CN117447548A - 采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
本发明涉及化学合成技术领域,提供了一种采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,将化学合成或生物重组表达的含有半胱氨酸的多肽序列与乙酰氨基甲醇混合,在酸性胍盐溶液中反应得到乙酰氨基保护的多肽溶液,再经过制备、冻干等步骤就可以获得纯品乙酰氨基甲基保护的多肽。本方法可以直接在溶液中对多肽半胱氨酸进行选择性修饰,操作简单,反应选择性高、反应条件温和和底物应用广泛,不仅对化学合成的多肽具有选择性修饰功能,而且对生物表达的多肽以及蛋白质也有同样的修饰效果。同时这种修饰方法又可以与天然化学连接方法合用,采用一锅法的方式选择性脱硫和脱除保护基而获得选择性保留半胱氨酸的多肽或者蛋白质。
Description
技术领域
本发明属于有机合成技术领域,涉及蛋白质多肽的修饰,具体涉及一种采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法。
背景技术
蛋白质多肽的天然化学连接需要N端半胱氨酸和C端硫酯前体。在20种天然氨基酸中,半胱氨酸的自然界丰度较低,直接导致片段连接过程没有可用的半胱氨酸(Cys)作为连接位点,从而使蛋白质的化学合成受到限制。为了在其他氨基酸处实现肽连接,科研工作者开发了很多方法来介导多肽连接。其中一种方法就是使用半胱氨酸原位替代序列中丙氨酸进行天然化学连接,将连接产物进行脱硫,从而得到天然蛋白质。但当蛋白质序列含有多个半胱氨酸且都不在连接位点时,使用这种策略将会脱除全部巯基,无法达到合成目的。因此需要开发一种保护基保护连接位点除外的半胱氨酸,实现一锅法天然化学连接,之后对连接产物进行选择性脱硫和脱除保护基处理。
为了解决上述技术问题,现有技术中进行了诸多有益探索:2020年,Brik课题组提出了琥珀酰亚胺与重组蛋白Trx-1 N端半胱氨酸化学选择性偶联,偶联产物与化学合成的带修饰(磷酸化、糖基化、乙酰化)的硫酯片段进行天然化学连接,之后再选择性脱硫和脱保护基实现天然蛋白质的合成;2021年,王平课题组使用乙醛酸对重组蛋白N端半胱氨酸进行暂时掩蔽,形成L-噻唑烷酸(Thz)类似物,用喹啉修饰其他半胱氨酸残基,随后在甲氧胺盐酸盐作用下解除乙醛酸的掩蔽,暴露出N端半胱氨酸实现2个片段连接,连接产物进行化学选择性脱硫和喹啉脱保护处理化学半合成CST4蛋白质。使用这种方法可以实现蛋白质中半胱氨酸残基的选择性去留,为天然蛋白质的合成提供了一种思路,尤其在蛋白质的化学半合成中,这种方法则显得尤为重要。但这两种方法操作比较繁琐,反应物需要纯化,无法一锅法合成蛋白质,增加了蛋白质合成的困难。
乙酰氨基甲基(Acm)是一种半胱氨酸的保护基,常应用于蛋白质(多肽)的化学合成。1968年,Veber等人首次报导了乙酰氨基甲基,他们发现,乙酰氨基甲基在常温酸性条件(TFA,HCl)以及0℃无水HF都是稳定的。Acm与常用的肽合成保护基相比表现出良好的稳定性,可以在相对温和的条件(如醋酸汞、氯化钯、硫酸铜)下去除,并没有显示出外消旋问题;2012年,kent课题组使用Acm保护的半胱氨酸合成了HIV蛋白,并使用了醋酸/醋酸汞完成Acm脱保护;2019年,Brik课题组用Acm保护的半胱氨酸通过固相多肽合成实现了氧硫还蛋白的合成,并在DTT/氯化钯作用下去除Acm保护基团;2020年,Otaka课题组用Acm保护的半胱氨酸合成了带有两个二硫键的蛋白质,并使用硫酸铜脱除了Acm保护基。但这些蛋白质的合成,均通过固相多肽合成的方法在固体支撑物上合成,无法实现游离多肽上半胱氨酸的选择性保护。
发明内容
本发明基于上述研究进行,目的在于提供一种适用于在游离多肽上进行半胱氨酸选择性保护的方法,具体提供了一种采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法。
为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:将化学合成或生物重组表达的含有半胱氨酸的多肽序列和乙酰氨基甲基修饰剂分别溶解在各自的溶剂中形成相应的溶液,然后将两种溶液混合并加入一定量的酸反应调节剂,在酸性胍盐溶液中反应得到乙酰氨基保护的多肽溶液,再经过制备、冻干等步骤就可以获得纯品乙酰氨基甲基保护的多肽。
具体的,本发明提供的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,包括如下步骤:
A、反应原料配制
将待修饰多肽和乙酰氨基甲基修饰剂分别溶解在各自的溶剂中,得到一定浓度的多肽溶液和乙酰氨基甲基溶液;
B、合成
将多肽溶液和乙酰氨基甲基溶液混合,并加入一定量的酸反应调节剂,在室温条件下进行反应,反应完全后即得到乙酰氨基甲基修饰的多肽粗品;
