CN110386970B - 虎纹镇痛肽的合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种虎纹镇痛肽的合成方法和应用。所述合成方法包括：提供包括第1～8位氨基酸的肽片段1、包括第9～23位氨基酸的肽片段2及包括第24～33位氨基酸的肽片段3；脱除、裂解、氧化肽片段2，获得第9位和第22位半胱氨基酸形成一对二硫键的肽片段4；脱除肽片段3上的保护基，并与肽片段4进行偶联处理，得到肽片段5；脱除肽片段5中的氨基保护基，并与裂解的肽片段1进行偶联处理，得到肽片段6；裂解、氧化肽片段6，得到第2位和第17位半胱氨酸连接的肽片段8；对肽片段8进行氧化处理，使第16位和第29位半胱氨酸氧化连接，得到虎纹镇痛肽。本合成方法具有工艺稳定性好，合成效率高，纯度高、收率高等特点。

Description

虎纹镇痛肽的合成方法和应用
技术领域
本发明属于虎纹镇痛肽技术领域，尤其涉及一种虎纹镇痛肽的合成方法和应用。
背景技术
虎纹镇痛肽(HWTX-I)是从我国特有的虎纹捕鸟蛛毒液中提取的一种含33个氨基酸的短肽化合物，其分子量为3750Da，二维核磁共振方法解析发现其具有三桥三迭式空间结构，具有三对二硫键和三股反平行的β-折叠为核心的结构模体，是N-型钙离子通道阻滞剂，可用于治疗各种急、慢性疼痛，尤其是对吗啡类控制无效的晚期癌症的疼痛病人，具有强镇痛、不成瘾的显著特点。
目前，虎纹镇痛肽的制备方法仍然处于实验室研发阶段，且其制备方法的研究主要侧重于利用发酵技术，而化学合成方法的报道相对较少。因此有必要研究开发新的虎纹镇痛肽，以适应市场对虎纹镇痛肽的巨大需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虎纹镇痛肽的合成方法，该合成方法为化学合成方法，以适应市场需求。
进一步地，本发明还提供该虎纹镇痛肽在镇痛药物中的应用。
本发明是这样实现的：
一种虎纹镇痛肽的合成方法，包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2及肽片段3；
其中，肽片段1为虎纹镇痛肽主链序列中的第1-8位氨基酸和载体；
肽片段2为虎纹镇痛肽主链序列中的第9-23位氨基酸和载体；
肽片段3为虎纹镇痛肽主链序列中的第24-33位氨基酸和载体；步骤S02.采用反应液对肽片段2进行保护基脱除，并采用裂解液使得肽片段2从载体上裂解，得到全保护肽片段2’，且全保护肽片段2’中第9位和第22位半胱氨基酸的保护基被脱除；
步骤S03.对肽片段2’进行氧化处理，获得肽片段4，且肽片段4中第9位和第22位半胱氨基酸之间形成一对二硫键；
步骤S04.采用裂解液将肽片段1从载体中裂解，得到全保护肽片段1’；
步骤S05.脱除肽片段3上的氨基保护基；并将处理后的肽片段3与肽片段4进行偶联处理，得到包含载体的肽片段5；
步骤S06.脱除肽片段5中的氨基保护基，并将处理后的肽片段5与全保护肽片段1’进行偶联处理，得到肽片段6；
步骤S07.采用裂解液去除肽片段6的载体，得到肽片段7；
步骤S08.对肽片段7进行氧化处理，使得其中第2位和第17位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段8；
步骤S09.对肽片段8进行氧化处理，使第16位和第29位半胱氨酸上的保护基脱除并氧化连接成虎纹镇痛肽。
相应地，上述虎纹镇痛肽的合成方法制备得到的虎纹镇痛肽在制作镇痛药物中的应用。
本发明的有益效果如下：
相对于现有技术，本发明提供的虎纹镇痛肽的合成方法，该合成方法工艺稳定，制得的虎纹镇痛肽，纯度可达到99％以上，总收率可达到50％以上；该合成方法可以3个多肽片段同时进行合成，可有效的缩短合成周期，提高生产效率；该合成法可减少缺失肽的产生，从而提高产品的纯度；该合成方法有效的降低了分离纯化上的难度；该合成方法所采用的多片段的连接位点巧妙的避开了消旋的可能性，有效的降低消旋杂质的生成，使得产品易于纯化。
本发明提供的虎纹镇痛肽在制作镇痛药物中的应用，由于其纯度高、无消旋杂质，因而制备的药物纯度也高，有利于提高药效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的虎纹镇痛肽的合成过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种虎纹镇痛肽的合成方法。该合成方法包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2及肽片段3；
其中，肽片段1为虎纹镇痛肽主链序列中的第1-8位氨基酸和载体；
肽片段2为虎纹镇痛肽主链序列中的第9-23位氨基酸和载体；
肽片段3为虎纹镇痛肽主链序列中的第24-33位氨基酸和载体；步骤S02.采用反应液对肽片段2进行保护基脱除，并采用裂解液使得肽片段2从载体上裂解，得到全保护肽片段2’，且全保护肽片段2’中第9位和第22位半胱氨基酸的保护基被脱除；
步骤S03.对肽片段2’进行氧化处理，获得肽片段4，且肽片段4中第9位和第22位半胱氨基酸之间形成一对二硫键；
步骤S04.采用裂解液将肽片段1从载体中裂解，得到全保护肽片段1’；
步骤S05.脱除肽片段3上的氨基保护基；并将处理后的肽片段3与肽片段4进行偶联处理，得到包含载体的肽片段5；
步骤S06.脱除肽片段5中的氨基保护基，并将处理后的肽片段5与全保护肽片段1’进行偶联处理，得到肽片段6；
步骤S07.采用裂解液去除肽片段6的载体，得到肽片段7；
步骤S08.对肽片段7进行氧化处理，使得其中第2位和第17位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段8；
步骤S09.对肽片段8进行氧化处理，使第16位和第29位半胱氨酸上的保护基脱除并氧化连接成虎纹镇痛肽。
下面对上述合成方法做进一步的解释说明：
步骤S01中的肽片段1、肽片段2及肽片段3均可以采用固相法制备。
具体地，肽片段1的制备过程可以如下：在偶联试剂的作用下，将Fmoc-Ala-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，并脱去Fmoc保护基得到Ala-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH，得到肽片段1。
