CN113214376A - 一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法 - Google Patents

一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，通过探索在高温的条件下缩合剂和催化剂使用的最佳比例，确定最佳的反应条件。本发明在50℃条件下，使用1当量的树脂(Rink Amide AM树脂或Wang树脂)：4当量的氨基酸：8(或12、或16)当量的DIC：4当量的Oxyma，实现蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效固相合成。本发明涉及的一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，在更温和的50℃条件下，使用经济且稳健的DIC/Oxyma缩合剂，实现了蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效制备。

Description

一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法
技术领域
本发明涉及生物领域，具体是指一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法。
背景技术
RhTx毒素：青岛大学药学院的王克威教授与云南动物所的赖仞研究员合作于2015年在Nature Communications杂志上发表文章报道，具有攻击性的中国红头蜈蚣能够分泌RhTx毒素。RhTx是含有27个氨基酸残基的毒素多肽。RhTx第5位的Cys(半胱氨酸)和第16位的Cys形成二硫键，第10位的Cys和第23位的Cys形成二硫键。核磁共振谱图显示RhTx毒素是一条紧凑的多肽，并且两对二硫键共同维持着折叠多肽的构象。RhTx多肽的N-端比较灵活多变，而多肽近C-端的一半片段中几乎聚集着所有的富电荷残基。正是由于富电荷残基聚集在多肽分子的一端，使得RhTx毒素成为一个极化分子。
RhTx毒素的靶点和价值：RhTx毒素选择性作用于TRPV1离子通道。TRPV1是瞬时感受器电位离子通道蛋白(transient receptor potential ion channel protein；TRP)家族中的一个亚型。TRP是一类非选择性阳离子通道蛋白，存在于细胞膜或者胞内细胞器膜上，能够非常灵敏的感受温度变化，并且可以转化成热疼痛。RhTx是TRPV1非常有效的激活剂，能够特异性激活TRPV1的胞外区，通过诱导构象重排，干扰离子渗透，产生剧烈的疼痛，具有高效亲和力和高度特异性。RhTx在自然界中的含量较低，有必要人工合成RhTx来弥补天然毒素来源不足的问题。
GsMTx4蜘蛛毒素：GsMTx4最先由Suchyna等人从Grammostola spatulata蜘蛛的毒素中提取得到。编码GsMTx4是含有34个氨基酸的活性多肽，分子中含有三对二硫键。GsMTx4第2位的Cys和第17位的Cys形成二硫键，第9位的Cys和第23位的Cys形成二硫键，第16位的Cys和第30位的Cys形成二硫键。
GsMTx4蜘蛛毒素的价值：Piezo通道是一个多功能的机械敏感的阳离子通道，介导触觉，血管发育和本体感觉。Piezo突变与涉及机械传导的多种遗传性人类疾病有关。Piezo通道可以作为一个重要的潜在治疗靶点。GsMTx4是目前报道的唯一一个特异性靶向Piezo通道的抑制剂。Piezo通道的机械控制和调节的动态过程尚不清楚，因此通过化学合成GsMTx4对作用机制和疾病的研究至关重要。
现有的多肽合成技术主要有两种：
1.常温多肽合成方法：反应温度25-30℃，反应稳健，但合成周期长、合成效率低，接一个氨基酸大约需要40-120分钟；另外，常温法使用HCTU和HATU等缩合剂，多肽合成的成本较高。
2.高温多肽合成方法：反应温度75℃以上，缩合效率较高，接一个氨基酸需要20-40分钟。由于高温法需要持续在75℃以上反应，对仪器的性能要求较苛刻；反应过程中需要反复打开外盖，非常容易损害仪器。另外，75℃反应对操作人员不友好，容易导致皮肤烫伤。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，在更温和的50℃条件下，使用经济且稳健的DIC/Oxyma缩合剂，实现了蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的高效制备。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，包括以下步骤：
1)称取一定量的Rink Amide AM树脂或Wang树脂(1当量)置于多肽合成管中，标准洗一次，抽干；加入3mL DMF于室温中浸泡溶胀1h，标准洗一次；加入3mL DMF/DCM混合溶液，所述DMF和DCM的体积比为1:1，于28℃恒温振荡器中活化树脂30min，标准洗一次；
2)在28℃恒温振荡条件下，加入20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团，在28℃温度下，在恒温振荡器中反应5min，DMF洗两次；再加入20％哌啶的DMF溶液，在28℃温度下，在恒温振荡器中反应10min，标准洗一次，抽干待用；
3)精氨酸之外的其它氨基酸缩合使用的缩合体系是含有Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量、或12当量、或16当量)的3mL DMF溶液，在50℃恒温振荡条件下缩合两次，第一次反应10-15min，第二次根据氨基酸连接的难易程度和Kaiser检测情况反应15-30min，然后，在50℃恒温振荡的条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，第一次反应3min，第二次反应6min；
4)Fmoc-Arg(Pbf)-OH使用的缩合体系含有Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4当量)、HCTU(3.7当量)和DIEA(8当量)的3mL DMF溶液，在28℃恒温振荡条件下缩合，第一次反应20min，第二次反应40min，然后，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，第一次反应5min，第二次反应10min；
5)切肽：标准洗一次，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，第一次反应5min，DMF冲洗两次，再次加入20％哌啶的DMF溶液，反应10min，标准洗一次，取少量树脂，用Kaiser试剂检测，在加热条件下检测显色，使用DCM冲洗树脂5次，水泵抽真空5分钟，油泵抽真空5分钟，加入切肽试剂，28℃恒温振荡器中反应2.5小时；
6)多肽沉淀：使用氮气鼓泡浓缩方法，将切肽溶液浓缩至2-3mL，使用冰乙醚沉淀，在3000r/min的条件下离心1min，弃去上清液，保留沉淀；溶解-离心-弃上清步骤重复三次；多肽沉淀在通风橱中静置至干燥。
