CN114591403A - 基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法 - Google Patents

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CN114591403A CN202210392778.6A CN202210392778A CN114591403A CN 114591403 A CN114591403 A CN 114591403A CN 202210392778 A CN202210392778 A CN 202210392778A CN 114591403 A CN114591403 A CN 114591403A
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Abstract

本发明涉及一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法。该方法采用Rink Amide MBHA树脂为固相载体，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接氨基酸，得到卡贝缩宫素直链肽树脂，用切割试剂将直链肽从树脂上切割，加入甲基叔丁基醚沉淀直链肽粗品，将直链肽溶解于含有还原剂的碱性溶液中，室温液相缩合环化反应，再用制备型HPLC进行分离纯化，获得目标产物。本发明的方法能明显降低卡贝缩宫缩氧化杂质含量，提高合成收率，增加产品的成本优势。

Description

基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法
技术领域
本发明涉及基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，属于多肽药物制备技术领域，
背景技术
卡贝缩宫素(Carbetocin Acetate)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素八肽类似物，卡贝缩宫素分子式为C45H69N11O12S，结构式如下：
Figure BDA0003596190270000011
贝缩宫素多肽性状为白色疏松粉末，其临床和药理特性与天然产生的催产素类似。卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达到高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。
现有卡贝缩宫素的合成方法总的来说分为液相合成以及固相合成两种。专利文件CN104262464A、CN102796178A、CN104086631A、CN101555272A分别公开了先以固相法合成卡被缩宫素线性肽树脂，然后固相上进行环化反应，该类方法在合成过程中存在环化不彻底等问题。
卡贝缩宫素的液相合成由于合成难度以及合成成本、纯化成本较高，相关报道较少。现有的卡贝缩宫素制备方法多为固液合成法。中国专利文件CN102167723A公开了一种多肽合成卡贝缩宫素的制备方法。该方法采用Rink Amide MBHA Resin为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，依次连接氨基酸，其中Cys采用Fmoc-Cys(CH2CH2COOR)-OH，最后一个氨基酸使用FmocTyr(Me)-OH，得到保护的九肽树脂后，脱掉Tyr上的Fmoc氨基保护基，切割树脂得到直链肽粗品，然后加入BOP/HOBt/DMF进行成环反应，采用制备型HPLC进行分离纯化，得到目标产物。但是该方法存在操作繁琐等问题，不利于工业化生产。
ES2115543的合成方法中用到了LiOH、NaHCO3和DMAP原料，由此会导致产生许多杂质，降低产品的纯度和使用效果。CN101555272A提供的合成方法中采用了Cys(Alloc)原料，并以氯化锂为环化试剂进行环化，酸解后得到卡贝缩宫素，该方法存在催化剂中毒的问题，Cys(Alloc)在去Alloc保护后-SH裸露，极易使四三苯基膦钯催化剂中毒而失效，从而严重影响去保护反应的效率。
现有制备卡贝缩宫素的方法不同程度地存在着合成周期长、生产成本高、产品活性低等不足，不利于卡贝缩宫素的大规模生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法。本发明的目的在于有效控制卡贝缩宫素合成过程中氧化杂质，提高合成收率，可用于大规模生产卡贝缩宫素。
术语说明：
Rink Amide-MBHA Resin，4-(2′,4′-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙酰氨基-甲基二苯甲胺树脂。简写为Rink AM-MBHA Resin，是本发明优选的一种氨基树脂。
DCM：二氯甲烷
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺
TFA：三氟乙酸
EDT：乙二硫醇
DIEA：N,N-二异丙基乙胺
DTT：二硫苏糖醇
TCEP：三(2-羧乙基)膦
本说明书中“卡贝缩宫素直链肽”、“卡贝缩宫素线性肽II”和“贝缩宫素前体肽Ⅱ”具有同样的含义。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，包括步骤：
