CN108440652A - 一种普卡那肽的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种普卡那肽的固相合成方法，包括如下步骤：用TFA裂解试剂把多肽从树脂上裂解下来，得到2，10两位有Acm保护的游离多肽，其中另外一对(5，13位)Cys的巯基已经裸露；在碱性条件下，用30％过氧化氢/反应溶液体积为0.5ml/g～1ml/g的过氧化氢氧化这一对巯基，得到形成5‑13一对二硫键的一环普卡那肽；剩余一对二硫键的形成：酸性条件下，一定浓度的碘液缓慢滴入溶液中，反应3h，把Acm脱除的同时，形成2‑10一对二硫键，反应结束后加入抗坏血酸除去过量的碘；反应溶液过滤后，进行纯化，冻干得到粉末状普卡那肽。本申请优化环化路线和条件，在保证产率的同时，能做到准确定位，步骤简单，环化过程即时可控，无需等待终产品确认对错，进而有效的提高了效率。

Description

一种普卡那肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，特别是普卡那肽的固相合成方法，该方法能够准确定位环化普卡那肽。
背景技术
普卡那肽(plecanatide)是有16个氨基酸组成的环状多肽，能调节胃肠道中的酸碱离子，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。
普卡那肽序列：H-Asn-Asp-Glu-Cys(13)-Glu-Leu-Cys(10)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(5)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH
结构图：
目前普卡那肽是通过生物提取技术得到，生物提取受到现有有限生物资源的影响，提取过程较繁琐，效率低，且比较难得到高纯度的产物，并且在自然环化时无法精准定位。
发明内容
本发明的目的就是为了解决背景技术中的问题，提供一种普卡那肽的固相合成方法，其能够克服在自然环化时无法精准定位的问题，并且在定位环化的基础上，实现可操作性强，过程可检测，可控的优点。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种普卡那肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)使用催化酯化条件使Fmoc-Leu-OH连载到WANG树脂上；
(2)按照普卡那肽序列，使用缩合试剂从C端到N端依次偶联保护氨基酸，其中普卡那肽序列顺序为：Asn(trt)16-Asp(tbu)15-Glu(otbu)14-Cys(trt)13-Glu(otbu)12-Leu11-Cys(A cm)10-Val9-Asn(trt)8-VaL7-Ala6-Cys(trt)5-Thr(tbu)4-Gly3-Cys(Acm)2-Le u1-wang resin；
(3)用TFA裂解试剂把多肽从树脂上裂解下来，得到2，10两位有Acm保护的游离多肽，其中另外一对(5，13位)Cys的巯基已经裸露；在碱性条件下，用30％过氧化氢/反应溶液体积为0.5ml/g～1ml/g的过氧化氢氧化这一对巯基，得到形成5-13一对二硫键的一环普卡那肽；
(4)剩余一对二硫键的形成：酸性条件下，一定浓度的碘液缓慢滴入溶液中，反应3h，把Acm脱除的同时，形成2-10一对二硫键，反应结束后加入抗坏血酸除去过量的碘；
(5)反应溶液过滤后，进行纯化，冻干得到粉末状普卡那肽。
对于本发明的一种优化，步骤(1)中Fmoc-Leu-WANG RESIN的制备，以HOBT、DIC和DMAP组成酯化催化试剂，制得替代度为0.25的Fmoc-Leu王树脂。
对于本发明的一种优化，步骤(2)中偶联缩合试剂为TBTU/DIEA的组合，去保护试剂为20％的哌啶/DMF溶液，所有氨基酸均为带保护的氨基酸，其中5，13两位使用trt保护；2，10两位使用Acm保护。从C端第二个氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH开始偶联，偶联完成后去除Fmoc保护，按顺序依次偶联至最后第16位Fmoc-Asn(trt)-OH。
对于本发明的一种优化，步骤(3)中TFA裂解试剂比例是TFA：1，2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：水＝90：4：3：2：1；第一对环化时用氨水调节PH，过氧化氢加的量范围在：0.51ml/g～1ml/g，根据巯基检测液显色程度来增减过氧化氢加的量。
