CN110372788B - 克胰素的合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及克胰素技术领域，具体提供一种克胰素的合成方法和应用。该合成方法包括：提供包括第1～11位氨基酸的肽片段1、包括第12～24位氨基酸的肽片段2、包括第25～33位氨基酸的肽片段3、包括第34～39位氨基酸的肽片段4、包括第40～55位氨基酸的肽片段5；将肽片段4、3和2逐步偶联，并脱除第13位和第35位半胱氨酸的保护基，氧化得到含一对二硫键的全保护肽片段8，将肽片段5、8和1逐步偶联，得到全保护的克胰素肽片段10，经裂解、氧化形成第4位和第52位半胱氨酸连接的二硫键，脱除第27位和第48位半胱氨酸上的保护基，氧化，得到克胰素。本合成方法具有工艺稳定性好，合成效率高，纯度高等特点。

Description

克胰素的合成方法和应用
技术领域
本发明属于克胰素技术领域，尤其涉及一种克胰素的合成方法和应用。
背景技术
虎纹克胰肽(HWTX-XI)是第一个从蜘蛛毒素中分离的具有Kunitz型结构模体的胰蛋白酶抑制剂，其由55个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸形成3对二硫键，相对分子质量为6166.2Da，是迄今为止发现的胰蛋白酶抑制活性最强的天然多肽，其抑制活性是较经典的胰蛋白酶抑制剂BPTI强两个数量级，同时其抑制活性专一性要高于后者，表明HWTX-XI在治疗与胰蛋白酶相关的疾病中有较好的应用前景。
目前克胰肽的制备仍然处在实验室研究阶段，而且制备的研究主要侧重在利用发酵技术领域，目前尚未看到有化学合成方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克胰素的合成方法，该合成方法为化学合成方法，突破现有仅有发酵生产的方法，以适应市场巨大需求。
进一步地，本发明还提供该克胰素在作为胰蛋白酶抑制剂组分的应用。
本发明是这样实现的：
一种克胰素的合成方法，包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2、肽片段3、肽片段4、肽片段5；
其中，肽片段1包含克胰素主链序列中的第1-11位氨基酸和载体；
肽片段2包含克胰素主链序列中的第12-24位氨基酸和载体；
肽片段3包含克胰素主链序列中的第25-33位氨基酸和载体；
肽片段4包含克胰素主链序列中的第34-39位氨基酸和载体；
肽片段5包含克胰素主链序列中的第40-55位氨基酸和载体；
步骤S02.在裂解液作用下，分别将肽片段1、肽片段2、肽片段3从载体上裂解，得到全保护肽片段1’、肽片段2’、肽片段3’；脱除肽片段4上的氨基保护基，在缩合剂和活化剂的作用下，使肽片段3’与肽片段4发生偶联，得到肽片段6；脱除肽片段6的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段1’与肽片段6发生偶联，得到肽片段7；
步骤S03.在裂解液作用下，将肽片段7从载体上裂解，得到全保护肽片段7’；对肽片段7’进行氧化处理，使得肽片段7’上的第7位半胱氨酸和第13位半胱氨酸上的保护基脱除，并氧化连接成全保护肽片段8；
步骤S04.脱除肽片段5上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段5和肽片段8发生偶合，得到肽片段9；在缩合剂与活化剂的作用下，使得肽片段9和肽片段1发生偶合，得到肽片段10；
步骤S05.在裂解液作用下，使得肽片段10从载体上裂解，得到肽片段11；
步骤S06.对肽片段11进行氧化处理，使得肽片段11上第4位半胱氨酸与第52位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段12；
步骤S07.对肽片段12进行氧化处理，使得肽片段12的第27位半胱氨酸和第48位半胱氨酸上的保护基脱除并发生氧化连接，得到克胰素。
相应地，采用如上所述的克胰素的合成方法制备得到的克胰素在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。
本发明的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的克胰素的合成方法，该合成方法工艺稳定，制得的克胰素纯度可达到99％以上，总收率可达到20％以上；该合成方法可以5个多肽片段同时进行合成，可有效的缩短合成周期，提高生产效率；该合成法可减少缺失肽的产生，从而提高产品的纯度；该合成方法能选择性地形成正确的三对二硫键，有效的降低了分离纯化上的难度；该合成方法所采用的多片段的连接位点巧妙的避开了消旋的可能性，有效的降低消旋杂质的生成，使得产品易于纯化。
本发明提供的克胰素在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，由于制备得到的克胰素纯度高、无消旋杂质，因而制备胰蛋白酶抑制剂时具有纯度高，药效好等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的克胰素的合成过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种克胰素的合成方法。该合成方法包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2、肽片段3、肽片段4、肽片段5；
其中，肽片段1包含克胰素主链序列中的第1-11位氨基酸和载体；
肽片段2包含克胰素主链序列中的第12-24位氨基酸和载体；
肽片段3包含克胰素主链序列中的第25-33位氨基酸和载体；
肽片段4包含克胰素主链序列中的第34-39位氨基酸和载体；
肽片段5包含克胰素主链序列中的第40-55位氨基酸和载体；
步骤S02.在裂解液作用下，分别将肽片段1、肽片段2、肽片段3从载体上裂解，得到全保护肽片段1’、肽片段2’、肽片段3’；脱除肽片段4上的氨基保护基，在缩合剂和活化剂的作用下，使肽片段3’与肽片段4发生偶联，得到肽片段6；脱除肽片段6的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段1’与肽片段6发生偶联，得到肽片段7；
步骤S03.在裂解液作用下，将肽片段7从载体上裂解，得到全保护肽片段7’；对肽片段7’进行氧化处理，使得肽片段7’上的第7位半胱氨酸和第13位半胱氨酸上的保护基脱除，并氧化连接成全保护肽片段8；
步骤S04.脱除肽片段5上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段5和肽片段8发生偶合，得到肽片段9；在缩合剂与活化剂的作用下，使得肽片段9和肽片段1发生偶合，得到肽片段10；
步骤S05.在裂解液作用下，使得肽片段10从载体上裂解，得到肽片段11；
步骤S06.对肽片段11进行氧化处理，使得肽片段11上第4位半胱氨酸与第52位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段12；
步骤S07.对肽片段12进行氧化处理，使得肽片段12的第27位半胱氨酸和第48位半胱氨酸上的保护基脱除并发生氧化连接，得到克胰素。
下面对上述合成方法做进一步的解释说明：
步骤S01中的肽片段1～5均可以采用固相法制备。
具体地，肽片段1的制备过程可以如下：
