CN116947966B - 一种伊特卡肽中间体及伊特卡肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种伊特卡肽中间体及伊特卡肽的制备方法。涉及医药合成技术领域。本发明首先制备伊特卡肽中间体，采用固相合成方式，在裂解树脂之前先进行氧化反应构筑二硫键，使得反应中所用原料、杂质及所使用的试剂，更容易通过简单过滤的方式除去。本发明利用制备的中间体，采用片段法合成伊特卡肽，合成效率高，合成难度降低，合成收率高，达到70%左右。本发明具备简单、高效、低成本、绿色环保且适合工业化生产等优势。
Description
技术领域
本发明涉及医药合成技术领域，具体而言，涉及一种伊特卡肽中间体及伊特卡肽的制备方法。
背景技术
PHPT（原发性甲状旁腺功能亢进症）是一种相对常见的内分泌疾病，是由于甲状旁腺本身病变引起的甲状旁腺激素（PTH）的合成与分泌过多所引起的疾病。伊特卡肽是由Amgen Europe B.V开发的一种拟钙剂，具有调节甲状旁腺主细胞表面钙敏感受体(CaSR)分泌甲状旁腺的作用，从而降低PTH水平，可用于治疗甲状旁腺功能亢进。
伊特卡肽的合成主要有以下几种，一种是液相法合成线性多肽，先构筑末端酰胺键，而后逐一将多肽序列中的氨基酸偶联，完成肽链合成。这种方式需要多步液相合成，且每步合成后需要进行后处理，时间成本高，效率低下。另一种是固液结合法，采用常规固相法合成线性多肽后，裂解粗肽，再利用液相法围绕二硫键键合方式的不同形成不同的方案；但是，先裂解的粗肽需要进一步纯化处理，且需要液相法进行二硫键氧化；由此，使得整条工艺单元操作较多，生产较为复杂；氧化过程杂质较多；且氧化剂选择较为局限，多为含硫氧化剂，对环境影响较大，种种原因导致终产品收率较低。还有一种是片段法，采用常规固相法合成线性多肽（例如6肽），而后将含N-D-Cys-(S-S)-L-Cys-OH的衍生物通过偶联反应完成线性肽链的构筑，这种方式通过先完成二硫键的构筑一定程度上降低了伊特卡肽的合成难度，但是关键的含二硫键的中间体仍然需要采用液相方法合成，同时也不可避免的使用含硫的氧化剂进行构筑，对环境影响大，且这类中间体多为柱层析纯化手段得到，生产成本高，不利于工业化生产。因此，目前需要一种简单、高效、低成本、绿色环保适合工业化生产的伊特卡肽制备方法。
发明内容
本发明所要解决的问题是现有合成伊特卡肽的方式存在工艺效率低、液相法氧化二硫键后处理操作复杂，产品收率低等问题。
为解决上述问题中的至少一个方面，本发明第一方面提供一种伊特卡肽中间体的制备方法，包括：
通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin；
对所述第一产物进行封端处理并脱除保护基后，得到第二产物H-D-Ala-O-Resin；
通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；
对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin；
对所述第四产物进行裂解树脂反应，得到伊特卡肽终中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH。
较佳地，所述通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin包括：
对所述第一树脂进行溶胀处理，并抽干滤液，得到处理后的第一树脂；
将所述Fmoc-D-Ala-OH、碱、催化剂加入反应溶剂中溶解，得到第一反应液，将所述第一反应液加入所述处理后的第一树脂中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，反应完成后，进行抽滤、洗涤、干燥处理，得到所述Fmoc-D-Ala-O-Resin；
其中，所述催化剂包括HOBT和HOAT中的一种，所述碱包括DIEA，所述反应溶剂包括NMP、DMF和DMSO中的一种。
较佳地，所述通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-OH、缩合剂、所述催化剂加入至重新量取的所述反应溶剂中进行溶解，冰水浴下加入所述碱，搅拌均匀得到第二反应液，将所述第二反应液加入至所述Fmoc-D-Ala-O-Resin中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，得到所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；其中，所述缩合剂包括HATU、HBTU、HCTU、DIC、HyBOP和HyAOP中的一种。