该肽片段1的结构为：
Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Val-Phe-Asp(OtBu)-Ala-树脂。
肽片段2的制备过程可以如下：在偶联试剂的作用下，将Fmoc-Ser(tBu)-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂进行偶联处理，脱去Fmoc保护基得到Ser(tBu)-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH，得到肽片段2。
该肽片段2的结构为：
Fmoc-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys(StBu)-Ser(tBu)-树脂。
肽片段3的制备过程可以如下：在偶联试剂的作用下，将Fmoc-Leu-OH与替代度为0.4～0.7mmol/g的2-氯三苯甲基树脂偶联后，脱去Fmoc保护基得到Leu-树脂载体，然后加入N,N-二异丙基乙胺/2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HBTU)，依次偶联如下氨基酸：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，得到肽片段3。
该肽片段3的结构为：
Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂；
上述肽片段1、肽片段2、肽片段3的合成过程中，Fmoc表示9-芴甲氧碳基；Boc表示叔丁基碳基；tBu表示叔丁基；Trt表示三苯甲基；Pbf表示2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基；Acm表示(乙酰氨基)甲基。
N,N-二异丙基乙胺/2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HATU)可以使用N,N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DIC/HOBt)或者N,N-二异丙基乙胺/O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(DIEA/HBTU)替代。
由于肽片段1、肽片段2、肽片段3均采用固相合成，其所携带的载体为树脂载体，具体是2-氯三苯甲基树脂。
步骤S02中，反应液体为体积百分比为(15～25)％2-巯基乙醇的0.1M N-甲基吗啡啉的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，在该反应液条件下，可以使得肽片段2中第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸的保护基(StBu)被去除。
而采用体积百分比为1％的三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液作为裂解液，可以使肽片段2上的2-氯三苯甲基树脂载体与肽片段2中第9-23位氨基酸链发生分离，由此得到除第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸以外的全保护肽片段2’，即该全保护肽片段2’中第9位和第22位半胱氨基酸的保护基被脱除。
步骤S03中，对全保护肽片段2’进行氧化处理前，先将全保护肽片段2’进行溶解，具体是采用体积比为1：1的去离子水与乙腈混合溶液，对全保护肽片段2’进行溶解，随后使用碳酸氢铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠等(将溶解后的溶液的pH调节至7～8，并以空气作为氧化剂进行氧化处理，使得第9位和第22位半胱氨酸发生连接，形成一对二硫键，由此得到肽片段4。
步骤S04中，采用体积百分比为1％的不饱和脂肪酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液作为裂解液，可以使肽片段1上的2-氯三苯甲基树脂载体与肽片段1中第1-8位氨基酸链发生分离，由此得到全保护肽片段1’。
步骤S05中，肽片段3中氨基保护基的脱除处理使用的保护液为体积百分比为20％的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
其中，将处理后的肽片段3与肽片段4进行偶联处理所使用的缩合剂与活化剂为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)的混合物或N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)的混合物；所述缩合剂与活化剂的摩尔比为(1.0～1.5):1；用于溶解所述缩合剂与活化剂的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。
步骤S06中，肽片段5中氨基保护基的脱除处理使用的保护液为体积百分比为20％的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
其中，将将处理后的肽片段5与全保护肽片段1’进行偶联处理所使用的缩合剂与活化剂为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)的混合物或N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)的混合物；所述缩合剂与活化剂的摩尔比为(1.0～1.5):1；用于溶解所述缩合剂与活化剂的溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。
