CN104761619A

CN104761619A - 醋酸去氨加压素的固相制备工艺

Info

Publication number: CN104761619A
Application number: CN201510004651.2A
Authority: CN
Inventors: 高鲁; 胡影莉; 陈逸民; 王良友
Original assignee: SUZHOU TIANMA GROUP TIANJI BIO-PHARMACEUTICAL CO LTD
Current assignee: SUZHOU TIANMA GROUP TIANJI BIO-PHARMACEUTICAL CO LTD
Priority date: 2015-01-06
Filing date: 2015-01-06
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，包括以下步骤：以替代度为1.6~2.0mmol/g的Am Resin树脂，溶胀、抽干为起始原料，偶联Fmoc Rink Amide AM-Linker；根据肽序，从C端到N端开始再依次偶联，直至完成线肽树脂的合成；在线肽树脂中加入I₂溶液，从而将线性肽树脂氧化成氧化型肽树脂，I₂溶液为将I₂溶解于由DMF、MeOH按照1：1体积比形成的溶剂中；将氧化型肽树脂缓缓加入裂解液中，待全部加完后，再在室温裂解2h，待裂解时间结束后，将树脂滤掉得到含多肽的裂解液；将含多肽的裂解液缓缓加入到的冰乙醚中，析出白色的固体粗肽，从而得到干燥后的粗肽。本发明产品纯度可达到99%以上，总收率可超过45%，生产效率较高，对设备要求低，并且可以实现规模化生产，有较好的经济社会价值和广泛的应用前景。

Description

醋酸去氨加压素的固相制备工艺

技术领域

本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺。

背景技术

去氨加压素的氨基酸序列为：3-巯基丙氨酰-L-酪氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰胺氨酰-L-天冬酰胺氨酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酰-甘氨酰胺（1→6）环二硫化物，其结构如下：

去氨加压素为天然精氨盐加压素的结构类似物，系对天然激素的化学结构进行两处改动而得（即1位半胱氨酸脱去氨基和8位D-精氨酸取代L-精氨酸）。静脉或皮下给予去氨加压素0.3μg/kg体重，可使血浆中凝血因子VIII（VIII：C）的活力增加2~4倍；也使VonWillebrand因子抗原（VWF：AG）的含量增加，但强并稍小。

同时，释放出组织型纤维蛋白溶酶原激活因子（t-PA）。皮下注射的生物利用度约为静脉注射生物利用度的85%，按体重0.3μg/kg给药的最大血药浓度在给药后约60分钟达到峰值，平均值约为600pg/ml，血浆半衰期3-4小时，止血效果取决于血浆中VIII：C的半衰期，约8-12小时。去氧加压素能使因尿毒症、肝硬化、先天性或药源性血小板功能不良等，以及未知病因的出血时间过长患者的出血时缩短或正常化，IIB型血管性血友病患者身上的VIII因子异常，使用去氧加压素可引致血小板发生凝聚或血小板减少症。使用城乡差别氨加压素可避免因使用VIII因子浓缩物而导致爱滋病病毒或肝炎病毒传染的危险临床用于中枢性尿崩症、夜间遗尿及血友病等，也用于肾尿液浓缩功能的测试。

