CN104861045A

CN104861045A - 环肽化合物gg6f及其制备方法

Info

Publication number: CN104861045A
Application number: CN201410057197.2A
Authority: CN
Inventors: 陈杰桃; 丁慧文; 穆青; 杨萍
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2015-08-26

Abstract

本发明属于药学领域，涉及式(I)结构的环六肽化合物GG6F及其化学制备方法。所述环六肽化合物GG6F由六个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，表示为cyclo-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Phe)。本发明中，以Wang树脂为固相载体，HATU/HOAt为缩合剂，N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，固相合成直链肽前体；液相合环化学制备环肽；所述GG6F由反应产物通过柱色谱纯化，其结构通过核磁共振波谱和质谱进行确证。本发明的制备方法步骤简单、产率高，适用于药物活性环六肽的制备。

Description

环肽化合物GG6F及其制备方法

技术领域

本发明属化学领域，涉及肽类化合物及其化学制备方法，具体涉及环六肽化合物GG6F及其化学制备方法。

背景技术

现有技术公开了环肽类成分在组成结构上与普通(直链)肽类具有结构的高度相似性，但环肽类化合物因其主体结构中氨基酸残基连接成环，与直链肽结构不同，以致药物性质不同：首先，环肽类化合物分子中的游离羧基和氨基等亲水基团消失，使得其水溶性明显减小，在溶剂中的极性降低，化合物的脂溶性增强；第二，游离氨基和羧基的消失，使得所述环肽化合物对体内氨肽酶和羧肽酶的敏感性明显降低，在生物体内的稳定性增加；第三，直链肽成环后，减少了肽链运动的自由度，因而环状多肽在溶液中具有相对稳定和明确的构象，与受体契合的可能性明显提高。研究显示，通常，环肽的代谢稳定性和生物利用度高于直链，因此，环肽类化合物作为药物，与直链肽和其他有机小分子药物相比具有其结构和性质的独特性。

现有技术中，环肽合成的第一步是合成直链肽前体。目前链状肽的合成方法主要有固相和液相两种肽合成方法，由于固相肽合成技术独特的优势，已有若干具有重要生物活性的多肽、激素及蛋白质被陆续合成，促进了生命科学研究的深入发展。

目前，固相法已成为实验室多肽合成的首选方法。固相合成中，将带有保护基的氨基酸连接到固态树脂上，脱去保护基，再将下一个保护氨基酸与第一个氨基酸残基的游离氨基形成肽键，最后脱去保护而再连接下一个氨基酸，如此循环使肽链不断延长直到完成，再用切割试剂将肽链从树脂上分离下来。固相合成免除了传统液相直链合成中的重结晶、蒸馏、萃取、柱层析或者薄层层析等繁重复杂的纯化方法；同时，固相载体对分子的固定作用和对反应底物一端功能基的保护避免了反应底物分子之间的成键，并可确保含多功能基的分子只发生单一功能基反应。

目前，直链肽的合成已趋自动化和商业化，但环状肽的合成还存在着一定的难度，其关键问题在于直链肽的合环的步骤。通常环状肽的合环方式分为首尾相连、侧链之间相连、侧链与端基相连，二硫桥键相连或其他方式相连；其中，肽链首尾相连成环的合成难度更大，因为环肽的前体直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更倾向于形成反式构象，呈舒展状态，造成首尾成环的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内的肽键缩合，更有利于分子间的缩合反应，因此，环肽合成中产率低成为制约因素；另一方面，由于每一个肽链的氨基酸残基不同，或顺序不同，使得每一个环肽合环条件都具有其特殊性，因此，对于有活性的环肽化合物，尚不能用商业化或自动化方法方便地获得，且首尾相连的环状肽的合成尚存在有一定的挑战性。

现有技术的合成首尾相连的环肽的经典方法是在稀溶液（10^-3-10^-4M）中，用活泼酯法或叠氮法将带有保护基的的线性前体肽选择性地活化并合环；使用DCC、DMAP等通用有机缩合剂，产率通常为10-30%，且反应时间通常为数天。