(1)将氨基树脂溶胀、脱保护并洗涤，与DIC活化的Fmoc保护氨基酸溶液于多肽合成器中缩合反应2-3小时，缩合完成后洗涤，脱保护并洗涤，依次偶联接入从氨基树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸，最后加入4-氯基丁酸，偶联N末端的4-氯丁酸，每次缩合完成后洗涤，脱保护并洗涤，得到卡贝缩宫素直链肽树脂：
4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin；
其中，Fmoc保护氨基酸依次为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(Me)-OH；
(2)将卡贝缩宫素直链肽树脂脱保护并洗涤后抽干，加入切割试剂，进行切割反应，沉降、分离沉淀，得到卡贝缩宫素直链肽：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(3)将卡贝缩宫素直链肽溶解于乙腈水溶液中，加入还原剂，用碱溶剂调节pH，进行液相缩合环化，室温反应20-35小时环化得到卡贝缩宫素粗肽；
所述的还原剂为维生素C、亚硫酸钠、DTT或TCEP，所述碱试剂为NaOH、KOH、三乙胺或DIEA。
(4)将卡贝缩宫素粗肽通过反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到卡贝缩宫素精肽。
优选的，步骤(1)中，所述氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，取代度为0.35～0.6mmol/g；所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
优选的，步骤(1)中，活化的保护氨基酸溶液是按以下方法制备：将Fmoc保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液，活化后形成的活泼酯将自发的与C端保护氨基酸反应，减小消旋产物的生成。
优选的，步骤(1)中，所述每一种Fmoc保护氨基酸投料量为氨基树脂摩尔数的2-4倍，4-氯丁酸投料量为氨基树脂摩尔数的2-4倍。缩合反应温度为20-40℃，HOBt、DIC、保护氨基酸、4-氯丁酸，摩尔比为1：1：1：1。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入7-10倍氨基树脂体积的20％哌啶与DMF混合溶液，氮气鼓吹反应，洗脱时间为15-30min；然后用真空泵将溶液抽干；再加入7-10倍树脂体积的DMF溶液，氮气鼓吹1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作2～3次。
优选的，步骤(1)最后用甲醇收缩。
优选的步骤(2)中，所述的切割试剂为：87.5mL三氟乙酸(TFA)，5ml茴香硫醚，5mLH2O，2.5mL乙二硫醇(EDT)和5g苯酚，配成100mL的切割试剂。
优选的步骤(2)中，所述切割反应时间为1.5-2小时。切割反应最好在磁力搅拌下进行。
优选的步骤(2)中，切割反应完成后，加入甲基叔丁基醚，沉淀，离心干燥。
优选的，步骤(3)中，所述乙腈水溶液浓度为50％体积比；卡贝缩宫素直链肽在乙腈水溶液中的质量体积比浓度为1g/mL-2g/mL。
优选的，步骤(3)中，所述的还原剂为维生素C、亚硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)；进一步优选亚硫酸钠或TCEP。所述碱试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。所述用碱溶剂调节pH是指调节pH为8.5-9.5，优选调节pH为9.0。
优选的，步骤(3)中，所述的还原剂与卡贝缩宫素直链肽摩尔比为1～2:1。进一步优选，还原剂与卡贝缩宫素直链肽摩尔比为1:1。还原剂的加入量较为重要，太低不能很好控制环化液中的氧化杂质1和氧化杂质，太高会产生其他杂质而影响卡贝缩宫素粗肽纯度。
优选的，步骤(3)中，所述环化反应条件为室温反应。此处“室温”具有本领域公知的含义，一般为25℃±2℃。优选的环化反应时间为24-30小时。
优选的，步骤(4)中，通过制备型反相高效液相色谱进行纯化，填料为C18，流动相采用硫酸铵水溶液和乙腈的混合溶液，优选的检测波长为280nm。
本发明的有益效果：
本发明的方法以氨基树脂为起始树脂载体，通过固相合成法依次缩合卡贝缩宫素氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸以及N末端的4-氯基丁酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到卡贝缩宫素直链肽树脂-氨基树脂，之后洗涤树脂并进行切割、沉降后，得到卡贝缩宫素线性肽Ⅱ，线性肽Ⅱ经过纯化除杂和环化得到卡贝缩宫素粗肽，卡贝缩宫素粗肽经过纯化及冻干后得到卡贝缩宫素精肽。其优势在于：
1.本发明利用液相环化技术，卡贝缩宫素粗品收率高达60％左右，粗品纯度>70％，可高达85％，提高了卡贝缩宫素合成收率。纯化后卡贝缩宫素精肽纯度约为99.9％。
2.本发明的方法，能降低卡贝缩宫素氧化杂质，加入还原剂后能中和溶液中氧气，大大减少了卡贝缩宫素被氧化成亚砜的杂质生成，环化液中的氧化杂质1和氧化杂质2明显降低。本发明优选实施例中，能使粗肽中氧化杂质1和氧化杂质2的含量控制在2％以下，氧化杂质1和氧化杂质2相对保留时间分别为0.37、0.49。且最大单杂不超过2％。
3.本发明的方法操作简单，反应过程取样方便，易于中控，生产成本低，副产物少，产品收率高，利于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
