CN105418736A - 一种固液结合制备特利加压素的方法 - Google Patents

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CN105418736A CN201511022476.6A CN201511022476A CN105418736A CN 105418736 A CN105418736 A CN 105418736A CN 201511022476 A CN201511022476 A CN 201511022476A CN 105418736 A CN105418736 A CN 105418736A
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李同金
王仁友
石鑫磊
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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，具体涉及一种固液结合制备特利加压素的方法，本发明中采用Boc-Gly-OH和双甘肽液相合成片段肽Boc-Gly-Gly-Gly-OH，同时固相合成环化片段肽H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂；最后将二者偶联制备特利加压素肽树脂，经裂解，纯化，冻干得特利加压素；此工艺减少了杂质肽的生成，提高了粗肽纯度和收率，简化了操作步骤，使生产成本进一步降低，便于规模化放大生产。

Description

一种固液结合制备特利加压素的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种固相和液相结合制备特利加压素的方法。
技术背景
特利加压素(Terlipressin)最早由Ferring公司开发，于1977年首先在荷兰作为止血药上市，商品名为Glypressin；之后又以商品名Glypressine在法国、德国、英国上市，用于治疗消化道静脉曲张出血；Ferring公司于1999年，在中国取得该品种的上市许可。
特利加压素为赖氨酸加压素衍生物，本身无活性，在体内经氨基肽酶作用，脱去其N末端的3个甘氨酰残基后，缓慢“释放”出有活性的赖氨酸加压素。其结构如下：Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-NH2
Ferring公司申请的专利SK278755(CZ281589)采用Boc保护氨基酸固相合成工艺制备特利加压素，此合成工艺中用到HF，对生产设备要求较高，三废较严重，规模放大较困难。专利CN1865282B采用Fmoc保护氨基酸固相合成工艺制备特利加压素，避免了HF的使用，降低了对环境的污染；其氧化工艺为液相氧化，溶液浓度不能过高，操作复杂，副反应较多，后期纯化难度较大，生产成本高。专利CN101693738A同样采用Fmoc保护氨基酸固相合成了线性特利加压素肽树脂，然后采用碘氧化固相成环工艺形成二硫键，然后经裂解，纯化、冻干得精肽，简化了操作过程，便于规模性放大；但是存在成环较困难，粗肽纯度较低的缺点。专利CN102408471A，为了解决工艺中容易产生特利加压素±Gly的杂质，特采用Fmoc-Gly-OH和CTC树脂合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-CTC树脂,然后经裂解得到单体Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH,在固相接肽合成线性特利加压素肽树脂；虽然有效的避免了特利加压素±Gly的杂质的产生，但是提高了生产成本。专利CN104371008A采用片段合成的方法来制备特利加压素，其公布的液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH或Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH方法,需要经过偶联、脱保护、再偶联、再脱保护等四个步骤，且所选原料H-Gly-OMe或H-Gly-OtBu价格较高，整个制备过程操作复杂，不适合规模放大生产。
本发明人为了解决特利加压素±Gly杂质的生成，降低纯化难度；同时为了简化特利加压素的生产工艺，提高收率，降低生产成本，对特利加压素的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种特利加压素的固相和液相相结合的制备方法。本发明采用常规的保护氨基酸作为起始原料，降低了合成难度，提高了精肽纯度，降低了生产成本，有利于规模化工业生产。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)以Boc-Gly-OH和双甘肽为原料，液相合成片段肽A:Boc-Gly-Gly-Gly-OH；
(b)以Fmoc保护氨基酸和氨基树脂依次偶联，固相合成片段肽B树脂:
H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)–Gly-氨基树脂
(c)片段肽A和片段肽B树脂偶联，固相合成特利加压素的肽树脂:
Boc-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂
(d)特利加压素肽树脂经裂解、纯化、转盐、冻干得醋酸特利加压素精肽。
以上技术方案中，步骤(a)的具体操作步骤为：
将Boc-Gly-OH和HOSu按照摩尔比1:1～1.2的比例溶解在四氢呋喃中，待完全溶解后，冰水浴下滴加入1.0-1.2倍摩尔量(以Boc-Gly-OH的量计)的DCC四氢呋喃溶液；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3-4h；滤除白色沉淀，四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液；旋蒸浓缩滤液和洗液至原体积的1/3，加入石油醚析晶，过滤得白色固体Boc-Gly-OSu，抽干后待用；
将双甘肽与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.5～1.0倍摩尔量(以双甘肽的量计)Boc-Gly-OSu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸掉有机溶剂后，再加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Boc-Gly-Gly-Gly-OH。
以上步骤中，所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种；有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
以上技术方案中，步骤(b)中片段肽B树脂合成的具体操作步骤为：以Rinkamideresins或RinkamideAMresins为固相载体，经脱保护试剂处理后，以2-5倍的摩尔投料比，加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，得到H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂；然后用2-5倍的摩尔投料比，加入碘的DMF溶液，氧化反应40～120min，然后DMF洗涤树脂六次,得到片段肽B树脂：H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)–Gly-氨基树脂。
以上技术方案，步骤(c)的具体操作步骤为：称取2-5倍摩尔投料比Boc-Gly-Gly-Gly–OH和缩合剂，放入溶解瓶中，加入DMF溶解完全，加入装有片段肽B树脂的合成柱中，室温下搅拌反应,kaiser试剂检测反应终点。