目前多肽化学合成去氨加压素主要有液相合成法和固相合成两种途径。液相法合成操作繁琐，每一个氨基酸偶联完成后都需要一步纯化过程，对合成人员的化学操作水平及设备要求都较高，且周期较长，合成结束后在碱性液相条件下氧化成二硫键。该方法一般适合于短肽的合成和大规模生产；而固相多肽合成法操作简便快捷，每步只需简单的洗涤树脂，就可以达到简单提纯的目的，合成周期相对较短，合成完成后，在液相或者固相条件下，氧化得粗品，经液相反相制备得去氨加压素精肽。固相法尤其适用于中长肽的合成，而且易于放大生产。本发明拟在常规固相合成法基础上，加以改善优化。WO2011011342公开了一种分别在MBHA、Sieber 和CTC树脂上合成醋酸去氨加压素的方法，该方法采用碘/二氯甲烷进行固相环化，其中CTC树脂固相环化、裂解得到碳端为羧基的去氨加压素前体，再进行氨化得到醋酸去氨加压素，通过三种树脂和不同方法合成所得产品的纯度都低于90%。US5726287公开了一种分别采用Boc法（MBHA树脂）和Fmoc法（AM树脂）合成醋酸去氨加压素的方法，具体步骤为：先合成醋酸去氨加压素线性肽，然后在水相体系和碘氧化条件下进行环化生成二硫键，最后分别采用离子交换填料和反相HPLC进行了纯化，产品纯度都低于95%。CN101372505公开了一种采用Sieber Amide树脂固相合成醋酸去氨加压素的方法，其通过逐步偶联法合成去氨加压素线性肽树脂后，在乙腈/水体系中用双氧水对线性肽进行氧化生成去氨加压素肽树脂，再经过裂解、纯化得到醋酸去氨加压素，其收率为55%，产品纯度未见报道。但Sieber Amide树脂是一种非常特殊的树脂，供应商很少，不易采购，且售价高昂。专利CN102863513以Rink Amide AM 树脂为起始树脂进行了去氨加压素的Fmoc法合成，合成线性肽肽树脂并裂解后，再通过线性肽的液相双氧水氧化生成二硫键，未报到收率和产品纯度。

专利CN103102395采用Sieber Amide 树脂合成去氨加压素线性肽，裂解得到线性肽粗肽并经过纯化后，再于水相中进行氧化反应生成去氨加压素，最后经转盐得到醋酸去氨加压素，纯度99.5%以上，收率可达52%。同样存中其原料Sieber Amide 树脂价格昂贵和供应商少的缺点。CN201310412013针对以上各项目的缺点，采用AM树脂作为载体，常规固相法合成线肽后，使用含1%TFA的DCM溶液去除Cys(Trt)和Mpa(Trt)上的保护基Trt，接着加氧化试剂固环得到环肽树脂，最后经裂解得到去氨加压素。经制备纯化，线肽纯度可达97%以上，收率高于65%，但该方法未阐述树脂使用Rink Amide AM Resin，价格同样偏高，且在固相环化前，增加一步1%TFA的DCM溶液去除Cys(Trt)和Mpa(Trt)上的保护基Trt，由于TFA为树脂裂解试剂，所以该步骤较大程度的提高了肽链从树脂上掉落的可能，不利于工艺稳定和收率提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，该固相制备工艺解决由于液相环化造成大量液体污染物产生的问题的前提下，工艺操作简便，产品纯度可达到99%以上，总收率可超过45%，生产效率较高，对设备要求低，并且可以实现规模化生产，有较好的经济社会价值和广泛的应用前景。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，包括以下步骤：

步骤一、以替代度为1.6~2.0mmol/g的Am Resin树脂，溶胀、抽干为起始原料，偶联Fmoc Rink Amide AM-Linker，制得功能基载体；

步骤二、采用固相多肽逐步缩合法，根据肽序从C端至N端，首先将Fmoc-Gly-OH与步骤一Rink Amide-AM Resin偶联反应获得Fmoc-Gly-功能基载体；

步骤三、去除步骤二Fmoc-Gly-功能基载体的保护基Fmoc，从而获得H -Gly-功能基载体；

步骤四、根据肽序，按照Fmoc/tBu固相逐步合成策略，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，从C端到N端开始再依次偶联Fmoc-D-Arg(pbf) -OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt) -OH、 Fmoc-Asn(Trt) -OH、 Fmoc-Gln(Trt) -OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Tyr(tBu) -OH、 Mpr(Trt) -OH，期间依次脱去Fmoc-保护基团，直至完成线肽树脂的合成；

步骤五、在所述线肽树脂中加入I₂溶液，从而将线性肽树脂氧化成氧化型肽树脂，所述I₂溶液为将I₂溶解于由DMF、MeOH按照1：1体积比形成的溶剂中，所述I₂的量为线肽树脂的摩尔数的4~8倍；

步骤六、将所述氧化型肽树脂缓缓加入裂解液中，待全部加完后，再在室温裂解2h，待裂解时间结束后，将树脂滤掉得到含多肽的裂解液，所述裂解液由TFA、TIS、H₂O按照95：2~3：2~3体积份比例混合形成；