较佳地，所述对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin加入反应器中，并进行溶胀处理，将氧化剂溶解于重新量取的所述反应溶剂中，并加入至所述反应器中，氧化反应4h，进行抽滤、洗涤处理，得到所述Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin，其中，所述氧化剂包括氧气、双氧水、DMSO、NCS和碘单质中的一种或多种。
较佳地，所述裂解树脂反应中用到的裂解剂包括TFA/DCM和TFE/DCM中的一种，所述TFA/DCM由体积比1-5:95-99的TFA和DCM组成；所述TFE/DCM由体积比15-25:75-85的TFE和DCM组成。
较佳地，所述第一树脂包括CTC树脂，所述CTC树脂的取代度为0.3-1mmol/g。
本发明相较于现有技术的优势在于：
本发明的制备方法，采用固相合成方式合成中间体，在裂解树脂之前先进行氧化反应构筑二硫键，使得反应中所用原料、杂质及所使用的试剂，更容易通过例如过滤的方式除去。相比于先裂解树脂而后再构筑二硫键，由于其属于液相过程，反应为均相，杂质、原料等不易除去，通常需要进行萃取、选干、柱层析等复杂的后处理步骤，操作复杂、纯化困难。而本发明采用在树脂上先构筑二硫键的方式，使中间体的纯化更加简单，只需进行简单的过滤洗涤即可。因此与现有技术中采用液相方法合成含二硫键的中间体相比，本发明的方法制备过程及后处理更简单，且由于合成及后处理纯化等操作简单，也有助于提升工艺效率和产品收率，使得本发明更具有工业化生产的优势。
本发明第二方面提供一种伊特卡肽的制备方法，包括：
采用如上所述的伊特卡肽中间体的制备方法制得伊特卡肽终中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH；
以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A，所述伊特卡肽片段A具备伊特卡肽序列脱除Fmoc的位置3到位置7的氨基酸单元的序列；
将所述伊特卡肽片段A和所述伊特卡肽中间体采取固相合成的方式偶联在一起，脱除Fmoc保护基团，乙酰化保护端位氨基，采用多肽裂解剂将粗肽从树脂上裂解下来，经纯化分离得到伊特卡肽。
较佳地，所述以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A包括：
将所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH固载偶联在第二树脂上，得到Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
对所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin进行封端处理并脱除保护基，得到H-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
将所述H-D-Arg(Pdf)-O-Resin依次与Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH偶联，得到所述伊特卡肽片段A；
所述伊特卡肽片段A为
Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-Rink Amide-Resin。
较佳地，所述第二树脂包括Rink Amide-MBHA树脂、Sieber树脂和Rink Amide树脂中的一种；其中，所述Rink Amide树脂的取代范围为0.374-0.7mmol/g。
较佳地，所述多肽裂解剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种以上组成的混合溶液。
本发明相较于现有技术的优势在于：
本发明采用片段法合成伊特卡肽，两个片段可以同时进行，更加节约时间，提升效率，有助于扩大生产，实现工业化规模生产。另外，所合成的两个片段较伊特卡肽粗肽短，因此合成难度降低，产生的杂质少，且由于二硫键构筑选择在树脂上进行，以及构筑二硫键所用氧化剂为非硫试剂，因此解决了常规伊特卡肽合成时液相构筑二硫键操作复杂、不环保等问题，且由于本发明操作简单，单元合成难度小，因此伊特卡肽合成收率也较高，收率可达70%左右。综上，本发明的制备方法具有简单、高效、低成本、绿色环保且适合工业化生产等优势。
附图说明
图1为本发明实施例中伊特卡肽中间体的制备方法流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
需要说明的是，本实施例提及的第一，第二等仅用于区分，例如第一树脂、第二树脂，并不能认为是对其的限定。
伊特卡肽是一种钙敏感受体激动药，也称为拟钙剂，具有调节甲状旁腺主细胞表面钙敏感受体分泌甲状旁腺激素的作用，可用于治疗成人慢性肾病进行透析治疗后出现的继发性甲状旁腺功能亢进。
依特卡肽由3个D构型的精氨酸、2个D构型的丙氨酸、1个D构型的精氨酰胺、1个L构型的半胱氨酸与1个D构型的半胱氨酸构成，其中D构型半胱氨酸与L构型半胱氨酸以二硫键连接在一起。因此，伊特卡肽是一种含有S-S键的8个氨基酸多肽化合物，其中，C端以酰胺结尾，N段被乙酰化修饰，从N-末端到C-末端的顺序为：