C、纯化
步骤B中得到的粗品依次经冻干、纯化、冻干得到乙酰氨基甲基修饰的多产品。
上述各步骤的优选条件如下:
步骤A中,溶解多肽的溶剂选自盐酸胍溶液、尿素溶液、乙腈/水溶液、PBS缓冲液中的任意一种;优选盐酸胍溶液,该盐酸胍溶液由TFA和盐酸胍以体积比1:1混合而成。
乙酰氨基甲基修饰剂选择乙酰氨基甲醇、乙酰氨基乙醇、氯乙酰甲胺、乙酰氨基甲基乙酸酯中的任意一种;
溶解乙酰氨基甲基修饰剂的溶剂选自水、乙腈、甲醇、DMF中的任意一种。
步骤B中,酸反应调节剂选自三氟乙酸、二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸中的任意一种;优选的,上述溶剂浓度至少为50%,优先选用无水形式;
多肽和乙酰氨基甲基修饰剂之间的摩尔浓度比为1:30,多肽和酸反应调节剂之间的摩尔浓度比为1:1及以上,一般酸反应调节剂体积大于等于多肽溶液。
合成条件为25℃,反应时间为45~60min;合成条件为37℃时,反应时间为30min。
步骤C中,冻干条件如下:液氮冻成固体,然后悬挂于冻干机中冻干,得到固体粉末;
纯化方法采用半制备高效液相色谱,条件如下:流动相:A:0.1%TFA/H2O,B:0.1%TFA/乙腈;色谱柱:Waters C18,流速:15mL/min,检测波长:214nm。
本发明的有益保障及效果如下:
本发明提供的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法中,乙酰氨基甲基修饰剂直接在溶液中对蛋白质(多肽)中的半胱氨酸进行选择性修饰,为半胱氨酸的选择性修饰提供了一种简洁可行,应用前景更加广泛的途径。
具体的,该方法首先通过乙酰氨基甲基修饰剂、酸反应调节剂一步保护多肽上半胱氨酸,制得乙酰氨基甲基保护的多肽。该方法具有反应选择性高,操作简单,反应条件温和和底物应用广泛等优点,不仅对化学合成的多肽具有选择性修饰功能,而且对生物表达的蛋白质也有同样的修饰效果,同时保护基又可以在温和条件下高效去除,实现选择性保留半胱氨酸残基的功能。与传统方法相比,本发明合成方法具有反应时间短,反应选择性高,操作简单,以及底物应用广等优点。
附图说明
图1为多肽产品的HPLC-质谱分析结果。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明,以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述实施例。
本发明中的修饰方法适合于任何长度游离性多肽中任何位置半胱氨酸的选择性修饰,下以多肽LYRACGELG-NH2为例,对修饰方法的具体过程进行描述。
实施例1多肽LYRACGELG-NH2的制备
称取0.1mmol Rink amide resin加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30min。加入DBLK脱保护3+4+3分钟,DMF洗涤树脂6次。称取148.65mg Fmoc-Gly-OH(0.5mmol)和71mg Oxyma(0.5mmol),用适量DMF溶解。加入0.125g(1mmol)DIC,激活3min后加入到树脂中,室温反应1h。反应结束,抽除反应液,DMF洗涤树脂三次。
按照偶联Fmoc-Gly-OH同样的方法依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH反应时间均为1h,以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应;如树脂显色则延长反应1h),最终得到多肽LYRACGELG-NH2树脂。
将肽LYRACGELG-NH2树脂用DMF洗涤3次,用DCM洗涤2次,真空抽干后,加入预先配制好的裂解液TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5(V:V)3mL,室温反应1h,过滤树脂,收集滤液,用少量裂解液洗涤树脂,合并滤液。将滤液缓慢加入1.5L冰乙醚中沉淀、离心,弃去上清液,减压干燥得到LYRACGELG-NH2粗肽。然后通过半制备液相制备粗肽,得到LYRACGELG-NH2纯品。
上述多肽序列中各氨基酸以及合成过程中所用主要原料的英文缩写及中文名称对应参见下表1:
表1多肽氨基酸及合成原料缩写对应的物质名称
英文缩写 | 中文名 | 英文缩写 | 中文名 |
Leu | 亮氨酸 | Oxyma | 2-氯三苯甲基树脂 |
Tyr | 酪氨酸 | DIC | 二异丙基碳二亚胺 |
Arg | 精氨酸 | DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
Ala | 丙氨酸 | DIC | 二异丙基碳二亚胺 |