在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH和替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)，按照上述方法依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH，得到肽片段1。
该肽片段1的结构为
Fmoc-Ile-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-树脂。
肽片段2制备过程可以如下：
在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)，按照前述步骤依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到肽片段2。
该肽片段2的结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Phe-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Gly-树脂。
肽片段3制备过程可以如下：
在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH，得到肽片段3。
该肽片段3的结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Lys(Boc)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-树脂。
肽片段4制备过程可以如下：
在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Gly-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Gly-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH，得到肽片段4。
该肽片段4的结构为：
Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-树脂。
肽片段5制备过程可以如下：
在偶联试剂的存在下，将Fmoc-Ala-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Ala-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，得到肽片段5。
该肽片段5的结构为：
Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Phe-Pro-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Met-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Ala-Lys(Boc)-Ala-树脂。
上述N,N-二异丙基乙胺与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)为缩合剂与活化剂，可以采用N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)或N,N-二异丙基乙胺/2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HATU)替代。
在所有肽片段的合成过程中，所述缩合剂与活化剂的摩尔比为(1.5～2.0):1。
由于肽片段1～5均采用固相合成，其所携带的载体为树脂载体，具体是2-氯三苯甲基树脂。
Fmoc表示9-芴甲氧碳基；Boc表示叔丁基碳基；tBu表示叔丁基；Trt表示三苯甲基；Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5磺酰基；Acm表示(乙酰氨基)甲基。
步骤S02中，采用体积百分比为1％的三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液作为裂解液，可以使肽片段1～3上的2-氯三苯甲基树脂载体发生分离，由此得到从而得到不含有载体的肽片段1’、肽片段2’、肽片段3’。
肽片段4上的氨基保护基脱除使用的保护液为体积百分比为(15～25)％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，如可以使用体积百分比为20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
肽片段3’与肽片段4发生偶联使用的缩合剂/活化剂可以是N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)、N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)中的任一种，且缩合剂和活化剂按照摩尔比为(1.0～1.5):1，溶解缩合剂和活化剂的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
肽片段6上的氨基保护基脱除使用的保护液为体积百分比为(15～25)％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，如可以使用体积百分比为20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
肽片段1’与经过脱保护处理的肽片段6发生偶联使用的缩合剂/活化剂可以是N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)、N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)中的任一种，且缩合剂和活化剂按照摩尔比为(1.0～1.5):1，溶解缩合剂和活化剂的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
步骤S03中，采用体积百分比为1％的三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液作为裂解液，可以使肽片段7上的2-氯三苯甲基树脂载体发生分离，由此得到从而得到不含有载体的全保护肽片段7’。
氧处理使用的氧化剂为(0.4～0.6)mol/L的碘-二氯甲烷溶液与(0.4～0.6)mol/L的硫代硫酸钠溶液。通过氧化出里，使得全保护肽片段7’中半胱氨酸侧链上的三苯甲基(Trt)保护基被脱除，并且氧化形成分子内二硫键。
步骤S04中，肽片段5上氨基保护基的脱除，使用的保护液为体积百分比为(15～25)％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
脱除氨基保护基的肽片段5和肽片段8发生偶合所使用的缩合剂/活化剂可以是N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)、N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)中的任一种，且缩合剂和活化剂按照摩尔比为(1.0～1.5):1，溶解缩合剂和活化剂的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