图2是实施例2卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
图3是实施例3卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
图4是实施例4卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
图5是实施例5卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
图6是对比例1卡贝缩宫素粗肽的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例中氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，卡贝缩宫素纯化工艺中选用十八烷基硅烷键合硅胶(C18)柱、5μm制备柱进行反相高效液相色谱纯化。流动相采用硫酸铵水溶液和乙腈的混合溶液，检测波长为280nm。
缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为2-3小时；脱保护剂为20％哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。
所述的切割试剂按100mL计组成为：87.5mL TFA+5ml茴香硫醚(TIS)+5mL H2O+2.5mL EDT+5g苯酚。
实施例中所述“％”如无特别说明的，均为质量百分比。
实施例1、一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，步骤如下：
(1)氨基树脂的溶胀、脱保护，卡贝缩宫素直链肽树脂的合成
a.称量取代度为0.67mmol/g的氨基酸树脂Rink Amide-MBHA Resin 3.0g，加入至多肽合成反应器中，取30mL DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，溶剂充分接触，溶胀0.5h。抽干溶剂，再加入30mL DMF溶剂充分接触，溶胀0.5h。溶胀后加入30mL、20％哌啶DMF溶液脱保护两次，第一次10min，第二次15min，脱保护后加入30mL DMF溶剂洗涤六次。
b.将Fmoc保护氨基酸2.5g加入到18mL DMF中，加入0.54g HOBT(缩合剂)，滴入0.62mL DIC(活化剂)，得到活化的Fmoc保护氨基酸溶液。
c.将活化的Fmoc保护氨基酸Fmoc-Gly-OH溶液加入到步骤a溶胀、脱保护、洗涤好的氨基树脂中，30℃缩合反应2.5小时。加入30mL DMF溶剂洗涤六次，重复步骤a中的脱保护、洗涤操作。
d.重复步骤b、步骤c的操作，依次偶联氨基酸的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，最后加入4-氯基丁酸偶联N末端的4-氯丁酸。
e.偶联4-氯丁酸后加入30mL甲醇溶剂洗涤两次，抽干。
以上缩合反应中Fmoc保护氨基酸、4-氯基丁酸投料量按所投氨基树脂摩尔数的3倍左右。Fmoc保护氨基酸、4-氯丁酸的摩尔比为1：1。
得到卡贝缩宫素直链肽树脂：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin。
(2)贝缩宫素前体肽Ⅱ的合成
将步骤(1)制备的卡贝缩宫素直链肽树脂脱保护并洗涤后抽干成颗粒状，具体操作如下：将溶液抽干后，加入30mL、20％哌啶DMF溶液脱保护两次，第一次10min，第二次15min，脱保护后加入30mL DMF溶剂洗涤六次，加入30mL甲醇溶剂洗涤两次。
取处理后的颗粒状卡贝缩宫素直链肽树脂3.0g,加入30mL切割试剂，切割试剂配比为：TFA:茴香硫醚:H20:EDT:苯酚＝87.5:5:5:2.5:5)(v:v:v:v:m，单位mL：g)，磁力搅拌，反应100min，过滤，加入300mL甲叔醚，过滤，得贝缩宫素前体肽Ⅱ：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
(3)卡贝缩宫素粗肽的合成
取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ,加入100mL 50％乙腈水溶液中，再加入0.17g维生素C(维生素C与贝缩宫素前体肽Ⅱ的摩尔比1:1)，用DIEA调节pH＝9.0，进行液相环化，室温反应24小时，得卡贝缩宫素粗肽0.51g(以含量计)，粗品收率52.85％，HPLC检测主峰纯度为70.43％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为3.97％、3.33％。
(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.89％。
实施例2、一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，步骤如下：
步骤(1)氨基树脂的溶胀及卡贝缩宫素直链肽树脂的合成，同实施例1，所不同的是其中的(1)b.活化的Fmoc保护氨基酸溶液制备中Fmoc保护氨基酸加量为3.5g。
步骤(2)贝缩宫素前体肽Ⅱ的合成，同实施例1，得贝缩宫素前体肽Ⅱ：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
步骤(3)卡贝缩宫素粗肽的合成
