CN104072605B - 一种替度鲁肽的制备方法 - Google Patents
一种替度鲁肽的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及多肽药物制备方法领域，尤其涉及一种替度鲁肽制备方法。该方法以Asp‑Gly二肽及氨基酸为原料，制备第一多肽片段；合成C端多肽片段‑树脂及中间多肽片段；按照替度鲁泰肽序，在C端多肽片段‑树脂上依次偶联中间多肽片段和第一多肽片段，制得替度鲁肽树脂；取替度鲁肽树脂经裂解、纯化，即得；Asp‑Gly二肽中Gly侧链保护基为Dmb或Hmb；第一多肽片段具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；中间多肽片段为1～3个。该方法避免了五元环结构的形成，提高纯度。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物制备方法领域，尤其涉及一种替度鲁肽制备方法。
背景技术
短肠综合征（SBS）是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体无法正常吸收营养而引发一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，导致他们脱水和营养不良。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险，迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。
替度鲁肽(teduglutide)是一种胰高血糖素样肽2（GLP-2）类似物，替度鲁肽的氨基酸序列中包含有33个氨基酸，其结构如SEQ ID NO:11所示，是一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。替度鲁肽于2001年被定性为孤儿药。临床试验表明，该药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求。
目前，对替度鲁肽的合成方式主要有顺序偶联和片段偶联两种方法，其中顺序偶联是以wang树脂为载体，采用纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成，最终切割得到替度鲁肽；片段偶联则是先合成具有SEQ ID NO：2所示结构的全保护片段，然后采用纯化后的全保护片段与具有SEQ ID NO:12所示结构的片段肽树脂进行固相偶联，最终裂解得到替度鲁肽。
由于替度鲁肽的肽链较长，采用顺序偶联的方式合成会使合成的难度增大，并产生难以纯化的杂质，降低回收率。而更重要的是，替度鲁肽的N端第3～第4个氨基酸为Asp-Gly，天冬氨酸（Asp）侧链中的羧基能与酰胺键中的-H成五元环，这种五元环结构一旦形成，会在一定条件下降解开环，而在开环过程中会产生多种杂质，例如：Asp的消旋、产生α,β天冬氨酸等，造成替度鲁肽纯度的下降。研究表明，五元环结构的形成与Asp或Asn的右侧氨基酸有重大关系，而Gly由于侧链没有保护基团且空间位阻小，当Gly先于Asp偶联时最易成环的结构。因此采用顺序偶联的方式必然会使替度鲁肽的N端第3～第4个氨基酸在合成的过程中生成五元环，从而造成纯度的降低。因此，为了解决Asp-Gly片段产生降解的问题，采用片段偶联的方式先合成具有SEQ ID NO:2所示结构的全保护片段，该全保护片段即为替度鲁肽的N端第1～第4个氨基酸，其中包括Asp-Gly结构，然后对该全保护片段进行纯化，并采用纯化后的全保护片段与具有SEQ ID NO:12所示结构的片段肽树脂进行固相偶联，最终裂解得到替度鲁肽。但是，虽然在固相偶联之前已经对会产生降解杂质的全保护片段进行了纯化，不但增加了制备步骤，且无法保证其在后续的固相偶联过程中不发生再一次的降解。因此，采用这种片段方法不能从根本上解决Asp-Gly片段产生降解的问题。检测表明，以现有技术制备替度鲁肽现有技术制备的醋酸替度鲁肽的收率为20%，纯度为98.5%，其中Asp-Gly片段降解产生杂质的含量为0.2%。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种替度鲁肽的制备方法，采用Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH为偶联原料，从而解决合成过程中Asp-Gly降解的问题。
本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以Asp-Gly二肽及氨基酸为原料，制备第一多肽片段；
步骤2：合成C端多肽片段-树脂及中间多肽片段；
步骤3：按照替度鲁泰肽序，在C端多肽片段-树脂上依次偶联中间多肽片段和第一多肽片段，制得替度鲁肽树脂；
步骤4：取替度鲁肽树脂经裂解、纯化，即得；
Asp-Gly二肽为Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH；
第一多肽片段具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
中间多肽片段的数量为1个～3个。
由于先偶联Gly再偶联Asp的合成方法极易使Asp侧链中的羧基与酰胺键中的-H成五元环，因此本发明将易产生五元环结构的Asp-Gly作为一个整体进行偶联，从而避免了在顺序偶联过程中五元环结构的形成，提高了纯度及收率。而由于Asp-Gly相连时侧链极不稳定，因此采用OtBu对Asp的侧链进行保护，而采用Hmb或Dmb对Gly的侧链进行保护，从而进一步避免五元环结构的形成。本发明提供的替度鲁肽制备方法采用片段合成的方式，以Asp-Gly二肽作为合成原料，从而提高了纯度及收率。采用Asp-Gly二肽作为合成原料的目的是避免Asp先于Gly偶联而产生Asp降解产物，而采用片段合成是为了避免多次偶联过程中使Asp发生降解。
当中间多肽片段数量为1时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
当中间多肽片段数量为2时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
当中间多肽片段数量为3时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ IDNO：9所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQID NO：2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
作为优选，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为1个，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为1个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～9个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:1所示；中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第10～18个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ IDNO:6所示；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第19～33个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
更优选地，TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
更优选的，TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
优选地，序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Ala，然后从C端至N端依次偶联Leu、Asn、Asp、Leu、Ile、Thr、Asn、Met，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln、Ile、Leu、Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg和Ala即得。
更优选地，Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
更优选地，裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