步骤七、将含多肽的裂解液缓缓加入到的冰乙醚中，析出白色的固体粗肽，静置后离心，并用冰的无水乙醚交替研磨洗涤、离心，所述粗品经真空干燥至恒重，得到干燥后的粗肽；

步骤八、将所述干燥后的粗肽采用乙腈：纯水=2：8的溶液溶解，借助制备型反相HPLC 纯化，收集目的产物，旋蒸，冻干得到醋酸去氨加压素成品。

上述技术方案进一步改进的技术方案如下：

1. 上述方案中，所述步骤二和步骤四中Fmoc保护的氨基酸的投料量为与其进行的偶联的树脂的摩尔数的2～4倍。

2. 上述方案中，所述步骤六中裂解液由TFA、TIS、H₂O按照95：2.5：2.5重量份比例混合形成。

3. 上述方案中，所述步骤八中A相选择磷酸盐缓冲液，B相为磷酸盐缓冲液-乙腈。

4. 上述方案中，所述步骤二和步骤四中采用DIC/HOBt缩合体系。

5. 上述方案中，所述干燥后的粗肽的溶解浓度2.5~3.5mmol/L。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其以AM Resin树脂作为起始载体，Fmoc- linker缩合后得到功能基树脂载体有效的降低了成本，使用Fmoc/tBu固相逐步合成策略完成粗肽合成，工艺简单，操作容易上手且易于放大生产，使用碘固相环化工艺步骤少，操作简便，减少了其它固相环化在脱保护时的不必要损失，生产周期短，大大降低了液体试剂使用量，减少了对环境的污染。可实现单批次几百克至千克级的生产规模。每步的氨基酸缩合率能达到99.5%以上，成品纯度可达到99.0%以上，最终产品的总收率可达到68%以上，且整个生产的过程采用的是常规试剂原料，无剧毒物质，安全环保。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，包括以下步骤：

（1）称取312.5g的Am Resin(1.6mmol/g)，置于入反应釜中，加入3500mLDCM溶涨约10min。待溶涨时间截止后，抽掉DCM，加入已经冰浴活化完成的反应液（323.8gRink Amide AM-Linker，97.3gHOBt冰浴2min，然后再加入185.5mLDIC于溶液中活化5min）待反应6h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入3500mLDMF洗涤2遍，每次洗涤1min左右抽掉DMF后，加1500mLDBLK(20%哌啶/DMF溶液)脱保护2次，时间分别是5min+15min，两次脱保护之间用1500mLDMF洗涤一次，时间约1min，抽掉。待脱完保护后按照如下顺序洗涤：DMF×1次，DMF×1次，MeOH×1次，DCM×1次，DMF×1次，每次洗涤试剂用量约1500mL，洗涤时间为1min，洗完后抽掉。

茚三酮检测显阳性，称取297.3±0.1g Fmoc-Gly-OH和162.1±0.1gHOBt置烧杯中，加入1500mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入185.8mLDIC于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起。30℃反应，时间2-3h。待反应2h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入1500mLDMF洗涤2遍，每次洗涤1min左右。

（2）上述步骤结束后，根据醋酸去氨加压素从C端到N端的序列，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Trt)-OH，得到Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(Pbf)-Gly–RinK Amide Resin。

（3）称取508.0g I₂溶解于2000mLDMF/MeOH体积比为1/1的混合溶液中，30℃反应约2.5h，反应结束后抽掉溶液。使用DMF洗涤4遍后，再用1500mLMeOH收缩两次，每次10min。将肽树脂从反应釜中转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到干燥的醋酸去氨加压素肽树脂2007.5g。

（4）将2007.5g肽树脂缓缓加入到裂解液（TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5）中，待全部加完后计时。室温裂解2h，待裂解时间结束后，用砂芯漏斗将树脂滤掉，得到含多肽的裂解液。准备预先冰冻的无水乙醚，将含多肽的裂解液缓缓加入到的冰乙醚中，会有白色的固体粗肽析出，静置30min后离心，用冰的无水乙醚洗涤，离心共3次得到粗肽，再将湿品移至真空干燥箱中干燥，得到干燥后的粗肽。