另外，还应当了解的是，国际上统一规定，多肽的N端（氨基端）在最左边，多肽的C端（羧基端）在最右边。对于多肽的书写通常有两种形式，即单字母和三字母形式。对于单字母书写形式，即一个字母表示一个氨基酸，氨基酸通常用大写字母表示，例如，A表示L-丙氨酸（Alanine）、C表示L-半胱氨酸（Cysteine）。若氨基酸的构型改变，则用小写字母表示。例如D-丙氨酸（Alanine），可以用a表示。对于三字母表示形式，即三个字母代表一个氨基酸，三个字母中，第一个字母大写，第二和第三个字母小写，例如丙氨酸（Alanine）用Ala表示，半胱氨酸（Cysteine）用Cys表示。
现有的通过固液相合成伊特卡肽线性肽的方式存在合成难度大，工艺效率低，构筑二硫键时需使用含硫试剂，对环境危害大等缺点；而液相法处理较为复杂，时间成本高；片段法存在中间体纯化分离难度大，液相合成中间体时需使用含硫氧化剂等问题。
本发明提供一种片段法制备伊特卡肽的方法，以及为制备伊特卡肽用到的关键中间体的制备方法。本发明所制备的中间体已经完成了二硫键的构筑，由此降低了伊特卡肽的合成难度；同时，本发明的中间体的制备方法，采用固相合成方式制成，与现有技术中采用液相方法合成含二硫键的中间体相比，本发明固相法合成中间体的方式，无需进行复杂的后处理操作，工艺效率大幅提高，且产品收率高，有利于进行工业化生产。
本发明实施例的一种伊特卡肽中间体的制备方法，包括：
通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin；
对所述第一产物进行封端处理并脱除保护基后，得到第二产物H-D-Ala-O-Resin；
通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；
对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物
Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin；
对所述第四产物进行裂解树脂反应，得到伊特卡肽终中间体
Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH。
其中，Fmoc保护基就是常用的对氨基的保护剂，Fmoc基团即9-芴甲氧羰基，Resin为树脂的英文。
本实施例中，首先以Fmoc-D-Ala-OH为原料，通过固相合成的方式合成Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin，再通过氧化反应合成
Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin，裂解树脂得到所述中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH。本实施例在裂解树脂之前先进行氧化反应构筑二硫键，由于在树脂上进行二硫键氧化得到的是带有二硫键的多肽中间体，由此目标中间体已固载在树脂上，因此反应中所用原料、杂质及所使用的试剂，更容易通过例如过滤的方式除去。而常规的液相方法合成中间体，即裂解树脂后再构筑二硫键，属于液相过程，反应为均相，因此杂质原料等不易除去，通常需要进行萃取、选干、柱层析例如需经硅胶或C18分离纯化等复杂的后处理步骤，存在操作复杂、纯化困难等问题。因此，本实施例采用在树脂上先构筑二硫键的方式，而后再裂解树脂得到中间体，有利于后处理纯化，使中间体的纯化更加简单，只需进行简单的过滤洗涤即可，本实施例的方法更具有工业化生产的优势。
另外，本实施例采用固相合成方式制备伊特卡肽中间体，而后再利用该中间体合成伊特卡肽，由于在合成中间体时，已经通过氧化反应构筑了二硫键，因此，后续合成伊特卡肽时不用再构建二硫键，避免发生副反应，纯度较高。
其中一些实施方式中，所述通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin包括：
对所述第一树脂进行溶胀处理，并抽干滤液，得到处理后的第一树脂；
将所述Fmoc-D-Ala-OH、碱、催化剂加入反应溶剂中溶解，将溶解后的反应液加入所述处理后的第一树脂中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，反应完成后，进行抽滤、洗涤、干燥处理，得到所述Fmoc-D-Ala-O-Resin；
其中，所述催化剂包括HOBT和HOAT中的一种，所述碱包括DIEA，所述反应溶剂包括NMP、DMF和DMSO中的一种。
本实施例首先对第一树脂进行溶胀、抽滤处理，然后将第一个氨基酸原料固相合成在第一树脂上，经过简单的抽滤、洗涤后，得到树脂Fmoc-D-Ala-O-Resin。