肽片段9和肽片段1发生偶合所使用的缩合剂/活化剂可以是N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)、N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(DIEA/HBTU)中的任一种，且缩合剂和活化剂按照摩尔比为(1.0～1.5):1，溶解缩合剂和活化剂的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，至步骤S04获得的肽片段10即是克胰素主链肽树脂。
步骤S05中，以三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚(PhSMe)、三异丙基硅烷(TIS)与去离子水的混合物作为裂解液。按照体积比，所述裂解液中三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：去离子水＝87.5:2.5:5:2.5:2.5。裂解处理肽片段10后，经过过滤沉降，得到肽片段11，至此，将克胰素主链肽树脂(肽片段10)上的树脂载体去除，得到克胰素主链粗肽(即肽片段11)。
步骤S06中的氧化处理，使用的氧化剂是空气，即利用空气中的氧气使得肽片段11中第4位半胱氨酸和第52位半胱氨酸氧化连接，具体是处理前将肽片段11溶于由去离子水和乙腈的混合溶剂中，并通入空气，由此得到克胰素主链粗肽(即肽片段12)。
步骤S07中的氧化处理，使用的氧化剂是是(0.4～0.6)mol/L的碘-甲醇混合溶液与(0.4～0.6)mol/L的硫代硫酸钠溶液，肽片段12在该氧化剂的氧化处理下，第27位半光氨酸和第48位半光氨酸的保护基被去除，这两个半胱氨酸发生连接，由此得到克胰素。
由于步骤S07得到的克胰素属于一种粗肽，因而可以对步骤S07得到克胰素进行反相高效液相色谱纯化、冻干，由此得到高纯度的克胰素。
上述克胰素的合成方法，具有合成效率高、成本低、收率高以及适于工业化应用的特点。具体来说，上述克胰素合成方法的特点主要表现在：
(1).可以5个多肽片段同时合成，从而有效地缩短合成周期，提高生产效率；
(2).多片段的合成过程中，解决了常规方法因为克胰素链过长导致缺失肽的问题，使得本发明合成方法主要的杂质不再是缺失肽，而是未偶联的肽片段，而未偶联的肽片段由于与克胰素肽链氨基酸序列差异较大，使得产品容易纯化分离；
(3).合成过程能够选择性地形成正确的三对二硫键，解决了常规方法对二硫键多容易产生错位连接的问题，降低了分离提纯的难度；
(4).合成过程中多片段的连接位点巧妙地避开了消旋肽的可能性，有效地降低消旋杂质的生成，有利于产品的纯化。
(5).整个工艺稳定性好，制得的克胰素纯度高达99％以上，总收率达到20％以上。
本发明的克胰素合成方法合成工艺具有上述优点，其可以快速合成适合工业应用的克胰素，极大地提高了克胰素的合成效率。
由于克胰素可以用作胰蛋白酶抑制剂的有效成分，因此，本发明还提供一种含有克胰素的胰蛋白酶抑制剂，该胰蛋白酶抑制剂具有高强度抑制活性，并且抑制活性专一性高，在治疗与胰蛋白酶有关的疾病有广泛的应用。
为更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种克胰素的合成方法，其合成路径请参阅图1，包括以下步骤：
S11.取替代度为0.7mmol/g树脂2000g(1.40mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至12L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。称取332.8g Fmoc-Gly-OH(1.12mol)和365.6mLDIEA(2.08mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.45mmol/g。
取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂560g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2eq)、HBTU(1.95eq)和DIEA(3eq)，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段1树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段1树脂半h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到肽片段1’541.0g，纯度96.2％，收率95.2％。
具体地，该肽片段1’结构如下：
Fmoc-Ile-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-OH。
S12.称取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂560g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(2eq)、HBTU(1.95eq)和DIEA(3eq)溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段2树脂半h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L的体积，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到肽片段2’730.9g，纯度95.6％，收率94.4％。
具体地，肽片段2’的结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Phe-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Gly-OH。
S13.称取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂560g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(2eq)、HBTU(1.95eq)和DIEA(3eq)溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段3树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段3树脂半h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L的体积，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到肽片段3’489.9g，纯度98.2％，收率97.8％。
具体，肽片段3’的结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Lys(Boc)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-OH。
S14.称取Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂370g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
