CN112062829B - 依降钙素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种依降钙素的制备方法，包括以下步骤：1)由Fmoc‑Pro‑OH与Sieber Amide Resin反应；2)在Fmoc‑Pro‑Sieber Amide Resin树脂上按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc‑Ser(tBu)‑OH；3)脱除肽树脂的氨基酸Asu上的侧链保护基OAll，脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽，将带保护基的线性依降钙素从树脂上脱落；4)溶液调节至中性，除去DCM，加入Cl‑HOBT与DIC充分反应；5)加水将带有侧链保护基的环状依降钙素析出，加入裂解液，加入冰乙醚沉淀；6)上制备分离纯化，得到纯度合格的液体依降钙素，将溶液转盐形成醋酸盐，冻干得到精品依降钙素。本发明制备方法简单，在液相条件下进行环化反应，大大提高了粗品纯度，有效提高了依降钙素的收率，降低了成本与“三废”排放。

Description

依降钙素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种合成多肽的方法，具体涉及一种依降钙素的制备方法。
背景技术
依降钙素(Carbocalcitonin)是合成的鳗鱼降钙素的一种衍生物，在临床研究方面，以依降钙素为主要原料的药物具有防止骨钙丢失的作用，还能起到改善骨质疏松的效果。
依降钙素是一条由31个氨基酸组成的多肽，其中包含具有环状结构的片段，由N端第1个氨基酸Ser上的氨基与N端第6为氨基酸Asu的侧链羧基结合成酰胺键，从而形成相对稳定的环状结构。依降钙素的序列如下：
[Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu]-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-OH，(Ser-AsuLacton)；Cas.No.:60731-46-6，分子式：C148H244N42O47，分子量：3363.77。
现有技术有关依降钙素的制备方法并不多。在传统的生产工艺中，会遇到粗品纯度低、收率低等情况，甚至需要经过多次分离纯化才能得到合格依降钙素。而低收率、高成本是不利于大规模生产的，同时会产生大量“三废”污染环境。
因此，需要对现有技术进行改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种依降钙素的制备方法。本发明提出了一种较为合理的生产路线，使用固相、液相技术生产依降钙素，收率较高。
为解决上述技术问题，本发明提供一种依降钙素的制备方法，包括以下步骤：
1)由Fmoc-Pro-OH与Sieber Amide Resin反应，得到替代度为0.30-0.40mmol/g的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂；
2)在Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂上按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH；得到肽树脂；
3)使用四三苯基磷钯脱除肽树脂的氨基酸Asu上的侧链保护基OAll，然后脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽，用TFA/DCM裂解液将带保护基的线性依降钙素从树脂上脱落；得到TFA/DCM依降钙素溶液；
4)用DIEA将裂解得到TFA/DCM依降钙素溶液调节至中性，中和TFA，然后旋蒸除去DCM，将得到的油状依降钙素线性肽后溶于DMF中，加入Cl-HOBT与DIC使肽链N端氨基与N端第6位Asu侧链的羧基充分反应，得到带有侧链保护基的环状依降钙素；
Cl-HOBT与DIC之间的摩尔数量比为1:1。
5)加水将带有侧链保护基的环状依降钙素析出，抽滤得固体，加入裂解液反应2小时，加入冰乙醚沉淀得到粗品依降钙素；
6)上制备分离纯化，得到纯度合格的液体依降钙素，将溶液转盐形成醋酸盐，冻干得到精品依降钙素。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤3)中，脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽采用体积比为20％的DBLK/DMF溶液。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤2)中，N端第13、14位使用Fmoc-Gln(Trt)-Glu(Otbu)-OH二肽作为反应原料，能有效提高粗品纯度；N端第6位使用Fmoc-Asu(OAll)-OH。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤2)中，缩合中使用的氨基酸均为Fmoc保护氨基酸，侧链保护基分别是：Ser侧链采用tBu保护，Asn侧链采用Trt保护，Ser侧链采用tBu保护，Thr侧链采用tBu保护，Asu侧链使用OAll保护，Lys侧链采用Boc保护，Gln侧链采用Trt保护，His侧链采用Trt保护，Tyr侧链采用tBu保护，Arg侧链采用Pbf保护，Asp侧链采用tBu保护；
