CN103254295A - 特利加压素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特利加压素的制备方法，包括：用脱保护试剂将RinkAmideAM树脂脱保护，去除Fmoc保护基团；以脱保护后的Rink AmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次耦联氨基酸，得到特利加压素肽树脂；耦联第2～12位氨基酸之前，用所述脱保护试剂依次脱去上一位耦联产物的Fmoc保护基团；裂解所述特利加压素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加压素肽树脂，得到还原型特利加压素粗肽；将所述还原型特利加压素粗肽环化得到氧化型特利加压素粗肽；将所述氧化型特利加压素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到特利加压素。本发明的特利加压素收率达到50%以上。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物的制备方法，具体地说，涉及特利加压素的制备方法。
背景技术
特利加压素的化学名称为三甘氨酰赖氨酸加压素，是一种新型的人工合成的长效血管加压素制剂。它是一种前体药物，本身无活性，在体内经氨基肽酶作用，脱去其N末端的3个甘氨酰残基后，缓慢“释放”出有活性的赖氨酸加压素，因此特利加压素相当于一个能以稳定速率释放出赖氨酸加压素的储藏库。特利加压素的主要作用是收缩内脏血管平滑肌，减少内脏血流量（如减少肠系膜、脾、子宫等的血流），从而减少门静脉血流、降低门静脉压，同时也可作用于食道和子宫等平滑肌。另一方面，在对肝肾综合征的防治研究中发现特利加压素还可降低血浆肾素浓度，从而减少血管紧张素II产生，减轻肾血管收缩，增加肝肾综合征患者的肾血流量，显著增加了患者的肾小球滤过率，改善了肾功能。与血管加压素相比，它作用持久，不引起危险性并发症，包括促纤维蛋白溶解以及心血管系统方面的严重并发症。
目前特利加压素的制备方法主要包括以下步骤：以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品，加入碱性物质，在pH为7.5～10.0的条件下通空气氧化，获得氧化型粗品，最后采用C18（或C8）柱进行分离纯化，获得目标产物。但是该方法耦联采用的缩合剂为TBTU或者HBTU/HOBt，随着肽链的增长，耦联越来越困难。此外，特利加压素的空间位阻大，脱除难度大，也影响了合成的收率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有特利加压素的制备方法耦联氨基酸，随着肽链的增长，耦联越来越困难。
本发明的技术方案如下：
一种特利加压素的制备方法，包括：用脱保护试剂将Rink AmideAM树脂脱保护，去除Fmoc保护基团；以脱保护后的Rink AmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以1-羟基苯并三氮唑（1-Hydroxybenzotriazole，HOBt）/N,N-二异丙基碳二亚胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）为缩合剂，依次耦联氨基酸，得到特利加压素肽树脂；耦联第2～12位氨基酸之前，用所述脱保护试剂依次脱去上一位耦联产物的Fmoc保护基团；裂解所述特利加压素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加压素肽树脂，得到还原型特利加压素粗肽；将所述还原型特利加压素粗肽环化得到氧化型特利加压素粗肽；将所述氧化型特利加压素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到特利加压素。
进一步，所述脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于二氯甲烷（dichloromethane，DCM）/氮氮二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）/N-甲基吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到所述脱保护试剂，其中，DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占所述脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占所述脱保护试剂的体积百分比为1%；所述脱保护的反应温度为15℃。
进一步：所述Rink AmideAM树脂的替代度≤0.6mmol/g。
进一步：耦联第1位氨基酸时，Rink AmideAM树脂：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第2至第6位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第7至第12位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第7～12位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加20%。
进一步：所述耦联的温度为32℃，时间为2.5～3小时。
进一步：所述裂解的裂解液各成分的体积比为三氟乙酸（trifluoroaceticacid，TFA）：1,2-乙二硫醇（1,2-ethanedithiol，EDT）：三异丙基硅烷（Triisopropylsilane，TIS）：H2O=92.5:2.5:4:1，裂解时间为2h。
进一步：所述环化的氧化剂为双氧水，pH值为7.1～7.2，时间为2小时。
进一步：所述纯化的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径
的C18柱，流动相分别为TFA溶液和乙腈，流速为50ml/min，上样量为3～5g，色谱仪的检测波长为280nm。
进一步：所述转盐包括离子转换、去离子、平衡和洗脱，所述转盐的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径
的C18柱，流速为50ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为280nm；其中，所述离子转换的流动相分别为乙酸铵和乙腈，所述去离子的流动相分别为纯水和乙腈，所述平衡的流动相分别为冰醋酸和乙腈，所述洗脱的流动相分别为冰醋酸和乙腈。
进一步：所述浓缩的温度为33℃，真空度≤10mbar。
本发明的技术效果如下：
1、本发明采用DIC/HOBt为耦联剂，可以加快反应速率，降低消旋，使氨基酸的耦联效果更好。
2、本发明随着肽链的增长，从耦联第7位氨基酸开始，氨基酸和耦联剂的摩尔用量增加10%，脱保护试剂的体积用量增加20%，使得耦联反应的后期连接顺利，产品容易纯化，收率高。
3、本发明控制耦联温度为32℃，耦联2小时后，对耦联产物茚检完全显阴性，耦联效率高。
4、传统的脱除方法只能脱除大部分的Fmoc基团，要脱除彻底必然损伤肽链，增加副反应产物，本发明采用的脱保护试剂，有助于长链肽的合成收率，脱除效果好且脱除完全，也有利于降低精制难度。曲拉酮-100可以减小多肽结构的空间位阻，有利于哌啶完全的彻底的脱除Fmoc基团，同时减少哌啶对整个肽链的损伤；彻底脱除Fmoc基团有利于合成收率的提高，大大减小副反应产物的产生。
