CN103254305B - 醋酸鲑降钙素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种醋酸鲑降钙素的制备方法，包括以下步骤：用脱保护试剂将Rink Amide MBHA树脂脱保护，去Fmoc保护基团；以脱保护后的Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次耦联氨基酸，得到醋酸鲑降钙素肽树脂；缩合剂为DIC/HOBt或者PyBOP/HOBt；裂解所述醋酸鲑降钙素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鲑降钙素肽树脂，得到还原型醋酸鲑降钙素粗肽；将所述还原型醋酸鲑降钙素粗肽环化得到氧化型醋酸鲑降钙素粗肽；将所述氧化型醋酸鲑降钙素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到醋酸鲑降钙素。本发明的醋酸鲑降钙素的收率达20%以上。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体地说，涉及一种醋酸鲑降钙素的制备方法。
背景技术
醋酸鲑降钙素能够抑制破骨细胞的活性；抑制骨盐溶解，阻止骨内钙释出；改善骨密度，有效缓解疼痛症状；降低骨折的危险性和降低血钙。因此，临床上主要用于治疗老年骨质疏松症，绝经后骨质疏松症，骨转移癌致高钙血症。目前醋酸鲑降钙素的制备方法多是利用Fmoc-策略固相法制备鲑鱼降钙素，主要包括以下步骤：Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或 Rink Amide AM树脂脱Fmoc-保护后按照固相合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护三十二肽树脂；其间依次脱去Fmoc－保护基团；脱侧链保护基团及切肽同步进行，得还原型粗品；粗品经弱碱空气氧化反应，并经反相HPLC分离纯化，制得醋酸鲑降钙素精品。但是该方法耦联32位氨基酸时均采用对称酸酐法，均需要在反应罐外进行制酸酐过滤步骤，使得某些位的氨基酸的耦联较为困难，合成的收率较低。此外，醋酸鲑降钙素属于中长肽，空间位阻大，脱除难度大，也影响了合成的收率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有制备方法在耦联32位氨基酸时，均采用对称酸酐法，使得某些位的氨基酸的耦联较为困难，合成的收率较低。
本发明的技术方案如下：
一种醋酸鲑降钙素的制备方法，包括以下步骤：用脱保护试剂将RinkAmide MBHA树脂脱保护，去Fmoc保护基团；以脱保护后的Rink AmideMBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次耦联氨基酸，得到醋酸鲑降钙素肽树脂；其中，耦联第1、2、4～13、15～19、21、23、25和27～32位氨基酸时的缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）/1-羟基苯并三氮唑（1-Hydroxybenzotriazole，HOBt）；耦联第3、14、20、22、24和26位氨基酸时的缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP）/HOBt；耦联第2～32位氨基酸之前，用所述脱保护试剂依次脱去上一位耦联产物的Fmoc保护基团；裂解所述醋酸鲑降钙素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鲑降钙素肽树脂，得到还原型醋酸鲑降钙素粗肽；将所述还原型醋酸鲑降钙素粗肽环化得到氧化型醋酸鲑降钙素粗肽；将所述氧化型醋酸鲑降钙素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到醋酸鲑降钙素。
进一步，所述脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于哌啶溶于二氯甲烷（dichloromethane，DCM）/氮氮二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）/N-甲基吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到所述脱保护试剂，其中，DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占所述脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占所述脱保护试剂的体积百分比为1%；所述脱保护的反应温度为15℃。
进一步：所述Rink Amide MBHA树脂的替代度≤0.6mmol/g。
进一步：耦联第1位氨基酸时，Rink Amide MBHA树脂：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第2和4～11位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第12、13和15～19位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第21、23、25和27～32位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.9:3.9:3.9；耦联第3位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3:3:3；耦联第14和20位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第22、24和26位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3.9:3.9:3.9；耦联第7～20位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加20%；耦联第21～32位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加50%。
进一步：所述耦联的温度为35℃，时间为2.5～3小时。
进一步：所述裂解的裂解液各成分的体积比为三氟乙酸（trifluoroaceticacid，TFA）：1,2-乙二硫醇（1,2-ethanedithiol，EDT）：三异丙基硅烷（Triisopropylsilane，TIS）：苯甲硫醚=90:2.5:4:3.5，裂解时间为2小时。
进一步：所述环化的氧化剂为双氧水，pH值为7.4～7.6，时间为2小时。
进一步：所述纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为磷酸-三乙胺缓冲液和乙腈，流速为250ml/min，上样量为3～5g，色谱仪的检测波长为220nm。
进一步：所述转盐包括离子转换、去离子、平衡和洗脱，所述转盐的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流速为50ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为280nm；其中，所述离子转换的流动相分别为乙酸铵和乙腈，所述去离子的流动相分别为纯水和乙腈，所述平衡的流动相分别为冰醋酸和乙腈，所述洗脱的流动相分别为冰醋酸和乙腈。
进一步：所述浓缩的温度为33℃，真空度≤10mbar。
本发明的技术效果如下：
1、特定位的氨基酸，比如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸等是基团庞大的氨基酸，它们的空间结构复杂，空间位阻较大，耦联相当困难，传统的对称酸酐法应用到这几个氨基酸耦联效率很低，本发明采用对称酸酐法和PyBOP/HOBT活化法交替耦联氨基酸，专用于空间位阻大，空间结构复杂的特殊氨基酸，可有效提高耦联效率，可以制得收率较高的醋酸鲑降钙素；此外，采用PyBOP/HOBT活化法不需要在反应罐外进行制酸酐过滤步骤，使制备过程简单。
2、本发明的方法随着耦联氨基酸增多和肽链增长，逐渐增加氨基酸、耦联剂、脱保护试剂和洗涤剂的用量，从耦联第7位氨基酸开始，脱保护试剂和洗涤剂的体积用量增加20%，耦联第12位氨基酸开始，氨基酸和耦联剂的摩尔用量增加10%，耦联第21位氨基酸开始，氨基酸和耦联剂的摩尔用量增加30%，脱保护试剂和洗涤剂的体积用量增加50%，有效提高合成收率。
3、传统的脱除方法只能脱除大部分的Fmoc基团，要脱除彻底必然损伤肽链，增加副反应产物，本发明采用的脱保护试剂，有助于长链肽的合成收率，脱除效果好且脱除完全，也有利于降低精制难度。曲拉酮-100可以减小多肽结构的空间位阻，有利于哌啶完全的彻底的脱除Fmoc基团，同时减少哌啶对整个肽链的损伤；彻底脱除Fmoc基团有利于合成收率的提高，大大减小副反应产物的产生。
