CN106554406B - 一种乌拉立肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，公开了一种乌拉立肽的合成方法。本发明所述合成方法将保护的Tyr与离子液体载体在偶联体系的作用下偶联；然后按照乌拉立肽的肽序固相合成剩余保护氨基酸，获得乌拉立肽线性肽离子液体肽载体，然后裂解获得线性肽粗品；线性肽粗品氧化获得形成二硫键的乌拉立肽粗品；乌拉立肽粗品纯化获得精肽。本发明以室温离子液体载体替代了传统固相合成中的树脂载体以及氧化环节中的有机溶剂和水的液相氧化介质，使得固相合成的乌拉立肽线性肽粗肽纯度得到显著提高，同时氧化反应时间可大幅减少，操作方便，避免有机废液的产生。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种乌拉立肽的合成方法。
背景技术
乌拉立肽(Ularitide)是从人体尿液中分离出来的一种利钠肽，其分析结构与心房利钠肽类似，区别仅仅是在于其序列N-端多出四个氨基酸残基。相关的研究表明，乌拉立肽具有扩张血管、扩张支气管和利尿等多种作用，临床上对心力衰竭、肾衰竭、肺动脉高压及支气管哮喘均有一定的治疗作用。
乌拉立肽的结构为32个氨基酸组成的含有一对分子内二硫键的多肽，一般通过化学合成制得，序列结构为：
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH(S-S)。
目前，针对乌拉立肽的合成方法，主要有两种。一种是在固相中完成线性肽肽树脂的偶联，然后采用碘固相氧化形成相应的二硫键；另一种方法是先固相合成线性肽前体，然后在浓度非常低的有机溶剂/水溶液中，液相氧化形成相应的二硫键。
前者的合成方法中采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，然后加入固体碘单质，氧化形成二硫键，得到氧化后成环的肽树脂，裂解后得到粗品。该合成方法虽然合成步骤简单，但是在偶联肽树脂过程中，部分残基偶联困难，得到的粗肽纯度较低。同时采用碘在肽树脂上进行氧化，碘在整个过程中难以完全洗脱，容易导致最终的纯品即原料药中含有微量的碘，导致原料药偏黄色。此外，采用强氧化剂对肽进行氧化，容易破坏肽序自身的二级结构，最终将影响肽本身的生物活性及药效。
而后者的合成方法中同样采用Fmoc固相肽合成技术，以Wang树脂为起始原料，依次偶联各个氨基酸残基，得到线性肽树脂，线性肽树脂裂解后，得到线性肽粗肽。粗肽经过HPLC纯化，得到线性肽精肽。线性肽精肽用甲醇或者乙腈溶解，加入水稀释到10-3mg/ml的浓度，空气条件下氧化72h，得到氧化后的环肽粗品。环肽粗品经过HPLC纯化后，得到精肽。该方法具有与前者的合成方案相同的缺点，即部分残基偶联困难，线性肽粗品纯度较低。相对于前者的优势是，最终产物的空间二级结构能够得到完整的保留，最终精肽的生物活性相对于前者来说要好一些。但是，采用该方案进行氧化，由于乌拉立肽溶解困难，且最终氧化需要在非常稀的浓度下进行，操作非常困难，同时反应时间长，不利于大规模生产。此外，该方法会产生大量的有机溶剂和水的混合废液，在环保上也不利于绿色化学的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种乌拉立肽的合成方法，使得所述合成方法能够提高乌拉立肽线性肽粗品的纯度和收率以及最终的总收率。
本发明的另一个目的在于提供一种乌拉立肽的合成方法，使得所述合成方法缩短氧化时间，且操作方便、绿色环保。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种乌拉立肽的合成方法，包括：
步骤1、合成离子液体载体；
步骤2、将保护的Tyr与离子液体载体在偶联体系的作用下偶联；
步骤3、按照乌拉立肽的肽序固相合成剩余保护氨基酸，获得乌拉立肽线性肽离子液体肽载体，然后裂解获得线性肽粗品；
步骤4、线性肽粗品氧化获得形成二硫键的乌拉立肽粗品；
步骤5、乌拉立肽粗品纯化获得精肽。
针对现有固相合成方法的粗肽纯度较低的缺陷，本发明提供一种新型固相肽偶联方法，即采用室温离子液体作为载体替代常规使用的树脂载体进行固相合成，可提高线性肽粗品的纯度和收率以及最终的总收率。
其中，所述离子液体载体优选自N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]、N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]、吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]、吡啶乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]。
本发明所采用的离子液体载体在明确了阳离子和阴离子后可按照该领域一般的直接合成法或两步法进行合成(可参照百度百科离子液体词条中记载的合成方案)，作为优选，本发明以N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐为例给出了两步法合成离子液体载体的方案：
称取120mmol的N-甲基咪唑，加入等摩尔量的氯乙醇，微波条件下加热到80℃，反应10min，停止反应，得到N-甲基咪唑乙醇氯。N-甲基咪唑乙醇氯与四氟硼酸铵进行离子交换，得到N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸载体[PEG1min][BF4]。
其他离子液体载体合成在更换对应物质后可参照上述合成方案进行合成。
在本发明合成方法中，所述保护氨基酸或者保护的aa(aa指代某具体氨基酸)是指以保护基保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等易于发生干扰反应基团的氨基酸。对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团。作为优选，所述保护的Tyr为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
在将保护的Tyr连接到离子液体载体上的步骤中，步骤2所述偶联体系优选为DCC/DMAP双偶联体系，保护的Tyr、DCC和DMAP的摩尔比可参照5:6:1或其他适宜的比例。反应溶剂可采用乙腈等有机溶剂
本发明步骤3可采用现有常规的固相合成方法进行剩余氨基酸的偶联，反应溶剂可采用常规的DMF，作为优选，步骤3为：
按照乌拉立肽C端到N端肽序，利用偶联体系逐一偶联以下剩余保护氨基酸：
Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH；
偶联完成后脱Fmoc保护基获得乌拉立肽线性肽离子液体肽载体，然后裂解获得线性肽粗品。
上述固相合成剩余氨基酸的偶联体系包括DIC+A或B+A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP。