其中一些实施方式中，所述通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-OH、缩合剂、所述催化剂加入至重新量取的所述反应溶剂中进行溶解，冰水浴下加入所述碱，搅拌均匀得到反应液，将所述反应液加入至所述Fmoc-D-Ala-O-Resin中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，得到所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；其中，所述缩合剂包括HATU、HBTU、HCTU、DIC、HyBOP和HyAOP中的一种。
本实施例将第二个氨基酸原料与缩合剂、催化剂、碱、反应溶剂混合后，加入至前步合成的树脂Fmoc-D-Ala-O-Resin中，通过固相偶联反应，进一步在树脂上偶联氨基酸，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin。
本实施例中，缩合偶联时需使用缩合剂、催化剂、碱、反应溶剂中两种或两种以上，其中缩合剂为必选。所述缩合剂选自HATU、HBTU、HCTU、DIC、HyBOP、HyAOP中的一种或多种，所述催化剂选自HOBT、HOAT中的一种或多种，所述碱选自DIEA，所述反应溶剂选自NMP、DMF、DMSO中的一种或多种。优选地，缩合偶联系统优选DIC/HOBT/DIEA/DMF。
其中一些实施方式中，所述对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin加入反应器中，并进行溶胀处理，将氧化剂溶解于反应溶剂中，并加入至所述反应器中，氧化反应4h，进行抽滤、洗涤处理，得到所述Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin，其中，氧化剂包括氧气、双氧水、DMSO、NCS和碘单质中的一种或多种，优选为H2O2和碘单质中的一种或两种。
本实施例对第三产物进行氧化处理，在树脂上构筑二硫键，且氧化剂采用非硫试剂，降低环境污染。另外，本实施例的第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin中，首号为Cys，即在合成第三产物时所用的第二个氨基酸原料为Fmoc-Cys（Acm）-OH，因此，对第三产物氧化时可以直接进行氧化，无需先脱除Acm。因此，本实施例的氧化过程更加简单，没有脱除保护基团的步骤。
其中一些实施方式中，所述裂解树脂反应中用到的裂解剂包括TFA/DCM和TFE/DCM中的一种，所述TFA/DCM由体积比1-5:95-99的TFA和DCM组成；所述TFE/DCM由体积比15-25:75-85的TFE和DCM组成。优选TFE/DCM 20:80组成的混合溶液。
其中一些实施方式中，所述第一树脂包括CTC树脂，所述CTC树脂的取代度（或称为取代范围）为0.3-1mmol/g。所谓取代度表示每克树脂装载了多少毫摩尔的活性反应位点。由于树脂取代范围越高，固载的氨基酸的量越多，单次制备伊特卡肽的质量越多，对于将来产业化的成本（包括人工成本、制造成本等）就会越低。综合考虑成本及收率以及批次质量等因素，本实施例CTC树脂的取代范围更优选为0.7-0.98mmol/g。
本发明还提供一种伊特卡肽的制备方法，包括：
采用上述伊特卡肽中间体的制备方法制得伊特卡肽终中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH；
以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A，所述伊特卡肽片段A具备伊特卡肽序列脱除Fmoc的位置3到位置7的氨基酸单元的序列；
将所述伊特卡肽片段A和所述伊特卡肽中间体采取固相合成的方式偶联在一起，脱除Fmoc保护基团，乙酰化保护端位氨基，采用多肽裂解剂将粗肽从树脂上裂解下来，经纯化分离得到伊特卡肽。其中，脱除Fmoc的试剂由体积比1:1-10的哌啶和DMF组成，优选由体积比1:4哌啶和DMF组成。
本实施例中，脱除伊特卡肽片段A的保护基团Fmoc，通过缩合偶联，将伊特卡肽中间体偶联到伊特卡肽片段A上，然后再脱除Fmoc保护基团并进行乙酰化保护端位氨基，采用多肽裂解剂将粗肽从树脂上裂解下来，经纯化分离得到伊特卡肽纯品。
本实施例采用片段法合成伊特卡肽，中间体和片段A两个片段可以同时进行，更加节约时间，提升效率，有助于扩大生产，实现工业化规模生产。另外，本实施例所合成的两个片段较伊特卡肽粗肽短，因此合成难度降低，产生的杂质少，且二硫键构筑选择在树脂上进行，解决常规伊特卡肽合成时液相构筑二硫键操作复杂问题，且由于本实施例操作简单，单元合成难度小，因此伊特卡肽合成收率也较高，本实施例的收率可达70%左右，是一种简单、高效、低成本、绿色环保且适合工业化生产的制备方法。
其中一些实施方式中，所述以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A包括：
