CN103275207A

CN103275207A - 一种制备奈西立肽的方法

Info

Publication number: CN103275207A
Application number: CN2013100948669A
Authority: CN
Inventors: 肖庆; 唐洋明; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-03-22
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-03-22
Also published as: CN103275207B

Abstract

本发明涉及一种制备奈西立肽的方法，其操作简单、成本低、制备周期短和/或总收率高（＞25%），有利于大规模生产。所述制备奈西立肽的方法包括：制备5个片段，将所述片段依次偶联得到线型奈西立肽，然后经氧化得到奈西立肽，所述方法任选地包括纯化奈西立肽的步骤。

Description

一种制备奈西立肽的方法

技术领域

本发明涉及一种新的制备奈西立肽的方法。

背景技术

奈西立肽(Nesiritide)，由Suhoh于1988年从猪脑组织中分离出来，是内源性利钠家族的重要成员之一，主要由心脏分泌。其结构与心钠素相似，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素分泌等作用，主要用于治疗心力衰竭等，适用于患有休息或轻微活动时呼吸困难的急性失代偿心力衰竭患者的静脉治疗，其效果较好且副作用小，是一种很有市场前景的多肽药物。

奈西立肽的结构为：

关于奈西立肽的制备方法，国内外均有报道，US5114923以一种基因工程的方法制备奈西立肽，US20080287650报道以固相合成的方法制备奈西立肽。

中国专利CN200910104860.9和CN200910104861.3报道了一种固相制备和纯化的方法；CN201110171152.4报道了一种Ser-Ser-Ser-Ser片段的方法制备奈西立肽。

发明内容

在长肽合成中现有的固相合成容易产生缺省肽等副产物，大部分缺省肽性质与目的肽相似，导致难纯化、收率低。

本发明在SPPS(固相多肽合成)的基础上衍生出一种片段法固相制备奈西立肽的合成方法。

奈西立肽由32个氨基酸残基组成，因此存在海量的可能片段和偶联顺序。

1 5 10 15

H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ile-

20 25 30

Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His-OH

对此，本发明经过对不同片段偶联策略的实验之后，得到以下片段适合制备奈西立肽：序列(1-7)、序列(8-12)、序列(13-18)、序列(19-25)、序列(26-32)。

本发明提供一种制备奈西立肽的方法，包括以下步骤：

1)制备5个片段：

片段1，即序列(26-32)，H-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-His(Trt)-载体树脂，

片段2，即序列(19-25)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH，

片段3，即序列(13-18)，Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Pbf)-Ile-OH，

片段4，即序列(8-12)，Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH，和

片段5，即序列(1-7)，Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-OH；

2)将片段2和片段1偶联得到肽树脂I，即Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-His(Trt)-载体树脂；

3)将片段3和肽树脂I偶联得到肽树脂II，即Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-His(Trt)-载体树脂；

4)将片段4和肽树脂II偶联得到肽树脂III，即Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-His(Trt)-载体树脂；

5)将片段5和肽树脂III偶联得到肽树脂IV，即H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln(Trt)-Gly-OH-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Pbf)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-His(Trt)-载体树脂；

6)将肽树脂IV裂解得到线型奈西立肽；和

7)将线型奈西立肽氧化得到奈西立肽，

其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连。

优选地，本发明方法还包括纯化奈西立肽的步骤。

本发明制备奈西立肽的方法通过固相合成肽片段，肽片段在固相上逐步偶联而制备奈西立肽，其操作简单、成本低、制备周期短和/或总收率高(＞25％)，有利于大规模生产。其中，由本发明方法制得的中间体的纯度高，后处理简单，有利于纯化，最终产品纯度高。

