CN103694320A - 一种普利卡那肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种普利卡那肽的制备方法。该方法包括：固相合成Fmoc-Leu-树脂；按照普利卡那肽的肽序，在Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、-Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-Cys4、-Glu、-Asp、-Asn，制得普利卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。该方法采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，并通过两步环化，得到了纯度以及收率都很高、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。

Description

一种普利卡那肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种普利卡那肽的制备方法。
背景技术
慢性便秘的治疗通常使用较多的是轻泻剂，但是轻泻剂不能有效改善便秘的症状，2008年一项研究显示，虽然16%～40%的便秘患者使用轻泻剂，但症状依然存在，与未使用轻泻剂的患者相比没有显著差别。2007年一项基于网络的调查显示，有47%的患者对轻泻剂不完全满意，其中82%由于疗效不佳，16%由于安全性。因此，现有的治疗还不能满足慢性便秘者的治疗需要。
目前便秘治疗的非轻泻剂包括：阿片类受体拮抗剂（如溴甲纳曲酮，仅适用于阿片诱导的便秘）、氯离子通道活化剂（如鲁比前列酮）、5-HT4受体激动剂（如普卢卡必利）、鸟苷酸环化酶刺激剂[如linaclotide，正在进行便秘型IBS（IBS-C）的Ⅲ期临床研究]。但治疗慢性便秘的非轻泻剂仍有待进一步的开发。
美国Synergy制药公司于2013年1月2日宣布，其在研药物普利卡那肽用于治疗慢性特发性便秘（CIC）具有较好的耐受性，Ⅱb/Ⅲ期临床试验取得积极结果。
普利卡那肽，英文名称为Plecanatide，是一种多肽药物，其结构如式I所示：
Figure BDA0000435459700000011
其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其肽序中N端第4位半胱氨酸（标记为Cys4）与第12位半胱氨酸（标记为Cys12）成环，第7位半胱氨酸（标记为Cys7）与第15位半胱氨酸（标记为Cys15）成环。
普利卡那肽是一种鸟苷酸环化酶C（GC-C）受体激动剂，其治疗机理与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力。普利卡那肽为一类新的口服制剂，无需注射就可以直接口服用药，可为众多患者接受。这类制剂模仿利钠肽Uroguanylin的作用，诱导肠液分泌的胃肠道进入管腔。其作为一种可模拟胃肠液体调节肽效应的新药，对成人慢性特发性便秘的客观指标和患者自评转归有效。
但是，普利卡那肽的制备方法目前在国际上仍属空白，至今尚无适合大规模生产且收率高、杂质含量低的普利卡那肽的制备方法报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种普利卡那肽的制备方法，该方法收率高，且杂质含量低，适合大规模工业化生产。
本发明提供的普利卡那肽的制备方法包括以下步骤：
步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；
步骤2：按照普利卡那肽的肽序，在Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、-Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-Cys4、-Glu、-Asp、-Asn，制得普利卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；
步骤3：取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。
作为优选，Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基；或Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基。
优选的，Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基，第一环化具体为：采用过氧化氢水溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键，第二环化具体为：采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键。
优选的，Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基，第一环化具体为：采用过氧化氢水溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键，第二环化具体为：采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键。
现有技术中，多肽偶联过程中，半胱氨酸常采用Trt作为侧链保护基，但由于Trt的体积较大，造成拥挤，反应位点不易暴露，使得偶联效果下降，最终造成线性肽纯度下降，收率偏低。本发明提供的制备方法在合成线性肽过程中，采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，为了能够准确定位环化Cys4和Cys12采用相同的侧链保护剂，而Cys7和Cys15采用相同的侧链保护基。其中，tBu体积较小，能有效的降低空间位阻引发的偶联困难，利于提高收率；而Acm在酸性条件下稳定在裂解时不被脱除，就使得裸露的半胱氨酸在第一环化时能够定位环化。