取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ，加入100mL 50％乙腈水溶液中，再加入0.15gDTT(DTT与卡贝缩宫素直链肽的摩尔比1:1)，用DIEA调节pH＝9.0,进行液相环化，室温反应24小时，得卡贝缩宫素粗肽0.55g(以含量计)，粗品收率56.99％，HPLC检测主峰纯度为73.66％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为3.78％，3.29％。
(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.90％。
实施例3、一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，步骤如下：
(1)卡贝缩宫素直链肽树脂的合成
a.称量取代度为0.67mmol/g的氨基酸树脂Rink Amide-MBHA Resin 3.0g，加入至多肽合成反应器中，取30mL DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，溶剂充分接触，溶胀0.5h。抽干溶剂，再加入30mL DMF溶剂充分接触，溶胀0.5h。溶胀后加入30mL、20％哌啶DMF溶液脱保护两次，第一次10min，第二次15min，脱保护后加入30mL DMF溶剂洗涤六次。得处理好的氨基树脂。
b.将Fmoc保护氨基酸3g加入到18mL DMF中，加入缩合剂HOBT 0.54g，滴入0.62mL活化剂DIC，得活化的Fmoc保护氨基酸溶液。
c.将活化的Fmoc保护氨基酸Fmoc-Gly-OH溶液加入到步骤a处理好的氨基树脂中，30℃缩合反应2.5小时。加入30mL DMF溶剂洗涤六次，重复步骤a中的脱保护、洗涤操作。
d.重复步骤b、步骤c的操作，依次偶联氨基酸的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(Me)-OH，最后加入4-氯基丁酸偶联N末端的4-氯丁酸。
e.偶联4-氯丁酸后加入30mL甲醇溶剂洗涤两次，抽干。
以上缩合反应中Fmoc保护氨基酸、4-氯基丁酸投料量按所投氨基树脂摩尔数的3倍。Fmoc保护氨基酸、4-氯丁酸的摩尔比为1：1。
得到卡贝缩宫素直链肽树脂：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin。
(2)贝缩宫素前体肽Ⅱ的合成
将步骤(1)制备的卡贝缩宫素直链肽树脂脱保护并洗涤后抽干成颗粒状，具体操作如下：将溶液抽干后，加入30mL、20％哌啶DMF溶液脱保护两次，第一次10min，第二次15min，脱保护后加入30mL DMF溶剂洗涤六次，加入30mL甲醇溶剂洗涤两次。
取处理后的颗粒状卡贝缩宫素直链肽树脂3.0g,加入30mL切割试剂，切割试剂配比为：TFA:茴香硫醚:H20:EDT:苯酚＝87.5:5:5:2.5:5)(v:v:v:v:m，单位mL：g)，磁力搅拌，反应100min，过滤，加入300mL甲基叔丁基醚，离心干燥，得贝缩宫素前体肽Ⅱ：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
(3)卡贝缩宫素粗肽的合成
取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ,加入100mL 50％乙腈水溶液中，再加入0.12g亚硫酸钠，用DIEA调节pH＝9.0,进行液相环化，室温反应24小时，得卡贝缩宫素粗肽0.57g(以含量计)，粗品收率59.07％，HPLC检测，主峰纯度为80.13％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为1.87％、1.96％。
(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.90％。
实施例4、一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，步骤如下：
步骤(1)、步骤(2)如实施例1所述，所不同的是：
步骤(3)卡贝缩宫素粗肽的合成
取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ,加入100mL 50％乙腈水溶液中，再加入0.28gTCEP(TCEP与卡贝缩宫素直链肽的摩尔比1:1)，用DIEA调节pH＝9.0,进行液相环化，室温反应24小时，得卡贝缩宫素粗肽0.61g(以含量计)，粗品收率63.21％，HPLC检测主峰纯度为85.25％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为1.00％、1.50％。
步骤(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.91％。
实施例5、如实施例1所述，所不同的是：
(3)取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ,加入100mL 50％乙腈水溶液中，再加入0.56gTCEP(TCEP与卡贝缩宫素直链肽的摩尔比2:1)，用三乙胺调节pH＝9.0,进行液相环化，室温反应28小时，得卡贝缩宫素粗肽0.57g(以含量计)，粗品收率59.07％，HPLC检测纯度为79.92％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为0.66％、0.32％。
(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.86％。
对比例1：不加还原剂
步骤(1)、步骤(2)如实施例1所述，所不同的是：