作为优选，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为2个，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为2个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～4个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:2所示；序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第5～12个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第13～20个氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第21～33个氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
更优选地，TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
更优选的，TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
优选地，序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Thr，然后从C端至N端依次偶联Asn、Met、Glu、Asp、Ser、Phe、Ser，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Arg，然后从C端至N端依次偶联Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、Ile，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln、Ile、Leu、Trp、Asn、Ile、Phe和Asp，即得。
更优选地，Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
作为优选，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为3个，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：11所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为3个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～4个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:2所示；序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第5～9个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第10～18个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第19～26个氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第27～33个氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:5所示。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
更优选地，TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
更优选的，TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
优选地，序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Glu，然后从C端至N端依次偶联Asp、Ser、Phe、Ser，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Ala，然后从C端至N端依次偶联Leu、Asn、Asp、Leu、Ile、Thr、Asn、Met，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Leu，然后从C端至N端依次偶联Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg、Ala，经裂解即得。
优选地，序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln和Ile，即得。
更优选地，Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，包括以下步骤：步骤1：以Asp-Gly二肽及氨基酸为原料，制备第一多肽片段；步骤2：合成C端多肽片段-树脂及中间多肽片段；步骤3：按照替度鲁泰肽序，在C端多肽片段-树脂上依次偶联中间多肽片段和第一多肽片段，制得替度鲁肽树脂；步骤4：取替度鲁肽树脂经裂解、纯化，即得；Asp-Gly二肽为Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH；第一多肽片段具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5所示氨基酸序列；中间多肽片段的数量为1个～3个。现有的合成方法中，对于替度鲁肽的合成不论是采用顺序偶联的方式还是采用片段偶联的方式，都会由于先偶联Gly再偶联Asp而使Asp侧链中的羧基与酰胺键中的-H成五元环，而这种五元环结构一旦形成，会在一定条件下降解开环产生杂质，而这些由Asp降解产生的杂质不易去除，因此本发明将易产生五元环结构的Asp-Gly作为一个整体进行偶联，从而避免了在顺序偶联过程中五元环结构的形成，提高了纯度及收率。由于Asp-Gly相连时侧链极不稳定，因此采用OtBu对Asp的侧链进行保护，采用Hmb或Dmb对Gly的侧链进行保护，从而进一步避免五元环结构的形成。另外，本发明通过对替度鲁泰肽序的合理划分，将替度鲁泰分为3～5个片段进行合成，从而提高了合成效率，且降低了在逐步偶联过程中造成的降解。因此，本发明提供的方法提高了替度鲁肽的纯度，缩短了合成周期，实验表明，本发明提供的方法制备的替度鲁肽的纯度可达99.23%，较采用现有方法制备的替度鲁肽的纯度提高0.7%，而Asp降解杂质的含量为0.15%。较现有技术降低25%。
附图说明
图1示市售替度鲁肽醋酸盐对照样品检测的结果；
图2示采用与市售对照样品相同检查色谱条件对本发明实施例138中制备的替度鲁肽粗肽纯化、成盐并冻干后，得到替度鲁肽醋酸盐精肽进行检测的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种替度鲁肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以Asp-Gly二肽及氨基酸为原料，制备第一多肽片段；
步骤2：合成C端多肽片段-树脂及中间多肽片段；
步骤3：按照替度鲁泰肽序，在C端多肽片段-树脂上依次偶联中间多肽片段和第一多肽片段，制得替度鲁肽树脂；
步骤4：取替度鲁肽树脂经裂解、纯化，即得；
Asp-Gly二肽为Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH；
第一多肽片段具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
中间多肽片段的数量为1个～3个。
当中间多肽片段数量为1时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第一多肽片段。
当中间多肽片段数量为2时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
当中间多肽片段数量为3时，步骤3中偶联的顺序为：如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的C端多肽片段-树脂、如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的中间多肽片段、如SEQID NO：2所示氨基酸序列的第一多肽片段。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为1个，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为1个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～9个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:1所示；中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第10～18个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ IDNO:6所示；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第19～33个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法为：首先在固相载体上偶联Gly，然后从C端至N端依次偶联Asp、Ser、Phe、Ser、Asp-Gly、Gly、His，经裂解即得。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段中偶联采用的偶联试剂为HOBt。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