4、本发明控制脱保护反应温度，越长的肽链，在脱除反应时要控制温度越低，可以有效保护肽链不被脱除反应放出的热量破坏，这样有助于长肽链的合成收率，形成的肽链完整，也有利于精制难度的降低，从而有效提高产品质量。
5、本发明采用的裂解试剂及其配比，增加了裂解过程中的保护剂和捕捉剂，适当降低了三氟乙酸的比例，降低了鲑降钙素在裂解中的损失，提高了裂解的收率，降低了后期纯化精制的难度。
6、本发明采用低替代度的Rink Amide MBHA树脂，以便减小合成过程中的空间位阻，提高合成效率和产品收率，降低精制难度和成本。
具体实施方式
实施例1制备脱保护试剂
脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到脱保护试剂，其中DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占脱保护试剂的体积百分比为1%。
实施例2Rink Amide MBHA树脂的预处理
将替代度≤0.6mmol/g的Rink Amide MBHA树脂投入到反应器中，先用DMF洗涤一次，抽干。然后用适量DMF常温溶涨，N2吹拂，搅拌约30min至树脂充分泡涨，抽干液体。再用DMF洗涤一次，抽干。将Rink Amide MBHA树脂在15℃下脱保护反应20min去除Fmoc保护基团，排干，脱保护试剂为3200ml，Rink Amide MBHA树脂的重量浓度为5～10ml/g。该脱保护温度可以有效保护肽链不被脱保护反应放出的热量破坏，从而有效提高产品质量。最后依次用DMF、甲醇和DMF洗涤，排干。脱保护后，用玻璃棒挑取少许树脂，茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
实施例3耦联反应得到醋酸鲑降钙素肽树脂
（1）第1位氨基酸的耦联
第1位氨基酸的耦联反应的投料配比如表1所示，第1位氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH。
表1第1位氨基酸耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 预处理后的Rink Amide MBHA树脂 | 400g(100mmol，0.4mmol/g) | 1 |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 175.7g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4000ml |
称取175.7g的Fmoc-Cys(Trt)-OH和40.5gHOBt置于烧杯中，加入2000ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将去除Fmoc保护基团的Rink Amide MBHA树脂加入到反应柱中，然后将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入2000ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在35℃下耦联反应3h得到反应产物（1）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（1）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（1），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（1）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（2）第2位氨基酸的耦联：
第2位氨基酸的耦联反应的投料配比如表2所示，第2位氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-OH。
表2耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（1） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 115.0g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4000ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3200ml*2 |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（1）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入4000ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉；每次加入3200ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入4000ml的DMF洗涤1min，抽掉；脱保护后每次再用4000ml的DMF洗涤4次，第5次用4000ml精制DMF洗涤一次；用玻璃棒挑取少许反应产物（1），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取115.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入2000ml精制DMF溶解。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中2min，再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min，若出现白色絮状泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入2000ml精制DMF于反应柱中，调节好氮气，使反应产物（1）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（2）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（3）第3位氨基酸的耦联：
第3位氨基酸的耦联反应的投料配比如表3所示，第3位氨基酸为Fmoc-Asn（Trt）-OH。
表3第3位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（2） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Asn（Trt）-OH | 179.0g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| PyBOP | 156.1g | 3 |
| DMF | 4000ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3200ml*2 |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（2）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第2位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（2）5min。然后称取179.0g Fmoc-Asn(Trt)-OH、156.1g PyBOP和40.5g HOBt置于反应柱中，加入4000ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（2）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（3）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（4）第4位氨基酸的耦联：
第4位氨基酸的耦联反应的投料配比如表4所示，第4位氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
表4耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（3） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Leu-OH | 106.0g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4000ml*9 |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3200ml*2 |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（3）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第2位氨基酸的过程。
