CN101696236B - 一种固相合成阿托西班方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相合成阿托西班方法，包括如下步骤：1)以Rink Amide树脂为载体，脱Fmoc-保护后得到H2N-Rink Amide树脂；2)以HOBT、DIPCI为缩合试剂，将Fmoc-Gly-OH的羧基与树脂氨基相连，得到Fmoc-Gly(树脂)；3)采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸；4)用碘进行固相环化；5)然后用裂解试剂(三氟乙酸/硫代苯甲醚/1，2-乙二硫醇/水)切割，乙醚沉淀，得到阿托西班粗肽；6)粗品经HPLC制备分离得阿托西班纯品。
Description
技术领域：
本发明涉及一种合成活性多肽原料药的方法，尤其是涉及一种固相合成阿托西班的方法。
背景技术：
阿托西班(atosiban)，其化学名称为：1-(3-硫醇丙醇酸)-2-(O-乙基-D酪氨酸)-4-L-苏氨酸-8-L-鸟氨酸-催产素。
其结构式为：
阿托西班是一种催产素类似物，为人工合成的环状多肽，是子宫内及蜕膜、胎膜上受体的催产素竞争性拮抗剂，在临床上使用其醋酸盐治疗早产。醋酸阿托西班注射液(AtosibanAcetate Injection)由辉凌公司(Ferring AB)研制，2000年3月23日首次在奥地利上市，商品名为：
相关文献报道阿托西班的合成方法是通过Boc保护的甘氨酸(Gly)和氯甲基树脂制备得到氨基酸树脂，然后通过循环缩合偶联其余的保护氨基酸得到肽树脂，肽树脂经氨解后得到全保护肽，通过钠氢解脱去侧链保护基团，进行碘环化得到目的肽。该合成方法存在这样几个问题：一、氨解低温操作要求且时间长，产品纯度不高，设备要求复杂；二、脱侧链保护基团用到金属钠，在安全性方面存在隐患，对生产操作有较大的限制；三、步骤较为繁琐，影响生产进度，增加了产品质量的风险。本发明结合肽的结构性质，选择了能直接用TFA裂解得到酰胺键的Rink Amide树脂作为起始树脂，选用了Fmoc固相合成方法解决了上述问题。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种固相合成阿托西班的方法，以克服现有技术上存在的缺陷。
本发明的方法包括：
以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以DIPCI和HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸，用碘进行固相环化，加入裂解试剂，用乙醚沉淀，获得氧化型粗品；采用反相高效液相色谱法进行分离纯化后，再经冷冻干燥获得游离肽或相应的盐。
本发明的制备方法，步骤如下：
1)以Fmoc-Rink Amide树脂为起始原料，去除Fmoc后与Fmoc-Gly-OH的侧链羧基相连，得到Fmoc-Gly树脂；
2)按照阿托西班氨基酸的结构顺序依次连接其余氨基酸；
3)用碘进行固相环化；
4)用裂解试剂进行切割得阿托西班粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
5)用反相高效液相法纯化分离。
上述过程以HOBT、DIPCI为缩合试剂，以三氟乙酸/硫代苯甲醚/1，2-乙二硫醇/水为裂解试剂，树脂的取代值为0.6～0.8mmol/g。
裂解试剂优选是按：三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶1，2-乙二硫醇∶水＝90％∶5％∶3％∶2％的体积比配制而成。
用反相高效液相法纯化分离阿托西班时，其色谱条件优选为：
色谱柱：φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18) 10μm
上样量：≤50g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。
本发明优选的制备方法，其步骤如下：
(1)制备Fmoc-Gly-树脂：
将Rink Amide树脂加入到反应柱中，加入DCM洗涤3次、再加入DMF洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Gly-OH及HOBT，加入N、N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，完全溶解后加入DIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。抽去反应液，用DMF/DCM/甲醇洗涤，抽干。
(2)制备Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Orn(Boc)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(3)制备Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Pro-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(4)制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(6)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(7)制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-Ile-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(8)制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(9)制备Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
将Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM、DMF洗涤。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤。称取Mpr(Trt)-OH及HOBT，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF洗涤。
(10)环化
称取碘(I2)加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min。反应完毕后，抽去反应液，用DMF、DCM、甲醇洗涤，抽干。
(11)裂解
将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶1，2-乙二硫醇∶水)，搅拌反应120min。过滤，树脂用三氟乙酸(TFA)洗涤。合并滤液，缓慢沉降到10倍体积的无水乙醚中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚离心洗涤，即得氧化型阿托西班粗品。
(12)纯化
将得到的粗肽减压干燥后加水溶解，溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤。滤液经C18柱分离纯化，以0.3％醋酸水溶液和乙腈为流动相，检测波长为230nm，流速：300～800ml/min，收集需要的流出液后，去盐，冷冻干燥，的目标产物，收率约为65％。
本发明的的阿托西班制备工艺中，采用DMF、HOBT、和DIPCI进行缩合反应，具有操作简单，工艺稳定，副反应少，消旋率低的特点。裂解过程中采用TFA，而不是Boc策略的HF，大大降低了对人员的毒害及环境污染，并且未采用通常的离子交换柱换盐，而是将样品的纯化与换盐同时进行，减少了溶剂的浪费及目标产物的损失。生产成本低，产率高，在工业生产中具有重要意义。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1 制备Fmoc-Gly-树脂
将100.00g Rink Amide树脂加入到反应柱中，加入DCM 550ml/次洗涤3次、再加入DMF550ml/次洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Gly-OH 23.79g及HOBT 10.80g，加入N、N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，完全溶解后加入12ml DIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时。反应完毕后，抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤3次，再用DCM 550ml/次洗涤3次，最后用甲醇550ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h。取出称重，为103.19g，测定替代值为0.77mmol/g。
实施例2 制备Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂
将103.19g Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM 550ml/次洗涤3次、再加入DMF550ml/次洗涤3次。向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Orn(Boc)-OH 108.34g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例3 制备Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Pro-OH及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例4 制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH 139.61g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例5 制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 142.23g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例6 制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 139.61g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例7 制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-Ile-OH84.24g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例8 制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 103.02g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例9 制备Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果。称取Mpr(Trt)-OH83.06g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀。将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min。抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果。
实施例10 环化
称取31.73g碘(I2)加入1250ml DMF中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min。反应完毕后，抽去反应液，反应完毕后，抽去反应液，用DMF 1250ml/次洗涤3次，再用DCM 1250ml/次洗涤3次，最后用甲醇1250ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h。
实施例11 裂解
将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂(三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶1，2-乙二硫醇∶水＝90％∶5％∶3％∶2％)2200ml，搅拌反应120min。过滤，树脂用三氟乙酸(TFA)洗涤3次。合并滤液，缓慢沉降到22000ml的无水乙醚中。静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚2500ml/次离心洗涤6次，将得到的粗肽放入真空干燥箱内抽干，即得氧化型阿托西班粗品。
实施例12 纯化
色谱柱：φ15cm
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(C18)10μm
上样量：≤50g目的肽/次
检测波长：230nm
流速：400ml/min
流动相：A：0.3％醋酸水溶液；B：乙腈
色谱条件：梯度程序见下表。
将得到的粗肽减压干燥后加水35000ml溶解，溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤。滤液按照纯化条件上样，收集流动相从0.3％醋酸水溶液∶乙腈(64∶36)至0.3％醋酸水溶液∶乙腈(58∶42)梯度内的目的峰溶液，并将收集的溶液浓缩，去盐，冷冻干燥，的目标产物，收率为66.5％。
Claims (1)
1.一种阿托西班的固相合成方法，其特征在于，所述方法如下：
(1)制备Fmoc-Gly-树脂
将100.00g Rink Amide树脂加入到反应柱中，加入DCM 550ml/次洗涤3次、再加入DMF550ml/次洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Gly-OH 23.79g及HOBT 10.80g，加入N、N-二甲基甲酰胺搅拌溶解，完全溶解后加入12ml DIPCDI，搅拌均匀后加入到玻璃反应柱内，搅拌反应24小时，反应完毕后，抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤3次，再用DCM 550ml/次洗涤3次，最后用甲醇550ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h，取出称重，为103.19g，测定替代值为0.77mmol/g；
(2)制备Fmoc-Orn(Boc)-Gly-树脂
将103.19g Fmoc-Gly-树脂加入到反应柱中，加入DCM 550ml/次洗涤3次、再加入DMF550ml/次洗涤3次，向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Orn(Boc)-OH 108.34g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入lmmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min，抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(3)制备Fmoc-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Pro-OH及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(4)制备Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Cys(Trt)-OH 139.61g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(5)制备Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Asn(Trt)-OH 142.23g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(6)制备Fmoc-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 139.61g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(7)制备Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-Ile-OH84.24g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(8)制备Fmoc-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Fmoc-D-Tyr(Et)-OH 103.02g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/mlDIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(9)制备Mpr(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-树脂：
向玻璃反应柱内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF 550ml/次洗涤6次，用5％的茚三酮乙醇溶液检测去保护效果；称取Mpr(Trt)-OH83.06g及HOBT 32.21g，加入DMF搅拌溶解，完全溶解后加入1mmol/ml DIPCDI的DMF溶液37ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应柱内，搅拌反应90min；抽去反应液，用DMF 550ml/次洗涤6次，取样用5％的茚三酮乙醇溶液检测偶联效果；
(10)环化
称取31.73g碘加入1250ml DMF中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应柱内，氮气吹搅反应30min；反应完毕后，抽去反应液，用DMF 1250ml/次洗涤3次，再用DCM 1250ml/次洗涤3次，最后用甲醇1250ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h；
(11)裂解
将环化后的树脂加入到圆底烧瓶中，加入配制好的裂解试剂2200ml，搅拌反应120min，其中所述裂解试剂为三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶1，2-乙二硫醇∶水＝90％∶5％∶3％∶2％；过滤，树脂用三氟乙酸洗涤3次；合并滤液，缓慢沉降到22000ml的无水乙醚中；静置2h后开始离心，离心完毕后用无水乙醚2500ml/次离心洗涤6次，将得到的粗肽放入真空干燥箱内抽干，即得氧化型阿托西班粗品。
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