制备序列如SEQ ID NO:1所示的第一多肽片段的方法中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Ala，然后从C端至N端依次偶联Leu、Asn、Asp、Leu、Ile、Thr、Asn、Met，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln、Ile、Leu、Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg和Ala即得。
Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
如SEQ ID NO:3所示的C端多肽片段-树脂的合成方法中，偶联采用的偶联剂为HOBt。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4的裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化采用高效液相色谱法。
为使替度鲁肽能够稳定保存，在本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化后还包括成盐的步骤。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为2个，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为2个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～4个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:2所示；序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第5～12个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第13～20个氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第21～33个氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法为：首先在固相载体上偶联Asp-Gly，然后从C端至N端依次偶联Gly、His，经裂解即得。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶联采用的偶联试剂为HOBt。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Thr，然后从C端至N端依次偶联Asn、Met、Glu、Asp、Ser、Phe、Ser，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:7所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Arg，然后从C端至N端依次偶联Ala、Ala、Ley、Asn、Asp、Leu、Ile，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:8所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln、Ile、Leu、Trp、Asn、Ile、Phe和Asp，即得。
Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
如SEQ ID NO:4所示的C端多肽片段-树脂的合成方法中，偶联采用的偶联剂为HOBt。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化采用高效液相色谱法。
为使替度鲁肽能够稳定保存，在本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化后还包括成盐的步骤。
作为优选，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为3个，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示
替度鲁肽制备方法的中间多肽片段的数量为3个时，第一多肽片段优选为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第1～4个氨基酸的多肽片段，序列如SEQ ID NO:2所示；序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第5～9个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第10～18个氨基酸的多肽片段；序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第19～26个氨基酸的多肽片段；C端多肽片段-树脂为包含替度鲁肽的肽序中自C端至N端的第27～33个氨基酸的多肽片段序列如SEQ ID NO:5所示。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法为：首先在固相载体上偶联Asp-Gly，然后从C端至N端依次偶联Gly、His，经裂解即得。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的固相载体为CTC Resin。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段中偶联采用的偶联试剂为HOBt。
本发明提供的替度鲁肽制备方法中制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
TFA与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFA的体积分数为0.5%～5%。
TFE与DCM的混合物作为裂解液，裂解液中TFE的体积分数为20%。
制备序列如SEQ ID NO:2所示的第一多肽片段的方法中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Glu，然后从C端至N端依次偶联Asp、Ser、Phe、Ser，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:9所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Ala，然后从C端至N端依次偶联Leu、Asn、Asp、Leu、Ile、Thr、Asn、Met，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:6所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段的合成具体为：采用顺序偶联的方法，首先在固相载体上偶联Leu，然后从C端至N端依次偶联Trp、Asn、Ile、Phe、Asp、Arg、Ala，经裂解即得。
序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段的合成方法中，偶联采用的偶联试剂为HOBt。
序列如SEQ ID NO:10所示的中间片段的合成中裂解后还包括：过滤、第一洗涤、浓缩、沉淀、第二洗涤、干燥的步骤。
优选地，序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂的合成采用顺序偶联的方法。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法中序列如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂的合成具体为：在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上自C端至N端依次偶联Thr、Ile、Lys、Thr、Gln和Ile，即得。
更优选地，Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。
如SEQ ID NO:5所示的C端多肽片段-树脂的合成方法中，偶联采用的偶联剂为HOBt。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤3中偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
更优选地，本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的体积比为86:5:5:3:1。