称取106.0g Fmoc-Leu-OH和40.5g HOBt，量取46.5ml DIC，耦联过程同第2位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（5）第5位氨基酸的耦联：
第5位氨基酸的耦联反应的投料配比如表5所示，第5位氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-OH。
表5第5位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（4） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 115.0g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4000ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3200ml*2 |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（4）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第2位氨基酸的过程。
称取115.0g Fmoc-Ser(tBu)-OH和40.5g HOBt，量取46.5ml DIC，耦联过程同第2位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（6）第6位氨基酸的耦联：
第6位氨基酸的耦联反应的投料配比如表6所示，第6位氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH。
表6第6位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（5） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 119.3 g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4000ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3200ml*2 |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（5）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第2位氨基酸的过程。
称取119.3g Fmoc-Thr(tBu)-OH和40.5g HOBt，量取46.5ml DIC，耦联过程同第2位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（7）第7位氨基酸的耦联：
第7位氨基酸的耦联反应的投料配比如表7所示，第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH。
表7第7位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（6） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Cys（Trt）-OH | 175.7g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（6）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入4800ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入3840ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入4800ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用4800ml的DMF洗涤4次，第5次用4000ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（6），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取175.7gFmoc-Cys(Trt)-OH和40.5gHOBt置于烧杯中，加入2000ml精制DMF溶解。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中2min，再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min，若出现白色絮状泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入2800ml精制DMF于反应柱中，调节好氮气，使反应产物（6）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（7）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（8）第8位氨基酸的耦联：
第8位氨基酸的耦联反应的投料配比如表8所示，第8位氨基酸为Fmoc-Val-OH。
表8第8位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（7） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Val-OH | 101.8 g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（7）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取101.8gFmoc-Val-OH和40.5gHOBt，量取46.5mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（9）第9位氨基酸的耦联：
第9位氨基酸的耦联反应的投料配比如表9所示，第9位氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
表9第9位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（8） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Leu-OH | 106.0g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（8）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取106.0gFmoc-Leu-OH和40.5gHOBt，量取46.5mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（10）第10位氨基酸的耦联：
第10位氨基酸的耦联反应的投料配比如表10所示，第10位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表10第10位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（9） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 89.2g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（9）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取89.2gFmoc-Gly-OH和40.5gHOBt，量取46.5mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（11）第11位氨基酸的耦联：
第11位氨基酸的耦联反应的投料配比如表11所示，第11位氨基酸为Fmoc-Lys(BOC)-OH。
表11第11位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（10） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Lys(BOC)-OH | 140.6g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（10）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取140.6gFmoc-Lys(BOC)-OH和40.5gHOBt，量取46.5mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（12）第12位氨基酸的耦联：
第12位氨基酸的耦联反应的投料配比如表12所示，第12位氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