将所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH固载偶联在第二树脂上，得到Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
对所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin进行封端处理并脱除保护基，得到H-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
将所述H-D-Arg(Pdf)-O-Resin依次与Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH偶联，得到所述伊特卡肽片段A；所述伊特卡肽片段A为Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-Rink Amide-Resin。
本实施例中，通过缩合偶联，将伊特卡肽片段A的C-末端第一个氨基酸原料Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH固载偶联在树脂上得到树脂Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin，并用乙酸酐进行封端，脱除Fmoc保护基，得到H-D-Arg(Pdf)-O-Resin树脂；通过缩合偶联，分别将伊特卡肽片段A的肽序列从C的末端到N的末端的每一个带有保护基团的氨基酸偶联到H-D-Arg(Pdf)-O-Resin树脂上，进行酰胺化反应，从而得到伊特卡肽片段A。
其中一些实施方式中，所述第二树脂包括Rink Amide-MBHA树脂、Sieber树脂和Rink Amide树脂中的一种。优选Rink Amide树脂，Rink Amide树脂取代范围0.374-0.7mmol/g，优选地，Rink Amide树脂取代范围0.374-0.5mmol/g。
其中一些实施方式中，所述多肽裂解剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种以上组成的混合溶液。优选由体积比95:5 的TFA、H2O组成的混合溶液。
本发明实施例的伊特卡肽的制备方法，以固相氧化构筑二硫键为思路，选取关键的伊特卡肽中间体和肽序中的5肽片段合成的方案，解决了二硫键构筑时，使用的含硫试剂对环境的影响；解决关键中间体采用常规液相方法带来的操作复杂，纯化困难的问题；解决常规固相合成后液相法构筑二硫键所带来的杂质较多、反应处理复杂、收率低的问题；解决常规固相合成线性多肽时效率低下的问题。本发明实施例通过对伊特卡肽制备过程中各个工艺参数的控制，解决了上述诸多问题，且收率和纯度较高，本发明实施例的收率可达70%左右。
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可在市场购得。本发明采用的试剂的中英文对照表如表1所示。
表1：
实施例1：
本实施例用于制备伊特卡肽片段A，所述伊特卡肽片段A为Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-Rink Amide-Resin。其合成步骤如下：
(1)Fmoc-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin的合成
称取20g取代度0.374mmol/g的RinkAmideResin加入至多肽反应器中，同时量取200mlDMF洗涤并溶胀树脂1小时，抽干滤液。向多肽反应器中继续加入20%哌啶DMF溶液（V/V）搅拌15min脱除Fmoc，重复脱除Fmoc操作1次。量取50mlDMF洗涤树脂，重复洗涤操作3次，茚三酮检测显蓝色。称取Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH（9.70g,14.96mmol）、HOBT（2.02g,14.96mmol）、DIC（1.89g,14.96mmol）加入至重新量取100mlDMF中进行溶解，冰水浴下加入DIEA(1.93g,14.96mmol)搅拌0.5h。将活化后的反应液加入至前面处理后的树脂中，等待反应液搅拌均匀后，保持20-30℃下反应2小时。通过茚三酮检测反应终点，若树脂显无色，则反应终止，若树脂显蓝色，则延长反应1h。
反应完成后，继续向反应液中加入64ml吡啶和76ml醋酸酐用于封闭树脂上未反应完的活性位点，继续搅拌1小时，静置12小时。通过封闭树脂上未反应完的活性位点，防止没有偶联上氨基酸的树脂裸露的氨基在后续偶联第二个氨基酸或者第三个氨基酸时进行偶联反应，从而造成在制备伊特卡肽过程中得到缺失肽。反应完毕，抽干反应溶剂，分别用100mlDMF洗涤树脂，100mlDCM洗涤树脂，100ml甲醇洗涤树脂，重复3次上述洗涤操作。所得Fmoc-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin进行干燥处理，所得树脂24.5g。经检测取代度为0.35mmol/g。