优选的，第一环化中，过氧化氢水溶液中，过氧化氢的摩尔-体积浓度为8.8mmol/L～13.2mmol/L。
优选的，第一环化中过氧化氢与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为（8～12）:1。
更优选的，第一环化中过氧化氢与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为10:1。
优选的，第一环化的时间为2h。
优选的，第二环化中，碘的甲醇溶液中，碘的质量-体积浓度为4.19g/L～8.18g/L。
更优选的，碘的甲醇溶液pH值为3.0。
优选的，第二环化中，碘与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为（3～6）:1。
更优选的，第二环化中，碘与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为5:1。
优选的，第二环化的时间为1h。
目前，多肽的环化方法多采用一步氧化法，但一步氧化易造成定位不准从而产生过多杂质，不利于纯化分离，收率不高，也不利于工艺的放大。而本发明提供的方法通过两步环化，中间过程无需纯化，就得到了纯度以及收率都很高的、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。
作为优选，偶联中，-Thr采用的侧链保护基为叔丁基，-Asn采用的侧链保护基为三苯甲基，-Glu采用的侧链保护基为叔丁氧基，-Asp采用的侧链保护基为叔丁氧基。
在本发明的步骤2中，在脱除保护的Fmoc-Leu-树脂上依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH制得普利卡那肽线性肽树脂。
作为优选，本发明步骤2采用固相合成法偶联。
作为优选，Fmoc-Leu-树脂中树脂采用Wang树脂。
优选的，Fmoc-Leu-Wang的替代度为0.4mmol/g～0.8mmol/g。
更优选的，Fmoc-Leu-Wang的替代度为0.5mmol/g。
作为优选，偶联的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物，或HOBt、PyBop与DIPEA的混合物，或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
作为优选，裂解的裂解试剂中包括：三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷。
优选的，裂解试剂中，各组分的体积分数为：
三氟乙酸70～75%、苯甲硫醚5～8%、苯酚5～8%、1，2-乙二硫醇5～10%、三异丙基硅烷3～6%，余量为水。
更优选的，裂解试剂中各组分的体积比为：三氟乙酸：苯甲硫醚：苯酚：水：1，2-乙二硫醇：三异丙基硅烷=75：5：5：4：8：3。
作为优选，第二环化后还包括纯化的步骤。
优选的，纯化采用RP-HPLC。
更优选的，RP-HPLC纯化色谱中，流动相A相为体积分数为0.1%的TFA水溶液，流动相B相为乙腈。
本发明提供的普利卡那肽的制备方法包括：固相合成Fmoc-Leu-树脂；按照普利卡那肽的肽序，在Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、-Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-Cys4、-Glu、-Asp、-Asn，制得普利卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；取普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。本发明提供的制备方法在合成线性肽过程中，采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基，为了能够准确定位环化Cys4和Cys12采用相同的侧链保护剂，而Cys7和Cys15采用相同的侧链保护基。其中，tBu体积较小，能有效的降低空间位阻引发的偶联困难，利于提高收率；而Acm在酸性条件下稳定在裂解时不被脱除，就使得裸露的半胱氨酸在第一环化时能够定位环化。在环化过程中，本发明通过两步环化，中间过程无需纯化，就得到了纯度以及收率都很高的、二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。实验结果表明：本发明制备得到的普利卡那肽纯度可达99.47%，总收率可达37.88%。
附图说明
图1示对本发明实施例13制得的普利卡那肽的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种普利卡那肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，本发明采用试剂的中英文名称对照如表1所示：
表1本发明采用试剂的中英文名称对照
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Wang Resin 4-苄氧基苄醇树脂
tBu 叔丁基
Fmoc-Cys(tBu)-OH 芴甲氧羰基-S-叔丁基-L-半胱氨酸
Fmoc-Cys(Acm)-OH 芴甲氧羰基-S-乙酰氨甲基-L-半胱氨酸
OtBu 叔丁氧基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DBLK 20%六氢吡啶/DMF溶液
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
DMSO 二甲基亚砜
HATU O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
TIS 三异丙基硅烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
HPLC 高效液相色谱法
EDT 1，2-乙二硫醇