(3)卡贝缩宫素粗肽的合成
取1.0g贝缩宫素前体肽Ⅱ4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2，加入100mL 50％乙腈水溶液中，用DIEA调节pH＝9.0,进行液相环化，室温反应24小时，得卡贝缩宫素粗肽0.41g(以含量计)，粗品收率41.49％，HPLC检测，主峰纯度为65.96％，氧化杂质1、氧化杂质2分别为7.79％，12.52％。
(4)卡贝缩宫素精肽制备
取卡贝缩宫素粗肽环化液体进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，冻干，得到卡贝缩宫素，HPLC纯度99.88％。
对比结论：环化过程中对比例1不加还原剂，与加入还原剂的实施例(加入卡贝缩宫素直链肽等摩尔量的还原剂维生素C、DTT、亚硫酸钠或TCEP)粗品比较，主峰纯度远低于加入还原剂的实施例产品，且其氧化杂质1和氧化杂质2含量偏大。

Claims (10)

1.一种基于液相环合的卡贝缩宫素制备方法，包括步骤：
(1)将氨基树脂溶胀、脱保护并洗涤，与DIC活化的Fmoc保护氨基酸溶液于多肽合成器中缩合反应2-3小时，缩合完成后洗涤，脱保护并洗涤，依次偶联从氨基树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸，最后加入4-氯基丁酸偶联N末端的4-氯丁酸，每次缩合完成后洗涤，脱保护并洗涤，得到卡贝缩宫素直链肽树脂：
4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink-AM-Resin；
其中，Fmoc保护氨基酸依次为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(Me)-OH；
(2)将卡贝缩宫素直链肽树脂脱保护并洗涤后抽干，加入切割试剂，进行切割反应，沉降，分离沉淀，得到卡贝缩宫素直链肽：4-氯丁酸-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(3)将卡贝缩宫素直链肽溶解于乙腈水溶液中，加入还原剂，用碱溶剂调节pH，进行液相缩合环化，室温反应20-35小时环化得到卡贝缩宫素粗肽；
所述的还原剂为维生素C、亚硫酸钠、DTT或TCEP，所述碱试剂为NaOH、KOH、三乙胺或DIEA；
(4)将卡贝缩宫素粗肽通过反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到卡贝缩宫素精肽。
2.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，取代度为0.35～0.6mmol/g；优选的，所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
3.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述每一种Fmoc保护氨基酸投料量为氨基树脂摩尔数的2-4倍，4-氯丁酸投料量为氨基树脂摩尔数的2-4倍；优选的，缩合反应温度为20-40℃，HOBt、DIC、保护氨基酸、4-氯丁酸，摩尔比为1：1：1：1。
4.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)中，所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入7-10倍氨基树脂体积的20％哌啶与DMF混合溶液，氮气鼓吹反应，洗脱时间为15-30min；然后用真空泵将溶液抽干；再加入7-10倍树脂体积的DMF溶液，氮气鼓吹1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作2～3次。
5.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(2)中，所述的切割试剂为：87.5mL三氟乙酸(TFA)，5ml茴香硫醚，5mL H2O，2.5mL乙二硫醇(EDT)和5g苯酚，配成100mL的切割试剂；优选的，所述切割反应时间为1.5-2小时。
6.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述卡贝缩宫素直链肽在乙腈水溶液中的质量体积比浓度为1g/mL-2g/mL。
7.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述的还原剂为维生素C、亚硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)；优选所述的还原剂与卡贝缩宫素直链肽摩尔比为1～2:1；进一步优选，还原剂与卡贝缩宫素直链肽摩尔比为1:1。
8.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述碱试剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)；优选调节pH为9.0。
9.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(3)中，所述环化反应时间为24-30小时。
10.如权利要求1所述的卡贝缩宫素制备方法，其特征在于步骤(4)中，通过制备型反相高效液相色谱进行纯化，填料为C18，流动相采用硫酸铵水溶液和乙腈的混合溶液。
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