对于本发明的一种优化，步骤(4)中第二对环化时用醋酸来调节PH；碘液用甲醇溶解，反应过程中碘液滴加速度根据溶液的颜色变化来控制。
对于本发明的一种优化，步骤(2)中，使用的缩合试剂为TBTU/DIEA或者HBTU/NMM；反应温度为室温，偶联所用到的溶剂为DMF,DCM,甲醇；去保护液为20％的哌啶/DMF；检测试剂为茚三酮检测液；先用20％的哌啶/DMF去除Fmoc-Leu-Wang Resin上的Fmoc保护基团，用TBTU/DIEA作为缩合剂，DMF为反应溶剂，加入第二位保护氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH，在室温下进行偶联；反应1h后，取树脂小样用茚三酮检测，检测溶液亮黄，树脂透明则已反应完全；如溶液或树脂有蓝色或棕红色，则反应未完全，选择进一步加料或者抽掉反应溶液，换缩合剂重新反应；确认反应完全后，重复以上去保护、偶联、检测的步骤，直至偶联至最后一个氨基酸；偶联完成后，去除最后的Fmoc保护基团，用DMF、DCM、甲醇依次各洗3遍，抽干粗肽树脂待用。
对于本发明的一种优化，所述步骤(3)沉淀溶剂为乙醚，环化第一对二硫键反应介质为水，调节PH时所用试剂为氨水，巯基检测试剂为DTNB。
对于本发明的一种优化，裂解试剂按照粗肽树脂重量的7-8倍加入，控制裂解温度在24℃～32℃，搅拌反应2.5小时～3.5小时，反应结束抽滤取滤液，一边搅拌一边缓慢倒入事先准备好的冰乙醚中沉淀，乙醚用量为裂解液的8-10倍，待沉淀完全，抽滤取白色虑物，再用乙醚洗涤3次，转入真空干燥器干燥成白色固体粉末，得到粗肽；对粗肽进行称重，按照粗肽(重量)：水(体积)＝1：10的比例进行溶解，溶解完全后，用氨水调节PH值，调至7.5-8之间；随后加入0.5ml/L(30％过氧化氢/反应溶液体积)比例的过氧化氢在室温下搅拌，30min后，取小样滴加巯基检测液，如果溶液为无色透明，则表示巯基已被氧化，反应结束；如果溶液有黄色，则表示还有游离的巯基，此时补加过氧化氢，待反应一段时间后，继续检测，直至反应溶液中无游离巯基，第一对环化结束。
对于本发明的一种优化，纯化时用到的试剂有乙腈，TFA，氨水，冰乙酸，用0.45μm微孔过滤板过滤，通过C18制备柱上样制备，洗脱，收集目标峰肽溶液；高纯度肽溶液转盐成醋酸盐形式；溶液减压旋蒸浓缩，浓缩液通过低温冷冻机干燥成粉末状精品普卡那肽。
本发明与背景技术相比，具有通过对工艺路线的深入研究，优化环化路线和条件，在保证产率的同时，能做到准确定位，步骤简单，环化过程即时可控，无需等待终产品确认对错，进而有效的提高了效率。
附图说明
图1是二环普卡那肽的质谱图。
图2是实施例2所述精品普卡那肽的色谱图。
具体实施方式
实施例1：一种普卡那肽的固相合成方法，包括如下步骤：
(1)使用催化酯化条件使Fmoc-Leu-OH连载到WANG树脂上；
(2)按照普卡那肽序列，使用缩合试剂从C端到N端依次偶联保护氨基酸，其中普卡那肽序列顺序为：Asn(trt)16-Asp(tbu)15-Glu(otbu)14-Cys(trt)13-Glu(otbu)12-Leu11-Cys(A cm)10-Val9-Asn(trt)8-VaL7-Ala6-Cys(trt)5-Thr(tbu)4-Gly3-Cys(Acm)2-Le u1-wang resin；
(3)用TFA裂解试剂把多肽从树脂上裂解下来，得到2，10两位有Acm保护的游离多肽，其中另外一对(5，13位)Cys的巯基已经裸露；在碱性条件下，用30％过氧化氢/反应溶液体积为0.5ml/g～1ml/g的过氧化氢氧化这一对巯基，得到形成5-13一对二硫键的一环普卡那肽；
(4)剩余一对二硫键的形成：酸性条件下，一定浓度的碘液缓慢滴入溶液中，反应3h，把Acm脱除的同时，形成2-10一对二硫键，反应结束后加入抗坏血酸除去过量的碘；
(5)反应溶液过滤后，进行纯化，冻干得到粉末状普卡那肽。
步骤(1)中Fmoc-Leu-WANG RESIN的制备，以HOBT、DIC和DMAP组成酯化催化试剂，制得替代度为0.25的Fmoc-Leu王树脂。
步骤(2)中偶联缩合试剂为TBTU/DIEA的组合，去保护试剂为20％的哌啶/DMF溶液，所有氨基酸均为带保护的氨基酸，其中5，13两位使用trt保护；2，10两位使用Acm保护。从C端第二个氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH开始偶联，偶联完成后去除Fmoc保护，按顺序依次偶联至最后第16位Fmoc-Asn(trt)-OH。