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤2)中，偶联体系为：HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与DIC或DIEA与HOBT、HOAT、Cl-HOBT中的任意一个或一个以上与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上组成偶联体系。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤3)中，使用四三苯基磷钯脱除Asu上的侧链保护基OAll时，加入的四三苯基磷钯数量为树脂反应摩尔量的0.3倍；在步骤4)中，在DMF溶液中加入二乙胺调至PH在7-8，通入氮气反应4h。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤3)中，将线性依降钙素从树脂脱落，用TFA/DCM体积比为5：95的裂解液为最佳。TFA/DCM裂解液采用10-15ml/g树脂。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤4)中，N端第1位Ser上氨基与N端第6位氨基酸Asu侧链羧基反应时，使用Cl-HOBT与DIC作为Ser氨基与Asu侧链羧基反应的偶联缩合剂，投料倍数为反应摩尔量的1.8倍。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：在步骤5)中，裂解液采用的试剂配方体积比例为TFA：苯甲硫醚：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86.5：5：4.5：2：2。裂解液采用10-15ml/g树脂。
作为对本发明依降钙素的制备方法的改进：在步骤1)中，Fmoc-Pro-Sieber AmideResin树脂替代度为0.35mmol/g时为最佳。
作为对本发明依降钙素的制备方法的进一步改进：将粗品依降钙素溶于纯化水中，用滤膜过滤，得粗肽溶液。使用高效液相色谱仪器对已将改善粗肽进行纯化：通过DAC-HB50动态轴向压缩柱，流动相A为三氟醋酸水溶液，B为三氟醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰的肽溶液。经过高效液相纯化得到纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体，旋蒸浓缩后得到液体。将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体，在醋酸水溶液体系下洗脱50min，将收集的目的产物旋转浓缩，进行预冻干、冻干处理，最终得到依降钙素精品肽。
本发明依降钙素的制备方法的技术优势为：
按照本发明的工艺，可以生产纯度更高的粗品依降钙素，从而提高产品收率，有效降低成本，具有很好的产业化前景。本发明方法工艺简单，能够降低依降钙素的合成难度，合成得到的依降钙素产品收率高，成本较低，纯度在98％以上，利于推广。
与传统工艺对比，本发明制备方法简单，在液相条件下进行环化反应，大大提高了粗品纯度，有效提高了依降钙素的收率，降低了成本与“三废”排放。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：一种依降钙素的制备方法；
具体步骤如下：
1)称取替代度为1mmol/g的Sieber Amide Resin(30g)装入反应釜中，加入适量DCM溶胀20min，抽干后用DMF洗涤3遍后抽干，分别加入适量的脱帽液(DBLK/DMF体积比为1：4)依次反应5min、10min，中间用DMF洗涤一次。称取Fmoc-Pro-OH(13.65g)与TBTU(19.27g)彻底溶于适量DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(19.83ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到上述的反应釜中，室温条件下搅拌反应2h后抽干，用适量DMF洗涤3遍后，加入25ml醋酸酐/吡啶(体积比1：1)至反应釜，补充适量的DMF后进行室温搅拌反应2h。用Kaiser试剂进行检测呈阴性，抽干后用DMF洗涤3遍。取小量的树脂装入反应柱，依次用DCM、甲醇洗涤3遍，烘干树脂测树脂替代度为0.35mmol/g。
2)将反应釜中的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin进行脱保护操作后用DMF洗涤3遍。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(8.35g)与TBTU(6.74g)溶于适量的DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(6.9ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到反应釜中，室温条件下搅拌反应1h后进行Kaiser检测，反应结束后抽干用DMF洗涤3遍。按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH。
其中，N端第13、14位使用的反应原料为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(Otbu)-OH，选择缩合剂是PyBop+DIEA组合。