其中步骤(b)或(c)中所述氨基树脂为Rinkamideresins和RinkamideAMresins中的一种，树脂替代度为0.4-1.2mmol/g。
其中步骤(b)或(c)中的具体操作步骤中所述缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；脱保护试剂为15～25％(体积含量)哌啶/DMF溶液。
以上技术方案，步骤(d)中裂解所用裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
本发明的有益效果为：
1)、本申请采用双甘肽作为起始原料，其价格便宜且易获得，利用双甘肽在碱性条件下可以和Boc-Gly-Osu发生偶联反应，生成Boc-Gly-Gly-Gly–OH的性质，简化了其制备过程，降低了合成成本，提高了终产品的纯度；
2)、本发明中二硫键的形成工艺，采用了先制备H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂，然后固相条件下碘氧化的方法，这样可以减少Fmoc-Gly-Gly-Gly-基团的空间位阻，有利于二硫键的形成，提高粗肽的纯度。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
Fmoc9-芴甲氧羰基
RinkamideresinsRink酰胺树脂
RinkamideAMresinsRink酰胺AM树脂
tBu叔丁基
Trt三苯甲基
Boc叔丁氧羰基
NMPN-甲基-2-吡咯烷酮
DCM二氯甲烷
DMFN,N-二甲基甲酰胺
DMAP4-二甲氨基吡啶
DIPEAN,N-二异丙基乙胺
DICN,N-二异丙基碳二亚胺
HBTU苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTUO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT1-羟基苯并三唑
HOAT1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA三氟乙酸
TIS三异丙基硅烷
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
实施例1：Boc-Gly-Gly-Gly–OH的制备
准确称取Boc-Gly-OH105.1g(0.6mol)和HOSu69.0g(0.6mol)溶于1.2L四氢呋喃中，待完全溶解后，低温(2-8℃)下滴加入DCC123.6g(0.6mol)四氢呋喃溶液600ml；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3h；滤除白色沉淀，300ml四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液；旋蒸浓缩滤液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，过滤得白色固体，石油醚洗涤三次，抽干后用1.0L四氢呋喃复溶，待用；
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH79.8g(0.6mol)和碳酸钠127.2g(1.2mol)溶于1200mL水中，低温下(2-8℃)缓慢加入Boc-Gly-OSu的四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Gly-Gly-Gly-OH135.6g，收率75.2％。
实施例2：Boc-Gly-Gly-Gly-OH的制备
准确称取Boc-Gly-OH105.1g(0.6mol)和HOSu82.8g(0.72mol)溶于1.2L四氢呋喃中，待完全溶解后，低温(2-8℃)下滴加入DCC123.6g(0.6mol)四氢呋喃溶液600ml；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3h；滤除白色沉淀，300ml四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液；旋蒸浓缩滤液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，过滤得白色固体，石油醚洗涤三次，抽干后用1.0L四氢呋喃复溶，待用；
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH79.8g(0.6mol)和碳酸钠63.6g(0.6mol)溶于1200mL水中，低温下(2-8℃)缓慢加入Boc-Gly-OSu的四氢呋喃溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Gly-Gly-Gly-OH131.1g，收率75.6％。
实施例3：Boc-Gly-Gly-Gly–OH的制备
准确称取Boc-Gly-OH105.1g(0.6mol)和HOSu82.8g(0.72mol)溶于1.2L四氢呋喃中，待完全溶解后，低温(2-8℃)下滴加入DCC148.3g(0.72mol)四氢呋喃溶液600ml；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3h；滤除白色沉淀，300ml四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液；旋蒸浓缩滤液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，过滤得白色固体，石油醚洗涤三次，抽干后用1.0L四氢呋喃复溶，待用；
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH159.6g(1.2mol)和碳酸钠152.6g(1.44mol)溶于1600mL水中，低温下(2-8℃)缓慢加入Boc-Gly-OSu的四氢呋喃溶液搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Gly-Gly-Gly-OH148.4g，收率85.6％。
实施例4：Boc-Gly-Gly-Gly–OH的制备
准确称取Boc-Gly-OH105.1g(0.6mol)和HOSu75.9g(0.66mol)溶于1.2L四氢呋喃中，待完全溶解后，低温(2-8℃)下滴加入DCC136.0g(0.66mol)四氢呋喃溶液600ml；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3h；滤除白色沉淀，300ml四氢呋喃洗涤3次，合并洗液和滤液；旋蒸浓缩滤液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，过滤得白色固体，石油醚洗涤三次，抽干后用1.0L二氧六环复溶，待用；
准确称取双甘肽Gly-Gly-OH110.9g(8.4mol)和碳酸钠106.8g(1.01mol)溶于1600mL水中，低温下(2-8℃)缓慢加入Boc-Gly-OSu的二氧六环溶液，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，旋蒸浓缩至1000ml，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，加入石油醚2000ml析晶，得Boc-Gly-Gly-Gly-OH139.1g，收率80.2％。
实施例5：片段肽B树脂的制备