具体实施方式

对本发明中所用缩写及其含义说明如下：

本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。

本文中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。

本发明中的宽泛的、优选的、更优选的、和最优选的定义和范围可以相互组合。

本发明提供一种制备奈西立肽的方法，包括以下步骤：

1)制备5个片段：

片段2，即序列(19-25)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH，

片段4，即序列(8-12)，Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH，和

6)将肽树脂IV裂解得到线型奈西立肽；

7)将线型奈西立肽氧化得到奈西立肽，

优选地，本发明方法还包括纯化奈西立肽的步骤。

本发明中“肽”是指类似地通过多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的偶联产物。

对所述载体树脂无特别限定，只要其具有可与物质中的羧基进行反应的活性位点且不与所述物质中的其他基团反应即可。所述载体树脂优选为2-CTC树脂或王树脂两类，树脂替代度为0.2-1.2mmol/g，优选为0.5-1.1mmol/g，更优选为0.6-1.0mmol/g。

本发明所用王树脂类的结构如下：

所用2-CTC树脂类的结构如下：

其中

代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。

上述两种树脂均可商购得到(天津南开和成科技有限公司)或按文献已知的方法制备。优选地，所述载体树脂为2-CTC树脂。

在一个具体实施方案中，可根据树脂的用量、反应前的替代度以及所需的反应后的替代度来选择Fmoc-氨基酸-OH的用量，通常为树脂上可与氨基酸偶联的官能团的摩尔数的1-5当量，优选2-4当量，更优选2.5-3.5当量，其中树脂上可与氨基酸偶联的官能团摩尔数为树脂重量与替代度的乘积。

所述溶剂为常用于此目的的溶剂，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选DMF、DCM，或DMF和DMSO的混合液(例如，二者体积比为1∶1，用于步骤1)-5))。

优选地，步骤1)的制备片段1的反应温度在-30℃至0℃，优选-30℃至-20℃。

优选地，将步骤1)-5)中物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA或DIPCDI。

偶联制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的Fmoc固相合成方法来实现，例如可以参见文献Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，W.C.Chan，Peter D.White著，March2，2000(ISBN-10：0199637245)，英国Oxford University Press。

其中在氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH偶联至载体树脂上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤，以避免其在下一步偶联反应中与另外的待偶联物质反应形成副产物，以及除去所加入的封闭液的步骤。当所述载体树脂为2-CTC树脂时，所加入的封闭液优选为体积比DIPEA∶甲醇∶DCM＝1∶2∶17的混合液；当所述载体树脂为王树脂时，所加入的封闭液优选为摩尔比为1∶1的醋酐和吡啶。

偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。

偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为DIPCDI、A、或其结合，或者为DIPEA、A、B或其结合，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一种；例如，步骤1)中的偶联剂为HOBt/DIC、PyBOP/HOBt，或TBTU/HOBt；步骤2)-5)中的偶联剂为HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA，或TBTU/HOBt/DIPEA，优选TBTU/HOBt/DIPEA。

所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。

此外，每种物质进行偶联反应的时间通常为1-6小时，优选2-5小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行；温度优选为室温(指20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行。

在偶联过程中，所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。

脱除Fmoc的试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选DBLK(即20％哌啶/DMF)。

脱保护反应时间通常为5-30分钟，优选10-20分钟；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行；温度优选为室温(指20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行

所述裂解优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的温度和压力下进行。

步骤1)中的裂解试剂为弱酸，如TFA或TFE和DCM的混合物，其中TFE∶DCM的体积比为1∶4。

步骤6)中的裂解液为TFA、苯酚、苯甲硫醚(PhSMe)、乙二硫醇(EDT)、水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA体积比为80-85％，苯酚的体积比1-5％、苯甲硫醚的体积比1-5％、乙二硫醇的体积比1-5％、水的体积比1-5％。

步骤7)中的溶剂为水和乙腈的混合液或是水和甲醇的混合液，优选水和乙腈的1∶1的混合液。

优选地，制备奈西立肽化合物的方法还包括纯化奈西立肽的步骤。纯化可采用快速薄层色谱法等常规用于纯化奈西立肽的方法进行。

本发明中，优选地，纯化通过重结晶方法而进行，即通过用溶剂溶解奈西立肽，然后析出奈西立肽的晶体而实现。

在一个具体实施方案中，纯化奈西立肽的步骤通过用良性溶剂溶解奈西立肽，然后加入不良溶剂析出奈西立肽的晶体而实现。此处“良性溶剂”是指在室温和常压下对奈西立肽的溶解度大于90重量％、优选大于95重量％、更优选大于99重量％的溶剂；“不良溶剂”是指在室温和常压下对奈西立肽的溶解度小于10重量％、优选小于5％，更优选小于1％的溶剂。良性溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，或其任意结合，但不限于此，更优选为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯的单一溶剂。不良溶剂优选为正己烷、水、醚，或其任意结合，但不限于此，更优选为正己烷、水或醚的单一溶剂。

