CN103145827A - 一种乌拉力肽的固相合成方法 - Google Patents

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CN103145827A CN2013100668009A CN201310066800A CN103145827A CN 103145827 A CN103145827 A CN 103145827A CN 2013100668009 A CN2013100668009 A CN 2013100668009A CN 201310066800 A CN201310066800 A CN 201310066800A CN 103145827 A CN103145827 A CN 103145827A
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徐红岩
竺剑峰
张所德
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Shanghai GL peptide Ltd
WUXI ASIAPEPTIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
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Shanghai GL peptide Ltd
WUXI ASIAPEPTIDE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种固相合成乌拉力肽的方法。主要解决目前没有适于工业化制备乌拉力肽方法的技术问题。本发明采用固相合成方法，主要包括以下几个步骤：1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树；2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将三十二肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到乌拉力肽直链肽粗品；3）将乌拉力肽直链肽粗品溶解于水中进行空气氧化成环，得到乌拉力肽粗品肽。本发明具备大规模化生产能力，操作简易、工艺稳定、生产成本低，总收率超过20%。

Description

一种乌拉力肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及一种乌拉力肽的合成方法，特别涉及一种乌拉力肽的固相合成法。
背景技术
乌拉力肽，中文名称乌拉力肽，英文名称Ularitide；Urodilatin，是一种含有32个氨基酸残基的二硫桥环肽，它的分子式是C145H234N52O44S3，分子量：3506.00，CAS号为：118812-69-4，多肽序列为Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr[Disulfidebridge:11-27]，结构式如下：
Figure 744911DEST_PATH_IMAGE001
乌拉力肽归类于利钠肽类药物，是一种肾脏分泌尿钠素的生物工程学产品，不仅具有尿钠排泄及利尿作用，而且有明显的扩血管效应，适用于失代偿性心力衰竭，急性心力衰竭，急性肾衰竭及支气管哮喘等病症。该产品由CardioPep Pharma公司开发并生产，由Protein Design Labs公司进行临床开发及市场推广，同时近期研究表明随着本品用药剂量的增加，PCWP、全身血管阻抗以及N末端-前脑钠肽(N-ProBNP)均降低，而心排血量却增加，并伴患者呼吸困难症状明显改善。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的乌拉力肽的固相合成方法。主要解决目前没有适于工业化制备乌拉力肽方法的技术问题。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种乌拉力肽的固相合成方法，包括如下步骤：
1）以Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；
2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将三十二肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基 团，得到乌拉力肽直链肽粗品；
3）将乌拉力肽直链肽粗品溶解于水中进行空气氧化成环，得到乌拉力肽粗品肽溶液。
具体步骤如下：
⑴取Fmoc-Tyr(tbu)-王树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH、NMM或DIEA，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/HOAT中的一种混合物作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)-王树脂；
Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂取代度为：0.2mmol/g~1.0mmol/g，更为优化的方案为0.35mmol/g；
Fmoc-Arg(pbf)-OH的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为树脂摩尔量的2倍。
⑵在步骤（1）获得的树脂中，加入脱帽试剂，反应10-30分钟，抽干，用DMF洗涤5-10次，抽干，以DMF为溶剂，加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸、NMM或DIEA，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/HOAT中的一种混合物作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸。用DMF洗涤3-5次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到侧链全保护的肽链树脂，即Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂；
脱帽试剂的配比为10%-30%的PIP/DMF(v/v)溶液，更为优化的方案为20%的PIP/DMF(v/v)溶液；
Fmoc保护的氨基酸的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为树脂摩尔量的2倍；
缩合试剂（HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/HOAT中的一种混合物）的量为树脂摩尔量的1-5倍，更为优化的方案为HBTU/HOBT 的量为树脂摩尔量的2倍；
NMM或DIEA的量为树脂摩尔量的2-10倍，更为优化的方案为NMM为树脂摩尔量的4倍；
所说的具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH。
按照本发明，所述的切肽包括如下步骤：
将上述步骤(2)所获得的侧链全保护的肽链树脂中加入切割试剂，切割试剂的配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)；反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品。
按照本发明，所述的直链肽氧化成环包括如下步骤：
将乌拉力肽直链肽粗品按1-5g/L的浓度溶解于纯水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值8-10之间，搅拌反应6-24小时，进行空气氧化反应成环，并用质谱检测反应终点，得到乌拉力肽粗品肽溶液；
更为优化的方案是选择2g/L的水溶液浓度，调pH值到8.5。
本发明中一些常用缩写具有以下含义
HBTU：O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HATU：O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
TBTU：O-(苯并三唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐
DIC：二异丙基碳二亚胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三唑
DIEA：二异丙基乙胺
NMM：N-甲基吗啉
Fmoc：芴甲氧羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5磺酰基
Trt：三苯甲基
Tbu：叔丁基