作为优选，所述裂解采用体积比TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-5:0-2:1-5的裂解试剂裂解1.5-3.5h；更优选为采用体积比TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:2:1:4的裂解试剂裂解2.5h。
在保护的Try以及后续氨基酸的偶联过程中，由于N端均有Fmoc等保护基保护，故需要每次脱保护基，这是固相合成中常规步骤，本发明采用含有20％六氢吡啶的乙腈溶液，也可以使用其他适宜的试剂进行脱除。
本发明采用室温离子液体进行氨基酸偶联可显著提高乌拉立肽线性肽粗肽的收率和纯度以及最终的总收率，在此基础上本发明提供一种温和的氧化反应体系，即使用熔点在20℃以下的离子液体替代现有的有机溶剂和水为液相氧化的媒介，该体系对于乌拉立肽具有非常好的溶解性，可以在较高的浓度范围内进行氧化，不需要稀释到非常低的浓度下进行，操作方便，同时可以大大缩短氧化反应时间为0.5-3h，避免产生有机废液，且增加乌拉立肽的生物活性，可以实现大规模生产。
具体到步骤4优选为：
线性肽粗品加入到熔点在20℃以下的离子液体中，在碱性环境下氧化0.5-3h获得形成二硫键的乌拉立肽粗品。
其中，所述碱性条件可参照现有液相氧化方法中的碱性条件，例如调节pH为7.0-7.5或更高范围内，而终止氧化反应调节pH至酸性即可，氧化时间在本发明的一些具体实施方式中可以选择0.5h、1h、2h或3h。
作为优选，所述离子液体的阳离子为1-乙基-3-甲基咪唑阳离子或1-丁基-3-甲基咪唑阳离子。
优选地，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐[C2mim][OAc]、1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐[C2mim][TFA]、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[C2mim][PF6]、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐[C4mim][OAc]、1-丁基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐[C4mim][TFA]或1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[C4mim][PF6]。更优选地，所述氧化时乌拉立肽线性肽粗肽的浓度为20-200mg线性肽/mL离子液体。在本发明的一些具体实施方式中，乌拉立肽线性肽粗肽或精肽的浓度可以选择20.1mg/mL、50.25mg/mL、52.4mg/mL、82.25mg/mL、82.65mg/mL、100.5mg/mL。
本发明所述纯化乌拉立肽粗品的方法可采用本领域内的常规纯化方法，比如HPLC纯化方法进行纯化。具体地，本发明按照如下方法进行纯化：
取氧化后的乌拉立肽粗品，采用Waters 2454RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相C18柱，流动相：A相：0.3％TFA/乙腈溶液(v/v)；B相：乙腈，梯度：B％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽。
基于上述本发明具有的有益效果，本发明提供了离子液体在固相合成乌拉立肽线性肽中的应用。其中，所述离子液体优选自N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]、N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]、吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]、吡啶乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]。
由以上技术方案可知，本发明以室温离子液体载体替代了传统固相合成中的树脂载体以及氧化环节中的有机溶剂和水的液相氧化介质，使得固相合成的乌拉立肽线性肽粗肽纯度得到显著提高，同时氧化反应时间可大幅减少，操作方便，避免有机废液的产生。
具体实施方式
本发明公开了一种乌拉立肽的合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的合成方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中的一些缩略语和关键术语定义如下表，保护氨基酸等合成中常用试剂和材料购于吉尔生化公司、天津南开和成公司。
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| tBu | 叔丁基 |
| Trt | 三苯甲基 |
| Pbf | 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DBLK | 20％六氢吡啶/DMF溶液 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| PyBOP | 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸 |
| HBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸 |
| HOBT | 1-羟基苯并三唑 |
| HOAT | 1-羟基-7偶氮-苯并三唑 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| EDT | 1,2-乙二硫醇 |
| PhOH | 苯酚 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]的制备
称取120mmol的N-甲基咪唑，加入等摩尔量的氯乙醇，微波条件下加热到80℃，反应10min，停止反应，得到N-甲基咪唑乙醇氯。N-甲基咪唑乙醇氯与四氟硼酸铵进行离子交换，得到N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸载体[PEG1min][BF4](反应式见发明内容SCHEME 1)。
实施例2：N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]的制备
参考实施例1的方法，称取120mmol的N-甲基咪唑，加入等摩尔量的氯乙醇，微波条件下加热到80℃，反应10min，停止反应，得到N-甲基咪唑乙醇氯。N-甲基咪唑乙醇氯与六氟磷酸铵进行离子交换，得到N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸载体[PEG1min][PF6]。
实施例3：吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]的制备