7)分离纯化：通过制备型反相高效液相色谱对线性肽进行分离纯化，使用乙腈-水的混合溶液溶解粗肽，使用低温冷冻干燥机冷冻干燥，然后用乙腈-水的混合溶液再次溶解粗肽，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标线性多肽；
8)体外复性折叠和分离纯化：通过氧化还原对实现线性RhTx和GsMTx4的体外复性折叠，通过反相高效液相色谱对复性溶液进行分离纯化，通过低温冷冻干燥机冻干，得到目标毒素多肽。
作为改进，所述步骤8)的具体方法为：
配制0.1M Tris缓冲盐水溶液，用1M NaOH水溶液调节pH至7.5，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性RhTx、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，线性RhTx的终浓度为30μM；复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12小时，使用分析型反相高效液相色谱监测复性过程，复性完成后，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽RhTx；
配制0.1M Tris缓冲盐溶液，用1M NaOH溶液调节pH至7.8，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性GsMTx4、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽；线性GsMTx4的最终浓度为10μM，复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱监测复性过程，复性完毕后，用分析纯的三氟乙酸调节pH到2-3；低温冷冻干燥后，用dd H2O重新溶解复性产物，在4℃的条件下离心，保留上清液，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽GsMTx4。
作为改进，所述Kaiser试剂含有80％苯酚的乙醇溶液(w/v)和5％茚三酮的乙醇溶液(w/v)。
作为改进，所述切肽试剂需要提前冰浴降温至5℃以下。
作为改进，所述切肽试剂的配比为TFA:phenol:water:thioanisole:EDT＝82.5:5:5:5:2.5。
采用以上方法后，本发明具有如下优点：
反应效率高，前人采用基于DIC/Oxyma的常温固相缩合技术，反应效率低，反应时间长。本项目在50℃下，探索DIC和Oxyma的最佳比例，提高反应效率，大幅缩短缩合时间。单个氨基酸的缩合反应时间大约是常温法的30％-40％。反应条件温和，对仪器和操作人员均友好，氨基酸消旋较少。前人采用的高温固相缩合技术，需要75℃以上反应，对仪器和操作人员均不友好。本发明在50℃下反应，反应条件更加温和，对实验器材和实验人员友好，同时不会大幅降低反应效率。综上，本项目在50℃条件下，1当量树脂(Rink Amide AM树脂或Wang树脂)，4当量的氨基酸，8(或12、或16)当量的DIC，4当量的Oxyma缩合体系，可以避免前人技术的缺点(反应效率低、反应条件苛刻、氨基酸消旋等)，实现线性多肽的高效、经济、温和制备。
附图说明
图1是本发明专利名称的固相多肽合成的基本流程。
图2是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到线性RhTx的色谱图。
图3是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到线性RhTx的ESI-MS质谱图。
图4是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到线性RhTx的色谱图。
图5是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到线性RhTx的ESI-MS质谱图。
图6是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第三种方法得到线性RhTx的色谱图。
图7是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第三种方法得到线性RhTx的ESI-MS质谱图。
图8是本发明专利名称使用的基于Wang树脂得到线性RhTx的色谱图。
图9是本发明专利名称使用的基于Wang树脂得到线性RhTx的ESI-MS质谱图。
图10是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到线性GsMTx4的色谱图。
图11是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图12是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到线性GsMTx4的色谱图。
图13是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图14是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
图15是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。
图16是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
图17是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。
图18是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第三种方法得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
图19是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第三种方法得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。
图20是本发明专利名称使用的基于Wang树脂得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
图21是本发明专利名称使用的基于Wang树脂得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。
图22是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到复性纯化后的GsMTx4的色谱图。
图23是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第一种方法得到复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图24是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到复性纯化后的GsMTx4的色谱图。