重结晶优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的压力下进行。重结晶可使用常规用于此目的所有设备而实现。

优选地，纯化通过反相高压液相纯化、冻干得到奈西立肽，纯度大于99％。

以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。

实施例一：片段1(序列(26-32))

1.Fmoc-His(Trt)-CTC树脂制备

取2-CTC树脂树脂10g(sub＝0.8mmol/g)，加入到反应柱中，用干燥的二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟以上，环境温度控制在-30℃至-20℃。称取4.9gFmoc-His(Trt)-OH，用DCM溶解后冰浴条件下加1.6gDIPEA，活化5分钟后加入到反应柱中，环境温度控制在-30℃至-20℃，40分钟后反应结束，树脂分别用DMF洗涤三次，用封闭液(DIPEA∶甲醇∶DCM＝1∶2∶17v∶v)封闭三次，每次3min。封闭液体体积按4.0ml/克树脂计算。再用加入适量的甲醇洗涤3次，每次10分钟，减压干燥得到11.2gFmoc-His(Trt)-2CTC树脂，其替代度为0.18mmol/g。

2.片段1的制备

称取替代度为0.18mmol/g的Fmoc-His(Trt)-2CTC树脂11.2g(2mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将6.5g Fmoc-Arg(Pbf)-OH，1.6g HOBt，2.1ml DIC溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段1(序列(26-32))的顺序，依次完成Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-ys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH最后用DBLK脱除Fmoc保护，得到片段1。

实施例二：片段2(序列(19-25))的制备

1.片段2(序列(19-25))肽树脂的制备

称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂12g(6mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取8.9g Fmoc-GlyOH用DMF溶解，冰水浴下加入10mL DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入10mL无水甲醇封闭1小时，用DMF洗涤6次。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。

将11.5g Fmoc-Ser(tBu)-OH，4.9g HOBt，6.1ml DIC溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段2(序列(19-25))的顺序，依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到片段2(序列(25-21))15.2g。

2.裂解片段2(序列(19-25))

称取片段2(序列(19-25))15.2g，加入至250ml烧瓶中。配制裂解试剂150ml(体积比，TFE∶DCM＝1∶4)，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应2h。反应结束，过滤树脂，收集滤液。将滤液体积旋蒸至＜25体积％后，滴加至1500ml沉淀试剂中(体积比，正己烷∶乙醚＝1∶4)，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到片段2(序列(19-25))，将粗品溶于水后冻干，控制水分在2％以下，得8.2g片段2(序列(19-25))，纯度93.5％。

按上述方法制备片段3、片段4、片段5。

由上述方法制得的冻干后的片段2-5纯度均大于90％，直接用于下一步反应。

实施例三：肽树脂I的制备

称取8.2g片段2(序列(19-25))、3.8g HBTU、1.6g HOBt，用DMF和DMSO为1∶1的混合液溶解后加入3.4ml DIPEA，混合液加入实施例一固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂I。

实施例四：肽树脂II的制备

称取9.8g片段3、5.2gPyBOP、3.8gHOBt，用DMF和NMP为1∶1的混合液溶解后加入3.4ml DIPEA，混合液加入实施例三中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂II。

实施例五：肽树脂III的制备

称取7.5g片段4、5.2gPyBOP、3.8gHOBt，用DMF和DMSO为1∶1的混合液溶解后加入3.4ml DIPEA，混合液加入实施例四中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，得到肽树脂III。

实施例六：肽树脂IV的制备

称取9.4g片段5、5.2gPyBOP、3.8gHOBt，用DMF和DMSO为1∶1的混合液溶解后加入3.4ml DIPEA，混合液加入实施例五中肽树脂固相反应柱中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到22.5g肽树脂IV。