本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化采用高效液相色谱法。
为使替度鲁肽能够稳定保存，在本发明提供的替度鲁肽制备方法的步骤4中的纯化后还包括成盐的步骤。
本发明对各氨基酸采用的侧链保护基情况见表1：
表1本发明对各氨基酸采用的保护基
| His | Trt |
| Asp | OtBu |
| Gly | Dlllb、H1llb |
| Ser | tBu |
| Glu | OtBu |
| ASn | Trt |
| Thr | tBu |
| Arg | pbf |
| Trp | Boc |
| Gln | Trt |
| Lys | Boc |
本发明中采用试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
表2本发明采用试剂的缩写及其含义对照表
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Fmoc-Glu(OtBu)-HMPB树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7g Fmoc-Glu(OtBu)-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Glu(OtBu)-HMPB树脂。检测替代度为0.679mmol/g。
实施例2：Fmoc-Glu(OtBu)-HAL树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HAL树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7g Fmoc-Glu(OtBu)-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Glu(OtBu)-HAL树脂。检测替代度为0.683mmol/g。
实施例3：Fmoc-Glu(OtBu)-SASRIN树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7g Fmoc-Glu(OtBu)-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Glu(OtBu)-SASRIN树脂。检测替代度为0.672mmol/g。
实施例4：Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取85.1g Fmoc-Glu(OtBu)-OH（200mmol）溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5mlDIPEA（400mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mlDIPEA（200mmol）。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81ml封闭液（甲醇：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂。检测替代度为0.894mmol/g。
实施例5：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HMPB的制备
称取实施例1中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-HMBP树脂132.5g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HMPB树脂263.5g。
实施例6：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC肽树脂的制备
称取实施例4中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-CTC树脂132.5g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1gFmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂261.6g。
实施例7：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL肽树脂的制备
称取实施例2中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-HAL树脂131.8g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL树脂256.9g。
实施例8：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL肽树脂的制备
称取实施例2中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-HAL树脂131.8g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL树脂268.6g。
实施例9：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL肽树脂的制备
称取实施例2中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-HAL树脂133.9g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-HAL树脂265.4g。
实施例10：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-SASRIN肽树脂的制备
称取实施例3中制备的Fmoc-Glu(OtBu)-SASRIN树脂133.9g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-SASRIN树脂270.6g。
实施例11：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC肽树脂的制备
称取实施例4中制备的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂100.7g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂225.9g。
实施例12：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段树脂
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC肽树脂的制备
称取实施例4中制备的Fmoc-Ala-CTC树脂100.7g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1gFmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8gHOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC树脂224.6g。
实施例13～20：具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-OH的制备
将本发明实施例5～12任一项制备的第一多肽片段树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:1所示结构的第一多肽片段：
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH。
实施例21：Fmoc-Ala-HMPB树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取98.8g Fmoc-Ala-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ala-HMPB树脂。检测替代度为0.706mmol/g。
实施例22：Fmoc-Ala-HAL树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HAL树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取98.8g Fmoc-Ala-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ala-HAL树脂。检测替代度为0.702mmol/g。
实施例23：Fmoc-Ala-SASRIN树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取98.8g Fmoc-Ala-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ala-SASRIN树脂。检测替代度为0.716mmol/g。