步骤(3)中，TFA裂解试剂比例是TFA：1，2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：水＝90：4：3：2：1；第一对环化时用氨水调节PH，过氧化氢加的量范围在：0.51ml/g～1ml/g，根据巯基检测液显色程度来增减过氧化氢加的量。
步骤(4)中，第二对环化时用醋酸来调节PH；碘液用甲醇溶解，反应过程中碘液滴加速度根据溶液的颜色变化来控制。
步骤(2)中，使用的缩合试剂为TBTU/DIEA或者HBTU/NMM；反应温度为室温，偶联所用到的溶剂为DMF,DCM,甲醇；去保护液为20％的哌啶/DMF；检测试剂为茚三酮检测液；先用20％的哌啶/DMF去除Fmoc-Leu-Wang Resin上的Fmoc保护基团，用TBTU/DIEA作为缩合剂，DMF为反应溶剂，加入第二位保护氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH，在室温下进行偶联；反应1h后，取树脂小样用茚三酮检测，检测溶液亮黄，树脂透明则已反应完全；如溶液或树脂有蓝色或棕红色，则反应未完全，选择进一步加料或者抽掉反应溶液，换缩合剂重新反应；确认反应完全后，重复以上去保护、偶联、检测的步骤，直至偶联至最后一个氨基酸；偶联完成后，去除最后的Fmoc保护基团，用DMF、DCM、甲醇依次各洗3遍，抽干粗肽树脂待用。
所述步骤(3)沉淀溶剂为乙醚，环化第一对二硫键反应介质为水，调节PH时所用试剂为氨水，巯基检测试剂为DTNB。
裂解试剂按照粗肽树脂重量的7-8倍加入，控制裂解温度在24℃～32℃，搅拌反应2.5小时～3.5小时，反应结束抽滤取滤液，一边搅拌一边缓慢倒入事先准备好的冰乙醚中沉淀，乙醚用量为裂解液的8-10倍，待沉淀完全，抽滤取白色虑物，再用乙醚洗涤3次，转入真空干燥器干燥成白色固体粉末，得到粗肽；对粗肽进行称重，按照粗肽(重量)：水(体积)＝1：10的比例进行溶解，溶解完全后，用氨水调节PH值，调至7.5-8之间；随后加入0.5ml/L(30％过氧化氢/反应溶液体积)比例的过氧化氢在室温下搅拌，30min后，取小样滴加巯基检测液，如果溶液为无色透明，则表示巯基已被氧化，反应结束；如果溶液有黄色，则表示还有游离的巯基，此时补加过氧化氢，待反应一段时间后，继续检测，直至反应溶液中无游离巯基，第一对环化结束。
纯化时用到的试剂有乙腈，TFA，氨水，冰乙酸，用0.45μm微孔过滤板过滤，通过C18制备柱上样制备，洗脱，收集目标峰肽溶液；高纯度肽溶液转盐成醋酸盐形式；溶液减压旋蒸浓缩，浓缩液通过低温冷冻机干燥成粉末状精品普卡那肽。
实施例2：普卡那肽直链粗肽合成方法
1.制备树脂：替代度(loading)为0.35的Fmoc-Leu-Wang Resin 6mmol
准确称Fmoc-Leu-OH 26.5g，Hobt 10.1g，Dmap 0.92g加入三角瓶中，用少量DMF溶解；再称取原始Loading为0.96的Wang resin 85.7g加入三角瓶，用DMF调至适当的反应浓度，加入11.6ML的DIC，控温28-30℃，摇床反应3h。用砂芯反应柱抽掉溶液，DMF，DCM，DMF依次各洗2次，加入155.6ml醋酸酐和132.4ml吡啶，DMF做反应溶剂，控温28-30℃封闭5h。封闭结束，抽掉溶液，用DMF,DCM,甲醇依次各洗三遍，抽干待用。
紫外测得树脂替代度为0.35mmol/g。
2. 6mmol线性普卡那肽的偶联，序列如下：
Asn(trt)16-Asp(tbu)15-Glu(otbu)14-Cys(trt)13-Glu(otbu)12-Leu11-Cys(Acm)10-Val9-Asn(trt)8-VaL7-Ala6-Cys(trt)5-Thr(tbu)4-Gly3-Cys(Acm)2-Leu1-wangresin
准确称取树脂17.1g，放入砂芯反应柱中，加适量DCM氮气鼓吹溶胀30min。抽掉溶液，加入20％哌啶/DMF溶液去保护反应5min,10min各一次。DCM洗一次，DMF洗5次去除哌啶残留。