表12第12位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（11） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Leu-OH | 116.6 g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（11）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取116.6gFmoc-Leu-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（13）第13位氨基酸的耦联：
第13位氨基酸的耦联反应的投料配比如表13所示，第13位氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-OH。
表13第13位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（12） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 126.5g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（12）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取126.5gFmoc-Ser(tBu)-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（14）第14位氨基酸的耦联：
第14位氨基酸的耦联反应的投料配比如表14所示，第14位氨基酸为Fmoc-Gln(Trt)-OH。
表14第14位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（13） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | 201.5g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| PyBOP | 171.7g | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（13）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（13）5min。然后称取201.5gFmoc-Gln(Trt)-OH、171.7gPyBOP和44.6gHOBt置于反应柱中，加入4800ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（13）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（14）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（15）第15位氨基酸的耦联：
第15位氨基酸的耦联反应的投料配比如表15所示，第15位氨基酸为Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
表15第15位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（14） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Glu(OtBu)-OH | 140.4g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（14）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取140.4gFmoc-Glu(OtBu)-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（16）第16位氨基酸的耦联：
第16位氨基酸的耦联反应的投料配比如表16所示，第16位氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
表16第16位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（15） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Leu-OH | 116.6 g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（15）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取116.6gFmoc-Leu-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（17）第17位氨基酸的耦联：
第17位氨基酸的耦联反应的投料配比如表17所示，第17位氨基酸为Fmoc-His(Tos)-OH。
表17第17位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（16） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-His(Tos)-OH | 175.4g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（16）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取175.4gFmoc-His(Tos)-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（18）第18位氨基酸的耦联：
第18位氨基酸的耦联反应的投料配比如表18所示，第18位氨基酸为Fmoc-Lys(BOC)-OH。
表18第18位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（17） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Lys(BOC)-OH | 154.6g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（17）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取154.6gFmoc-Lys(BOC)-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（19）第19位氨基酸的耦联：
第19位氨基酸的耦联反应的投料配比如表19所示，第19位氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
表19第19位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（18） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Leu-OH | 116.6 g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（18）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
称取116.6gFmoc-Leu-OH和44.6gHOBt，量取51.2mlDIC，耦联过程同第7位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（20）第20位氨基酸的耦联：
第20位氨基酸的耦联反应的投料配比如表20所示，第20位氨基酸为Fmoc-Gln(Trt)-OH。
表20第20位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（19） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | 201.5g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| PyBOP | 171.7g | 3.3 |
| DMF | 4800ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 3840ml*2 | 体积增加20% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（19）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第7位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（19）5min。然后称取201.5gFmoc-Gln(Trt)-OH、171.7gPyBOP和44.6gHOBt置于反应柱中，加入4800ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（19）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（20）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（21）第21位氨基酸的耦联：