实施例24：Fmoc-Ala-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取65.9g Fmoc-Ala-OH（200mmol）溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5mlDIPEA（400mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mlDIPEA（200mmol）。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81ml封闭液（甲醇：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Ala-CTC树脂。检测替代度为0.916mmol/g。
实施例25：具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段-树脂
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-HMPB肽树脂的制备
称取实施例21中制备的Fmoc-Ala-HMPB树脂127.5g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取95.4gFmoc-Leu-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-HMPB树脂259.6g。
实施例26：具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段-树脂
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-HAL肽树脂的制备
称取实施例22中制备的Fmoc-Ala-HAL树脂128.2g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取95.4gFmoc-Leu-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-HAL树脂263.8g。
实施例27：具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段-树脂
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-SASRIN肽树脂的制备
称取实施例23中制备的Fmoc-Ala-SASRIN树脂125.7g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取95.4gFmoc-Leu-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-SASRIN树脂256.9g。
实施例28：具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段-树脂
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-CTC肽树脂的制备
称取实施例24中制备的Fmoc-Ala-CTC树脂98.3g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取95.4gFmoc-Leu-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-CTC树脂216.9g。
实施例29～32：具有SEQ ID NO:6所示结构的中间多肽片段Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的制备
将本发明实施例25～28任一项制备的中间片段-树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段：
Fmoc-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH。
实施例33：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例34：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50ml DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.198mmol/g。
实施例35：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75ml DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.302mmol/g。
实施例36：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.516mmol/g。
实施例37：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50ml DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.189mmol/g。
实施例38：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75ml DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.298mmol/g。
实施例39：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例40：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50ml DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.214mmol/g。
实施例41：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75ml DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.309mmol/g。
实施例42：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26ml DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例43：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-MBHA树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89gFmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50ml DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.203mmol/g。
实施例44：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-MBHA树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83gFmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75mlDIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.310mmol/g。
实施例45：具有SEQ ID NO:3所示结构的C端多肽片段-树脂
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂的制备
称取实施例33～35任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93gFmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂56.8g。
实施例46：具有SEQ ID NO:3所示结构的C端多肽片段-树脂
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-PAM Resin肽树脂的制备
称取实施例36～38任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93gFmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-PAM Resin树脂55.7g。
实施例47：具有SEQ ID NO:3所示结构的C端多肽片段-树脂
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-AM Resin肽树脂的制备