（5）将上述所得的粗肽用乙腈：纯水=1：9的溶液溶解（溶解浓度4mmol/L），充分搅拌至全溶解，再用合适大小孔径的滤膜过滤，滤液用反相高效液相制备柱纯化。纯化制备流动相为，A相：磷酸盐缓冲液（称取180g磷酸氢二钾和82g磷酸二氢钾，用20L水溶解，用磷酸调PH至6.5）；B相：磷酸盐缓冲液（称取140g磷酸氢二钾和61g磷酸二氢钾，用10L水溶解，用磷酸调PH至6.5）-乙腈（50：50）；一次分离上样量：15g左右；流速400mL/min；检测波长：220nm；柱温：室温；梯度洗脱条件：A相70-60%，B相30-40%。收集纯度99.0%以上，单杂小于0.5%的样品。重复上述操作，处理剩余全部粗品溶液，合并收集物，混合均匀。HPLC检测目的肽纯度，然后根据HPLC分析定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈，准备进行转盐。对于峰前、峰后后样品，按上述步骤多次纯化得到合格品。最后再用醋酸铵和醋酸转盐、减压浓缩、冻干得到成品，称重为247.5g，HPLC检测纯度达到99.4%，最大单杂为0.16%，总收率达到46.3%。

实施例2：一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，包括以下步骤：

（1）称取350.0g的Am Resin(2.0mmol/g)倒入反应釜中，加入4000mLDCM溶涨约10min。待溶涨时间截止后，抽掉DCM，加入已经冰浴活化完成的反应液（453.3gRink Amide AM-Linker，136.2gHOBt冰浴2min，然后再加入200.4mLDIC于溶液中活化5min）待反应6h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入2000mLDMF洗涤2遍，每次洗涤1min左右抽掉DMF后，加入2000mLDBLK(20%哌啶/DMF溶液)脱保护2次，时间分别是5min+15min，两次脱保护之间用200DMF洗涤一次，时间约1min，抽掉。待脱完保护后按照如下顺序洗涤：DMF×1次，DMF×1次，MeOH×1次，DCM×1次，DMF×1次，每次洗涤试剂用量约2000mL，洗涤时间为1min，洗完后抽掉。茚三酮检测显阳性，称取624.3±0.1g Fmoc-Gly-OH、770.0gHBTU、283.5±0.1gHOBt置烧杯中，加入2000mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入465mLNMM于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使树脂被均匀吹起。30℃反应，时间2-3h。待反应2h后，取样茚三酮检测，若显阴性，表明偶联反应完全，可抽掉反应液，加入2000mLDMF洗涤2遍，每次洗涤1min左右。

（2）上述步骤结束后，根据醋酸去氨加压素从C端到N端的序列，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，依次为偶联所有的氨基酸，Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-D-Arg(Pbf)-Gly–RinK Amide Resin。

（3）称取1422.4gI₂溶解于4000mLDMF/MeOH体积比为1/1的混合溶液中，30℃反应约2.5h，反应结束后抽掉溶液。使用DMF洗涤4遍后，再用4500mLMeOH收缩两次，每次10min。将肽树脂从反应釜中转移至真空干燥箱中干燥至恒重，得到干燥的醋酸去氨加压素肽树脂2496.3g。

（4）将2496.3g肽树脂缓缓加入到裂解液（TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5）中，待全部加完后计时。室温裂解2h，待裂解时间结束后，用砂芯漏斗将树脂滤掉，得到含多肽的裂解液。准备预先冰冻的无水乙醚，将含多肽的裂解液缓缓加入到的冰乙醚中，会有白色的固体粗肽析出，静置30min后离心，用冰的无水乙醚洗涤，离心共3次得到粗肽，再将湿品移至真空干燥箱中干燥，得到干燥后的粗肽。