(2)Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin的合成
重复上述脱除Fmoc保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤。
按照D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)肽序，依次完成Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBT的投料量每次分别为14.96mmol，DIC投料量为14.96mmol。偶联完毕将所得树脂分别用80mlDMF、80mlDCM、80mlMeOH分别洗涤树脂3次。洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱内至恒重，得到树脂29.83g。
所得树脂即为
Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin。
实施例2：
本实施例用于制备伊特卡肽中间体，所述伊特卡肽中间体为
Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-OH。其合成步骤如下：
(1)Fmoc-D-Ala-CTC-Resin的合成
称取20g取代度0.94mmol/g的CTC树脂加入至多肽反应器中，同时量取100mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时，抽干滤液。称取Fmoc-D-Ala-OH(11.69g,37.6mmol)、DIEA(4.85g,37.6mmol)、HOBT(4.85g,37.6mmol)加入至重新量取100mlDCM中进行溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，等待反应液搅拌均匀后，保持20-30℃下反应2小时，得到,Fmoc-D-Ala-CTC-Resin。反应完成后，抽干反应液。继续向反应器中加入80ml甲醇和24mlDIEA用于封闭树脂上未反应完的活性位点，继续搅拌2小时，等待反应完成。反应完毕，抽干反应溶剂，100mlDMF洗涤树脂，100mlDCM洗涤树脂，100ml甲醇洗涤树脂，重复3次上述洗涤操作。所得Fmoc-D-Ala-CTC-Resin进行干燥处理,所得树脂25.7g。经检测取代度为0.92mmol/g。
(2)Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-CTC-Resin的合成
称取Fmoc-D-Ala-CTC-Resin(25.7g，18.4mmol)加入到多肽反应器中，向反应器中加入80ml20%的哌啶/DMF溶液(V/V)，保持20-30℃并搅拌15分钟抽干反应溶剂，重复上述操作1次。以茚三酮法检测判断反应终点。树脂显蓝色，则表示反应到达终点。待反应结束，排干反应液，加入40mlDMF洗涤树脂，并重复洗涤操作3次。称取Fmoc-D-Cys(Acm)-OH(15.59g,37.6mmol)、DIC(4.74g,37.6mmol)、HOBT(5.08g,37.6mmol)加入至重新量取100mlDMF中进行溶解，冰水浴下加入DIEA(4.85g，37.6mmol)搅拌0.5h。将活化后的反应液加入至树脂中，等待反应液搅拌均匀后，保持20-30℃下反应2小时。茚三酮检测反应终点（树脂显无色则反应终止，树脂显蓝色则延长反应1h）。得31.5g树脂Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-CTC-Resin。
(3)Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-O-CTC-Resin的合成
称取31.5gFmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-CTC-Resin加入至多肽反应其中同时量取100mlDMF洗涤并溶胀树脂1小时。称取碘单质（19.1g，75.2mmol），Boc-L-Cys-OtBu（15.38g，37.6mmol）溶解于100mlDMF中，加入到反应器内搅拌4h。抽干反应液，用500ml预配置好的50mmol/L抗坏血酸DMF溶液洗涤树脂，分五次洗涤树脂，至无色透明。得33.4g树脂
Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-O-CTC-Resin。