参考实施例1的方法，称取120mmol的吡啶，加入等摩尔量的氯乙醇，微波条件下加热到80℃，反应10min，停止反应，得到吡啶乙醇氯。吡啶乙醇氯与四氟硼酸铵进行离子交换，得到吡啶乙醇四氟硼酸载体[PEG1py][BF4]。
实施例4：吡啶六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]的制备
参考实施例1的方法，称取120mmol的吡啶，加入等摩尔量的氯乙醇，微波条件下加热到80℃，反应10min，停止反应，得到吡啶乙醇氯。吡啶乙醇氯与六氟磷酸铵进行离子交换，得到吡啶乙醇六氟磷酸载体[PEG1py][PF6]。
实施例5：Fmoc-Tyr(tBu)-OH与N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]的偶联
用乙醚清洗干净实施例1中的离子液体载体，加入50ml乙腈，倒入固相反应柱中；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH 23克(50mmol)，DCC 16.2克(60mmol)，DMAP 1.2克(10mmol)，用50ml DMF溶解，加入上述载体中，鼓氮气反应2小时后，加入3倍体积(300ml)的乙醚，充分搅拌，多次用乙醚清洗反应的副产物和未反应的原料，加入70ml醋酸酐和60ml吡啶，混合封闭2h，乙醚洗涤三次，得到偶联好Fmoc-Tyr(tBu)-OH的N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]。
实施例6：Fmoc-Tyr(tBu)-OH与N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]的偶联
参照实施例5的方法制备获得。
实施例7：Fmoc-Tyr(tBu)-OH与吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]的偶联
参照实施例5的方法制备获得。
实施例8：Fmoc-Tyr(tBu)-OH与吡啶乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]的偶联
参照实施例5的方法制备获得。
实施例9：剩余氨基酸的偶联(N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体)
往实施例5中的反应柱加入含有20％六氢吡啶的乙腈溶液100ml，鼓泡反应5min，脱除Fmoc保护基团，用300ml乙醚洗涤6次。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH64.5克(100mmol)，HOAt16.3克(120mmol)，用DMF/乙腈(1:1，v/v)混合溶液100ml溶解，0℃冰水浴下加入15.1克DIC(120mmol)，活化5分钟，加入反应柱，鼓氮气反应2小时后，加入300ml乙醚洗涤树脂，再次用300ml乙醚依次洗涤树脂三次，用含有20％六氢吡啶的乙腈溶液脱除Fmoc保护基团，用乙醚洗涤6次。重复上述偶联操作，按照肽序依次偶联Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu-OH。反应结束后，乙醚洗涤，得到乌拉立肽线性肽结合N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体。
实施例10：剩余氨基酸的偶联(N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐)
取实施例6中载体，按照实施例9的方法进行偶联，得到乌拉立肽线性肽结合N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸载体[PEG1min][PF6]。
实施例11：剩余氨基酸的偶联(吡啶乙醇四氟硼酸盐载体)
取实施例7中载体，按照实施例9的方法进行偶联，得到乌拉立肽线性肽结合吡啶乙醇四氟硼酸载体[PEG1py][BF4]。
实施例12：剩余氨基酸的偶联(吡啶乙醇六氟磷酸盐载体)
取实施例8中载体，按照实施例9的方法进行偶联，得到乌拉立肽线性肽结合吡啶乙醇六氟磷酸载体[PEG1py][PF6]。
实施例13：乌拉立肽线性肽粗肽的制备
将实施例9得到的线性肽载体，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000mlTFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:2:1:4(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉树脂，树脂用100mlTFA洗涤，合并滤液，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体162.1克，收率92.5％，HPLC纯度86.61％。
实施例14：乌拉立肽线性肽粗肽的制备
将实施例10得到的线性肽载体，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000ml TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:3:1:3(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉载体，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体160.7克，收率91.3％，HPLC纯度84.52％。
实施例15：乌拉立肽线性肽粗肽的制备
将实施例11得到的线性肽载体，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000ml TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:2:2:2:4(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉载体，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体165.3克，收率94.0％。HPLC纯度88.32％。
实施例16：乌拉立肽线性肽粗肽的制备
将实施例12得到的线性肽载体，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000ml TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:1:3:3:3(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉载体，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体164.5克，收率93.8％。HPLC纯度89.47％。