5、本发明控制脱保护反应温度，越长的肽链，在脱除反应时要控制温度越低，可以有效保护肽链不被脱除反应放出的热量破坏，这样有助于长肽链的合成收率，形成的肽链完整，也有利于精制难度的降低，从而有效提高产品质量。
6、本发明采用低替代度的Rink AmideAM树脂，以便减小合成过程中的空间位阻，提高合成效率和产品收率，降低精制难度和成本。
具体实施方式
实施例1制备脱保护试剂
脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到脱保护试剂，其中DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占脱保护试剂的体积百分比为1%。
实施例2Rink AmideAM树脂的预处理
将Rink AmideAM树脂投入到反应器中，先用DMF洗涤一次，抽干。然后用适量DMF常温溶涨，N2吹拂，搅拌约30min至树脂充分泡涨，抽干液体。再用DMF洗涤一次，抽干。将Rink AmideAM树脂在15℃下脱保护反应20min去除Fmoc保护基团。脱保护试剂为600ml。Rink AmideAM树脂的重量浓度为5～10ml/g。该脱保护温度下可以有效保护肽链不被脱保护反应放出的热量破坏，从而有效提高产品质量。然后在室温下脱保护反应20min，排干。最后依次用DMF、甲醇和DMF洗涤，排干。脱保护后，用玻璃棒挑取少许树脂，茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
实施例3氨基酸耦联反应得到特利加压素肽树脂
（1）第1位氨基酸的耦联
第1位氨基酸的耦联反应的投料配比如表1所示，第1位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表1第1位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| Rink AmideAM树脂 | 100g(100mmol,1mmol/g) | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 89.2g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml |
称取89.2g Fmoc-Pro-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将去除Fmoc保护基团的Rink AmideAM树脂加入到反应柱中，然后将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（1）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（1）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（1）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（1），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（1）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（2）第2位氨基酸的耦联
第2位氨基酸的耦联反应的投料配比如表2所示，第2位氨基酸为Fmoc-Lys(Boc)-OH。
表2 第2位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（1） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Lys(Boc)-OH | 140.6g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 600ml*2 |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（1）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入500ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入600ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入500ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用500ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（1），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取140.6g Fmoc-Lys(Boc)-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（2）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（2）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（2）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（2），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（2）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（3）第3位氨基酸的耦联
第3位氨基酸的耦联反应的投料配比如表3所示，第3位氨基酸为Fmoc-Pro-OH。
表3第3位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（2） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Pro-OH | 101.2g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml*9 |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 600ml*2 |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（2）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入500ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入600ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入500ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用500ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（2），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取101.2g的Fmoc-Pro-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（3）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（3）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（3）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（3），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（3）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（4）第4位氨基酸的耦联