（4）Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-OH的合成
称取Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-O-CTC-Resin33.4g加入至多肽裂解仪中，加入100ml预先降温至0℃的裂解液20%TFE/DCM溶液。室温条件下搅拌2小时，反应完成后。将反应液过滤，滤液旋干。所得固体加入预先降温至0℃乙醚溶液中进行打浆，收集白色固体，真空干燥至恒重为12.06g白色固体Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-OH。收率为95.2%。
实施例3：
本实施例将实施例1制备的伊特卡肽片段A与实施例2制备的伊特卡肽中间体偶联，制备树脂N-AC-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin。其合成步骤如下：
(1)称取14.9g伊特卡肽片段A
Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin加入至多肽反应器中，同时量取100mlDMF洗涤并溶胀树脂1小时，抽干滤液。加入20%哌啶DMF溶液（V/V）搅拌15min脱除Fmoc，重复脱除Fmoc操作1次。量取50mlDMF洗涤树脂，重复洗涤操作3次，茚三酮检测显蓝色。
(2)称取伊特卡肽中间体
Fmoc-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-OH(5.15g,7.48mmol),DIC(0.95g,7.48mmol),HOBT(1.00,7.48mmol)加入至重新量取100mlDMF中进行溶解，冰水浴下加入DIEA(0.96,7.48mmol)搅拌0.5h。将活化后的反应液加入至树脂中，等待反应液搅拌均匀后，保持20-30℃下反应2小时。以茚三酮检测反应终点（树脂显无色则反应终止，树脂显蓝色则延长反应1h）。反应完毕，抽干反应溶剂，加入20%哌啶DMF溶液（V/V）搅拌15min脱除Fmoc，重复脱除Fmoc操作1次。继续向反应液中加入32ml吡啶和38ml醋酸酐，继续搅拌1小时，静止12小时。将100mlDMF洗涤树脂100mlDCM洗涤树脂100ml甲醇洗涤树脂，重复3次上述洗涤操作。所得树脂进行干燥处理，所得树脂17.3g。所得树脂即为N-AC-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin。
实施例4：
本实施例用于制备伊特卡肽纯品，步骤如下：
称取
N-AC-D-Cys(S-S-(NBoc)-L-Cys-OtBu)-D-Ala-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-RinkAmide-Resin（17.2g）加入至多肽裂解仪中，加入400ml预先降温至0℃的裂解液由体积比为95:5的TFA/H2O溶液。室温条件下搅拌3小时，反应完成后。将反应液过滤。所得滤液加入预先降温至0℃乙醚溶液中进行打浆3小时，收集白色固体，真空干燥至恒重为7.1g灰白色颜色固体为伊特卡肽粗品。粗品经HPLC纯化冻干处理，得到伊特卡肽2.74g，总收率70%，纯度98.8%。
虽然本发明披露如上，但本发明的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，包括：
通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin；
对所述第一产物进行封端处理并脱除保护基后，得到第二产物H-D-Ala-O-Resin；
通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；
对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin；
对所述第四产物进行裂解树脂反应，得到伊特卡肽终中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH。
2.根据权利要求1所述的伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，所述通过第一缩合偶联反应，将第一个氨基酸原料Fmoc-D-Ala-OH固载偶联在第一树脂上，得到第一产物Fmoc-D-Ala-O-Resin包括：
对所述第一树脂进行溶胀处理，并抽干滤液，得到处理后的第一树脂；
将所述Fmoc-D-Ala-OH、碱、催化剂加入反应溶剂中溶解，得到第一反应液，将所述第一反应液加入所述处理后的第一树脂中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，反应完成后，进行抽滤、洗涤、干燥处理，得到所述Fmoc-D-Ala-O-Resin；
