CN113801199A - 一种卡贝缩宫素的全固相合成方法 - Google Patents
一种卡贝缩宫素的全固相合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种卡贝缩宫素的全固相合成方法。该方法包括：以固相合成树脂为载体，依次连接氨基或者氨基及侧链经过保护的氨基酸，最后连接巯基经过保护的4‑巯基丁酸，得到末端巯基经过保护的线性肽树脂；脱除4‑巯基丁酸巯基保护基及丝氨酸羟基保护基，得到九肽片段树脂；在PPh3/DEAD作用下，末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，裂解，得到卡贝缩宫素。与现有固相环合技术相比，本发明粗肽纯度和收率大幅提高，降低了原料的成本和脱羧基保护引起的副反应。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种卡贝缩宫素的全固相合成方法。
背景技术
卡贝缩宫素是由辉凌制药有限公司开发的一种具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，并于1990年应用于临床，用于硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。分子结构如下：
氨基酸缩写肽序如下：
卡贝缩宫素及其类似物的制备方法早期主要是液相合成工艺，操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高。国外专利ES2115543及专利CS8605461是固液相结合的合成方法，在这些专利描述的方法中，都以液相方法进行环合。国内专利用液相环合的还有杭州和锦的专利(申请号：201010560715.4)，上海苏豪逸明制药的专利(申请号：201110001400.0)以及苏州天马的专利(申请号201510001735.0)。
国内专利中有多篇也使用固相方法环化。其合成思路主要有两类，第一类是先将溴代丁酸通过酰胺偶联与肽链的酪氨酸氨基偶联，再在碱(如DIPEA、NMM、LiCl、DMAP)作用下消除溴化氢形成硫醚键而关环，采用该方法的专利有我公司的专利(申请号200910106889.0)和杭州湃肽的专利(申请号201410461695.3)；另一类是先将羧基保护的丁酸连接到半胱氨酸的巯基上，偶联完所有残基后脱除丁酸羧基保护基，再通过酰胺偶联与肽链上的酪氨酸氨基偶联环合，采用该方法的专利有深圳健元药业的专利(申请号201010544419.5)，成都圣诺科技的专利(申请号201110151928.6)，无锡凯利的专利(申请号201210255959.0)，成都天台山药业的专利(申请号201410331088.5)。
液相环合方法需要反应原料在极稀溶液中反应，且副反应较多，在规模化生产中需大量溶剂，后处理复杂，随即产生大量废液。因此，采用固相环合更适合规模化生产。
固相环合方法前一类采用溴代丁酸为原料，由于溴比较活泼，易与NH2-等亲核试剂发生“卤代烃的亲核取代反应”，不容易发生-COOH与NH2-的定向缩合反应，推广应用有困难，致使杂质较多，收率不高；后一类方法由于要先保护羧基，增加了原料的成本和脱羧基保护引起的副反应，杂质情况并没有比前一类方法改善，反而增加了成本和操作的复杂性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种卡贝缩宫素的全固相合成方法。该方法以丝氨酸替代肽序中的半胱氨酸，以4-巯基丁酸替代肽序中4-氯丁酸，采用Mitsunobu反应高效形成硫醚键环合，方法简单、高效、同时副反应减少，环合率大幅度提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种卡贝缩宫素的全固相合成方法，包括如下步骤：
1)以固相合成树脂为载体，依次连接氨基或者氨基及侧链经过保护的甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸，最后连接巯基经过保护的4-巯基丁酸，得到末端巯基经过保护的线性肽树脂，即S(R)(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Pro-Leu-Gly-HN-氨基树脂，其中R为侧链保护基Mmt或Trt；
2)脱除4-巯基丁酸巯基保护基及丝氨酸羟基保护基，得到裸露巯基的九肽片段树脂；
3)在PPh3/DEAD作用下，九肽片段树脂的末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，得到卡贝缩宫素肽树脂；
4)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
作为优选，步骤1)中，氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH；氨基经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；氨基及侧链经过保护的丝氨酸选自Fmoc-Ser(Trt)-OH；氨基及侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；氨基及侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；氨基经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；氨基及侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；巯基经过保护的4-巯基丁酸选自Trt-S(CH2)3COOH或Mmt-S(CH2)3COOH。