准确称取替代度为0.40mmol/g的Rinkamideresins100g(合成规模40mmol)置于合成柱中，加入600mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，600mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液600ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用600mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Gly-OH47.7g(80mmol)、HOBT11.9g(88mmol)和DIC13.7ml(88mmol)的DMF溶液400ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用600mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照特利加压素肽序，逐一和Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联；得到H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)–Pro–Lys(Boc)-Gly-Rinkamideresins；
称取20.32g(80mmol)碘于溶解瓶中，加入1000mlDMF溶解，待完全溶解后，加入合成柱中，氧化反应2h；抽掉氧化液，分别用800mlDMF洗涤6次；得到H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rinkamideresins；
实施例6：特利加压素肽树脂的制备
准确称取23.12g(80mmol)Boc-Gly-Gly-Gly–OH和11.9g(88mmol)HOBt，放入溶解瓶中，加入50mlDMF溶解完全，然后加入13.7ml(88mmol)DIC,混合均匀后，加入实施例5的合成柱中，室温下搅拌反应,kaiser检测反应终点；偶联反应结束后，抽调反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤树脂两次，真空干燥，称重得肽树脂168.6g，树脂增重68.6g,增重率为98.8％。
实施例7：片段肽B树脂的制备
准确称取替代度为1.2mmol/g的Rinkamideresins33.3g(合成规模40mmol)置于合成柱中，加入200mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，200mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液200ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用200mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Gly-OH47.7g(80mmol)、HOBT11.9g(88mmol)和DIC13.7ml(88mmol)的DMF溶液120ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用200mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照特利加压素肽序，逐一和Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联；得到H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rinkamideresins；
称取20.32g(80mmol)碘于溶解瓶中，加入400mlDMF溶解，待完全溶解后，加入合成柱中，氧化反应2h；抽调氧化液，分别用300mlDMF洗涤6次；得到H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rinkamideresins；
实施例8：特利加压素肽树脂的制备
准确称取23.12g(80mmol)Boc-Gly-Gly-Gly–OH和11.9g(88mmol)HOBt，放入溶解瓶中，加入50mlDMF溶解完全，然后加入13.7ml(88mmol)DIC,混合均匀后，加入实施例5的合成柱中，室温下搅拌反应,kaiser检测反应终点；偶联反应结束后，抽调反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤树脂两次，真空干燥，称重得肽树脂101.8g，树脂增重68.5g,增重率为98.2％。
实施例9：片段肽B树脂的制备
准确称取替代度为1.0mmol/g的RinkamideAMresins40.0g(合成规模40mmol)置于合成柱中，加入300mlDCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，300mlDMF洗涤2次，加入20％哌啶/DMF溶液300ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用300mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Gly-OH47.7g(80mmol)、HOBT11.9g(88mmol)和DIC13.7ml(88mmol)的DMF溶液200ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用300mlDMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照特利加压素肽序，逐一和Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联；得到H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-RinkamideAMresins；
称取20.32g(80mmol)碘于溶解瓶中，加入600mlDMF溶解，待完全溶解后，加入合成柱中，氧化反应2h；抽调氧化液，分别用300mlDMF洗涤6次；得到H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-RinkamideAMresins；
实施例10：特利加压素肽树脂的制备
准确称取23.12g(80mmol)Boc-Gly-Gly-Gly–OH和11.9g(88mmol)HOBt，放入溶解瓶中，加入50mlDMF溶解完全，然后加入13.7ml(88mmol)DIC,混合均匀后，加入实施例5的合成柱中，室温下搅拌反应,kaiser检测反应终点；偶联反应结束后，抽调反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤树脂两次，真空干燥，称重得肽树脂108.7g，树脂增重68.7g,增重率为98.6％。
实施例11：肽树脂裂解
将实施例6得到的168.0g特利加压素肽树脂，加入到冷冻的1100ml裂解液(体积配比为TFA/苯酚/苯甲硫醚/TIS/H20＝85/5/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至800ml,倒入8L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得特利加压素粗肽47.6g,粗肽收率97.0％，纯度86.2％。
实施例12：肽树脂裂解
将实施例8得到的100.0g特利加压素肽树脂，加入到冷冻的1000ml裂解液(体积配比为TFA/苯甲硫醚/TIS/H20＝90/5/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至800ml,倒入8L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得特利加压素粗肽46.9g,粗肽收率95.6％，纯度85.7％。