第4位氨基酸的耦联反应的投料配比如表4所示，第4位氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH。
表4第4位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（3） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 175.7g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 600ml*2 |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（3）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入500ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入600ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入500ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用500ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（3），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取175.7g的Fmoc-Cys(Trt)-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（4）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（4）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（4）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（4），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（4）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（5）第5位氨基酸的耦联
第5位氨基酸的耦联反应的投料配比如表5所示，第5位氨基酸为Fmoc-Asn(Trt)-OH。
表5第5位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（4） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Asn（Trt）-OH | 179g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 600ml*2 |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（4）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入500ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入600ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入500ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用500ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（4），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取179g的Fmoc-Asn(Trt)-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（5）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（5）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（5）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（5），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（5）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（6）第6位氨基酸的耦联
第6位氨基酸的耦联反应的投料配比如表6所示，第6位氨基酸为Fmoc-Gln(Trt)-OH。
表6第6位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（5） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gln(Trt)-OH | 183.2g | 3 |
| HOBt | 40.5g | 3 |
| DIC | 46.5ml | 3 |
| DMF | 500ml*9 | |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 600ml*2 |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（5）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入500ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入600ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入500ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用500ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（5），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取183.2g的Fmoc-Gln(Trt)-OH和40.5g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入46.5ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入290ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（6）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（6）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（6）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（6），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（6）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（7）第7位氨基酸的耦联