Otbu：叔丁氧基
Pro：脯氨酸
Thr：苏氨酸
Gly：甘氨酸
Ala：丙氨酸
Ser：丝氨酸
Asn：天冬酰胺
Asp：天冬氨酸
Arg：精氨酸
Tyr：酪氨酸
Gln：谷氨酰胺
Leu：亮氨酸
Ile：异亮氨酸
Met：蛋氨酸
Phe：苯丙氨酸
Cys：半胱氨酸
Piperide：哌啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
TFA：三氟乙酸
EDT：乙二硫醇
Tis：三异丙基硅烷。
本发明的有益效果：本发明具备大规模化生产能力，操作简易、工艺稳定、生产成本低，总收率超过20%。
具体实施方式
以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述，但本发明不限于这具体实例。
实施例1
1) 制备Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂
称取Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂47.6克(0.42mmol/g, 20mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8，60mmol) 38.9g，TBTU(MW:321.1，60mmol) 19.3g，HOBT(MW:135.1，60mmol) 8.1g，DIEA(MW:129.24，120mmol)20ml，DMF500ml，反应1.5小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
2）制备Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
在步骤（1）获得的Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、DIEA、TBTU/HOBT、，反应1.5小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸之后，DMF洗涤3次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂共155g。
   每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，60mmol)23.3g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，60mmol)23g，
Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，60mmol)35.8g，
Fmoc-Cys(trt)-OH(MW:585.7，60mmol)35.2g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，60mmol)17.9g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，60mmol)21.2g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，60mmol)17.9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，60mmol)23g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，60mmol)36.7g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，60mmol)18.7g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，60mmol)17.9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，60mmol)21.2g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，60mmol)39.0g，
Fmoc-Asp(Otbu)-OH(MW:411.5，60mmol)24.7g，
Fmoc-Met-OH(MW:371.5，60mmol)22.3g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，60mmol)39.0g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，60mmol)17.9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，60mmol)17.9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，60mmol)23.3g，
Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，60mmol)35.2g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，60mmol)23g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，60mmol)23g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，60mmol)39.0g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，60mmol)39.0g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，60mmol)21.2g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，60mmol)23g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，60mmol)39.0g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，60mmol)20.3g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，60mmol)18.7g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，60mmol)23.9g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：TBTU(MW:321.1，60mmol) 19.3g，HOBT(MW:135.1，60mmol) 8.1g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：DIEA(MW:129.24，120mmol)20ml。
3）制备乌拉力肽直链肽粗品
取步骤（2）中的Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂 155g，置于2L的圆底烧瓶中，加入1500ml切割试剂，配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入7500ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品58g，粗品实际收率82.8%%，粗品纯度46.3%。
4) 对乌拉力肽直链肽进行二硫键搭桥氧化反应，制备获得乌拉力肽粗品溶液。
将步骤（3）中获得的乌拉力肽直链肽粗品共58g溶于58L 水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值至8.0，机械搅拌反应18小时，质谱检测已氧化完全，取小样用高效液相色谱检测分析得乌拉力肽粗品纯度为38.3%。
实施例2
1) 制备Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂
称取Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂57.1克(0.35mmol/g, 20mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8，40mmol) 26.0g，HBTU(MW:379.2，40mmol) 15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，NMM (MW:102.1，80mmol)9.0ml，DMF500ml，反应1小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