图25是本发明专利名称使用的基于Rink Amide AM树脂第二种方法得到复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。
图26是本发明专利名称使用的四种技术路线，得到目标RhTx的CD(圆二色谱)谱图。
图27是本发明专利名称使用的两种技术路线，得到目标GsMTx4的CD谱图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
称取一定量的Rink Amide AM树脂或Wang树脂置于多肽合成管中，标准洗一次(DMF洗2次，DCM洗2次，DMF洗1次，DCM洗1次，DMF洗2次)，抽干；加入3mL DMF于室温中浸泡溶胀1h，标准洗一次；加入3mL DMF/DCM(v/v＝1:1)混合溶液，于28℃恒温振荡器中活化树脂30min，标准洗一次。
在28℃恒温振荡条件下，加入20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团，恒温振荡器中(28℃)反应5min，DMF洗两次；再加入20％哌啶的DMF溶液(v/v)，恒温振荡器中(28℃)反应10min，标准洗一次，抽干待用。
精氨酸之外的其它氨基酸缩合使用的缩合体系是含有Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量、或12当量或16当量)的3mL DMF溶液。在50℃恒温振荡条件下缩合两次，第一次反应10-15min，第二次根据氨基酸连接的难易程度和Kaiser检测情况反应15-30min。然后，在50℃恒温振荡的条件下，使用20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团，第一次反应3min，第二次反应6min。
Fmoc-Arg(Pbf)-OH不能在高温条件下缩合，使用的缩合体系是含有Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4当量)、HCTU(3.7当量)、DIEA(8当量)的3mL DMF溶液。在28℃恒温振荡条件下缩合，第一次反应20min，第二次反应40min。然后，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基，第一次反应5min，第二次反应10min。
切肽：标准洗一次，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团，第一次反应5min，DMF冲洗两次，再次加入20％哌啶的DMF溶液(v/v)，反应10min，标准洗一次。取少量树脂，用Kaiser试剂(含有80％苯酚的乙醇溶液(w/v)和5％茚三酮的乙醇溶液(w/v))检测，在加热条件下检测显色。使用DCM冲洗树脂5次，水泵抽真空5分钟，油泵抽真空5分钟。加入切肽试剂TFA:phenol:water:thioanisole:EDT＝82.5:5:5:5:2.5(切肽试剂需要提前冰浴降温至5℃以下)，28℃恒温振荡器中反应2.5小时。
多肽沉淀：使用氮气鼓泡浓缩方法，将切肽溶液浓缩至2-3mL。使用冰乙醚沉淀，在3000r/min的条件下离心2min，弃去上清液，保留沉淀；此溶解-离心-弃上清步骤重复三次。多肽沉淀在通风橱中静置至干燥。
分离纯化：通过制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)对线性肽进行分离纯化。使用乙腈-水的混合溶液溶解粗肽，使用低温冷冻干燥机冷冻干燥。然后用乙腈-水的混合溶液再次溶解粗肽，使用半制备型反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标线性多肽。
如图2所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)得到线性RhTx的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“ProteinC18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈(含0.1％TFA，下同)1min，然后10％-60％乙腈(含0.1％TFA，下同)30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图3所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)合成线性RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2969.48，实际测定分子量：2968.47。
如图4所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)得到线性RhTx的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“ProteinC18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图5所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)合成线性RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2969.48，实际测定分子量：2968.94。
如图6所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(16当量)得到线性RhTx的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“ProteinC18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图7所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(16当量)合成线性RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2969.48，实际测定分子量：2968.43。
如图8所示，使用Wang树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)得到线性RhTx的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图9所示，使用Wang树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)合成线性RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2970.47，实际测定分子量：2969.44。