按照序列称取第二位保护氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH 5.0g(投料比为树脂摩尔量的2倍，即12mmol),TBTU 3.9g(投料比同氨基酸),加入反应柱，DMF做反应溶剂，加入缚酸试剂DIEA4.0ml(投料比为氨基酸的2倍)，室温下氮气鼓吹反应1h。取小样在玻璃试管中，DMF涮洗两次，加入茚三酮、苯酚、吡啶各三滴(均为除水试剂)，放入干式培养器110℃以上反应3min.检测溶液亮黄，树脂透明则已反应完全，如溶液或树脂有蓝色或棕红色，则反应未完全，可以选择进一步加料或者抽掉反应溶液，换缩合剂重新反应。确认反应完全后，重复以上去保护、偶联、检测的步骤，依次偶联到最后一个氨基酸。偶联结束用20％哌啶去除最后一个Fmoc-Asn(trt)-OH的保护，用DMF、DCM、甲醇各洗3次，抽干得37.5g线性肽树脂。
3.裂解并一次环化普卡那肽：
配置280ML裂解液，TFA、EDT、苯甲硫醚、苯酚、水分别为252ml、11.2ml、8.4ml、5.6ml、2.8ml，预冻至0℃以下。将裂解液倒入烧杯中磁力搅拌，冰浴状态下，把粗肽树脂缓慢加入，待温度稳定后控温至28℃反应3h。抽滤得到滤液，再用少量TFA涮洗树脂一次，抽滤合并滤液。把1500ml预冻的冰乙醚放入塑料杯中，边搅拌边缓慢加入滤液，使其在乙醚中充分析出，静置30min后抽滤，再用常温乙醚洗涤3次，抽干得到白色湿状固体。转移到真空干燥器中干燥成白色粉末状固体，称重11.6g，此时得到了5，13两位巯基裸露，2，10两位ACM保护的线性普卡那肽粗品。
用11.6L纯水溶解线性粗肽，搅拌桨搅拌，用氨水调至PH在7.5-8之间。取小样滴加巯基检测液，确认检测为黄色，以便对照。滴加30％的过氧化氢5.8ml，室温下搅拌反应30min。取小样滴加巯基检测液，如果溶液为无色透明，则表示巯基已被氧化，反应结束；如果溶液有黄色，则表示还有游离的巯基，此时可以补加过氧化氢，待反应一段时间后，继续检测，直至反应溶液中无游离巯基，第一对环化结束。此时得到了5-13成环的一环普卡那肽。
4.二次环化普卡那肽：
第一对氧化结束后，用冰乙酸调PH至4-5之间。称取3倍粗肽当量的碘4.7g，用20ml甲醇溶解。一边搅拌溶液，一边缓慢滴加碘液，观察溶液颜色的生成和消退，待出现棕褐色保持不消退后，停止滴加，等待反应。过程中颜色会反复消退变淡，及时加入碘液至颜色基本不变后，延长反应1h。加入适量抗坏血酸继续搅拌反应10min,颜色完全褪去反应结束。此时得到了5-13，2-10两对二硫键都被氧化的二环普卡那肽，HPLC检测二环粗肽纯度为83.3％，质谱图分子量为1681.2(附图1)，理论分子量为1681.89。
5.纯化冻干普卡那肽：
用0.45μm微孔过滤板过滤，通过C18制备柱上样制备，第一次制备使用TFA体系去除主要杂质，第二次使用醋酸体系，去除剩余杂质。制备结束后高纯度肽溶液转盐成醋酸盐形式。溶液减压旋蒸浓缩，浓缩液通过低温冷冻机干燥成粉末状精品普卡那肽，称重4.2g，精品纯度98.52％(附图2)，综合收率为42％。
需要理解到的是：本实施例虽然对本发明作了比较详细的说明，但是这些说明，只是对本发明的简单说明，而不是对本发明的限制，任何不超出本发明是指精神内的发明创造，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种普卡那肽的固相合成方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)使用催化酯化条件使Fmoc-Leu-OH连载到WANG树脂上；
(2)按照普卡那肽序列，使用缩合试剂从C端到N端依次偶联保护氨基酸，其中普卡那肽序列顺序为：
Asn(trt)16-Asp(tbu)15-Glu(otbu)14-Cys(trt)13-Glu(otbu)12-Leu11-Cys(Acm)10-Val9-Asn(trt)8-VaL7-Ala6-Cys(trt)5-Thr(tbu)4-Gly3-Cys(Acm)2-Leu1-wangresin；
(3)用TFA裂解试剂把多肽从树脂上裂解下来，得到2，10两位有Acm保护的游离多肽，其中另外一对(5，13位)Cys的巯基已经裸露；在碱性条件下，用30％过氧化氢/反应溶液体积为0.5ml/g～1ml/g的过氧化氢氧化这一对巯基，得到形成5-13一对二硫键的一环普卡那肽；
(4)剩余一对二硫键的形成：酸性条件下，一定浓度的碘液缓慢滴入溶液中，反应3h，把Acm脱除的同时，形成2-10一对二硫键，反应结束后加入抗坏血酸除去过量的碘；
(5)反应溶液过滤后，进行纯化，冻干得到粉末状普卡那肽。