实施例七：肽树脂IV裂解得到线型奈西立肽

将实施例六中的22.5g肽树脂IV加入到500ml烧瓶中，配制裂解试剂225ml(体积比，TFA∶DET∶PhSMe∶PHOH∶H₂O＝80∶5∶5∶5∶5)，将裂解试剂倒入烧瓶中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。滴加至3000ml乙醚试剂中，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到7.2g粗品奈西立肽，纯度75.4％。

实施例八：线型奈西立肽氧化

将实施例3中得到的7.2g线型奈西立肽用375ml水和375ml乙腈搅拌溶解，将pH调至8.5，缓慢通入氧气，室温氧化5个小时以上，采用HPLC监控直至氧化完全。反应完全后减压浓缩得到奈西立肽粗品的水溶液。

实施例九：粗品奈西立肽经纯化得到纯品奈西立肽

将实施例八中的奈西立肽粗品水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤。采用RE-HPLC进行纯化，转盐、冻干得到2.1g奈西立肽纯品，总收率30.0％，纯度大于99％。

虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。

Claims

1.一种制备奈西立肽的方法，包括以下步骤：

1)制备5个片段：

片段2，即序列(19-25)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-OH，

片段4，即序列(8-12)，Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Phe-Gly-OH，和

6)将肽树脂IV裂解得到线型奈西立肽；和

7)将线型奈西立肽氧化得到奈西立肽，

2.权利要求1的方法，还包括纯化奈西立肽的步骤，纯化优选通过重结晶方法或HPLC(例如反相HPLC)而进行。

3.权利要求1的方法，其中步骤1)-5)在固相反应柱中进行；且其中步骤1)中制备片段1的反应温度在-30℃至0℃，优选-30℃至-20℃，步骤2)-7)均在室温和常压下进行；所述树脂载体为2-CTC树脂或王树脂，优选2-CTC树脂；所述树脂的替代度为0.2-1.2mmol/g，优选为0.5-1.1mmol/g，更优选为0.6-1.0mmol/g。

4.权利要求1的方法，其中步骤1)中的偶联剂为HOBt/DIC、PyBOP/HOBt，或TBTU/HOBt；步骤2)-5)中的偶联剂为HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIPEA，或TBTU/HOBt/DIPEA，优选TBTU/HOBt/DIPEA。

5.权利要求1的方法，其中步骤1)-5)中偶联反应的时间通常为1-6小时，优选2-5小时。

6.权利要求1的方法，其中步骤1)-6)中脱除Fmoc的试剂为DBLK；脱保护反应时间通常为5-30分钟，优选10-20分钟。

7.权利要求1的方法，其中在偶联之前，将各步骤的肽树脂中的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行；活化剂优选为DIPEA或DIPCDI。

8.权利要求1的方法，其中步骤1)中的裂解试剂为弱酸，如TFA或TFE，或者为TFE和DCM的混合物，其中TFE∶DCM的体积比为1∶4；步骤6)中的裂解液为TFA、苯酚、苯甲硫醚、乙二硫醇、水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA体积比为80-85％，苯酚的体积比1-5％、苯甲硫醚的体积比1-5％、乙二硫醇的体积比1-5％、水的体积比1-5％。

9.权利要求1的方法，其中步骤1)-5)中的溶剂为DMF和DMSO的混合液，二者体积比为1∶1；步骤7)中的溶剂为水和乙腈的混合液或是水和甲醇的混合液，优选水和乙腈的体积比1∶1的混合液。

10.权利要求1的方法，其中步骤1)中在氨基酸Fmoc-His(Trt)-OH偶联至载体树脂上之后，还包括向其中加入一种封闭液除去树脂中过量的未反应基团的步骤；当所述载体树脂为2-CTC树脂时，所加入的封闭液优选为体积比DIPEA∶甲醇∶DCM＝1∶2∶17的混合液；当所述载体树脂为王树脂时，所加入的封闭液优选为摩尔比为1∶1的醋酐和吡啶。