称取Fmoc-Asn(Trt)-OH(2eq)、HBTU(1.95eq)和DIEA(3eq)溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Asn(Trt)-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到肽片段4树脂。
S15.称取替代度为0.7mmol/g树脂500g(0.35mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至3L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。称取65.4g Fmoc-Ala-OH(0.21mol)和91.4mLDIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.31mmol/g。
称取Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂270g，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
称取Fmoc-Lys(Boc)-OH(2eq)、HBTU(1.95eq)和DIEA(3eq)溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Lys(Boc)-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH，的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到肽片段5树脂。
S16.肽片段7的制备
取肽片段4树脂，加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H2N-Gly-Cys(Trt)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-树脂。称取331.8g肽片段3(167mmol)，27.0g HOBt(200mmol)溶于适量DMF中，加入25.2g DIC(200mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段6树脂。
加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到：
H2N-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Lys(Boc)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Cys(Trt)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-树脂。称取513.0g肽片段2(167mmol)，27.0g HOBt(200mmol)溶于适量DMF中，加入25.2g DIC(200mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段7树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段7树脂半h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到肽片段7’782.9g，，纯度88.2％，收率84.3％。
具体地，肽片段7’的结构为：
Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Phe-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Lys(Boc)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Cys(Trt)-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH。
S17.脱保护与二硫键的形成
称取780g肽片段7’溶于40L二氯甲烷中，滴加浓度为0.5mol/L的碘-二氯甲烷混合溶液至黄色不褪色，反应10min(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5mol/L的硫代硫酸钠溶液至黄色褪去。加入5L水，进行洗涤分层，取有机层进行干燥旋干，真空干燥得到722.1g肽片段8，纯度83.4％，收率95.0％。
S18.克胰素主链的制备
取肽片段5树脂，加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H2N-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Phe-Pro-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Met-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Ala-Lys(Boc)-Ala-树脂。称取456.6g肽片段8(84mmol)，13.6g HOBt(101mmol)溶于适量DMF中，加入12.7g DIC(101mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段9树脂。
加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到：
Arg(Pbf)-cyclo[Cys-Lys(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Phe-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Ala-Lys(Boc)-Phe-Ile-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Cys]-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asn(Trt)-Lys(Boc)-Phe-Pro-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-Cys(Acm)-Met-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Ala-Lys(Boc)-Ala-树脂。
称取189.3g肽片段1(84mmol)，13.6g HOBt(101mmol),溶于适量DMF中，加入12.7gDIC(101mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到全保护的克胰素主链10树脂(肽片段10)。
S19.裂解及二硫键的形成
取上述克胰素主链10树脂，加入2.5L裂解液(TFA:EDT:PhSMe:TIS:H2O的体积比为87.5：2.5：5：2.5：2.5)，室温搅拌反应2.5h，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并加入至20L预冷的无水乙醚中，静置沉降2h。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到克胰素主链11粗肽(即肽片段11)381.7g，纯度66.4％，粗肽收率72.3％。