如图10所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)得到线性GsMTx4的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先5％乙腈2min，然后5％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图11所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)合成线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4101.95，实际测定分子量：4100.99。
如图12所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，使用Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)得到线性GsMTx4的色谱图。色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先5％乙腈2min，然后5％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图13所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)合成线性GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4101.95，实际测定分子量：4101.19。
体外复性折叠和分离纯化：通过氧化还原对实现线性RhTx和GsMTx4的体外复性折叠。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)对复性溶液进行分离纯化。通过低温冷冻干燥机冻干，得到目标毒素多肽(白色固体)。
RhTx的复性(一次氧化折叠策略)和分离纯化：
配制0.1M Tris缓冲盐水溶液，用1M NaOH水溶液调节pH至7.5，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性RhTx、还原型谷胱甘肽(终浓度5mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度0.5mM)。线性RhTx的终浓度为30μM。复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12小时，使用分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)监测复性过程。复性完成后，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽RhTx。
GsMTx4的复性(一次氧化折叠策略)和分离纯化：
配制0.1M Tris缓冲盐溶液，用1M NaOH溶液调节pH至7.8，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性GsMTx4、还原型谷胱甘肽(终浓度为1mM)、氧化型谷胱甘肽(终浓度为0.1mM)。线性GsMTx4的最终浓度达为10μM。复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)监测复性过程。复性完毕后，用分析纯的三氟乙酸调节pH到2-3。低温冷冻干燥后，用dd H2O重新溶解复性产物，在4℃的条件下离心，保留上清液。使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽GsMTx4。
如图14所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图15所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2965.48，实际测定分子量：2964.76。
如图16所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图17所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2965.48，实际测定分子量：2964.74。
如图18所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(16当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图19所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(16当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2965.48，实际测定分子量：2964.45。
如图20所示，使用Wang树脂(1当量)，50℃下，使用Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，使用Wang树脂得到复性纯化后的RhTx的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先10％乙腈1min，然后10％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图21所示，使用Wang树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，使用Wang树脂得到复性纯化后的RhTx的ESI-MS质谱图。理论分子量：2966.47，实际测定分子量：2965.65。
如图22所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的GsMTx4的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先5％乙腈2min，然后5％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图23所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4095.95，实际测定分子量：4094.93。
如图24所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，50℃下，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的GsMTx4的色谱图。
色谱分离条件：Grace Vydac“Protein C18”，250×4.6mm，5um粒径，首先5％乙腈2min，然后5％-60％乙腈30min，流速为1.0mL/min，λ＝214nm。
如图25所示，使用Rink Amide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法，使用Rink Amide AM树脂得到复性纯化后的GsMTx4的ESI-MS质谱图。理论分子量：4095.95，实际测定分子量：4095.32。
