CN104072603A - 一种合成替度鲁肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成替度鲁肽的方法。本发明所述方法按照替度鲁肽肽链N端至C端的氨基酸顺序，先合成2-33氨基酸多肽片段，然后和N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His或其盐进行偶联合成得到替度鲁肽，其中所述X保护基为Boc保护基或Trt保护基，所述Y保护基为Trt保护基、Bum保护基、mtt保护基、Boc保护基或者mmt保护基。本发明首先按照替度鲁肽肽序合成2-33片段，然后再将2-33多肽片段与由特定保护基保护的His合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成His的消旋杂质含量较高，替度鲁肽纯度较低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成替度鲁肽的方法。
背景技术
替度鲁肽，英文名为Teduglutide，一种胰高血糖素样肽2（GLP-2）类似物，一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。该药增加了这些细胞的数量，后者可增加小肠吸收、减少腹泻。欧洲商品名为Revestive，在美国商品名为Gattex。在临床上用于治疗成人短肠综合征。该药成为首个被推荐应用于这种罕见却使患者极其虚弱疾病的药物，结构式和肽序如下：
在替度鲁肽的现有合成方法中，主要是采用纯固相顺序偶联的方法，如专利CN10182087A，其以wang树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到替度鲁肽。但是该专利在合成N末端的His时，采用Fmoc固相常规的偶联原料如Fmoc-His(Trt)-OH及常用偶联方法，造成His的消旋杂质，并且杂质通过纯化方法难以去除，导致替度鲁肽产品纯度的降低而杂质D-His-替度鲁肽含量较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成替度鲁肽的方法，使得本发明所述方法能够提高其纯度，降低杂质D-His-替度鲁肽含量。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成替度鲁肽的方法，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、Asp侧链上、Ser侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Gln侧链上、Trp侧链上和Lys侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽片段树脂；
步骤2、所述多肽片段树脂脱N端保护基，与N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐在双试剂偶联体系和有机碱的作用下进行偶联反应，得到替度鲁肽树脂；
其中，所述X保护基为Boc保护基或Trt保护基，所述Y保护基为Trt保护基、Bum保护基、Boc保护基、mtt保护基或者mmt保护基；所述双试剂偶联体系由A试剂和B试剂组成，A试剂选自HBTU、HATU、PyBOP、PyAOP中的一种，B试剂选自HOAt、HOBt中的一种，所述有机碱为DIPEA或TMP；
步骤3、将替度鲁肽树脂脱除N端X保护基后裂解，获得替度鲁肽粗品，经RP-HPLC纯化后获得替度鲁肽纯品。
其中，作为优选所述树脂为CTC树脂或者Wang树脂。在步骤1的合成中，除本发明所限定的保护基外，也可以采用其他合适的保护基对氨基酸加以保护。
作为优选，步骤2中所述A试剂为HATU，所述B试剂为HOAt，所述有机碱为TMP。
在本发明所述方法中，首先按照替度鲁肽肽序合成2-33片段，然后再将2-33多肽片段与由特定保护基保护的His合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成His的消旋杂质，最终导致替度鲁肽纯度降低杂质和D-His-替度鲁肽含量较高的问题。以替度鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-OH
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号2-33的多肽序列。本发明在步骤1中固相合成的多肽片段树脂是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其N端、Asp侧链上、Ser侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上、Gln侧链上和Lys侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂。在本技术领域可以通过保护氨基酸合成原料进行合成。
本发明所述保护基是在氨基酸合成领域中用以保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。在本技术领域，对于氨基酸侧链需要保护的基团、侧链结构以及如何偶联保护基为本领域技术人员公知。本发明中对偶联有保护基的氨基酸表示形式也是本领域常用表示形式，为本领域技术人员所熟知，如Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc为氨基酸N端保护基，括号里的OtBu为Asp侧链保护基，本发明其他保护氨基酸合成原料均可参照此说明。
作为优选方案，步骤1具体为：
步骤1.1、Fmoc-Asp（OtBu）-OH在HOBt/DMAP/DIC三试剂偶联体系或者有机碱DIPEA作用下与树脂进行偶联反应得到Fmoc-Asp（OtBu）-树脂；
步骤1.2、Fmoc-Asp（OtBu）-树脂脱除Fmoc保护基得到H-Asp（OtBu）-树脂，Fmoc-Thr（tBu）-OH在HOBt/DIC双试剂偶联体系作用下与H-Asp（OtBu）-树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr（tBu）-Asp（OtBu）-树脂；
步骤1.3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Arg（pdf）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH和Fmoc-Gly-OH按照步骤1.2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-树脂，即多肽片段树脂；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Trt、Boc、pbf为氨基酸侧链保护基。
在步骤1的优选方案基础上，进一步优选，步骤1.1所述Fmoc-Asp（OtBu）-OH、HOBt、DMAP、DIC的摩尔比为1:1.2:0.1:1.2，所述Fmoc-Asp（OtBu）-OH和DIPEA的摩尔比为1:3，步骤1.2和1.3所述各氨基酸与HOBt、DIC的摩尔比为1:1.2:1.2。
在步骤1固相合成多肽片段树脂的优选方案中，所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应（主链氨基和羧基的缩合反应）进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端Fmoc保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK脱除N端保护基。由于不断有氨基酸和树脂偶联，所合成的多肽片段树脂是不断变化的，作为优选，每个待偶联的保护氨基酸合成材料与之前已经合成的多肽片段树脂的摩尔比为2-3:1，此优选比例适用于本发明所有方案中。
作为优选，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐与A试剂、B试剂、有机碱的摩尔比为1:1:1.2:2。
作为优选，所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His为Trt-His（Trt）-OH或Boc-His（Boc）-OH，所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐为Boc-His（Boc）-OH.DCHA。
在步骤3的裂解步骤中，本发明优选为采用体积比TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:Phenol为80-85:2-5:2-5:2-5:0-3:0-2的混合裂解液裂解。
在本发明技术方案中，所有偶联反应优选以NMP、DMF、DCM中的一种或两种为溶剂，其中，当以NMP、DMF、DCM中的两种为溶剂时，两种溶剂的体积比优选为1:1。此外，本发明所有偶联反应的反应温度均优选为0-30℃。
在本发明所述方法步骤3中，作为优选方案，所述RP-HPLC纯化具体为：