实施例17：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例13中得到的52.4g线性肽粗肽，溶于1.0L[C2mim][OAc]中(氧化反应浓度为52.4mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例18：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例13中得到的52.4g线性肽粗肽，溶于1.0L[C2mim][TFA]中(氧化反应浓度为52.4mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例19：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例13中得到的52.4g线性肽粗肽，溶于1.0L[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为52.4mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例20：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例14中得到的40.2g线性肽粗肽，溶于2.0L[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为20.1mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应1.0h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例21：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例14中得到的40.2g线性肽粗肽，溶于0.8L[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为50.25mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应3.0h，加0.2L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例22：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例14中得到的40.2g线性肽粗肽，溶于0.4L[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为100.5mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应2.0h，加0.2L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例23：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例14中得到的40.2g线性肽粗肽，溶于0.2L[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为100.5mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.1L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例24：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例15中得到的165.3线性肽粗肽，溶于2.0[C2mim][PF6]中(氧化反应浓度为82.65mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例25：乌拉立肽二硫键环肽粗肽的合成
将实施例16中得到的164.5g线性肽粗肽，溶于2.0[C2mim][TFA]中(氧化反应浓度为82.25mg/mL)，用氨水调节pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应0.5h，加0.5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节溶液pH值为酸性，氧化完成。
实施例26：乌拉立肽精肽的制备
取实施例17中氧化后的粗肽溶液，采用Waters 2454RP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为100×500mm反相C18柱，流动相：A相：0.3％TFA/乙腈溶液(v/v)；B相：乙腈，梯度：B％：38％～68％，流速：6毫升/分钟，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到乌拉立肽精肽44.9g，HPLC纯度99.34％，总收率77.0％。
实施例27：乌拉立肽精肽的制备
取实施例18中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽47.8g，HPLC纯度99.04％，总收率82.1％。
实施例28：乌拉立肽精肽的制备
取实施例19中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽48.3g，HPLC纯度99.57％，总收率82.9％。
实施例29：乌拉立肽精肽的制备
取实施例20中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽35.7g，HPLC纯度99.61％，总收率81.6％。
实施例30：乌拉立肽精肽的制备
取实施例21中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽36.3g，HPLC纯度99.41％，总收率83.0％。
实施例31：乌拉立肽精肽的制备
取实施例22中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽35.9g，HPLC纯度99.35％，总收率82.1％。
实施例32：乌拉立肽精肽的制备
取实施例23中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽33.8g，HPLC纯度99.11％，总收率77.3％。
实施例33：乌拉立肽精肽的制备
取实施例24中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽142.7g，HPLC纯度99.72％，总收率81.5％。
实施例34：乌拉立肽精肽的制备
取实施例25中氧化后的粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽139.8g，HPLC纯度99.32％，总收率79.9％。