3)称取四三苯基磷钯(3.64g)投入到反应釜中，加入适量的DMF，在氮气条件下搅拌反应4h，取小量树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，加入裂解液反应2h，LC-MS分析得到主要峰面积对应分子量为3586，判断已经脱除Asu上侧链的OAll保护基。抽滤后用DMF洗涤3遍，脱除N端Ser上的Fmoc保护基，脱保护操作后分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，抽干、称依降钙素树脂肽重量为88.11g。
4)将树脂装入反应器，配置TFA/DCM体积比为5：95的裂解液900ml，加入反应器，缓慢搅拌反应2h，抽滤得滤液，此时已将带侧链保护基的线性依降钙素从树脂上脱落。
5)将切割得到得滤液旋蒸浓缩得油状液体，加入100mlDMF充分溶解，称取Cl-HOBT(3.89g)加入反应器中，缓慢加入DIC(2.93ml)，反应过程中用LC-MS进行跟踪，直至反应彻底。在冰浴条件下缓慢加入纯水终止反应，边加边搅拌，待固体完全析出后停止加水，然后抽滤得到白色粉色58.75g。将环化后的全保护依降钙素加入到圆底烧瓶中，冰浴条件下缓慢加入体积比为(TFA：苯甲硫醚：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86.5：5：4.5：2：2)的裂解液(500ml)，反应2h，加入5000ml冰乙醚析出粗品依降钙素，过滤分离的粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到粗品肽。烘干，称重为38.19g。
6)将粗品依降钙素溶于400ml纯化水中，用0.45μm的滤膜过滤，得粗肽溶液。使用高效液相色谱仪器对已将改善粗肽进行纯化：通过DAC-HB50动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度0.05％三氟醋酸水溶液，B为质量百分浓度0.05％三氟醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰的肽溶液。经过高效液相纯化得到纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体700ml，旋蒸浓缩后得到液体200ml。将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为200ml纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体，在2％醋酸水溶液体系下洗脱50min，将收集的目的产物旋转浓缩至160ml，进行预冻干、冻干处理，最终得到依降钙素精品肽重量为10.44g，收率为29.56％。
实施例2：一种依降钙素的制备方法；
具体步骤如下:
1)称取替代度为1mmol/g的Sieber Amide Resin(30g)装入反应釜中，加入适量DCM溶胀20min，抽干后用DMF洗涤3遍后抽干，分别加入适量的脱帽液(DBLK/DMF体积比为1：4)依次反应5min、10min，中间用DMF洗涤一次。称取Fmoc-Pro-OH(14.17g)与TBTU(19.27g)彻底溶于适量DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(19.83ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到上述的反应釜中，室温条件下搅拌反应2h后抽干，用适量DMF洗涤3遍后，加入25ml醋酸酐/吡啶(体积比1：1)至反应釜，补充适量的DMF后进行室温搅拌反应2h。用Kaiser试剂进行检测呈阴性，抽干后用DMF洗涤3遍。取小量的树脂装入反应柱，依次用DCM、甲醇洗涤3遍，烘干树脂测树脂替代度为0.41mmol/g。
2)将反应釜中的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin进行脱保护操作后用DMF洗涤3遍。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(12.22g)与TBTU(9.87g)溶于适量的DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(10.16ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到反应釜中，室温条件下搅拌反应1h后进行Kaiser检测，反应结束后抽干用DMF洗涤3遍。按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH。
其中，N端第13、14位使用的反应原料为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(Otbu)-OH，选择缩合剂是PyBop+DIEA组合。
3)称取四三苯基磷钯(5.69g)投入到反应釜中，加入适量的DMF，在氮气条件下搅拌反应4h，取小量树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，加入裂解液反应2h，LC-MS分析得到主要峰面积对应分子量为3586，判断已经脱除Asu上侧链的OAll保护基。抽滤后用DMF洗涤3遍，脱除N端Ser上的Fmoc保护基，脱保护操作后分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，抽干、称依降钙素树脂肽重量为100.11g。