将替度鲁肽粗品用水溶解后，采用RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分得到替度鲁肽纯品。
在临床应用中，替度鲁肽本身不太稳定，需要以替度鲁肽醋酸盐形式存在，故本发明还包括将替度鲁肽精品用RP-HPLC系统转盐步骤，具体为：
将替度鲁肽纯品溶液采用RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到替度鲁肽醋酸盐。
由本发明所述方法合成的替度鲁肽经SCX-HPLC检测，纯度为99%以上，杂质D-His-替度鲁肽在0.2%左右，而采用常规原料和合成方法合成的替度鲁肽，纯度为94.7%，杂质D-His-替度鲁肽在4%左右。
由以上技术方案可知，本发明首先按照替度鲁肽肽序合成2-33片段，然后再将2-33多肽片段与由特定保护基保护的His合成原料在特定的偶联体系下偶联获得替度鲁肽，解决了现有合成方法中由于合成原料以及偶联方法的不当造成His的消旋杂质含量较高，替度鲁肽纯度较低的问题。
附图说明
图1所示为本发明合成方法合成的替度鲁肽SCX-HPLC峰图；
图2所示为采用Fmoc-His（Trt）-OH为原料以常规方法合成的替度鲁肽SCX-HPLC峰图。
具体实施方式
本发明公开了一种合成替度鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用wang树脂和2-CTC树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
表1英文缩写释义
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取4.94g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（12mmol）、1.95g HOBt（14.4mmol）和0.15g DMAP（0.12mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.25ml DIC（14.4mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.100mmol/g。
实施例2：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50ml DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.198mmol/g。
实施例3：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取19.78g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（48mmol）、7.78g HOBt（57.6mmol）和0.58g DMAP（0.48mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入9.00ml DIC（57.6mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.402mmol/g。
实施例4：替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的CTC树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取1.98g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（4.8mmol）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入1.67ml DIPEA（9.6mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入0.83mlDIPEA（4.8mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入16.2ml CH3OH（400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。检测替代度为0.098mmol/g。
实施例5：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的CTC树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取3.96g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（9.6mmol）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入3.34ml DIPEA（19.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入1.67mlDIPEA（9.6mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入16.2ml CH3OH（400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。检测替代度为0.210mmol/g。
实施例6：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的CTC树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取7.91g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（19.2mmol）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入6.68ml DIPEA（38.4mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入3.34mlDIPEA（9.6mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入16.2ml CH3OH（400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。检测替代度为0.402mmol/g。
实施例7：替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的合成
称取替代度为0.198mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂101.0g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取23.85g Fmoc-Thr(tBu)-OH（60mmol），9.73g HOBt（72mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成2-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（2-33片段）-Wang树脂188.2g。
实施例8：替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的合成
称取替代度为0.220mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂90.9g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK（20%哌啶/DMF）脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取23.85g Fmoc-Thr(tBu)-OH（60mmol），9.73g HOBt（72mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成2-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（2-33片段）-CTC树脂171.9g。
