摩尔配比为Fmoc-氨基酸：DIC：Oxyma＝1:1:2。
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Citations (3)
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| US20130289241A1 (en) * | 2012-04-26 | 2013-10-31 | Shanghai Ambiopharm, Inc. | Method for preparing exenatide |
| CN108440654A (zh) * | 2018-02-24 | 2018-08-24 | 暨南大学 | 一种抗菌活性环六肽Thermoactinoamide A的合成方法 |
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- 2021-09-26 CN CN202111129460.0A patent/CN113735954A/zh active Pending
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