第21位氨基酸的耦联反应的投料配比如表21所示，第21位氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH。
表21第21位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（20） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 155.0g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（20）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入6000ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入4800ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入6000ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用6000ml的DMF洗涤4次，第5次用6000ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（20），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取155.0gFmoc-Thr(tBu)-OH和52.7gHOBt置于烧杯中，加入3000ml精制DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中2min，再加入60.5mlDIC于溶液中活化约8min，若出现白色絮状泡沫表明活化已完全，用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入3000ml精制DMF于反应柱中，调节好氮气，使反应产物（20）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（21）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（22）第22位氨基酸的耦联：
第22位氨基酸的耦联反应的投料配比如表22所示，第22位氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
表22第22位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 上反应产物（21） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 179.2g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| PyBOP | 203.0g | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（21）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（21）5min。然后称取179.2gFmoc-Tyr(tBu)-OH、203.0gPyBOP和52.7gHOBt置于反应柱中，加入6000ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（21）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（22）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（23）第23位氨基酸的耦联：
第23位氨基酸的耦联反应的投料配比如表23所示，第23位氨基酸为Fmoc-Pro-OH。
表23第23位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（22） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Pro-OH | 131.6g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（22）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取131.6gFmoc-Pro-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（24）第24位氨基酸的耦联：
第24位氨基酸的耦联反应的投料配比如表24所示，第24位氨基酸为Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
表24第24位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（23） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 253.0g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| PyBOP | 203.0g | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（23）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（23）5min。然后称取253.0gFmoc-Arg(Pbf)-OH、203.0gPyBOP和52.7gHOBt置于反应柱中，加入6000ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（23）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（24）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（25）第25位氨基酸的耦联：
第25位氨基酸的耦联反应的投料配比如表25所示，第25位氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH。
表25第25位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（24） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 155.0g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（24）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取155.0gFmoc-Thr(tBu)-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（26）第26位氨基酸的耦联：
第26位氨基酸的耦联反应的投料配比如表26所示，第26位氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-OH。
表26耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（25） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Asn(Trt)-OH | 232.7g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| PyBOP | 203.0g | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（25）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
脱保护后，用0.8mol/L的NaClO4/DMF溶液洗涤反应产物（25）5min。然后称取232.7gFmoc-Asn(Trt)-OH、203.0gPyBOP和52.7gHOBt置于反应柱中，加入6000ml精制DMF溶解，调节好氮气，使反应产物（25）被均匀吹起，套上干燥管，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现。上述试剂在35℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（26）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（27）第27位氨基酸的耦联：