实施例9：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段Wang树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例10：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例11：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段Wang树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加20.86ml DIPEA（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例12：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加20.86ml DIPEA（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例13：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DCM溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例14：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DCM（1:1）溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例15：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在25℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例16：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DCM溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在25℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例17：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DCM（1:1）溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在25℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例18：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP/DCM（1:1）溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在25℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例19：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。
实施例20：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DCM溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例21：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例22：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DMF(1:1)溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例23：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.75g HBTU（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DMF(1:1)溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例24：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、31.22g PyBOP（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DMF(1:1)溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例25：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、31.28g PyAOP（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml DMF/DMF(1:1)溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在30℃环境下反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例26：Boc-His(Boc)-OH.DCHA与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的预活化法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取32.22g Boc-His(Boc)-OH.DCHA（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，用500ml DMF溶解，冰水浴下加入15.81ml TMP（120mmol）活化5分钟，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点.如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例27：Boc-His(Boc)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取21.32g Boc-His(Boc)-OH、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。
实施例28：Boc-His(Trt)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取29.86g Boc-His(Trt)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例29：Boc-His(Bum)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取20.49g Boc-His(Bum)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例30：Boc-His(mmt)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取31.66g Boc-His(mmt)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例31：Boc-His(mtt)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取30.70g Boc-His(mtt)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例32：Trt-His(Trt)-OH与替度鲁肽2-33片段肽树脂（多肽片段树脂）的原位法合成
称取替度鲁肽2-33片段CTC树脂15mmol加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取38.39g Trt-His(Trt)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加500ml NMP溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
实施例33：替度鲁肽肽树脂的裂解
取实施例9～32中的任意肽树脂100g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O：Phenol=80:5:5:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽。
实施例34：替度鲁肽肽树脂的裂解
取实施例9～32中的任意肽树脂100g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O：Phenol=85:4:5:4:2:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽。
实施例35：替度鲁肽肽树脂的裂解
取实施例9～32中的任意肽树脂100g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O：Phenol=81.5:5:5:5:2.5:1（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽。
实施例36：替度鲁肽纯化以及醋酸盐的制备
称取实施例9～32中任意20.0g替度鲁肽粗肽用2000ml水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到替度鲁肽纯品醋酸盐》4.8g，RP-HPLC纯度》98.5%。采用SCX-HPLC方法检测其中D-His-替度鲁肽《0.3%。