称取实施例39～41任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂56.2g。
实施例48：具有SEQ ID NO:3所示结构的C端多肽片段-树脂
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA Resin肽树脂的制备
称取实施例42～44任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂10mmol g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到
H-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys( Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA Resin树脂55.7g。
实施例49～52：替度鲁肽肽树脂的合成
称取实施例45～48任一项制备的具有SEQ ID NO:3所示结构的C端多肽片段-树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将30mmol实施例29～32任一项制备的中间多肽片段、11.41g HATU（30mmol）、4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例13～20任一项制备的第一多肽片段、11.41g HATU（30mmol）和4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。然用甲醇收缩、真空干燥过夜，
得到白色固体粉末，即为替度鲁肽肽树脂。
实施例53：Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-HMPB树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7gFmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-HMPB树脂。检测替代度为0.654mmol/g。
实施例54：Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-HAL树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HAL树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7gFmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-HAL树脂。检测替代度为0.639mmol/g。
实施例55：Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-SASRIN树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7gFmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH（300mmol）、48.6gHOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-SASRIN树脂。检测替代度为0.673mmol/g。
实施例56：Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取85.1gFmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH（200mmol）溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5mlDIPEA（400mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mlDIPEA（200mmol）。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81ml封闭液（甲醇：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂。检测替代度为0.886mmol/g。
实施例57：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-HMPB树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7gFmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-HMPB树脂。检测替代度为0.672mmol/g。
实施例58：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-HAL树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HAL树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7g Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH（300mmol）、48.6g HOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-HAL树脂。检测替代度为0.665mmol/g。
实施例59：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-SASRIN树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取127.7g Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH（300mmol）、48.6gHOBt（360mmol）和3.7gDMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-SASRIN树脂。检测替代度为0.639mmol/g。
实施例60：Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取85.1gFmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH（200mmol）溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5mlDIPEA（400mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mlDIPEA（200mmol）。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81ml封闭液（甲醇：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂，检测替代度为0.902mmol/g。
实施例61～68具有SEQ ID NO:2所示结构的第一多肽片段-树脂的制备
称取实施例53～60中任一项制备的Fmoc-Asp-Gly-树脂90mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取270mmol Fmoc-Gly-OH，43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端完成Fmoc-His(Trt)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到具有SEQ ID NO:2所示结构的第一多肽片段-树脂。
实施例69～76：具有SEQ ID NO:2所示结构的第一多肽片段的制备
将本发明实施例61～68任一项制备的具有SEQ ID NO:2所示结构的第一多肽片段-树脂置于裂解反应瓶中，以每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ IDNO:2所示结构的第一多肽片段。
实施例77～80：Fmoc-Thr（tBu）-树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB、CTC、HAL或SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取300mmol Fmoc-Thr（tBu）-OH、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Thr（tBu）-树脂。
| 选用树脂 | 产物 | 产物替代度 | |
| 实施例77 | HMPB | Fmoc-Thr(tBu)-HMPB | 0.653mmol/g |
| 实施例78 | CTC | Fmoc-Thr(tBu)-CTC | 0.893mmol/g |
| 实施例79 | HAL | Fmoc-Thr(tBu)-HAL | 0.658mmol/g |