4)将树脂装入反应器，配置TFA/DCM体积比为5：95的裂解液1100ml，加入反应器，缓慢搅拌反应2h，抽滤得滤液，此时已将带侧链保护基的线性依降钙素从树脂上脱落。
5)将切割得到得滤液旋蒸浓缩得油状液体，加入100mlDMF充分溶解，称取Cl-HOBT(4.55g)加入反应器中，缓慢加入DIC(3.43ml)，反应过程中用LC-MS进行跟踪，直至反应彻底。在冰浴条件下缓慢加入纯水终止反应，边加边搅拌，待固体完全析出后停止加水，然后抽滤得到白色粉色72.77g。将环化后的全保护依降钙素加入到圆底烧瓶中，冰浴条件下缓慢加入体积比为(TFA：苯甲硫醚：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86.5：5：4.5：2：2)的裂解液(700ml)，反应2h，加入7000ml冰乙醚析出粗品依降钙素，过滤分离的粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到粗品肽。烘干，称重为40.73g。
6)将粗品依降钙素溶于450ml纯化水中，用0.45μm的滤膜过滤，得粗肽溶液。使用高效液相色谱仪器对已将改善粗肽进行纯化：通过DAC-HB50动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度0.05％三氟醋酸水溶液，B为质量百分浓度0.05％三氟醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰的肽溶液。经过高效液相纯化得到纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体600ml，旋蒸浓缩后得到液体200ml。将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为200ml纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体，在2％醋酸水溶液体系下洗脱50min，将收集的目的产物旋转浓缩至160ml，进行预冻干、冻干处理，最终得到依降钙素精品肽重量为9.87g，收率为23.86％。
实施例3
一种依降钙素的制备方法
具体步骤如下:
1)称取替代度为1mmol/g的Sieber Amide Resin(30g)装入反应釜中，加入适量DCM溶胀20min，抽干后用DMF洗涤3遍后抽干，分别加入适量的脱帽液(DBLK/DMF体积比为1：4)依次反应5min、10min，中间用DMF洗涤一次。称取Fmoc-Pro-OH(13.15g)与TBTU(19.27g)彻底溶于适量DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(19.83ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到上述的反应釜中，室温条件下搅拌反应2h后抽干，用适量DMF洗涤3遍后，加入25ml醋酸酐/吡啶(体积比1：1)至反应釜，补充适量的DMF后进行室温搅拌反应2h。用Kaiser试剂进行检测呈阴性，抽干后用DMF洗涤3遍。取小量的树脂装入反应柱，依次用DCM、甲醇洗涤3遍，烘干树脂测树脂替代度为0.32mmol/g。
2)将反应釜中的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin进行脱保护操作后用DMF洗涤3遍。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(7.63g)与TBTU(6.17g)溶于适量的DMF中，冰浴条件下缓慢加入DIEA(6.36ml)，边加边搅拌，搅拌均匀后加入到反应釜中，室温条件下搅拌反应1h后进行Kaiser检测，反应结束后抽干用DMF洗涤3遍。按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH。
其中，N端第13、14位使用的反应原料为Fmoc-Gln(Trt)-Glu(Otbu)-OH，选择缩合剂是PyBop+DIEA组合。
3)称取四三苯基磷钯(3.33g)投入到反应釜中，加入适量的DMF，在氮气条件下搅拌反应4h，取小量树脂分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，加入裂解液反应2h，LC-MS分析得到主要峰面积对应分子量为3586，判断已经脱除Asu上侧链的OAll保护基。抽滤后用DMF洗涤3遍，脱除N端Ser上的Fmoc保护基，脱保护操作后分别用DMF、DCM、甲醇洗涤3遍，抽干、称依降钙素树脂肽重量为88.23g。
4)将树脂装入反应器，配置TFA/DCM体积比为5：95的裂解液900ml，加入反应器，缓慢搅拌反应2h，抽滤得滤液，此时已将带侧链保护基的线性依降钙素从树脂上脱落。
5)将切割得到得滤液旋蒸浓缩得油状液体，加入100mlDMF充分溶解，称取Cl-HOBT(3.55g)加入反应器中，缓慢加入DIC(2.68ml)，反应过程中用LC-MS进行跟踪，直至反应彻底。在冰浴条件下缓慢加入纯水终止反应，边加边搅拌，待固体完全析出后停止加水，然后抽滤得到白色粉色52.89g。将环化后的全保护依降钙素加入到圆底烧瓶中，冰浴条件下缓慢加入体积比为(TFA：苯甲硫醚：苯酚：三异丙基硅烷：水＝86.5：5：4.5：2：2)的裂解液(500ml)，反应2h，加入5000ml冰乙醚析出粗品依降钙素，过滤分离的粗品多肽，冰乙醚洗涤3遍，得到粗品肽。烘干，称重为38.66g。