DIC N,N′-二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂120g（120mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取84.8g Fmoc-Leu-OH、38.9g HOBt、36.3g DIC、2.93g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189.8g吡啶和245.04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为0.408mmol/g。
实施例2：替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂120g（120mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取127.2g Fmoc-Leu-OH、58.4g HOBt、54.5g DIC、4.4g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189.8g吡啶和245.04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为0.807mmol/g。
实施例3：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂120g（120mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取101.7g Fmoc-Leu-OH、46.7g HOBt、43.6g DIC、3.5g DMAP溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。然后加入189.8g吡啶和245.04g乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次后，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂，检测替代度为0.498mmol/g。
实施例4：普利卡那肽树脂的制备
称取本发明实施例3制备得到的替代度为0.498mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin1010g（500mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将622g（1500mmol）Fmoc-Cys(Acm)-OH，243g（1800mmol）HOBt，232g（1800mmol）DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，称重为2753g。
实施例5：普利卡那肽树脂的制备
称取按照本发明实施例2制备得到的替代度为0.807mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin619.58g（500mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将622g（1500mmol）Fmoc-Cys(Acm)-OH，243g（1800mmol）HOBt、936.18g（1800mmol）PyBop、387.6g（3000mmol）DIPEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，称重为2231.2g。
实施例6：普利卡那肽树脂的制备
称取按照本发明实施例1制备得到的替代度为0.408mmol/g的Fmoc-Leu-Wang Resin1225.5g（500mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将622g（1500mmol）Fmoc-Cys(tBu)-OH，684.36g（1800mmol）HATU、244.98g（1800mmol）HOAt、387.6g（3000mmol）DIPEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h）。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asn(Trt)-OH，称重为2682.3g。
实施例7：普利卡那线性粗肽的制备
取本发明实施例4制备得到的2753g普利卡那肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT：TIS=75：5：5：4：8：3（V/V）），室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即普利卡那肽线性粗肽908g。线性粗肽收率为101.1%，HPLC纯度为88.9%。
实施例8：普利卡那线性粗肽的制备
取本发明实施例5制备得到的2231.2g普利卡那肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT：TIS=70：8：8：3：5：6（V/V）），室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即普利卡那肽线性粗肽722.3g。线性粗肽收率为81.89%%，HPLC纯度为80.3%。
实施例9：普利卡那线性粗肽的制备
取本发明实施例6制备得到的2682.3g普利卡那肽树脂置于裂解反应器中，以15ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT：TIS=72：6：6：6：5：5（V/V）），室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即普利卡那肽线性粗肽885.54g。线性粗肽收率为98.67%，HPLC纯度为85.2%。
实施例10：普利卡那粗肽的制备