2.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中Fmoc-Leu-WANG RESIN的制备，以HOBT、DIC和DMAP组成酯化催化试剂，制得替代度为0.25的Fmoc-Leu王树脂。
3.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(2)中偶联缩合试剂为TBTU/DIEA的组合，去保护试剂为20％的哌啶/DMF溶液，所有氨基酸均为带保护的氨基酸，其中5，13两位使用trt保护；2，10两位使用Acm保护。从C端第二个氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH开始偶联，偶联完成后去除Fmoc保护，按顺序依次偶联至最后第16位Fmoc-Asn(trt)-OH。
4.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(3)中TFA裂解试剂比例是TFA：1，2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：水＝90：4：3：2：1；第一对环化时用氨水调节PH，过氧化氢加的量范围在：0.51ml/g～1ml/g，根据巯基检测液显色程度来增减过氧化氢加的量。
5.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(4)中第二对环化时用醋酸来调节PH；碘液用甲醇溶解，反应过程中碘液滴加速度根据溶液的颜色变化来控制。
6.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中，使用的酯化催化剂组合为Hobt,Dic,Dmap；反应温度为28～32℃，反应溶剂为DMF，获得Fmoc-Leu-Wang Resin的取代度为0.2～0.4。
7.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：步骤(2)中，使用的缩合试剂为TBTU/DIEA或者HBTU/NMM；反应温度为室温，偶联所用到的溶剂为DMF,DCM,甲醇；去保护液为20％的哌啶/DMF；检测试剂为茚三酮检测液；先用20％的哌啶/DMF去除Fmoc-Leu-Wang Resin上的Fmoc保护基团，用TBTU/DIEA作为缩合剂，DMF为反应溶剂，加入第二位保护氨基酸Fmoc-Cys(Acm)-OH，在室温下进行偶联；反应1h后，取树脂小样用茚三酮检测，检测溶液亮黄，树脂透明则已反应完全；如溶液或树脂有蓝色或棕红色，则反应未完全，选择进一步加料或者抽掉反应溶液，换缩合剂重新反应；确认反应完全后，重复以上去保护、偶联、检测的步骤，直至偶联至最后一个氨基酸；偶联完成后，去除最后的Fmoc保护基团，用DMF、DCM、甲醇依次各洗3遍，抽干粗肽树脂待用。
8.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤(3)沉淀溶剂为乙醚，环化第一对二硫键反应介质为水，调节PH时所用试剂为氨水，巯基检测试剂为DTNB。
9.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：裂解试剂按照粗肽树脂重量的7-8倍加入，控制裂解温度在24℃～32℃，搅拌反应2.5小时～3.5小时，反应结束抽滤取滤液，一边搅拌一边缓慢倒入事先准备好的冰乙醚中沉淀，乙醚用量为裂解液的8-10倍，待沉淀完全，抽滤取白色虑物，再用乙醚洗涤3次，转入真空干燥器干燥成白色固体粉末，得到粗肽；对粗肽进行称重，按照粗肽(重量)：水(体积)＝1：10的比例进行溶解，溶解完全后，用氨水调节PH值，调至7.5-8之间；随后加入0.5ml/L(30％过氧化氢/反应溶液体积)比例的过氧化氢在室温下搅拌，30min后，取小样滴加巯基检测液，如果溶液为无色透明，则表示巯基已被氧化，反应结束；如果溶液有黄色，则表示还有游离的巯基，此时补加过氧化氢，待反应一段时间后，继续检测，直至反应溶液中无游离巯基，第一对环化结束。
10.根据权利要求1所述的普卡那肽的固相合成方法，其特征在于：纯化时用到的试剂有乙腈，TFA，氨水，冰乙酸，用0.45μm微孔过滤板过滤，通过C18制备柱上样制备，洗脱，收集目标峰肽溶液；高纯度肽溶液转盐成醋酸盐形式；溶液减压旋蒸浓缩，浓缩液通过低温冷冻机干燥成粉末状精品普卡那肽。
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