第7位氨基酸的耦联反应的投料配比如表7所示，第7位氨基酸为Fmoc-Phe-OH。
表7 第7位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（6） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Phe-OH | 127.8g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（6）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的 DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用600ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（6），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取127.8g的Fmoc-Phe-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（7）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（7）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（7）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（7），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（7）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（8）第8位氨基酸的耦联
第8位氨基酸的耦联反应的投料配比如表8所示，第8位氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
表8第8位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（7） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 133.1g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（7）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用500ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（7），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取133.1g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中，并要保持在反应过程中无挂壁现象出现，若出现挂壁，用少许精制DMF将壁上的树脂冲到反应液中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（8）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（8）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（8）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（8），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（8）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（9）第9位氨基酸的耦联
第9位氨基酸的耦联反应的投料配比如表9所示，第9位氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH。
表9第9位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（8） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | 193.3g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（8）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用600ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（8），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取193.3g的Fmoc-Cys(Trt)-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（9）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（9）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（9）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（9），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（9）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（10）第10位氨基酸的耦联
第10位氨基酸的耦联反应的投料配比如表10所示，第10位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表10第10位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（9） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 98.1g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（9）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用600ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（9），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取98.1g的Fmoc-Gly-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（10）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（10）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（10）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（10），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（10）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（11）第11位氨基酸的耦联