步骤S07中以三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、苯甲硫醚(PhSMe)、三异丙基硅烷(TIS)与去离子水的混合物作为裂解液。按照体积比，所述裂解液中三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：去离子水＝87.5:2.5:5:2.5:2.5。裂解处理肽片段6后，经过过滤沉降，得到肽片段7。
步骤S08中，将肽片段7溶于去离子水与乙腈的混合溶液中，并将pH调节至7～8，随后在空气中进行氧化，使得第2位和第17位半胱氨酸连接，由此得到肽片段8。
步骤S09的氧化处理，使用的氧化剂是(0.4～0.6)mol/L的碘-甲醇混合溶液与(0.4～0.6)mol/L的硫代硫酸钠溶液，肽片段8在该氧化剂的氧化处理下，第16位半光氨酸和第29位半光氨酸的保护基被去除，并氧化连接，由此得到虎纹镇痛肽。
由于步骤S09得到的虎纹镇痛肽属于一种粗肽，因而可以对步骤S09得到虎纹镇痛肽进行反相高效液相色谱纯化、冻干，由此得到高纯度的虎纹镇痛肽。
上述合成方法，具有合成效率高、成本低、收率高以及适于工业化应用的特点。具体来说，上述合成方法的特点主要表现在：
(1).可以3个多肽片段同时合成，从而有效地缩短合成周期，提高生产效率；
(2).多片段的合成过程中，解决了常规方法因为虎纹镇痛肽链过长导致缺失肽的问题，使得本发明合成方法主要的杂质不再是缺失肽，而是未偶联的肽片段，而未偶联的肽片段由于与虎纹镇痛肽氨基酸序列差异较大，使得产品容易纯化分离；
(3).合成过程能够选择性地形成正确的三对二硫键，解决了常规方法对二硫键多容易产生错位连接的问题，降低了分离提纯的难度；
(4).合成过程中多片段的连接位点巧妙地避开了消旋肽的可能性，有效地降低消旋杂质的生成，有利于产品的纯化。
(5).整个工艺稳定性好，制得的虎纹镇痛肽纯度高达99％以上，总收率达到50％以上。
本发明的虎纹镇痛肽合成方法合成工艺具有上述优点，其可以快速合成适合工业应用的虎纹镇痛肽，极大地提高了虎纹镇痛肽的合成效率。
由此，正因为其合成的纯度高，因此虎纹镇痛肽可以用作镇痛药物的镇痛组分，因此，本发明还提供一种含有虎纹镇痛肽的镇痛药物，该镇痛药物可以用于治疗各种急性、慢性疼痛，尤其对吗啡类控制无效的晚期癌症的疼痛病人，具有强镇痛、不成瘾的显著特点。
为更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种虎纹镇痛肽的合成方法，其合成路径请参阅图1，包括以下步骤：
S11.取替代度为0.7mmol/g的2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，置于多肽合成反应器中，向其中加入4L DCM，使2-氯-三苯甲基树脂发生溶胀，并用DCM洗涤溶胀的2-氯-三苯甲基树脂。
将87.2g Fmoc-Gly-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.42mmol/g。
取565g Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH、1.95当量HBTU和3.0当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段1树脂。
用1(Vol)％TFA的DCM溶液裂解肽片段1树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到331.0g肽片段1’：Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Val-Phe-Asp(OtBu)-Ala-OH，其纯度为98.2％，收率为97.5％。
S12.将替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。
将107.4g Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.40mmol/g。
取580g Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Cys(StBu)-OH、1.95当量HBTU和3当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Cys(StBu)-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，得到全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为20％2-巯基乙醇的0.1M N-甲基吗啡啉的DMF溶液脱除肽片段2第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸的保护基，反应16h，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到除第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸以外全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段2树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到697.6g肽片段2’：
Fmoc-Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys-Ser(tBu)-OH，纯度96.6％，收率95.4％。
称取697g肽片段2’溶于30L体积百分比为9：1的甲醇与水混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)，旋干，真空干燥得到691.4g肽片段4，其纯度为95.5％，收率为99.2％。
S13.取428g替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂(0.30mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。称取84.8g Fmoc-Leu-OH(0.24mol)和78.4mL DIEA(0.45mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.41mmol/g。