实施例37：本发明所述方法制备替度鲁肽纯品醋酸盐
称取替代度为0.5mmol/g的CTC树脂1000g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取98.88g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（240mmol）、溶于DMF溶液，冰水浴下加入83.5ml DIPEA（480mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入41.7mlDIPEA（240mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入405.2ml CH3OH（400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂1080.7。检测替代度为0.199mmol/g。
称取替代度为0.199mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂1080.4g（215mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟取256.4g Fmoc-Thr(tBu)-OH（645mmol），104.6g HOBt（774mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入121.0ml DIC（774mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成2-33片段的偶联，取346.4gBoc-His(Boc)-OH.DCHA（645mmol）、245.1g HATU（645mmol）、105.3g HOAt（774mmol）加入树脂中，加6000ml NMP/DCM（1:1）溶液，搅拌反应5min后，滴加169.9ml TMP（1290mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽肽树脂2049.3g。
将肽树脂2049.3g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O：Phenol=81.5:5:5:5:2.5:1（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽831.9g，重量收率为103.1%，粗肽纯度为59.7%。
将替度鲁肽粗肽经过纯化转盐，最终得到替度鲁肽纯品醋酸盐198.6g，重量收率为24.6%，采用SCX-HPLC检测纯度为99.1%，D-His-替度鲁肽为0.21%。HPLC图谱见图1。
实施例38：常规方法固相顺序制备替度鲁肽精肽醋酸盐
称取替代度为0.199mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂100.5g（20mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟取23.85g Fmoc-Thr(tBu)-OH（60mmol），9.73g HOBt（72mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成2-33片段的偶联，取37.18gFmoc-His(Trt)-OH（60mmol）、22.81g HATU（60mmol）、9.80g HOAt（72mmol）加入树脂中，加6000ml NMP/DCM（1:1）溶液，搅拌反应5min后，滴加15.81ml TMP（120mmol），在0℃环境下反应3h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽肽树脂185.9g。
将肽树脂185.9g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O：Phenol=81.5:5:5:5:2.5:1（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽76.52g，将替度鲁肽粗肽经过纯化转盐，最终得到替度鲁肽纯品醋酸盐17.88g，重量收率为23.8%，采用SCX-HPLC检测纯度为94.7%，D-His-替度鲁肽为4.05%。HPLC图谱见图2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种合成替度鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、Asp侧链上、Ser侧链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Gln侧链上、Trp侧链上和Lys侧链上偶联有保护基且在C端偶联有树脂的多肽片段树脂；
步骤2、所述多肽片段树脂脱N端保护基，与N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐在双试剂偶联体系和有机碱的作用下进行偶联反应，得到替度鲁肽树脂；
其中，所述X保护基为Boc保护基或Trt保护基，所述Y保护基为Trt保护基、Bum保护基、Boc保护基、mtt保护基或者mmt保护基；所述双试剂偶联体系由A试剂和B试剂组成，A试剂选自HBTU、HATU、PyBOP、PyAOP中的一种，B试剂选自HOAt、HOBt中的一种，所述有机碱为DIPEA或TMP；
步骤3、将替度鲁肽树脂脱除N端X保护基后裂解，获得替度鲁肽粗品，经RP-HPLC纯化后获得替度鲁肽纯品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述树脂为CTC树脂或者Wang树脂。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1具体为：
步骤1.1、Fmoc-Asp（OtBu）-OH在HOBt/DMAP/DIC三试剂偶联体系或者有机碱DIPEA作用下与树脂进行偶联反应得到Fmoc-Asp（OtBu）-树脂；
步骤1.2、Fmoc-Asp（OtBu）-树脂脱除Fmoc保护基得到H-Asp（OtBu）-树脂，Fmoc-Thr（tBu）-OH在HOBt/DIC双试剂偶联体系作用下与H-Asp（OtBu）-树脂进行偶联反应得到Fmoc-Thr（tBu）-Asp（OtBu）-树脂；
步骤1.3、按照SEQ ID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys（Boc）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Arg（pdf）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH和Fmoc-Gly-OH按照步骤1.2偶联方式进行氨基酸延伸偶联，得到Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-树脂，即多肽片段树脂；
其中，所述Fmoc为氨基酸N端保护基，所述OtBu、tBu、Trt、Boc、pbf为氨基酸侧链保护基。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1.1所述Fmoc-Asp（OtBu）-OH、HOBt、DMAP、DIC的摩尔比为1:1.2:0.1:1.2。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1.1所述Fmoc-Asp（OtBu）-OH和DIPEA的摩尔比为1:3。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1.2和1.3所述各氨基酸与HOBt、DIC的摩尔比为1:1.2:1.2。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His或N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐与A试剂、B试剂、有机碱的摩尔比为1:1:1.2:2。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His为Trt-His（Trt）-OH或Boc-His（Boc）-OH，所述N端偶联有X保护基且侧链上偶联有Y保护基的His盐为Boc-His（Boc）-OH.DCHA。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3所述裂解为采用体积比TFA:PhSMe:EDT:TIS:H2O:Phenol为80-85:2-5:2-5:2-5:0-3:0-2的混合裂解液裂解。
10.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述偶联反应以NMP、DMF、DCM中的一种或两种为溶剂。
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