 2）制备Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
在步骤（1）获得的Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、NMM、HBTU/HOBT、，反应1小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸之后，DMF洗涤3次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂共172g。
   每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，40mmol)23.9g，
Fmoc-Cys(trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，40mmol)24.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Asp(Otbu)-OH(MW:411.5，40mmol)16.5g，
Fmoc-Met-OH(MW:371.5，40mmol)14.9g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，40mmol)13.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，40mmol)15.9g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HBTU(MW:379.2，40mmol) 15.2g，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102，80mmol)9.0ml。
3）制备乌拉力肽直链肽粗品
取步骤（2）中的Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂172g，置于2L的圆底烧瓶中，加入1700ml切割试剂，配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入8500ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品64g，粗品实际收率91.4%%，粗品纯度59.6%。
4) 对乌拉力肽直链肽进行二硫键搭桥氧化反应，制备获得乌拉力肽粗品溶液。
将步骤（3）中获得的乌拉力肽直链肽粗品共64g溶于32L 水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值至8.5，机械搅拌反应12小时，质谱检测已氧化完全，取小样用高效液相色谱检测分析得乌拉力肽粗品纯度为56.2%。
实施例3
1) 制备Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂
称取Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂43.5克(0.46mmol/g, 20mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8，40mmol) 26.0g，HATU(MW:380.2，40mmol) 15.2g，HOAT(MW:136.1，40mmol) 5.4g，NMM (MW:102.1，80mmol)9.0ml，DMF500ml，反应0.5小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
2）制备Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
在步骤（1）获得的Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、NMM、HATU/HOAT、，反应0.5小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸之后，DMF洗涤3次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂共160g。
   每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，40mmol)23.9g，
Fmoc-Cys(trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，40mmol)24.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Asp(Otbu)-OH(MW:411.5，40mmol)16.5g，
Fmoc-Met-OH(MW:371.5，40mmol)14.9g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，40mmol)13.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，40mmol)15.9g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：HATU(MW:380.2，40mmol) 15.2g，HOAT(MW:136.1，40mmol) 5.4g，
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102，80mmol)9.0ml。
3）制备乌拉力肽直链肽粗品
取步骤（2）中的Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂 160g，置于2L的圆底烧瓶中，加入1600ml切割试剂，配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入8000ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品61g，粗品实际收率87.1%%，粗品纯度52.6%。
4) 对乌拉力肽直链肽进行二硫键搭桥氧化反应，制备获得乌拉力肽粗品溶液。
将步骤（3）中获得的乌拉力肽直链肽粗品共61g溶于30L 水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值至8.5，机械搅拌反应12小时，质谱检测已氧化完全，取小样用高效液相色谱检测分析得乌拉力肽粗品纯度为48.9%。
实施例4
制备Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂
称取Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂57.1克(0.35mmol/g, 20mmol)，用800ml DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，抽干，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8，40mmol) 26.0g，DIC(MW:126，40mmol) 6.2ml，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g，NMM (MW:102.1，80mmol)9.0ml，DMF500ml，反应2小时，茚三酮检测树脂无色透明，抽干，用DMF洗涤3次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
2）制备Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂。
在步骤（1）获得的Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂中，加入800ml脱帽试剂(20%的PIP/DMF(v/v)溶液)，反应30分钟，抽干，用DMF洗涤6次，抽干，以DMF做溶剂，加入具有Fmoc保护的氨基酸、NMM、DIC/HOBT、，反应2小时，检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸之后，DMF洗涤3次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，获得Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂共168g。
   每一步缩合反应所加入的氨基酸的量分别为：
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW:596.7，40mmol)23.9g，