如图26所示，使用四种技术路线，得到目标RhTx的CD(圆二色谱)谱图。1.RinkAmide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法。2.RinkAmide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法。3.RinkAmide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(16当量)方法。4.Wang树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法。
如图27所示，使用两种技术路线，得到目标GsMTx4的CD谱图。1.Rink Amide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量)方法。2.Rink Amide AM树脂(1当量)，Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(12当量)方法。
RhTx的CD谱图测定的基本流程：将RhTx溶解于1×PBS中，最终浓度1-1.5mg/mL，使用J-815CD光谱仪，在170-260nm范围内记录三次CD光谱数据。所有的数据均采用100nm/min的扫描速度采集，所有校正和处理均采用Jasco标准分析程序进行。
GsMTx4的CD谱图测定的基本流程：将多肽GsMTx4溶解于dd H2O中，最终浓度0.5mg/mL，使用J-815CD光谱仪，在195-260nm范围内记录三次CD光谱数据。所有的数据均采用100nm/min的扫描速度采集，所有校正和处理均采用Jasco标准分析程序进行。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取1当量的Rink Amide AM树脂或Wang树脂置于多肽合成管中，标准洗一次，抽干；加入3mL DMF于室温中浸泡溶胀1h，标准洗一次；加入3mL DMF/DCM混合溶液，所述DMF和DCM的体积比为1:1，于28℃恒温振荡器中活化树脂30min，标准洗一次；
2)在28℃恒温振荡条件下，加入20％哌啶的DMF溶液(v/v)脱除Fmoc保护基团，在28℃温度下，在恒温振荡器中反应5min，DMF洗两次；再加入20％哌啶的DMF溶液，在28℃温度下，在恒温振荡器中反应10min，标准洗一次，抽干待用；
3)精氨酸之外的其它氨基酸缩合使用的缩合体系是含有Fmoc-氨基酸(4当量)、Oxyma(4当量)、DIC(8当量、或12当量、或16当量)的3mL DMF溶液，在50℃恒温振荡条件下缩合两次，第一次反应10-15min，第二次根据氨基酸连接的难易程度和Kaiser检测情况反应15-30min。然后，在50℃恒温振荡的条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，第一次反应3min，第二次反应6min；
4)Fmoc-Arg(Pbf)-OH使用的缩合体系是含有Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4当量)、HCTU(3.7当量)和DIEA(8当量)的3mL DMF溶液，在28℃恒温振荡条件下缩合，第一次反应20min，第二次反应40min，然后，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，第一次反应5min，第二次反应10min；
5)切肽：标准洗一次，在28℃恒温振荡条件下，使用20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基团，第一次反应5min，DMF冲洗两次，再次加入20％哌啶的DMF溶液，反应10min，标准洗一次，取少量树脂，用Kaiser试剂检测，在加热条件下检测显色，使用DCM冲洗树脂5次，水泵抽真空5分钟，油泵抽真空5分钟，加入切肽试剂，28℃恒温振荡器中反应2.5小时；
6)多肽沉淀：使用氮气鼓泡浓缩方法，将切肽溶液浓缩至2-3mL，使用冰乙醚沉淀，在3000r/min的条件下离心1min，弃去上清液，保留沉淀；溶解-离心-弃上清步骤重复三次；多肽沉淀在通风橱中静置至干燥；
7)分离纯化：通过制备型反相高效液相色谱对线性肽进行分离纯化，使用乙腈-水的混合溶液溶解粗肽，使用低温冷冻干燥机冷冻干燥，然后用乙腈-水的混合溶液再次溶解粗肽，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标线性多肽；
8)体外复性折叠和分离纯化：通过氧化还原对实现线性RhTx和GsMTx4的体外复性折叠，通过反相高效液相色谱对复性溶液进行分离纯化，通过低温冷冻干燥机冻干，得到目标毒素多肽。
2.根据权利要求1所述的一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，其特征在于，所述步骤8)的具体方法为：
配制0.1M Tris缓冲盐水溶液，用1M NaOH水溶液调节pH至7.5，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性RhTx、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，线性RhTx的终浓度为30μM；复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12小时，使用分析型反相高效液相色谱监测复性过程，复性完成后，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽RhTx；
配制0.1M Tris缓冲盐溶液，用1M NaOH溶液调节pH至7.8，定容，过滤，在磁子搅拌下依次加入dd H2O溶解的线性GsMTx4、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽；线性GsMTx4的最终浓度为10μM，复性溶液于25℃恒温振荡器中反应12h，使用分析型反相高效液相色谱监测复性过程，复性完毕后，用分析纯的三氟乙酸调节pH到2-3；低温冷冻干燥后，用dd H2O重新溶解复性产物，在4℃的条件下离心，保留上清液，使用半制备型反相高效液相色谱分离纯化，低温冷冻干燥，得到目标毒素多肽GsMTx4。
3.根据权利要求1所述的一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，其特征在于，所述Kaiser试剂是含有80％苯酚的乙醇溶液(w/v)和5％茚三酮的乙醇溶液(w/v)。
4.根据权利要求1所述的一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，其特征在于，所述切肽试剂需要提前冰浴降温至5℃以下。
5.根据权利要求4所述的一种新的合成蜈蚣毒素RhTx和蜘蛛毒素GsMTx4的方法，其特征在于，所述切肽试剂的配比为TFA:phenol:water:thioanisole:EDT＝82.5:5:5:5:2.5。
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