第11位氨基酸的耦联反应的投料配比如表11所示，第11位氨基酸为Fmoc-Gly-OH。
表11第11位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（10） | 100mmol | 1 |
| Fmoc-Gly-OH | 98.1g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（10）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用600ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（10），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取98.1g的Fmoc-Gly-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（11）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（11）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（11）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（11），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（11）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（12）第12位氨基酸的耦联
第12位氨基酸的耦联反应的投料配比如表12所示，第12位氨基酸为Boc-Gly-OH。在传统的肽合成中，Fmoc合成策略下的氨基酸都选用Fmoc保护主氨基的保护氨基酸，但在特利加压素的合成中，如果选用Fmoc保护氨基酸进行操作，由于三个Gly相连，合成后树脂如果不及时裂解，长期存放会发生断裂的问题。故在末位Gly的尝试选用Boc保护主氨基。由于末位氨基酸的保护类型的改变，提高了合成后的稳定性，并且在合成结束后还不用脱除Boc，在裂解反应进行时，Boc保护基可一并脱除。
表12第12位氨基酸的耦联反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 摩尔比 |
| 反应产物（11） | 100mmol | 1 |
| Boc-Gly-OH | 57.8g | 3.3 |
| HOBt | 44.6g | 3.3 |
| DIC | 51.2ml | 3.3 |
| DMF | 600ml*9 | 体积增加20% |
| 哌啶/DCM/DMF/NMP/曲拉通-100 | 720ml*2 | 体积增加20% |
在耦联反应前，采用实施例1的脱保护试剂将反应柱中的反应产物（11）脱保护，去除Fmoc保护基团。脱保护的反应温度为15℃。具体脱保护过程如下：每次加入600ml的DMF于反应柱中，洗涤2次，抽掉。每次加入720ml的脱保护试剂，脱保护2次，第一次为5min，第二次为10min，两次脱保护之间需加入600ml的DMF洗涤1min，抽掉。脱保护后每次再用600ml的DMF洗涤4次，第5次用600ml精制DMF洗涤一次。用玻璃棒挑取少许反应产物（11），茚检，显深紫红色，表明Fmoc已脱，待投料。
称取57.8g的Boc-Gly-OH和44.6g HOBt置于烧杯中，加入210ml精制DMF于烧杯中溶解上述试剂。待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冷却2min，然后再加入51.2ml DIC于溶液中活化约8min。若出现白色絮状泡沫表明活化已完全。用布氏漏斗将活化液中的白色固体小颗粒滤去，得到澄清滤液。将得到的澄清滤液倒入反应柱中，再加入390ml精制DMF于反应柱中。上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2.5～3h得到反应产物（12）。优选的，上述试剂在反应柱中32℃下耦联反应2h即得到反应产物（12）。
通过茚检确定耦联反应是否完全，具体做法为：用玻璃棒粘取少许反应产物（12）于小试管中，用DMF洗涤反应产物（12），每个茚检液各加2滴，放置于微量恒温器中，100℃放置5min。观察反应产物（12）和溶液都没有颜色，表明反应已经完全，可抽掉反应液，进入下一个氨基酸的耦联反应。若茚检不合格，则需重复耦联。
（13）耦联反应的最终程序
用600ml/次的DMF洗涤4次，每次约1min，洗涤后抽掉DMF。再用600ml/次的无水乙醚收缩2次，每次5min，洗涤后抽掉无水乙醚。在反应柱口塞上卷纸，用真空干燥抽干至树脂呈干燥流沙状为止，得到特利加压素肽树脂。称重合成完干燥后的特利加压素肽树脂。
实施例4裂解反应制备还原型特利加压素粗肽
裂解反应投料配比如表13所示。
表13裂解反应投料配比
| 原料/溶剂 | 投料量 | 体积比 |
| 特利加压素肽树脂 | 100g | |
| TFA | 925ml | 92.5% |
| EDT | 25ml | 2.5% |
| TIS | 40ml | 4% |
| H2O | 10ml | 1% |
| 乙醚 | 7L |
具体裂解操作如下：
检查生产场所、设备，必须为清洁状态和完好状态。
（1）将1L裂解液加入3L烧瓶中，冰浴冷却30min。裂解液为TFA/EDT/TIS/H2O，各成分的体积比为92.5:2.5:4:1。
（2）将100±1克特利加压素肽树脂慢慢加入预冷的裂解液中。室温下磁力搅拌反应2h，滤出液体，缓慢滴加入装有5L乙醚的血清瓶中，待其自然沉降，30分钟后撇除上清液，得到带有乙醚的生长抑素粗肽湿品。
（3）将带有乙醚的生长抑素粗肽湿品进行离心处理，倒出上清液，用乙醚研洗粗肽，再次离心。循环上述步骤操作4次。空气中静置15分钟后转移至真空干燥器中，进行减压干燥，将粗肽常温真空干燥过夜到恒重，得到还原型特利加压素粗肽。
（4）取样送检，检测纯度大于60%为合格粗肽。然后将合格粗肽送至纯化部门进行环化、纯化及冻干。
实施例5环化
(1)特利加压素粗肽溶液的制备
用研钵将还原型特利加压素粗肽充分研磨成粉末状，用乙睛体积浓度为5%的水溶液将还原型特利加压素粗肽溶解至浓度约为1mmol/L，充分搅拌至全溶，得到还原型特利加压素粗肽溶液。
(2)环化制备氧化型特利加压素粗肽
配制新鲜的双氧水体积浓度为1.5%的水溶液，作为氧化试剂备用。双氧水做氧化剂比传统的空气、氧气和碘作为氧化剂更稳定和快捷。
用稀氨水溶液（取浓氨水适量稀释5倍）或稀氢氧化钠溶液调整还原型特利加压素粗肽溶液pH值至7.1～7.2。将双氧水体积浓度为1.5%的水溶液600ml作为氧化试剂加入到还原型特利加压素粗肽溶液中，室温搅拌反应2小时。采用HPLC检测，直到氧化终点，用醋酸将溶液的pH值调至4左右。使用0.45um的滤膜过滤溶液，得到滤液为氧化型特利加压素粗肽。将氧化型特利加压素粗肽及时纯化，否则将滤液放在玻璃瓶里，置于4℃的冰柜中冷藏，第二天及时纯化，样品在室温条件下不能存放超过12小时。
实施例6纯化