第27位氨基酸的耦联反应的投料配比如表27所示，第27位氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH。
表27第27位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（26） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 155.0 g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（26）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取155.0gFmoc-Thr(tBu)-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（28）第28位氨基酸的耦联：
第28位氨基酸的耦联反应的投料配比如表28所示，第28位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表28第28位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（27） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 115.9g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（27）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取115.9gFmoc-Gly-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（29）第29位氨基酸的耦联：
第29位氨基酸的耦联反应的投料配比如表29所示，第29位氨基酸为Fmoc-Ser(tBu)-OH。
表29耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（28） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Ser(tBu)-OH | 149.5g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（28）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取149.5gFmoc-Ser(tBu)-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（30）第30位氨基酸的耦联：
第30位氨基酸的耦联反应的投料配比如表30所示，第30位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表30第30位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（29） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 115.9g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（29）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取115.9gFmoc-Gly-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（31）第31位氨基酸的耦联：
第31位氨基酸的耦联反应的投料配比如表31所示，第31位氨基酸为Fmoc-Thr(tBu)-OH。
表31第31位氨基酸的耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（30） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Thr(tBu)-OH | 155.0 g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（30）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取155.0gFmoc-Thr(tBu)-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（32）第32位氨基酸的耦联：
第32位氨基酸的耦联反应的投料配比如表32所示，第32位氨基酸为Fmoc-Pro-OH。
表32耦联反应投料配比表
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（31） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Pro-OH | 131.6g | 3.9 |
| HOBt | 52.7g | 3.9 |
| DIC | 60.5ml | 3.9 |
| DMF | 6000ml*9 | 体积增加50% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 4800ml*2 | 体积增加50% |
耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（31）脱保护去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程同耦联第21位氨基酸的过程。
称取131.6gFmoc-Pro-OH和52.7gHOBt，量取60.5mlDIC，耦联过程同第21位氨基酸的耦联过程。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法同耦联第1位氨基酸后的茚检方法。
（33）耦联反应的最终程序
每次加入6000mlDMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入4800ml的实施例1的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入6000ml的DMF洗涤1min，抽掉。两次脱完保护抽掉后每次再用6000ml的DMF洗涤4次，第5次用6000ml精制DMF洗涤一次，用玻璃棒挑取少许树脂，茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱。每次用6000mlDMF再洗涤4次，每次约1min，抽掉。每次再用6000ml无水乙醚收缩2次，每次收缩时间为5min，抽掉。在反应柱口塞上卷纸，用真空干燥抽干至树脂呈干燥流沙状为止得到醋酸鲑降钙素肽树脂。称重干燥后合成完的醋酸鲑降钙素肽树脂。
实施例4裂解反应制备还原型醋酸鲑降钙素粗肽
裂解反应投料配比如表33所示。
表33裂解反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 体积比 |
| 鲑降钙素肽树脂 | 100g | |
| TFA | 900ml | 90% |
| EDT | 25ml | 2.5% |
| TIS | 40ml | 4% |
| 苯甲硫醚 | 35ml | 3.5% |
| 乙醚 | 7L |
具体裂解操作如下：
检查生产场所、设备，必须为清洁状态和完好状态。
（1）将1L裂解液加入3L烧瓶中，冰浴冷却30min。裂解液为TFA/EDT/TIS/苯甲硫醚，其体积比为90:2.5:4:3.5。
（2）将100±1克醋酸鲑降钙素肽树脂慢慢加入预冷的裂解液中。室温下磁力搅拌反应2h，滤出液体，缓慢滴加入装有5L乙醚的血清瓶中，待其自然沉降，30分钟后撇除上清液，得到带有乙醚的生长抑素粗肽湿品。
（3）带有乙醚的生长抑素粗肽湿品进行离心处理，倒出上清液，用乙醚研洗粗肽，再次离心。循环上述两步操作4次。空气中静置15分钟后转移至真空干燥器中，进行减压干燥，将粗肽常温真空干燥过夜到恒重，得到还原型醋酸鲑降钙素粗肽。
（4）取样送检，检测纯度大于60%为合格粗肽。然后将合格粗肽送至纯化部门进行环化、纯化及冻干。
实施例5环化
(1)醋酸鲑降钙素粗肽溶液的制备
用研钵将还原型醋酸鲑降钙粗肽充分研磨成粉末状，用乙睛体积浓度为5%的水溶液将还原型醋酸鲑降钙素粗肽溶解至浓度约为1mmol/L，充分搅拌至全溶，得到还原型醋酸鲑降钙素粗肽溶液。
(2)环化制备氧化型醋酸鲑降钙素粗肽
配制新鲜的双氧水体积浓度为1.5%的水溶液，作为氧化试剂备用。双氧水做氧化剂比传统的空气、氧气和碘作为氧化剂更稳定和快捷。