近年氮杂苯骈唑类包括HATU、TBTU和HBTU等化合物新型有机缩合剂的使用，为肽合成方法的研究提供了很大的帮助；但迄今为止，尚未见有关环六肽化合物GG6F尤其是其化学制备方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供环六肽化合物GG6F及其化学制备方法。

本发明所述的制备目标产物环六肽化合物GG6F为环状肽，由六个α-L-氨基酸首尾顺次连接而成，肽链顺序为：环-(Gly-Leu¹-Val-Leu²-Leu³-Phe)；其中，所述氨基酸为甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)；其结构分子式为C₃₄H₅₄N₆O₆，分子量为642，其结构如式(I)所示，

本发明尤其提供了环六肽化合物GG6F的化学制备方法，包括固相合成直链肽、液相合环、萃取和柱色谱分离四部分，步骤为：由Wang树脂以Fomc保护的氨基酸为原料固相化学合成方法制备直链肽，由直链肽首尾相连合环，制成单环肽化合物；其中，所述直链肽的合环，在HOAt/HATU和NMM（氮甲基吗琳）存在下于溶液中完成。

本发明中，制备环六肽化合物GG6F所需设备与试剂包括：

制备前体直链肽反应设备为顶带有磨口，直径5厘米的玻璃色谱柱；合环反应设备为普通园底烧瓶；反应所用试剂包括，接有带Fmoc保护基氨基酸的Wang树脂；HATU：N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridin-1-yl-methylene]-N-methylmethanaminiumhexafluoroposphate N-oxide；DIEA：N,N-diisopro pylethylamine；HOBt：N-hydroxybenzotriazole；HBTU：O-(benzotriazol-1)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate；TEA：2,2,2-trifluoroethanol(三氟乙酸)；DCM：dimethylmthane(二氯甲烷)；乙二硫醇和苯甲硫醚；

反应产物纯化后用质谱仪测定分子量，并用Varian400MHz核磁共振仪进行¹H和¹³C-NMR测定，进行结构确证。

本发明的环六肽化合物GG6F的化学制备方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)以Wang树脂为固相载体，HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作为碱，N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，按氨基酸顺序依次实现酰胺键的构建；其中，每步偶合一定时间后未形成肽键的氨基用乙酸酐和吡啶混合液封端，固相合成直链肽前体；然后以HATU/HOAt为缩合剂，氮甲基吗啉作碱，在N，N-二甲基甲酰胺为溶剂的高稀释溶液中实现液相合环，制得环六肽化合物GG6F；

(2)所得GG6F产物采用萃取进行初步处理，萃取条件为：EtOAc/饱和食盐水；

(3)所得GG6F产物用柱色谱技术进行分离，色谱条件为：硅胶正相柱色谱分离；

所述GG6F纯化产物用高效液相色谱仪器检测，洗脱条件：A：B=95%：5%，其中A为H₂O；B为AcCN；产物分子量为642，分子式为cyclo-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Phe)；

(5)对进行环六肽化合物GG6F核磁共振波谱确证结构：纯化后的GG6F以氘代甲醇为溶剂，用Varian400MHz核磁共振（¹H-NMR和¹³C-NMR）进行结构确定。

本发明的制备方法能克服现有技术的制备方法中反应时间长、产物的立体结构不易得到保证、副产物多且与目标产物极性相似造成的纯化困难、目标产物往往失去天然化合物具有的生物活性等缺陷，具有制备设备步骤简单和产率高的优点，对于药物活性环六肽的制备具有实用价值。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1化学制备GG6F

化学制备方法包括固相合成直链肽、液相合环、萃取和柱色谱分离；

1、合成GG6F直链前体

(1)取树脂：称取一定量Fmoc-Gly-Wang树脂，在DMF中溶胀15min；

(2)脱除Fmoc保护基：在20%的piperidine/DMF溶液中氮气搅拌反应30min；再依次用等体积DMF反复洗涤3次，每次3min；

(3)茚三酮检测：取微量反应后树脂于试管中，加入2滴1%（体积分数，下同）的茚三酮/乙醇溶液，加热约2分钟；树脂呈蓝紫色或紫红色，则表示脱保护成功，进行下步反应；若树脂不变色，则表示脱保护未成功，重复上述反应步骤（1）直到树脂显蓝紫或紫红色；