采用制备型液相色谱仪将氧化型特利加压素粗肽分离纯化。本实施例采用的液相色谱仪器为创新通恒P6000制备型液相色谱仪。色谱柱为C18柱，该柱是直径为5cm、孔径为
的反相硅胶高压制备层析柱，其填料是粒径为10um的十八烷基键合硅胶。设定色谱仪的检测波长为280nm，洗脱流速为50ml/min，上样量约为3～5g。梯度洗脱条件如表14所示。
表14梯度洗脱条件
| 时间（min） | A相（%，V/V） | B相（%，V/V） |
| 0-40 | 85→81 | 15→19 |
表中A相为TFA体积浓度为1‰的溶液，通过如下方法制得：将1ml的TFA加入950ml纯水中，定容至1L，即得TFA溶液；B相为乙腈。A相的体积浓度从85%变为81%，B相的体积浓度从15%变为19%。
纯化出峰以后，根据峰形，按已编号的收集瓶，适时适量收集样品，然后根据HPLC分析检测，按峰前、峰顶和峰后分别并样。其中，纯度大于98%为合格品，收集合并。纯度小于98%的样品，收集合并。对纯度小于98%的样品按以上纯化步骤进行多次纯化得到合格品。
实施例7转盐
采用制备型液相色谱仪将纯化得到的合格品转盐，本实施例采用的液相色谱仪器为创新通恒P6000制备型液相色谱仪。色谱柱为C18柱，该柱是直径为5cm、孔径为
的反相硅胶高压制备层析柱，其填料是粒径为10um的十八烷基键合硅胶。设定色谱仪的检测波长为280nm，洗脱流速为50ml/min，上样量约为5～10g。转盐条件如表15所示。
表15转盐的工艺条件
| 分离步骤 | 时间（min） | A(%，V/V) | B(%，V/V) |
| 离子转换 | 0-15 | 95(50mmol乙酸铵) | 5(乙腈) |
| 去离子 | 15-25 | 95(纯水) | 5(乙腈) |
| 平衡 | 25-35 | 95(0.03%醋酸) | 5(乙腈) |
| 洗脱 | 35-60 | 50(0.03%醋酸) | 50(乙腈) |
表中A相分别为乙酸铵、纯水和冰醋酸。50mmol乙酸铵溶液通过如下方法制得：称取乙酸铵固体3.85g，加纯水溶解定容至1L，得50mmol乙酸铵溶液。冰醋酸溶液通过如下方法制得：将3ml冰醋酸加入950ml纯水中，定容至1L，即得冰醋酸溶液。B相为乙腈。
收集样品的主峰，合并在收集瓶中。
实施例8浓缩
转盐后所收集的合格溶液必须马上经减压浓缩去除乙腈和部分水。浓缩条件为：温度33℃，真空度10mbar以下。合格溶液浓缩至200～300mg/ml(约200ml)，使用0.22um的滤膜过滤溶液，滤液分装存放于直径为24.2cm，高度为1.8cm的不锈钢盘中，每盘放精肽约20～50g，准备冻干。
实施例9冻干
采用真空冷冻干燥机冻干。将上步浓缩分装好的滤液放入冷冻干燥机中冷冻干燥得白色粉末，即得特利加压素。具体冻干过程如下：
(1)预冻：将分装好的滤液置于冻干箱内隔板上进行预冻，度下降至-40℃以下，维持2小时。
(2)升华干燥：通过隔板下的加热系统缓缓加热，温度升至-27℃左右，维持约10小时，然后温度升至0℃左右，维持约8时。
(3)解吸附：温度升至27℃左右，保持5小时，取出，称量。
经过上述步骤，最终得到特利加压素成品。该特利加压素的化学式为Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2。特利加压素的收率如表16所示。
表16特利加压素收率
| 产品投料量 | 理论产量 | 实际产量 | 总收率 |
| 100mol | 122.7g | 62.3g | 50.8% |
Claims (10)
1.一种特利加压素的制备方法，其特征在于，包括：
用脱保护试剂将Rink AmideAM树脂脱保护，去除Fmoc保护基团；
以脱保护后的Rink AmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBt/DIC为缩合剂，依次耦联氨基酸，得到特利加压素肽树脂；耦联第2～12位氨基酸之前，用所述脱保护试剂依次脱去上一位耦联产物的Fmoc保护基团；
裂解所述特利加压素肽树脂，然后加入乙醚沉淀所述特利加压素肽树脂，得到还原型特利加压素粗肽；
将所述还原型特利加压素粗肽环化得到氧化型特利加压素粗肽；
将所述氧化型特利加压素粗肽纯化、转盐、浓缩和冻干得到特利加压素。
2.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于，所述脱保护试剂的制备方法为：将哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制备得到所述脱保护试剂，其中，DCM/DMF/NMP的体积比=1:1:1，哌啶占所述脱保护试剂的体积百分比为20%，曲拉通-100占所述脱保护试剂的体积百分比为1%；所述脱保护的反应温度为15℃。
3.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述RinkAmideAM树脂的替代度≤0.6mmol/g。
4.如权利要求1～3任一项所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：耦联第1位氨基酸时，Rink AmideAM树脂：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第2至第6位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3:3:3；耦联第7至第12位氨基酸时，上一位耦联产物：氨基酸：HOBt：DIC的摩尔比为1:3.3:3.3:3.3；耦联第7～12位氨基酸时，所述脱保护试剂的每次体积用量比耦联第1位氨基酸时增加20%。
5.如权利要求4所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述耦联的温度为32℃，时间为2.5～3小时。
6.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述裂解的裂解液各成分的体积比为TFA:EDT:TIS:H2O=92.5:2.5:4:1，裂解时间为2h。
7.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述环化的氧化剂为双氧水，pH值为7.1～7.2，时间为2小时。
8.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述纯化的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径 
的C18柱，流动相分别为TFA溶液和乙腈，流速为50ml/min，上样量为3～5g，色谱仪的检测波长为280nm。
9.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述转盐包括离子转换、去离子、平衡和洗脱，所述转盐的色谱柱为直径5cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径
的C18柱，流速为50ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为280nm；其中，所述离子转换的流动相分别为乙酸铵和乙腈，所述去离子的流动相分别为纯水和乙腈，所述平衡的流动相分别为冰醋酸和乙腈，所述洗脱的流动相分别为冰醋酸和乙腈。
10.如权利要求1所述的特利加压素的制备方法，其特征在于：所述浓缩的温度为33℃，真空度≤10mbar。
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