取490g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
称取2当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH、1.95当量HBTU和3当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，随后加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到全保护的肽片段3树脂：
H2N-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
S14.取全保护的肽片段3树脂和633.5g肽片段4(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3g DIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段5树脂。
加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到：
H2N-Cyclo[Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys]-Ser(tBu)Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
将287.6g肽片段1’(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3gDIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至上述反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到全保护的肽片段6树脂。
S15.取步骤S4获得的肽片段6树脂，加入6.0L裂解液(体积比为TFA:EDT:PhSMe:TIS:H2O＝87.5：2.5：5：2.5：2.5)，室温搅拌反应2.5h，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并加入至50L预冷的无水乙醚中，静置沉降2h。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到肽片段7粗肽651.6g，其纯度为83.7％，粗肽收率为83.2％。
取肽片段7粗品，加入至38L体积百分比为9：1的水与乙腈混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5mol/L的碘-甲醇混合溶液至黄色不褪色，反应2h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5M的硫代硫酸钠溶液至黄色褪去，得到肽片段8。
取上述肽片段8，使用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：77×250nm色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为80～90mL/min，梯度为10％B～50％B，循环进样纯化，收集产品峰，冻干得到虎纹镇痛肽纯品410.5g，其纯度为99.3％，纯化收率为63.0％，总收率为53.8％。
实施例2
一种虎纹镇痛肽的合成方法，其合成路径请参阅图1，包括以下步骤：
S21.取替代度为0.7mmol/g的2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，置于多肽合成反应器中，向其中加入4L DCM，使2-氯-三苯甲基树脂发生溶胀，并用DCM洗涤溶胀的2-氯-三苯甲基树脂。
将87.2g Fmoc-Gly-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.29mmol/g。
取565g Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH、1.95当量HBTU和3.0当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段1树脂。
用1(Vol)％TFA的DCM溶液裂解肽片段1树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到331.0g肽片段1’：Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Val-Phe-Asp(OtBu)-Ala-OH，其纯度为98.2％，收率为97.5％。
S22.将替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。
将107.4g Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.27mmol/g。取580g Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Cys(StBu)-OH、1.95当量DIC和3当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Cys(StBu)-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，得到全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为20％2-巯基乙醇的0.1M N-甲基吗啡啉的DMF溶液脱除肽片段2第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸的保护基，反应16h，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到除第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸以外全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段2树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到697.6g肽片段2’：