实施例13：肽树脂裂解
将实施例10得到的108.0g特利加压素肽树脂，加入到冷冻的1100ml裂解液(体积配比为TFA/苯酚/苯甲硫醚/TIS/H20＝82.5/5/5/2.5/5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至800ml,倒入8L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得特利加压素粗肽48.2g,粗肽收率98.2％，纯度87.6％。
实施例14：粗肽精制
称取实施例11所得粗肽47.0g溶于10％乙腈水溶液1500ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mmC18制备柱，流动相为50mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈体系，上样量为6.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5％以上，单杂小于0.1％的精肽溶液，脱盐后浓缩，冻干得精肽30.6g，纯化收率为65.1％，纯度99.6％，单杂均小于0.1％。
实施例15：粗肽精制
称取实施例12所得粗肽46.0g溶于10％乙腈水溶液1500ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mmC18制备柱，流动相为100mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈体系，上样量为6.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5％以上，单杂小于0.1％的精肽溶液，脱盐后浓缩，冻干得精肽29.2g，纯化收率为63.5％，纯度99.6％，单杂均小于0.1％。
实施例16：粗肽精制
称取实施例13所得粗肽48.0g溶于10％乙腈水溶液1500ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mmC18制备柱，流动相为80mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈体系，上样量为6.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5％以上，单杂小于0.1％的精肽溶液，脱盐后浓缩，冻干得精肽32.1g，纯化收率为66.9％，纯度99.6％，单杂均小于0.1％。

Claims (10)

1.一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)以Boc-Gly-OH和双甘肽为原料，液相合成片段肽A：Boc-Gly-Gly-Gly-OH；
(b)以Fmoc保护氨基酸和氨基树脂依次偶联，固相合成片段肽B树脂：
H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)–Gly-氨基树脂；
(c)片段肽A和片段肽B树脂偶联，固相合成特利加压素的肽树脂：
Boc-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂；
(d)特利加压素肽树脂经裂解、纯化、转盐、冻干得醋酸特利加压素精肽。
2.根据权利要求1所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(a)中所述Boc-Gly-Gly-Gly-OH的制备方法为：将双甘肽与碱A按照摩尔比1:1～2溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入0.5～1.0倍摩尔量(以双甘肽的量计)Boc-Gly-OSu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点，待反应结束后，减压蒸掉有机溶剂，再加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Boc-Gly-Gly-Gly-OH。
3.根据权利要求2所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，所述Boc-Gly-OSu的制备方法为：将Boc-Gly-OH和HOSu按照摩尔比1:1～1.2溶解在四氢呋喃中，待完全溶解后，滴加入1.0-1.2倍摩尔量(以Boc-Gly-OH的量计)的DCC四氢呋喃溶液；撤冰水浴，室温下继续搅拌反应3-4h；滤除白色沉淀，滤液浓缩至原体积的1/3，加入石油醚析晶，过滤得白色固体，抽干后待用。
4.根据权利要求2所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(a)中所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺中的一种；所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(b)中片段肽B树脂合成的步骤为：向装有H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂的合成柱中加入2-5倍摩尔投料比的碘的DMF溶液反应40～120min，然后用DMF溶液洗涤6次，得到H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)–Gly-氨基树脂。
6.根据权利要求5所述一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，所述H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂的制备方法为：以氨基酸树脂为固相载体，用脱保护试剂脱保护后，以2-5倍摩尔投料比加入Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，得H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基树脂。
7.根据权利要求6所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(b)中所述氨基树脂为Rinkamideresins或RinkamideAMresins，树脂替代度为0.4-1.2mmol/g；所述缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；所述脱保护试剂为15～25％(体积含量)哌啶/DMF溶液。
8.根据权利要求1所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(c)的具体操作步骤为：称取2-5倍摩尔投料比的Boc-Gly-Gly-Gly–OH和缩合剂，放入溶解瓶中，加入DMF溶解完全，加入步骤(b)中的合成柱中，室温下搅拌反应,kaiser检测反应终点。
9.根据权利要求8所述的一种固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，所述缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。
10.根据权利要求1所述的固液结合制备特利加压素的方法，其特征在于，步骤(d)中裂解所用裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
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