本发明以Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH、Trt-S(CH2)3COOH或Mmt-S(CH2)3COOH为原料合成线性肽树脂，用稀三氟乙酸脱除丝氨酸及4-巯基丁酸保护基Trt，然后在PPh3/DEAD作用下，末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，得到卡贝缩宫素肽树脂。最后，裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
在本发明提供的具体实施例中，末端巯基经过保护的线性肽树脂为S(Trt)(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Pro-Leu-Gly-HN-氨基树脂。
作为优选，全固相合成方法为Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；
作为优选，以摩尔比例计，偶联剂中各成分的比例为DIPCDI:A＝(1.1～1.5):(1.0～1.4)，DIPEA:A:B＝(1.8～2.2):(1.0～1.4):(0.95～1.05)。
更优选为DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
作为优选，步骤1)中，固相合成树脂为RinkAmide树脂、RinkAmide-AM树脂或RinkAmide-MBHA树脂，树脂替代度为0.2～0.9mmol/g。
更优选地，树脂替代度为0.4～0.6mmol/g。
作为优选，步骤1)中，连接所用反应溶剂选自四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮中的一种。
更优选地，步骤1)中，连接所用反应溶剂选自DMF或N-甲基吡咯烷酮，反应时间为2～3小时。
作为优选，步骤2)中，脱除所用试剂为含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，其中三氟乙酸的体积百分浓度为1％～5％，三异丙基硅烷的体积百分浓度为3％～8％。
作为优选，步骤3)中，九肽片段树脂、PPh3、DEAD的摩尔比为1:1:1～1:1:5。
优选地，步骤3)中，九肽片段树脂、PPh3、DEAD的摩尔比为1:1:1～1:1:3。
作为优选，步骤3)中，Mitsunobu反应的溶剂选自四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或乙腈中的一种。
优选地，步骤3)中Mitsunobu反应的溶剂为四氢呋喃，反应时间为1-3小时，优选2小时。
作为优选，步骤4)中，裂解所采用的裂解试剂为TFA、TIS、H2O的混合物，以体积比计，TFA:TIS:H2O＝(85～95):(2～8):(2～8)。
作为优选，步骤4)获得粗肽产物后，还包括纯化步骤，纯化方法选自重结晶或反相高压液相方法。
本发明提供了一种卡贝缩宫素的全固相合成方法，该方法包括如下步骤：1)以固相合成树脂为载体，依次连接氨基或者氨基及侧链经过保护的甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸，最后连接巯基经过保护的4-巯基丁酸，得到末端巯基经过保护的线性肽树脂；2)脱除4-巯基丁酸巯基保护基及丝氨酸羟基保护基，得到裸露巯基的九肽片段树脂；3)在PPh3/DEAD作用下，九肽片段树脂的末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，得到卡贝缩宫素肽树脂；4)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。与现有固相环合技术相比，本发明具有如下优势：
1、该技术避免了采用溴代丁酸为原料，从而避免了易与NH2-等亲核试剂发生“卤代烃的亲核取代反应”，致使杂质减少，粗肽纯度大幅提高；
2、本发明采用稀酸脱除Trt，脱除方法简单高效，避免了技术背景中所述第二类环合方法要先保护羧基的方法，降低了原料的成本和脱羧基保护引起的副反应，提高了粗肽纯度及收率；
3、本发明采用Mitsunobu反应进行环合形成硫醚键，其反应条件温和，环合反应更彻底。
具体实施方式
本发明公开了一种卡贝缩宫素的全固相合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本文中英文缩写及含义如下：
本发明合成路线如下：
本发明全固相合成方法具体步骤如下：
1)以固相合成树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基和侧链经过保护的甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)，4-巯基丁酸得到末端巯基经过保护的线性肽树脂；
2)脱除4-巯基丁酸巯基保护基及丝氨酸羟基保护基Trt，得到裸露巯基的九肽片段树脂；
3)在PPh3/DEAD作用下，末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，得到卡贝缩宫素肽树脂；
4)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
进一步地，步骤1)中所述氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；所述氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH；所述氨基和侧链经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；所述氨基和侧链经过保护的丝氨酸选自Fmoc-Ser(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；所述氨基和侧链经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；所述氨基和侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述氨基和侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；所述巯基保护的4-巯基丁酸选自Trt-S(CH2)3COOH或Mmt-S(CH2)3COOH。