用稀氨水溶液（取浓氨水适量稀释5倍）或稀氢氧化钠溶液调整还原型醋酸鲑降钙素粗肽溶液pH值至7.4～7.6。将双氧水体积浓度为1.5%的水溶液3200ml作为氧化试剂加入到还原型醋酸鲑降钙素粗肽溶液中，室温搅拌反应2小时。采用HPLC检测，直到氧化终点，用醋酸将溶液的pH值调至4左右。使用0.22um的滤膜过滤溶液，得到滤液为氧化型醋酸鲑降钙素粗肽。将氧化型醋酸鲑降钙素粗肽及时纯化，否则将滤液放在玻璃瓶里，置于4℃的冰柜中冷藏，第二天及时纯化，样品在室温条件下不能存放超过12小时。
实施例6纯化
采用制备型液相色谱仪将氧化型醋酸鲑降钙素粗肽分离纯化。本实施例采用的液相色谱仪器为创新通恒P6000制备型液相色谱仪。色谱柱为C18柱，该柱是直径为10cm、孔径为的反相硅胶高压制备的层析柱，其填料是粒径为10um的十八烷基键合硅胶。洗脱流速为250ml/min，上样量约为3～5g。梯度洗脱条件如表34所示。设定色谱仪的检测波长为220nm。
表34梯度洗脱条件
表中流动相分别为：A相为pH值为7.0的磷酸-三乙胺缓冲液、B相为乙腈。A相的体积浓度从85%变为65%，B相的体积浓度从15%变为35%。
纯化出峰以后，根据峰形，按已编号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前、峰顶和峰后分别并样。其中，纯度大于98%为合格品，收集合并。纯度小于98%的样品，收集合并。对纯度小于98%的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。
实施例7转盐
采用制备型液相色谱仪将纯化得到的合格品转盐，本实施例采用的液相色谱仪器为创新通恒P6000制备型液相色谱仪。色谱柱为C18柱，该柱是直径为5cm、孔径为的反相硅胶高压制备层析柱，其填料是粒径为10um的十八烷基键合硅胶。设定色谱仪的检测波长为280nm，洗脱流速为50ml/min，上样量约为5～10g。转盐条件如表35所示。
表35转盐的工艺条件
| 分离步骤 | 时间（min） | A (%，V/V) | B (%，V/V) |
| 离子转换 | 0-15 | 95(50mmol乙酸铵) | 5(乙腈) |
| 去离子 | 15-25 | 95(纯水) | 5(乙腈) |
| 平衡 | 25-35 | 95(0.03%醋酸) | 5(乙腈) |
| 洗脱 | 35-60 | 50(0.03%醋酸) | 50(乙腈) |
表中A相分别为乙酸铵、纯水和冰醋酸。50mmol乙酸铵溶液通过如下方法制得：称取乙酸铵固体3.85g，加纯水溶解定容至1L，得50mmol乙酸铵溶液。冰醋酸溶液通过如下方法制得：将3ml冰醋酸加入950ml纯水中，定容至1L，即得冰醋酸溶液。B相为乙腈。
收集样品的主峰，合并在收集瓶中。
实施例8浓缩
转盐后所收集的合格溶液必须马上经减压浓缩去除乙腈和部分水。浓缩条件为：温度33℃，真空度10mbar以下。合格溶液浓缩至200～300mg/ml(约200ml)，使用0.22um的滤膜过滤溶液，滤液分装存放于直径为24.2cm，高度为1.8cm的不锈钢盘中，每盘放精肽约20～50g，准备冻干。
实施例9冻干
采用真空冷冻干燥机冻干。将上步浓缩分装好的滤液放入冷冻干燥机中冷冻干燥得白色粉末，即得醋酸鲑降钙素。具体冻干过程如下：
(1)预冻：将分装好的滤液置于冻干箱内隔板上进行预冻，制品温度下降至-40℃以下，维持2小时。
(2)升华干燥：通过隔板下的加热系统缓缓加热，温度升至-10℃左右，维持约10小时，然后温度升至0℃左右，维持约8时。
(3)解吸附：温度升至25℃左右，保持5小时，取出，称量。
经过上述步骤，最终得到醋酸鲑降钙素成品。该醋酸鲑降钙素的化学式为：H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2，鲑降钙素分子量为3431.89。醋酸鲑降钙素的收率如表36所示。
表36醋酸鲑降钙素收率
Claims (9)
1.一种醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用脱保护试剂将Rink Amide MBHA树脂脱保护，去Fmoc保护基团；所述脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到所述脱保护试剂，其中，DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占所述脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占所述脱保护试剂的体积百分比为1%；所述脱保护的反应温度为15℃；
以脱保护后的Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次耦联氨基酸，得到醋酸鲑降钙素肽树脂；其中，耦联第1、2、4～13、15～19、21、23、25和27～32位氨基酸时的缩合剂为DIC/HOBt；耦联第3、14、20、22、24和26位氨基酸时的缩合剂为PyBOP/HOBt；耦联第2～32位氨基酸之前，用所述脱保护试剂依次脱去上一位耦联产物的Fmoc保护基团；
裂解所述醋酸鲑降钙素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鲑降钙素肽树脂，得到还原型醋酸鲑降钙素粗肽；
将所述还原型醋酸鲑降钙素粗肽环化得到氧化型醋酸鲑降钙素粗肽；
将所述氧化型醋酸鲑降钙素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到醋酸鲑降钙素。
2.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述Rink Amide MBHA树脂的替代度≤0.6mmol/g。
3.如权利要求1或2所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：耦联第1位氨基酸时，Rink Amide MBHA树脂：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第2和4～11位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第12、13和15～19位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第21、23、25和27～32位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.9:3.9:3.9；耦联第3位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3:3:3；耦联第14和20位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第22、24和26位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：PyBOP的摩尔比为1:3.9:3.9:3.9；耦联第7～20位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加20%；耦联第21～32位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加50%。
4.如权利要求3所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述耦联的温度为35℃，时间为2.5～3小时。
5.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述裂解的裂解液各成分的体积比为TFA:EDT:TIS:苯甲硫醚=90:2.5:4:3.5，裂解时间为2小时。
6.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述环化的氧化剂为双氧水，pH值为7.4～7.6，时间为2小时。
7.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径 的C18柱，流动相分别为磷酸-三乙胺缓冲液和乙腈，流速为250ml/min，上样量为3～5g，色谱仪的检测波长为220nm。
8.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述转盐包括离子转换、去离子、平衡和洗脱，所述转盐的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流速为50ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为280nm；其中，所述离子转换的流动相分别为乙酸铵和乙腈，所述去离子的流动相分别为纯水和乙腈，所述平衡的流动相分别为冰醋酸和乙腈，所述洗脱的流动相分别为冰醋酸和乙腈。
9.如权利要求1所述的醋酸鲑降钙素的制备方法，其特征在于：所述浓缩的温度为33℃，真空度≤10mbar。
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