Cys | 半胱氨酸 | DCM | 二氯甲烷 |
Gly | 甘氨酸 | DBLK | 20%哌啶的DMF溶液(v:v) |
Glu | 谷氨酸 | TFA | 三氟乙酸 |
Fmoc | 9-芴甲氧羰基 | tBu | 叔丁基 |
实施例2采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸
将制得的多肽LYRACGELG-NH2与Acm-OH在酸性条件下直接可得LYRAC(Acm)GELG-NH2,减少操作过程,提高生产效率,同时减少有机溶剂的使用。
具体步骤如下:
(1)取多肽LYRACGELG-NH2溶解在TFA/盐酸胍(1:1,v:v)溶液中,得到浓度为2mmol/L的多肽盐酸胍溶液;将乙酰氨基甲醇溶解水中,得到浓度为60mmol/L的乙酰氨基甲醇水溶液。
(2)将多肽盐酸胍溶液和乙酰氨基甲醇水溶液按体积比1:1混合,并加入同等多肽溶液体积的无水三氟乙酸,在室温条件下反应45min,反应完全后即得到乙酰氨基甲基修饰的多肽LYRAC(Acm)GELG-NH2粗品。当三氟乙酸、盐酸胍溶液的体积比为1:1时,可适当增加产率,减少副产物的生成。
(3)乙酰氨基甲基修饰的多肽LYRAC(Acm)GELG-NH2粗品依次经冻干、半制备高效液相色谱纯化、冻干得到乙酰氨基甲基修饰的多肽LYRAC(Acm)GELG-NH2产品。
对多肽产品进行HPLC-质谱分析,结果参见图1,结果显示,纯度为97.97%,MS=1051Da。
上述实施例中,多肽的溶剂采用TFA/盐酸胍(1:1,v:v)溶液,本领域常用的尿素溶液、乙腈、PBS缓冲液也可实现多肽溶解,其中尿素溶液的摩尔浓度在6mol/L附近。
乙酰氨基甲基修饰剂除本实施例应用的乙酰氨基甲醇外,乙酰氨基乙醇、氯乙酰甲胺、乙酰氨基甲基乙酸酯也能够实现相应功能。溶解乙酰氨基甲基修饰剂的溶剂除水外,乙腈、甲醇、DMF也可选择。
酸反应调节剂除无水三氟乙酸外,无水二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸也可实现相应功能。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (7)
1.一种采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
A、反应原料配制
将待修饰多肽和乙酰氨基甲基修饰剂分别溶解在各自的溶剂中,得到一定浓度的多肽溶液和乙酰氨基甲基溶液;
B、合成
将多肽溶液和乙酰氨基甲基溶液混合,并加入一定量的酸反应调节剂,在室温条件下进行反应,反应完全后即得到乙酰氨基甲基修饰的多肽粗品;
C、纯化
步骤B中得到的粗品依次经冻干、纯化、冻干得到乙酰氨基甲基修饰的多肽产品。
2.根据权利要求1所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,步骤A中,溶解多肽的溶剂选自盐酸胍溶液、尿素溶液、乙腈/水溶液、PBS缓冲液中的任意一种;
溶解乙酰氨基甲基修饰剂的溶剂选自水、乙腈、甲醇、DMF中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,所述盐酸胍溶液由TFA和盐酸胍以体积比1:1混合而成;
所述乙酰氨基甲基修饰剂选自乙酰氨基甲醇、乙酰氨基乙醇、氯乙酰甲胺、乙酰氨基甲基乙酸酯中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,步骤B中,酸反应调节剂选自三氟乙酸、二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸中的任意一种;
多肽和乙酰氨基甲基修饰剂之间的摩尔浓度比为1:30,多肽溶液和酸反应调节剂之间的体积比为1:1及以上。
5.根据权利要求4所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,所述三氟乙酸、二氟乙酸、乙酸、甲酸、盐酸、三氯乙酸的浓度为50%~100%。
6.根据权利要求1所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,步骤B中,合成条件为25℃时,反应时间为45~60min;合成条件为37℃时,反应时间为30min。
7.根据权利要求1所述的采用乙酰氨基甲基修饰蛋白质多肽中半胱氨酸的方法,其特征在于:
其中,步骤C中,冻干条件如下:液氮冻成固体,然后悬挂于冻干机中冻干,得到固体粉末;
纯化方法采用半制备高效液相色谱,条件如下:流动相:A:0.1%TFA/H2O,B:0.1%TFA/乙腈;色谱柱:WatersC18,流速:15mL/min,检测波长:214nm。
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