进一步地，步骤1)中所述的固相合成方法是Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；优选地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比例计为DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更优选为DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
进一步地，其中，步骤1)中所述的固相载体为Rink Amide树脂、Rink Amide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂，优选地树脂替代度为0.2～0.9mmol/g，更优选0.4～0.6mmol/g。
进一步地，步骤1)所用反应溶剂可选四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮等，优选为DMF或N-甲基吡咯烷酮，反应时间为2-3小时。
进一步地，步骤2)的脱除试剂为三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，三氟乙酸浓度为1～5％，三异丙基硅烷浓度为3～8％。
进一步地，步骤3)中线性肽树脂/PPh3/DEAD/摩尔比为1:1:1～1:1:5，优选1:1:1～1:1:3。
进一步地，步骤3)中反应溶剂可选四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或乙腈等，优选为四氢呋喃，反应时间为1-3小时，优选2小时。
进一步地，步骤4)采用的裂解试剂为TFA:TIS:H2O＝85～95:2～8:2～8(V:V)。
进一步地，步骤4)获得产物后，还包括纯化步骤，优选所述纯化步骤选自重结晶、反相高压液相方法。
本发明提供的卡贝缩宫素的全固相合成方法中所用载体、原料、试剂和仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：卡贝缩宫素肽树脂的制备
称取替代度为0.56mmol/g的RinkAmide树脂52.8g(29.4mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，DBLK脱保护6min+8min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(26.2g，88.2mmol)和HOBT(13.1g，97.0mmol)用DMF溶解，加入(15.2mL，106mmol)活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-Leu-OH(31.2g，88.2mmol)和HOBT(97.0mmol 13.1g)用DMF溶解，冰水浴下加入DIPCDI(15.2mL，105.8mmol)活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，按以上同样方法依次偶联Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ser(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(OMe)-OH和Trt-S(CH2)3COOH。反应结束，用DMF洗涤树脂3次。
脱除S-Trt及O-Trt保护基：用DCM洗涤树脂6次，将DCM：TFA：TIS＝90:3:7的脱保护液加入固相反应柱中，氮气鼓气反应10分钟后，抽掉，再加入脱保护液氮气反应10分钟，抽掉，再重复两次脱保护反应。
固相环化：脱Trt保护反应结束后，用DCM洗涤3次，THF洗涤3次。称取用PPh3(23.1g，88.2mmol)、DEAD(15.4，88.2mmol，)及适量THF溶解后加入固相反应柱中，室温反应2小时后，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。反应结束，抽干反应液，THF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥得到82.5g卡贝缩宫素肽树脂，树脂增重26.7g,理论增重22.0g，增重率121.4％。
实施例2：卡贝缩宫素的制备
将实施例1得到的卡贝缩宫素肽树脂82.5克加入到2000mL三口瓶中，氮气保护。加入预先配制好的TFA:TIS:H2O＝90:5:5(V:V)660mL，室温反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入6000mL冰乙醚中沉淀、离心，乙醚洗涤2次，减压干燥得到粗肽30.8克，HPLC纯度93.83％。经过高压液相制备纯化，冻干得到卡贝缩宫素精肽21.8g，纯度99.42％，最大单杂0.15％。理论产量29.04g，总收率75.1％。
实施例3：采用溴丁酸为原料的对比例
按照实施例1的方法，将Trt-S(CH2)3COOH改为4-溴丁酸进行固相偶联得到Br(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide树脂，然后脱除Mmt保护基。固相环化步骤采用DIPEA，室温环化3小时，以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。反应结束，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥。采用实施例2的方法裂解得到粗肽，粗肽纯度60.37％，明显低于实施例2。
实施例4：先偶联硫醚的对比例