取本发明实施例8制备的普利卡那肽线性粗肽100g（55mmol）溶解于50L的第一环化体系中，该第一环化体系为440mmol过氧化氢的水溶液（8.8mmol/L），置于室温中，搅拌反应2小时。将41.9g（165mmol）碘单质溶于10L甲醇中，缓慢滴加到反应体系，然后加冰乙酸调节pH=3.0，室温下第二环化反应1.0小时，反应结束后，缓慢加入固体维生素C，将过量的碘单质消耗完，同时反应体系颜色透明。所得反应液即为普利卡那粗肽溶液。
实施例11：普利卡那粗肽的制备
取本发明实施例9制备的普利卡那肽线性粗肽100g（55mmol）溶解于50L的环化体系中，该环化体系为660mmol过氧化氢的水溶液（13.2mmol/L），置于室温中，搅拌反应2小时。将81.8g（330mmol）碘单质溶于10L甲醇中，缓慢滴加到反应体系，然后加冰乙酸调节pH=3.0，室温反应1.0小时，反应结束后，缓慢加入固体维生素C，将过量的碘单质消耗完，同时反应体系颜色透明。所得反应液即为普利卡那粗肽溶液。
实施例12：普利卡那粗肽的制备
取本发明实施例7制备的普利卡那肽线性粗肽100g（55mmol）溶解于50L的环化体系中，该环化体系为550mmol过氧化氢的水溶液（11mmol/L），置于室温中，搅拌反应2小时。将69.85g（275mmol）碘单质溶于10L甲醇中，缓慢滴加到反应体系，然后加冰乙酸调节pH=3.0，室温反应1.0小时，反应结束后，缓慢加入固体维生素C，将过量的碘单质消耗完，同时反应体系颜色透明。所得反应液即为普利卡那粗肽溶液。
实施例13：普利卡那粗肽的纯化
取本发明实施例10～12任一项制备得到的普利卡那粗肽，采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，以体积分数为0.1%的TFA水溶液为流动相A相，以乙腈为流动相B相。纯化，除盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到普利卡那精肽。
经预测，普利卡那肽的分子量为1683.49，经质谱检测，本发明制得的普利卡那肽的分子量为1683.6，能够符合预期，证明本发明成功制备了普利卡那肽。
对本发明实施例12制得的普利卡那粗肽进行纯化后经色谱检测，其检测结果如表2所示，色谱图如图1所示。其中，普利卡那肽的出峰时间为10.797min，峰高为3355114。
表2本发明制得的普利卡那肽的色谱检测结果
保留时间 峰面积 面积百分比 峰高
1 10.797 27811367 99.47 3355114
2 12.497 3584 0.01 536
3 14.112 47618 0.17 6620
4 14.477 30355 0.11 4474
5 14.987 56978 0.20 7330
6 15.327 9666 0.03 1560
对本发明实施例10～12制得的普利卡那粗肽进行纯化后进行质量鉴定，结果如表3所示：
表3本发明制得的普利卡那肽的质量鉴定
所得精肽质量 总收率 HPLC纯度
实施例10 23.7g 27.20% 99.02%
实施例11 32.7g 35.80% 99.22%
实施例12 33.2g 37.88% 99.47%
由表3可知，以本发明提供的方法制备普利卡那肽的总收率可达37.88%而所得普利卡那肽产品的纯度可达99%以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure IDA0000435459760000011

Claims (9)

1.一种普利卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：固相合成Fmoc-Leu-树脂；
步骤2：按照普利卡那肽的肽序，在所述Fmoc-Leu-树脂上依次偶联-Cys15、-Gly、-Thr、-Cys12、-Ala、-Val、-Asn、-Val、-Cys7、-Leu、-Glu、-Cys4、-Glu、-Asp、-Asn，制得普利卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普利卡那肽线性粗肽；
步骤3：取所述普利卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基；或所述Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为叔丁基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述第一环化具体为：采用过氧化氢水溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键，所述第二环化具体为：采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述Cys4和Cys12的侧链保护基为乙酰胺甲基，所述Cys7和Cys15的侧链保护基为叔丁基，所述第一环化具体为：采用过氧化氢水溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys7和Cys15间形成二硫键，所述第二环化具体为：采用碘的水溶液或碘的甲醇溶液使所述普利卡那肽线性粗肽中Cys4和Cys12间形成二硫键。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联中，-Thr采用的侧链保护基为叔丁基，-Asn采用的侧链保护基为三苯甲基，-Glu采用的侧链保护基为叔丁氧基，-Asp采用的侧链保护基为叔丁氧基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂中所述树脂采用Wang树脂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的偶联试剂为HOBt与DIC的混合物，或HOBt、PyBop与DIPEA的混合物，或HATU、HOAt与DIPEA的混合物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解试剂中包括：三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二环化后还包括纯化的步骤。
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