| 实施例80 | SASRIN | Fmoc-Thr(tBu)-SASRIN | 0.664mmol/g |
实施例81～84：具有SEQ ID NO:7所示中间片段-树脂的制备
称取实施例77～88中任一项制备的Fmoc-Thr（tBu）-树脂90mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取95.4gFmoc-Asn（Trt）-OH（270mmol），43.8gHOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到具有SEQ ID NO:7所示中间片段-树脂。
实施例85～88：具有SEQ ID NO:7所示结构的中间多肽片段的制备
将本发明实施例81～84任一项制备的中间片段-树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:7所示结构的中间片段。
实施例89～92：Fmoc-Arg（pbf）-树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB、CTC、HAL或SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取300mmol Fmoc-Arg（pbf）-OH、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3 mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc- Arg（pbf）-树脂。
| 选用树脂 | 产物 | 产物替代度 | |
| 实施例89 | HMPB | Fmoc-Arg（pbf）-HMPB | 0.669mmol/g |
| 实施例90 | CTC | Fmoc-Arg（pbf）-CTC | 0.910mmol/g |
| 实施例91 | HAL | Fmoc-Arg（pbf）-HAL | 0.657mmol/g |
| 实施例92 | SASRIN | Fmoc-Arg（pbf）-SASRIN | 0.653mmol/g |
实施例93～96：具有SEQ ID NO:8所示中间片段-树脂的制备
称取实施例89～92中任一项制备的Fmoc- Arg（pbf）-树脂90mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取270 mmol Fmoc-Ala-OH，43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324 mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc- Leu -OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:8所示中间片段-树脂。
实施例97～100：具有SEQ ID NO:8所示结构的中间多肽片段的制备
将本发明实施例93～96任一项制备的中间片段-树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:8所示结构的中间片段。
实施例101：具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂H-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂的制备
称取实施例33～35任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例102：具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂H-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-PAM Resin肽树脂的制备
称取实施例36～38任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例103：具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂H-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-AM Resin肽树脂的制备
称取实施例39～41任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例104：具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂H-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA Resin肽树脂的制备
称取实施例42～44任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例105～108：替度鲁肽肽树脂的合成
称取实施例101～104任一项制备的具有SEQ ID NO:4所示结构的C端多肽片段-树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将30mmol实施例97～100任一项制备的具有SEQ ID NO:8所示结构的中间片段-树脂、11.41g HATU（30mmol）、4.90gHOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例85～88任一项制备的具有SEQ ID NO:7所示结构的中间片段、11.41g HATU（30mmol）、4.90gHOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例69～76任一项制备具有SEQ ID NO:2所示结构的第一多肽片段、11.41g HATU（30mmol）和4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。然用甲醇收缩、真空干燥过夜，得到白色固体粉末，即为替度鲁肽肽树脂。
实施例109～112：具有SEQ ID NO:9所示中间片段-树脂的制备
称取实施例1～4中任一项制备的Fmoc-Glu(OtBu)-树脂90mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取111.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到具有SEQ ID NO:9所示中间片段-树脂。
实施例113～116：具有SEQ ID NO:9所示结构的中间多肽片段的制备
将本发明实施例109～112任一项制备的中间片段-树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:9所示结构的中间片段。
实施例117～120：Fmoc-Leu-树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPB、CTC、HAL或SASRIN树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取300mmol Fmoc-Leu-OH、48.6g HOBt（360mmol）和3.7g DMAP（30mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入56.3mL DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入350.1mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，2000mmol：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-树脂。
| 选用树脂 | 产物 | 产物替代度 | |
| 实施例117 | HMPB | Fmoc-Leu-HMPB | 0.675mmo1/g |
| 实施例118 | CTC | Fmoc-Leu-CTC | 0.897mmol/g |
| 实施例119 | HAL | Fmoc-Leu-HAL | 0.649mmol/g |
| 实施例120 | SASRIN | Fmoc-Leu-SASRIN | 0.641mmol/g |
实施例121～124：具有SEQ ID NO:10所示中间片段-树脂的制备
称取实施例117～120中任一项制备的Fmoc-Leu-树脂90mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取270mmolFmoc-Trp(tBu)-OH，43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:10所示中间片段-树脂。
实施例125～128：具有SEQ ID NO:10所示结构的中间多肽片段的制备
将本发明实施例121～124任一项制备的中间片段-树脂置于裂解反应瓶中，每克树脂10mL裂解试剂的比例加入裂解液，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即为具有SEQ ID NO:10所示结构的中间片段。