Fmoc-Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys-Ser(tBu)-OH，纯度96.6％，收率95.4％。
称取697g肽片段2’溶于30L体积百分比为9：1的甲醇与水混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)，旋干，真空干燥得到691.4g肽片段4，其纯度为95.5％，收率为99.2％。
S23.取428g替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂(0.30mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。称取84.8g Fmoc-Leu-OH(0.24mol)和78.4mL DIEA(0.45mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.28mmol/g。
取490g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
称取2当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH、1.95当量HBTU和3当量DIEA，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，随后加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到全保护的肽片段3树脂：
H2N-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
S24.取全保护的肽片段3树脂和633.5g肽片段4(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3g DIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段5树脂。
加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到：
H2N-Cyclo[Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys]-Ser(tBu)Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
将287.6g肽片段1’(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3gDIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至上述反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到全保护的肽片段6树脂。
S25.取步骤S4获得的肽片段6树脂，加入6.0L裂解液(体积比为TFA:EDT:PhSMe:TIS:H2O＝87.5：2.5：5：2.5：2.5)，室温搅拌反应2.5h，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并加入至50L预冷的无水乙醚中，静置沉降2h。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到肽片段7粗肽651.6g，其纯度为83.7％，粗肽收率为83.2％。
取肽片段7粗品，加入至38L体积百分比为9：1的水与乙腈混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5mol/L的碘-甲醇混合溶液至黄色不褪色，反应2h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5M的硫代硫酸钠溶液至黄色褪去，得到肽片段8。
取上述肽片段8，使用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：77×250nm色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为80～90mL/min，梯度为10％B～50％B，循环进样纯化，收集产品峰，冻干得到虎纹镇痛肽纯品237.1g，其纯度为99.5％，纯化收率为58.0％，总收率为49.6％。
实施例3
一种虎纹镇痛肽的合成方法，其合成路径请参阅图1，包括以下步骤：
S31.取替代度为0.7mmol/g的2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，置于多肽合成反应器中，向其中加入4L DCM，使2-氯-三苯甲基树脂发生溶胀，并用DCM洗涤溶胀的2-氯-三苯甲基树脂。
将87.2g Fmoc-Gly-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.49mmol/g。
取565g Fmoc-Ala-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Asp(OtBu)-OH、1.95当量DIEA和3.0当量DIC，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到全保护的肽片段1树脂。
用1(Vol)％TFA的DCM溶液裂解肽片段1树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到331.0g肽片段1’：Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Val-Phe-Asp(OtBu)-Ala-OH，其纯度为98.2％，收率为97.5％。