(4)形成肽键：向树脂中加入3倍量Fmoc-氨基酸、3倍量HOAt、3倍量HATU、5倍量NMM，DMF（10mL/g resin）中搅2-3小时；缩合反应完成后反复用等体积DMF洗涤5次；接入的氨基酸依次为：Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Phe-OH；

(5)茚三酮检测：方法同步骤(3)；若树脂褪去蓝紫色或紫红色，则表示缩合反应完全，可进行下一步反应；若树脂仍呈蓝紫色或紫红色，则表示仍然有未保护的氨基存在，即缩合未完全，须重复上述步骤(2)直到树脂褪去蓝紫色或紫红色；

(6)封端：当重复上述步骤(2)多次，树脂仍未褪去蓝紫色或紫红色，加入乙酸酐/吡啶(1:1,10ml/g树脂)封端，N₂搅拌2h，反应完成后反复用等体积DMF洗涤5次，每次3min

(7)重复步骤(2)、(3)、(4)、(5)、(6)直至肽链完成；

(8)再重复一次步骤(2)、(3)，得到载有脱保护的直链肽的树脂；

(9)直链肽脱树脂:将洗涤干净的树脂再用乙醚洗涤3次，放置，使乙醚挥发完全；将接有直链肽的树脂在三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/乙二硫醇(44：2：2：3：1，体积比，10mL/g resin)中搅拌2小时；将树脂过滤；

(10)将滤液置于离心管中，加入过量乙醚，搅拌后离心，弃上清液，保留沉淀，如此反复操作3次，将沉淀部分置干燥中，使乙醚挥发，即得直链肽粗品；

2、液相合环

将直链肽粗品用DMF稀释至10^-3mol/L，置于冰浴中充分溶解后加入3倍量HOAt、3倍量HATU、10倍量NMM，继续冰浴搅拌2小时，撤去冰浴，继续常温下搅拌40小时，减压蒸馏后得固体残余物；

3、萃取

将合环得到的固体残余物用乙酸乙酯溶解（1mL/100mg固体），混悬液用适量饱和食盐水分两次萃取，取上层有机相，旋蒸至干；

4、柱色谱分离

将萃取得到的固体以300～400目硅胶为固定相，二氯甲烷/甲醇(95:5-94:6)为流动相条件下经两次柱色谱分离，254nm检测，110℃HCl水解，茚三酮显色，将含有环肽的流分合并蒸干，得得GG6F粗产率17%。

5、结构确证

将所述GG6F以氘代甲醇溶解，经核磁共振波谱（¹H-NMR和¹³C-NMR）和质谱确证结构为GG6F。

Claims

1.式(I)结构的环六肽化合物GG6F，其分子式为C₃₄H₅₄N₆O₆，分子量为642，

2.按权利要求1所述的化合物GG6F，其特征在于，所述化合物的六个α-L-氨基酸首尾顺次连接，肽链顺序为：环-(Gly-Leu-Val-Leu-Leu-Phe)。

3.按权利要求2所述的化合物GG6F，其特征在于，所述化合物的α-L-氨基酸组成为：甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)。

4.制备权利要求1的化合物GG6F的化学方法，其特征在于，其包括固相合成直链肽、液相合环、萃取和柱色谱分离四部分，步骤为：由Wang树脂以Fomc保护的氨基酸为原料固相化学合成方法制备直链肽，由直链肽首尾相连合环，制成单环肽化合物；其中，所述直链肽的合环，在HOAt/HATU和NMM（氮甲基吗琳）存在下于溶液中完成。

5.按权利要求4的方法，其特征在于，所述方法中，以Wang树脂在HOAt/HATU和NMM条件下固相合成直链肽，在溶液中形成头尾相连的环状肽。

6.按权利要求4的方法，其特征在于，所述的合成原料氨基酸为Fomc保护氨基酸。

7.按权利要求4的方法，其特征在于，其中采用接Wang树脂的Gly为合成直链肽的起始氨基酸。

8.权利要求1所述的化合物GG6F在制备药物合成的先导化合物中的用途。