取克胰素主链11粗品，加入至38L体积百分比为9：1的水与乙腈混合液中，用氨水调节溶液pH值约在8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5mol/L的碘-甲醇混合溶液至黄色不褪色，反应2h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)；滴加浓度为0.5M的硫代硫酸钠溶液至黄色褪去。
S110.纯化
取上述步骤S19得到的克胰素粗品，使用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：77×250nm色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为80～90mL/min，梯度为10％B～50％B，循环进样纯化，收集产品峰，冻干得到克胰素纯品108.3g，纯度为99.1％，纯化收率为42.7％，总收率为20.9％。
实施例2
一种克胰素的合成方法，其合成路径请参阅图1，具体过程参阅实施例1的。
实施例2与实施例1的区别在于：步骤S21相对于步骤S11中Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.30mmol/g；Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.25mmol/g；步骤S21中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/HATU，步骤S22中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/DIC。
步骤S210纯化后，最终得到克胰素纯品84.2g，纯度为99.2％，纯化收率为40.5％，总收率为20.2％。
实施例3
一种克胰素的合成方法，其合成路径请参阅图1，具体过程参阅实施例2的步骤。
实施例3与实施例2的区别在于：步骤S31中Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.49mmol/g；Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂的替代度为0.45mmol/g；步骤S31中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/DIC，步骤S32中的缩合剂与活化剂的组合为DIEA/DIC。
步骤S310纯化后，最终得到克胰素纯品143.8g，纯度为99.4％，纯化收率为37.5％，总收率为19.1％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种克胰素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2、肽片段3、肽片段4、肽片段5；
其中，肽片段1包含克胰素主链序列中的第1-11位氨基酸和载体；
肽片段2包含克胰素主链序列中的第12-24位氨基酸和载体；
肽片段3包含克胰素主链序列中的第25-33位氨基酸和载体；
肽片段4包含克胰素主链序列中的第34-39位氨基酸和载体；
肽片段5包含克胰素主链序列中的第40-55位氨基酸和载体；
步骤S02.在裂解液作用下，分别将肽片段1、肽片段2、肽片段3从载体上裂解，得到全保护肽片段1’、肽片段2’、肽片段3’；脱除肽片段4上的氨基保护基，在缩合剂和活化剂的作用下，使肽片段3’与肽片段4发生偶联，得到肽片段6；脱除肽片段6的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段2’与肽片段6发生偶联，得到肽片段7；
步骤S03.在裂解液作用下，将肽片段7从载体上裂解，得到全保护肽片段7’；对肽片段7’进行氧化处理，使得肽片段7’上的第7位半胱氨酸和第13位半胱氨酸上的保护基脱除，并氧化连接成全保护肽片段8；
步骤S04.脱除肽片段5上的氨基保护基，在缩合剂与活化剂的作用下，使肽片段5和肽片段8发生偶合，得到肽片段9；在缩合剂与活化剂的作用下，使得肽片段9和肽片段1’发生偶合，得到肽片段10；
步骤S05.在裂解液作用下，使得肽片段10从载体上裂解，得到肽片段11；
步骤S06.对肽片段11进行氧化处理，使得肽片段11上第4位半胱氨酸与第52位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段12；
步骤S07.对肽片段12进行氧化处理，使得肽片段12的第27位半胱氨酸和第48位半胱氨酸上的保护基脱除并发生氧化连接，得到克胰素。
2.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，所述肽片段1、肽片段2、肽片段3、肽片段4、肽片段5中的载体均是2-氯三苯甲基氯树脂。
3.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，步骤S02、S03中的裂解液为体积百分比为0.5％～1.5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液；
步骤S05的裂解液为三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、三异丙基硅烷与去离子水的混合溶液；按照体积比，所述裂解液中三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：去离子水＝87.5:2.5:5:2.5:2.5。
4.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，步骤S02和步骤S04中，所述缩合剂与活化剂为N,N-二异丙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑的混合物或N,N-二异丙基乙胺与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物；
所述缩合剂与活化剂的摩尔比为(1.0～1.5):1；
用于溶解所述缩合剂与活化剂的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
脱除肽片段4、肽片段5、肽片段6的氨基保护基使用的保护液为体积百分比为15％～25％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
5.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，步骤S03中，氧处理使用的氧化剂为0.4～0.6mol/L的碘-二氯甲烷溶液和0.4～0.6mol/L的硫代硫酸钠溶液。
6.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，步骤S06的氧化处理过程中，氧化剂为空气，先将肽片段11溶于去离子水和乙腈的混合溶剂中，再通入空气。
7.如权利要求1所述的克胰素的合成方法，其特征在于，步骤S07的氧化处理，使用的氧化剂为0.4～0.6mol/L的碘-甲醇溶液与0.4～0.6mol/L的硫代硫酸钠溶液。
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