S32.将替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂500g(0.35mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。
将107.4g Fmoc-Ser(tBu)-OH(0.28mol)和91.4mL DIEA(0.52mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.46mmol/g。
取580g Fmoc-Ser(OtBu)-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
取2当量Fmoc-Cys(StBu)-OH、1.95当量DIEA和3.0当量DIC，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Cys(StBu)-Ser(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，得到全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为20％2-巯基乙醇的0.1M N-甲基吗啡啉的DMF溶液脱除肽片段2第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸的保护基，反应16h，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，得到除第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸以外全保护的肽片段2树脂。
用体积百分比为1％TFA的DCM溶液裂解肽片段2树脂0.5h，过滤除去树脂，将树脂再进行裂解2次，收集所有滤液并将其旋蒸至约1L，随后加入至10L低温乙醚中，析出白色固体，过滤收集沉淀，无水乙醚洗涤5次，真空干燥得到697.6g肽片段2’：
Fmoc-Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys-Ser(tBu)-OH，纯度96.6％，收率95.4％。
称取697g肽片段2’溶于30L体积百分比为9：1的甲醇与水混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)，旋干，真空干燥得到691.4g肽片段4，其纯度为95.5％，收率为99.2％。
S33.取428g替代度为0.7mmol/g 2-氯-三苯甲基树脂(0.30mol)，加入至多肽合成反应器中，加入至4L DCM溶胀树脂30min，用DCM洗涤一次。称取84.8g Fmoc-Leu-OH(0.24mol)和78.4mL DIEA(0.45mol)，用DCM溶解，加入到上述反应器中，反应2h后抽干，用DCM洗涤一次。加入体积比为10：1的DCM与甲醇溶液，搅拌封闭30min。抽干溶剂，用DCM洗涤3次，甲醇收缩树脂3次，真空干燥后得到Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，经监测，树脂替代度为0.45mmol/g。
取490g Fmoc-Leu-2-氯-三苯甲基树脂，用体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到H-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
称取2当量的Fmoc-Lys(Boc)-OH、1.95当量DIEA和3.0当量DIC，溶于适量DMF中，搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-2-氯-三苯甲基树脂。
重复上述Fmoc脱除和氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶联，用DMF洗涤三次，DCM洗涤3次，甲醇收缩3次，真空干燥，随后加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到全保护的肽片段3树脂：
H2N-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
S34.取全保护的肽片段3树脂和633.5g肽片段4(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3g DIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤两次，得到全保护的肽片段5树脂。
加入体积百分比为20％哌啶的DMF溶液脱除Fmoc保护基，每次10min，共两次，随后用DMF洗涤6次，得到：
H2N-Cyclo[Cys-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys]-Ser(tBu)Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
将287.6g肽片段1’(201mmol)，32.4g HOBt(241mmol)，溶于适量DMF中，加入30.3gDIC(241mmol)搅拌活化5min，加入至上述反应器中，室温反应4h(反应终点以茚三酮法检测为准)。抽干溶剂，用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩4次，真空干燥，得到全保护的肽片段6树脂。
S35.取步骤S4获得的肽片段6树脂，加入6.0L裂解液(体积比为TFA:EDT:PhSMe:TIS:H2O＝87.5：2.5：5：2.5：2.5)，室温搅拌反应2.5h，过滤，收集滤液，树脂用少量TFA洗涤3次，滤液合并加入至50L预冷的无水乙醚中，静置沉降2h。过滤，滤饼用适量的无水乙醚洗涤3次，真空干燥，得到肽片段7粗肽651.6g，其纯度为83.7％，粗肽收率为83.2％。