6)将粗品依降钙素溶于400ml纯化水中，用0.45μm的滤膜过滤，得粗肽溶液。使用高效液相色谱仪器对已将改善粗肽进行纯化：通过DAC-HB50动态轴向压缩柱，流动相A为质量百分浓度0.05％三氟醋酸水溶液，B为质量百分浓度0.05％三氟醋酸乙腈溶液，进行梯度洗脱分离纯化，采用紫外检测器对样品进行检测，分段收集目的峰的肽溶液。经过高效液相纯化得到纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体550ml，旋蒸浓缩后得到液体200ml。将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为200ml纯度大于98％的依降钙素三氟醋酸液体，在2％醋酸水溶液体系下洗脱50min，将收集的目的产物旋转浓缩至145ml，进行预冻干、冻干处理，最终得到依降钙素精品肽重量为8.15g，收率为26.32％。
上述各原料名称简写与原料名称全称的对照表如表1所示。
表1原料名称简写与原料名称全称的对照表
Figure BDA0002640581680000071
Figure BDA0002640581680000081
综上所述，本发明专利使用Fmoc固相法合成依降钙素，并且选择二肽片段进行偶联，在液体条件下进行环化处理，具有可操作性强，效率高、收率高、等特点，具有可观的经济实用价值，适合规模化生产。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种依降钙素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）由Fmoc-Pro-OH与Sieber Amide Resin反应，得到替代度为0.30-0.40mmol/g的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂；
2）在Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂上按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser（tBu）-OH；得到肽树脂，偶联体系为TBTU与DIEA；
3）使用四三苯基磷钯脱除肽树脂的氨基酸Asu上的侧链保护基OAll，然后脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽，用TFA/DCM裂解液将带保护基的线性依降钙素从树脂上脱落；得到TFA/DCM依降钙素溶液；
4）用DIEA将裂解得到TFA/DCM依降钙素溶液调节至中性，中和TFA，然后旋蒸除去DCM，将得到的油状依降钙素线性肽溶于DMF中，加入Cl-HOBT与DIC使肽链N端第1位Ser上氨基与N端第6位Asu侧链的羧基充分反应，得到带有侧链保护基的环状依降钙素；
Cl-HOBT与DIC之间的质量比为1:1；
5）加水将带有侧链保护基的环状依降钙素析出，抽滤得固体，加入裂解液反应2小时，加入冰乙醚沉淀得到粗品依降钙素；
6）进一步分离纯化，得到纯度合格的液体依降钙素，将溶液转盐形成醋酸盐，冻干得到精品依降钙素；
在步骤3）中，脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽采用体积比为20%的DBLK/DMF溶液；
在步骤2）中，N端第13、14位使用Fmoc-Gln（Trt）-Glu（Otbu）-OH二肽作为反应原料，能有效提高粗品纯度，缩合剂是PyBOP与DIEA组合；N端第6位使用Fmoc-Asu(OAll)-OH；
在步骤5）中，裂解液采用的试剂配方体积比例为TFA：苯甲硫醚：苯酚：三异丙基硅烷：水=86.5：5：4.5：2：2；裂解液采用10-15ml/g树脂。
2.根据权利要求1所述的依降钙素的制备方法，其特征在于：
在步骤2）中，缩合中使用的氨基酸均为Fmoc保护氨基酸，侧链保护基分别是：Ser侧链采用tBu保护，Asn侧链采用Trt保护，Thr侧链采用tBu保护，Asu侧链使用OAll保护，Lys侧链采用Boc保护，Gln侧链采用Trt保护，His侧链采用Trt保护，Tyr侧链采用tBu保护，Arg侧链采用Pbf保护，Asp侧链采用tBu保护。
3.根据权利要求1所述的依降钙素的制备方法，其特征在于：
在步骤3）中，使用四三苯基磷钯脱除Asu上的侧链保护基OAll时，加入的四三苯基磷钯数量为树脂反应摩尔量的0.3倍。
4.根据权利要求1所述的依降钙素的制备方法，其特征在于：
在步骤3）中，将线性依降钙素从树脂脱落，用TFA/DCM体积比为5：95的裂解液为最佳；TFA/DCM裂解液采用10-15ml/g树脂。
5.根据权利要求1所述的依降钙素的制备方法，其特征在于：
在步骤4）中，N端第1位Ser上氨基与N端第6位氨基酸Asu侧链羧基反应时，使用Cl-HOBT与DIC作为Ser氨基与Asu侧链羧基反应的偶联缩合剂，投料倍数为反应摩尔量的1.8倍。
6.根据权利要求1所述的依降钙素的制备方法，其特征在于：
在步骤1）中，Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂替代度为0.35mmol/g。
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