实施例35：现有固相合成方法合成乌拉立肽
1、乌拉立肽线性肽肽树脂的制备
使用Wang Resin作为起始原料，以100mmol为合成规模，根据目前标准的固相肽合成方法，按照乌拉立肽C端到N端肽序，利用偶联体系逐一偶联以下氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH；
偶联完成后脱Fmoc保护基获得804g(100mmol)乌拉立肽线性肽肽树脂。
2、乌拉立肽线性肽肽树脂的氧化反应(碘氧化方法)
取乌拉立肽线性肽肽树脂50mmol，往肽树脂中加入200mmol的碘的DMF溶液，鼓氮气氧化反应2h，抽干反应液，得到398.2g乌拉立肽肽树脂。
3、乌拉立肽粗肽的制备
将得到的乌拉立肽肽树脂，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000mlTFA：TIS：PhOH：H2O＝90:3:3:4(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉载体，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体126.5克，收率72.3％。HPLC纯度48.62％。
4、乌拉立肽精肽的制备
取所获得的粗肽，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽43.4g，HPLC纯度99.12％，总收率24.8％。
实施例36：现有固相合成方法合成乌拉立肽
1、乌拉立肽线性肽粗肽的制备
取实施例35得到的乌拉立肽线性肽肽树脂402g(50mmol)，加入到5000ml单口烧瓶中，预先配置裂解液4000ml TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝90:3:2:1:4(体积比)，将裂解液加入到烧瓶中，室温反应2.5小时，滤掉载体，加入到40000ml的冷冻无水乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥后得到白色固体166.3克，收率95.0％。HPLC纯度56.8％。
2、乌拉立肽线性肽粗肽的氧化反应
取得到的线性肽粗肽166.3g，溶于2.0L DMF中，加入198L水稀释至200L，用氨水调节溶液pH为7.0-7.5碱性环境，室温下轻微搅拌，氧化反应48.0h(HPLC监测反应进程)，加5L浓度为0.1％的TFA水溶液调节pH为酸性，氧化完成。得到乌拉立肽的粗品纯度为50.46％。
3、乌拉立肽精肽的制备
取2中粗肽溶液，采用实施例26中的纯化方法进行纯化，得到乌拉立肽精肽65.8g，HPLC纯度99.09％，总收率37.6％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种乌拉立肽的合成方法，其特征在于，包括：
步骤1、合成离子液体载体；所述离子液体载体选自N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]、N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]、吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]、吡啶乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]；
步骤2、将保护的Tyr与离子液体载体在偶联体系的作用下偶联；
步骤3、按照乌拉立肽的肽序固相合成剩余保护氨基酸，获得乌拉立肽线性肽离子液体肽载体，然后裂解获得线性肽粗品；
步骤4、线性肽粗品氧化获得形成二硫键的乌拉立肽粗品；
步骤5、乌拉立肽粗品纯化获得精肽。
2.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，所述保护的Tyr为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
3.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤2所述偶联体系为DCC/DMAP双偶联体系。
4.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤3为：
按照乌拉立肽C端到N端肽序，利用偶联体系逐一偶联以下剩余保护氨基酸：
Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH；
偶联完成后脱Fmoc保护基获得乌拉立肽线性肽离子液体肽载体，然后裂解获得线性肽粗品。
5.根据权利要求4所述合成方法，其特征在于，所述偶联体系包括DIC+A或B+A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP。
6.根据权利要求1或4所述合成方法，其特征在于，所述裂解采用体积比TFA：TIS：EDT：PhOH：H2O＝85-95:2-5:0-5:0-2:1-5的裂解试剂裂解1.5-3.5h。
7.根据权利要求1所述合成方法，其特征在于，步骤3为：
线性肽粗品加入到熔点在20℃以下的离子液体中，在碱性环境下氧化0.5-3h获得形成二硫键的乌拉立肽粗品。
8.根据权利要求7所述合成方法，其特征在于，所述离子液体的阳离子为1-乙基-3-甲基咪唑阳离子或1-丁基-3-甲基咪唑阳离子。
9.根据权利要求7或8所述合成方法，其特征在于，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐[C2mim][OAc]、1-乙基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐[C2mim][TFA]、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[C2mim][PF6]、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐[C4mim][OAc]、1-丁基-3-甲基咪唑三氟乙酸盐[C4mim][TFA]或1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[C4mim][PF6]。
10.离子液体在固相合成乌拉立肽线性肽中的应用；所述离子液体包括N-甲基咪唑乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1min][BF4]、N-甲基咪唑乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1min][PF6]、吡啶乙醇四氟硼酸盐载体[PEG1py][BF4]、吡啶乙醇六氟磷酸盐载体[PEG1py][PF6]。
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