取肽片段7粗品，加入至38L体积百分比为9：1的水与乙腈混合液中，用氨水调节溶液pH值至8～8.5之间，敞口室温反应24h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5mol/L的碘-甲醇混合溶液至黄色不褪色，反应2h(反应终点以液相质谱连用仪检测为准)。滴加浓度为0.5M的硫代硫酸钠溶液至黄色褪去，得到肽片段8。
取上述肽片段8，使用0.45μm滤膜过滤，待纯化。纯化条件：77×250nm色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，检测波长220nm，流动相A为0.1％TFA/水溶液，流动相B为0.1％TFA/乙腈溶液，流速为80～90mL/min，梯度为10％B～50％B，循环进样纯化，收集产品峰，冻干得到虎纹镇痛肽纯品360.5g，其纯度为98.9％，纯化收率为62.0％，总收率为44.1％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S01.提供肽片段1、肽片段2及肽片段3；
其中，肽片段1为虎纹镇痛肽主链序列中的第1-8位氨基酸和载体；
肽片段2为虎纹镇痛肽主链序列中的第9-23位氨基酸和载体；
肽片段3为虎纹镇痛肽主链序列中的第24-33位氨基酸和载体；
步骤S02.采用反应液体对肽片段2进行保护基脱除，并采用裂解液使得肽片段2从载体上裂解，得到全保护肽片段2’，且全保护肽片段2’中第9位和第22位半胱氨基酸的保护基被脱除；
步骤S03.对全保护肽片段2’进行氧化处理，获得肽片段4，且肽片段4中第9位和第22位半胱氨基酸之间形成一对二硫键；
步骤S04.采用裂解液将肽片段1从载体中裂解，得到全保护肽片段1’；
步骤S05.脱除肽片段3上的氨基保护基；并将处理后的肽片段3与肽片段4进行偶联处理，得到包含载体的肽片段5；
步骤S06.脱除肽片段5中的氨基保护基，并将处理后的肽片段5与全保护肽片段1’进行偶联处理，得到肽片段6；
步骤S07.采用裂解液去除肽片段6的载体，得到肽片段7；
步骤S08.对肽片段7进行氧化处理，使得其中第2位和第17位半胱氨酸氧化连接，得到肽片段8；
步骤S09.对肽片段8进行氧化处理，使第16位和第29位半胱氨酸上的保护基脱除并氧化连接成虎纹镇痛肽；
其中，所述肽片段1的结构为：
Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Val-Phe-Asp(OtBu)-Ala-树脂；
所述肽片段2的结构为：
Fmoc-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Pro-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Cys(StBu)-Ser(tBu)-树脂；
所述肽片段3的结构为：
Fmoc-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-His(Boc)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Leu-树脂。
2.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段1、肽片段2、肽片段3中的载体均是2-氯三苯甲基氯树脂。
3.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，步骤S02中的反应液体为体积百分比为15%~25% 2-巯基乙醇的0.1M N-甲基吗啡啉的二甲基甲酰胺溶液；所述裂解液为体积百分比为1%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液；步骤S03的氧化处理中，使用的氧化剂为空气。
4.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，步骤S05中偶联处理使用的缩合剂与活化剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的混合物或N,N-二异丙基乙胺和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物；所述缩合剂与活化剂的摩尔比为（1.0~1.5）:1；用于溶解所述缩合剂与活化剂的溶剂为二甲基甲酰胺；肽片段3的脱除处理使用的保护液为体积百分比为20%的哌啶的二甲基甲酰胺溶液。
5.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，步骤S06中偶联处理使用的缩合剂与活化剂为N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑的混合物或N,N-二异丙基乙胺和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的混合物；所述缩合剂与活化剂的摩尔比为（1.0~1.5）:1；用于溶解所述缩合剂与活化剂的溶剂为二甲基甲酰胺；肽片段5的脱除处理使用的保护液为体积百分比为20%的哌啶的二甲基甲酰胺溶液。
6.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，步骤S07的裂解液为三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、苯甲硫醚、三异丙基硅烷与去离子水的混合物；按照体积比，所述裂解液中三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：去离子水=87.5:2.5:5:2.5:2.5。
7.如权利要求1所述的虎纹镇痛肽的合成方法，其特征在于，步骤S08中，氧化处理的氧化剂为空气；步骤S09中，氧化处理的氧化剂为0.4~0.6 mol/L的碘-甲醇溶液与0.4~0.6mol/L的硫代硫酸钠溶液的混合物。
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