Fmoc-Cys(trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW:610.7，40mmol)24.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Ile-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Asp(Otbu)-OH(MW:411.5，40mmol)16.5g，
Fmoc-Met-OH(MW:371.5，40mmol)14.9g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Gly-OH(MW:297.3，40mmol)11.9g，
Fmoc-Phe-OH(MW:387.4，40mmol)15.5g，
Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW:585.7，40mmol)23.5g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Leu-OH(MW:353.4，40mmol)14.2g，
Fmoc-Ser(tbu)-OH(MW:383.4，40mmol)15.4g，
Fmoc-Arg(pbf)-OH(MW:648.8，40mmol) 26.0g，
Fmoc-Pro-OH(MW:337.4，40mmol)13.5g，
Fmoc-Ala-OH(MW:311.3，40mmol)12.5g，
Fmoc-Thr(tbu)-OH(MW:397.5，40mmol)15.9g。
每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为：DIC(MW:126，40mmol) 6.2ml，HOBT(MW:135.1，40mmol) 5.4g， 
每一步缩合反应所添加的有机碱的量为：NMM(MW:102，80mmol)9.0ml。
3）制备乌拉力肽直链肽粗品
取步骤（2）中的Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂 168g，置于2L的圆底烧瓶中，加入1600ml切割试剂，配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)，置于恒温摇床中25℃振荡反应2.5小时，抽滤滤掉树脂颗粒，收集滤液，然后加入8000ml乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品60g，粗品实际收率85.7%%，粗品纯度48.7%。
4) 对乌拉力肽直链肽进行二硫键搭桥氧化反应，制备获得乌拉力肽粗品溶液。
将步骤（3）中获得的乌拉力肽直链肽粗品共60g溶于30L 水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值至8.5，机械搅拌反应12小时，质谱检测已氧化完全，取小样用高效液相色谱检测分析得乌拉力肽粗品纯度为45.3.%。

Claims (8)

1.一种乌拉力肽的固相合成法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保护氨基酸，合成得到侧链全保护的肽链树脂；
2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将三十二肽从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得到乌拉力肽直链肽粗品；
3）将乌拉力肽直链肽粗品溶解于水中进行空气氧化成环，得到乌拉力肽粗品肽溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）具体内容包括如下步骤
（1）取Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，抽干，加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH、NMM或DIEA，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/HOAT中的一种混合物作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，获得Fmoc-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂；
（2）在步骤（1）获得的树脂中，加入脱帽试剂，反应10-30分钟，抽干，用DMF洗涤5-10次，抽干，以DMF为溶剂，加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸、NMM或DIEA，用HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、DIC/HOBT、HATU/HOAT中的一种混合物作为缩合剂，反应0.5-2小时，茚三酮法检测反应终点，抽干，用DMF洗涤3-5次，抽干，然后再加入脱保护试剂，脱保护反应，再加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，如此反复，直至连完最后一个苏氨酸；用DMF洗涤3-5次，再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤3次，最后加甲醇收缩树脂，抽干，真空干燥，得到侧链全保护的肽链树脂，即Thr(tbu)-Ala-Pro-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(pbf)-Met-Asp(Otbu)-Arg(pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tbu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tbu)-Phe-Arg(pbf)-Tyr(tbu)- 王树脂；
所说的具有芴甲氧羰基保护的氨基酸，依次包括Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-OH。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂的取代度在0.2mmol/g-1.0mmol/g之间，Fmoc-Arg(pbf)-OH的量为树脂摩尔量的1-5倍；脱帽试剂为体积百分含量10－30%的PIP/DMF混合溶液，每一步保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的1-5倍，缩合试剂的量是树脂摩尔量的1-5倍，NMM或DIEA的量是树脂摩尔量的2-10倍，每一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，Fmoc-Tyr(tbu)- 王树脂的取代度为0.35mmol/g，Fmoc-Arg(pbf)-OH的量为树脂摩尔量的2倍；脱帽试剂为体积百分含量20%的PIP/DMF混合溶液，每一步保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的2倍，缩合试剂为HBTU/HOBT，其用量是树脂摩尔量的2倍，NMM的量是树脂摩尔量的4倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）包括如下步骤：在侧链全保护的肽链树脂中加入切割试剂，反应1-3小时，抽滤滤掉树脂颗粒，并收集滤液，然后加入乙醚结晶沉淀，离心收集沉淀，再用乙醚洗涤3-6次，真空干燥，获得乌拉力肽直链肽粗品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述切割试剂是：体积配比为TFA:苯甲硫醚:苯酚:EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5，反应2.5小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括如下步骤：将乌拉力肽直链肽粗品按1-5克每升的浓度溶解于纯水中，然后滴加质量百分浓度10%的稀氨水调pH值7-10之间，搅拌反应6-24小时，进行空气氧化反应成环，并用质谱检测反应终点，得到乌拉力肽粗品肽溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于将乌拉力肽直链肽粗品按2克每升的浓度溶解于纯水中，调pH值为8.5。
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