（5）将上述所得的粗肽用乙腈：纯水=2：8的溶液溶解（溶解浓度3mmol/L），充分搅拌至全溶解，调pH，氧化。溶液过滤后，滤液用反相高效液相制备柱纯化。纯化制备流动相为，A相：1‰TFA（量取20mLTFA溶解于20L水，摇匀）；B相：乙腈；一次分离上样量：15g左右；流速400mL/min；检测波长：220nm；柱温：室温；梯度洗脱条件：A相90-70%，B相10-30%。收集纯度99.0%以上，单杂小于0.5%的样品。重复上述操作，处理剩余全部粗品溶液，合并收集物，混合均匀。HPLC检测目的肽纯度，然后根据HPLC分析定量，旋转蒸发仪减压（33℃）旋去大部分乙腈，准备进行转盐。对于峰前、峰后后样品，按上述步骤多次纯化得到合格品。最后再用醋酸铵和醋酸转盐、减压浓缩、冻干得到成品，称重为343.5g，HPLC检测纯度达到99.1%，最大单杂为0.18%，总收率达到45.9%。

本发明的相关缩写具有如下含义：

tBu：叔丁基；DBLK：20%哌啶/DMF（V/V）；DCM：二氯甲烷；DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺； DMF：N,N-二甲基甲酰胺； Fmoc：9-芴甲氧羰基； HOBt：1-羟基苯并三氮唑； Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基； TFA：三氟乙酸；HBTU: 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐;

Fmoc-Gly-OH：芴甲氧羰基甘氨酸；

Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH：N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-D-精氨酸；

Fmoc-Pro-OH：芴甲氧羰基 -L-脯氨酸；

Fmoc-Cys(Trt)-OH：芴甲氧羰基-三苯甲基-L-半胱氨酸；

Fmoc-Asn(Trt)-OH：芴甲氧羰基-三苯甲基-L-天冬酰胺；

Fmoc-Gln(Trt)-OH：芴甲氧羰基-三苯甲基-L-谷氨酰胺；

Fmoc-Phe-OH：芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；

Fmoc-Tyr(tBu)-OH：芴甲氧羰基-叔丁基-L-缬氨酸；

Mpr(Trt)-OH：3-三苯甲基硫代丙酸

本发明中，Kaiser检测法主要采用的试剂为茚三酮，反应呈紫色或蓝色表明树脂上有游离的氨基存在，表面偶联未完全。

综上，本发明卡贝缩宫素的合成工艺，其以AM Resin树脂作为起始载体，Fmoc- linker缩合后得到功能基树脂载体有效的降低了成本，使用Fmoc/tBu固相逐步合成策略完成粗肽合成，工艺简单，操作容易上手且易于放大生产，使用碘固相环化工艺步骤少，操作简便，减少了其它固相环化在脱保护时的不必要损失，生产周期短，大大降低了液体试剂使用量，减少了对环境的污染。可实现单批次几百克至千克级的生产规模。每步的氨基酸缩合率能达到99.5%以上，成品纯度可达到99.0%以上，最终产品的总收率可达到68%以上，且整个生产的过程采用的是常规试剂原料，无剧毒物质，安全环保。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：

步骤四、根据肽序，按照Fmoc/tBu固相逐步合成策略，重复以上脱Fmoc保护和偶联操作步骤，从C端到N端开始再依次偶联Fmoc-D-Arg(pbf) -OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Cys(Trt) -OH、 Fmoc-Asn(Trt) -OH、 Fmoc-Gln(Trt) -OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Tyr(tBu) -OH、Mpr(Trt) -OH，期间依次脱去Fmoc-保护基团，直至完成线肽树脂的合成；

2. 根据权利要求1所述的醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特性在于：所述步骤二和步骤四中Fmoc保护的氨基酸的投料量为与其进行的偶联的树脂的摩尔数的2～4倍。

3. 根据权利要求1所述的醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特征在于：所述步骤六中裂解液由TFA、TIS、H₂O按照95：2.5：2.5体积份比例混合形成。

4. 根据权利要求1所述的醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特征在于：所述步骤八中A相选择磷酸盐缓冲液，B相为磷酸盐缓冲液-乙腈。

5. 根据权利要求1所述的醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特征在于：所述步骤二和步骤四中采用DIC/HOBt缩合体系。

6. 根据权利要求1所述的醋酸去氨加压素的固相制备工艺，其特征在于：所述干燥后的粗肽的溶解浓度2.5~3.5mmol/L。