采用固相偶联制备Fmoc-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Mmt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide树脂，然后脱除Mmt保护基，脱除Mmt保护基后，称取溴丁酸和DIPEA溶于DMF后加入反应柱中。反应0.5h后以DTNB检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时，直至树脂无色)。DMF洗涤树脂3次后，加入DBLK脱保护5min+7min。DCM洗涤3次，1％TFA/DCM溶液洗涤3次，DMF洗涤3次，得到H-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(CH2CH2CH2COOH)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide树脂。向上述树脂中加入TBTU和DIPEA的DMF溶液，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应完毕，抽干反应液，DMF洗涤树脂3次，抽干液体。甲醇收缩树脂3次，肽树脂真空干燥。采用实施例2的方法裂解得到粗肽，粗肽纯度53.32％。实施例4明显低于实施例2中粗肽纯度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种卡贝缩宫素的全固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以固相合成树脂为载体，依次连接氨基或者氨基及侧链经过保护的甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸，最后连接巯基经过保护的4-巯基丁酸，得到末端巯基经过保护的线性肽树脂，即S(R)(CH2)3CO-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Ser(Trt)-Pro-Leu-Gly-HN-氨基树脂，其中R为侧链保护基Mmt或Trt；
2)脱除4-巯基丁酸巯基保护基及丝氨酸羟基保护基，得到裸露巯基的九肽片段树脂；
3)在PPh3/DEAD作用下，九肽片段树脂的末端巯基与丝氨酸侧链羟基进行Mitsunobu反应脱水成环，得到卡贝缩宫素肽树脂；
4)裂解卡贝缩宫素肽树脂，得到卡贝缩宫素。
2.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤1)中，氨基经过保护的甘氨酸选自Fmoc-Gly-OH；氨基经过保护的亮氨酸选自Fmoc-Leu-OH；所述氨基经过保护的脯氨酸选自Fmoc-Pro-OH；氨基及侧链经过保护的丝氨酸选自Fmoc-Ser(Trt)-OH；氨基及侧链经过保护的天冬酰胺选自Fmoc-Asn(Trt)-OH；氨基及侧链经过保护的谷氨酰胺选自Fmoc-Gln(Trt)-OH；氨基经过保护的异亮氨酸选自Fmoc-Ile-OH；氨基及侧链经过保护的酪氨酸选自Fmoc-Tyr(Me)-OH；巯基经过保护的4-巯基丁酸选自Trt-S(CH2)3COOH或Mmt-S(CH2)3COOH。
3.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，所述全固相合成方法为Fmoc固相多肽合成方法，选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；
以摩尔比例计，偶联剂中各成分的比例为DIPCDI:A＝(1.1～1.5):(1.0～1.4)，DIPEA:A:B＝(1.8～2.2):(1.0～1.4):(0.95～1.05)。
4.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述固相合成树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-AM树脂或Rink Amide-MBHA树脂，树脂替代度为0.2～0.9mmol/g。
5.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述连接所用反应溶剂选自四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮中的一种。
6.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤2)中，所述脱除所用试剂为含有三氟乙酸和三异丙基硅烷的二氯甲烷溶液，其中三氟乙酸的体积百分浓度为1％～5％，三异丙基硅烷的体积百分浓度为3％～8％。
7.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤3)中，九肽片段树脂、PPh3、DEAD的摩尔比为1:1:1～1:1:5。
8.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤3)中，所述Mitsunobu反应的溶剂选自四氢呋喃、DMF、NMP、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或乙腈中的一种。
9.根据权利要求1所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤4)中，所述裂解所采用的裂解试剂为TFA、TIS、H2O的混合物，以体积比计，TFA:TIS:H2O＝(85～95):(2～8):(2～8)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的全固相合成方法，其特征在于，步骤4)获得粗肽产物后，还包括纯化步骤，所述纯化方法选自重结晶或反相高压液相方法。
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