其中，所述催化剂包括HOBT和HOAT中的一种，所述碱包括DIEA，所述反应溶剂包括NMP、DMF和DMSO中的一种。
3.根据权利要求2所述的伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，所述通过第二缩合偶联反应，将第二个氨基酸原料Fmoc-D-Cys(Acm)-OH偶联在所述第二产物上，得到第三产物Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-OH、缩合剂、所述催化剂加入至重新量取的所述反应溶剂中进行溶解，冰水浴下加入所述碱，搅拌均匀得到第二反应液，将所述第二反应液加入至所述Fmoc-D-Ala-O-Resin中，搅拌均匀后，在20-30℃下反应2h，得到所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin；其中，所述缩合剂包括HATU、HBTU、HCTU、DIC、HyBOP和HyAOP中的一种。
4.根据权利要求3所述的伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，所述对所述第三产物进行氧化反应，生成第四产物Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin包括：
将所述Fmoc-D-Cys(Acm)-D-Ala-O-Resin加入反应器中，并进行溶胀处理，将氧化剂溶解于重新量取的所述反应溶剂中，并加入至所述反应器中，氧化反应4h，进行抽滤、洗涤处理，得到所述Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-O-Resin，其中，所述氧化剂包括氧气、双氧水、DMSO、NCS和碘单质中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，所述裂解树脂反应中用到的裂解剂包括TFA/DCM和TFE/DCM中的一种，所述TFA/DCM由体积比1-5:95-99的TFA和DCM组成；所述TFE/DCM由体积比15-25:75-85的TFE和DCM组成。
6.根据权利要求2所述的伊特卡肽中间体的制备方法，其特征在于，所述第一树脂包括CTC树脂，所述CTC树脂的取代度为0.3-1mmol/g。
7.一种伊特卡肽的制备方法，其特征在于，包括：
采用如权利要求1-6任一项所述的伊特卡肽中间体的制备方法制得伊特卡肽终中间体Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-D-Ala-OH；
以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A，所述伊特卡肽片段A具备伊特卡肽序列脱除Fmoc的位置3到位置7的氨基酸单元的序列；
将所述伊特卡肽片段A和所述伊特卡肽中间体采取固相合成的方式偶联在一起，脱除Fmoc保护基团，乙酰化保护端位氨基，采用多肽裂解剂将粗肽从树脂上裂解下来，经纯化分离得到伊特卡肽。
8.根据权利要求7所述的伊特卡肽的制备方法，其特征在于，所述以Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH为原料采取固相合成的方式生成伊特卡肽片段A包括：
将所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH固载偶联在第二树脂上，得到Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
对所述Fmoc-D-Arg(Pdf)-O-Resin进行封端处理并脱除保护基，得到H-D-Arg(Pdf)-O-Resin；
将所述H-D-Arg(Pdf)-O-Resin依次与Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pdf)-OH偶联，得到所述伊特卡肽片段A；
所述伊特卡肽片段A为
Fmoc-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Arg(Pdf)-D-Ala-D-Arg(Pdf)-Rink Amide-Resin。
9.根据权利要求8所述的伊特卡肽的制备方法，其特征在于，所述第二树脂包括RinkAmide-MBHA树脂、Sieber树脂和Rink Amide树脂中的一种；其中，所述Rink Amide树脂的取代范围为0.374-0.7mmol/g。
10.根据权利要求7所述的伊特卡肽的制备方法，其特征在于，所述多肽裂解剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种以上组成的混合溶液。
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