实施例129：具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂H-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂的制备
称取实施例33～35任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93gFmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例130：具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂H-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-PAM Resin肽树脂的制备
称取实施例36～38任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93gFmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例131：具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂
H-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-AM Resin肽树脂的制备
称取实施例39～41任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例132：具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂H-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA Resin肽树脂的制备
称取实施例42～44任一项制备的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂10mmol，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63ml DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂。
实施例133～136：替度鲁肽肽树脂的合成
称取实施例129～132任一项制备的具有SEQ ID NO:5所示结构的C端多肽片段-树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将30mmol实施例125～128任一项制备的具有SEQ ID NO:10所示结构的中间片段、11.41g HATU（30mmol）、4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例29～32任一项制备的具有SEQ ID NO:6所示结构的中间片段、11.41g HATU（30mmol）、4.90gHOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例113～116任一项制备的具有SEQ ID NO:9所示结构的中间片段-树脂、11.41g HATU（30mmol）、4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。将30mmol实施例69～76任一项制备具有SEQ IDNO:2所示结构的第一多肽片段、11.41gHATU（30mmol）和4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束用DBLK脱除Fmoc保护，DMF洗涤6次。然用甲醇收缩、真空干燥过夜，得到白色固体粉末，即为替度鲁肽肽树脂。
实施例137～140：替度鲁肽粗肽的制备
将实施例49～52、实施例105～108或实施例133～136任一项中制备的替度鲁肽肽树脂置于裂解反应器中，以每克树脂加入10mL裂解液的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水=86：5：5：3：1（V/V）），室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽，HPLC鉴定纯度。
实施例141：替度鲁肽精肽的制备
称取实施例137～140中任一项中制备的替度鲁肽粗肽30.0g，用3000ml水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分即为替度鲁肽精肽溶液。
为使精肽能够稳定保存，将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到替度鲁肽醋酸盐精肽，RP-HPLC检测纯度并检测Asp降解杂质含量。
对本发明实施例138中制备的替度鲁肽粗肽纯化、成盐并冻干后，得到替度鲁肽醋酸盐精肽进行检测结果如图2所示，图1为采用同样色谱条件对市售替度鲁肽醋酸盐对照样品进行检测的结果。如图可知，本发明制备的替度鲁肽醋酸盐在相同的液相色谱条件下，出峰时间为56.745min与对照样品的出峰时间基本一致，其误差在本领域技术人员公知的允许范围之内，说明本发明提供的方法成功制备出了替度鲁肽。图1中54.656min处有一杂质峰，为Asp降解产物产生，而通过质谱分析在图2中，相同的Asp降解产物的出峰时间为55.472min，出峰时间误差为系统误差造成，在本领域技术人员公知的允许范围之内，通过比较图1和图2可知，图2中检测到的杂质峰的峰面积明显小于图1，说明本发明提供的方法制备的替度鲁肽的纯度要明显高于现有市售品中替度鲁肽的含量。定量分析结果显示，对本发明实施例54中制备的替度鲁肽粗肽纯化、成盐并冻干后，得到替度鲁肽醋酸盐精肽8.5g，RP-HPLC检测纯度为99.23%，其中，Asp降解杂质的含量为0.15%。
本发明其他实施例中制备的替度鲁肽粗肽经纯化、成盐并冻干后进行质量检测的结果与此相似，纯度较现有技术提高0.7%，而Asp降解杂质的含量较现有技术降低25%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以Asp-Gly二肽及氨基酸为原料，制备第一多肽片段；
步骤2：合成C端多肽片段-树脂及中间多肽片段；
步骤3：按照替度鲁泰肽序，在所述C端多肽片段-树脂上依次偶联中间多肽片段和第一多肽片段，制得替度鲁肽树脂；
步骤4：取所述替度鲁肽树脂经裂解、纯化，即得；
所述Asp-Gly二肽为Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH或Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH；
所述第一多肽片段具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；
所述中间多肽片段的数量为1个～3个；
所述中间多肽片段的数量为1个时，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；所述第一多肽片段具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
所述中间多肽片段的数量为2个时，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；所述第一多肽片段具有SEQID NO：2的氨基酸序列；
所述中间多肽片段的数量为3个时，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10所示；所述C端多肽片段具有如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列；所述第一多肽片段具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述制备第一多肽片段采用的固相载体为HMPB Resin、HAL Resin、SASRIN Resin或CTC Resin。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述制备第一多肽片段采用的裂解液为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的C端多肽片段-树脂中的树脂为Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin或HMPA-MBHA Resin。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述偶联的偶联试剂采用HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中所述裂解的裂解液为TFA、PhSMe、EDT、TIS与H2O的混合物。
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