CN111925418A - 伊特卡肽的液相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种伊特卡肽的液相合成方法。该合成方法包括：采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列，脱除式（I）序列中Ac‑D‑Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列；通过Boc‑L‑Cys(S‑S‑Py)‑OtBu在式（II）序列的D‑Cys处形成二硫键获得式（III）序列，脱除式（III）序列中的保护基，得到伊特卡肽；K为Mmt或Trt。Cbz保护基既易于控制纯度，避免缺失肽，又可经Pd/C加氢简单脱保护；采用Boc‑L‑Cys(S‑S‑Py)‑OtBu与肽链连接，便于精准控制二硫键的合成，提高了目标多肽的收率和纯度。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，具体而言，涉及一种伊特卡肽的液相合成方法。
背景技术
伊特卡肽(Etelcalcetide)是由KaiPharmaceuticals，Inc.开发的一种新颖的拟钙剂(calcimimetic agent)，能够抑制甲状旁腺激素的分泌。伊特卡肽可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素水平的降低。
伊特卡肽有3个D构型的精氨酸、2个D构型的丙氨酸、1个D构型的精氨酰胺、1个L构型半胱氨酸与1个D构型半胱氨酸(N段被乙酰基封闭)构成，其中D构型半胱氨酸与L构型半胱氨酸以二硫键连接在一起(N-acetyl-D-cysteinyl-D-alanyl-D-arginyl-D-arginyl-D-ar ginyl-D-alanyl -D-Arg ininamide， disulfid ewith-L-cysteine)，其结构式I所示：
目前报道Etelcalcetide 的合成工艺有以下专利：WO 2011/014707，US 2017/0190739A1， WO 2017/114240 A1，US 2019/0100554 A1，WO 2017/114238 A1，CN 109734778 A，CN109280078 A 等等。Etelcalcetide 的合成方法有液相合成和固相方法，通过制备纯化后的伊特卡肽纯品。
固相专利方法：
专利WO 2017/114240 A1：首先固相方法合成全保护的7肽，使用二硫二吡啶活化7肽构建二硫键，同Boc-L-Cys-OH偶联得到伊特卡肽。切割树脂后，制备纯化后得到最终产品，纯度98.5%。使用活性比较高的Boc-L-Cys-OH偶联得到粗肽纯度为81.0%，杂质较多，需多次纯化，使用溶剂较多，成本高。
专利US 2019/0100554 A1：首先固相方法合成全保护的N末端乙酰化的7肽，脱除Mmt后，同Boc-L-Cys（Npys）-OH偶联得到伊特卡肽。粗肽纯度较低，需要多次纯化，收率有待提高。
可见，目前固相合成方法，均存在粗肽纯度低，二硫键错接，杂质多，难纯化等问题。
液相专利方法：
WO 2017/114238 A1：采用液相方法合成N末端乙酰化、C末端酰胺化的直链七肽同L-Cys（SCl）偶联得到伊特卡肽。制备纯化后得到最终产品，纯度98.2%。 通过合成L-Cys（SCl）提高L-Cys-OH 的活性，提高了粗肽的纯度，但是合成步骤很长，且总收率11%。
综上，目前普遍采用固相合成方法合成伊特卡肽，但是目前的固相合成工艺普遍存在二硫键构建时副产物较多，纯度和收率不理想，原料比较贵，放大生产存在困难的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种伊特卡肽的液相合成方法，以解决现有技术中步骤繁琐的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种伊特卡肽的液相合成方法，该合成方法包括：采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列，Ac-D-Cys(K)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（I）；脱除式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列，Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（II）；通过Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在式（II）序列的D-Cys处形成二硫键获得式（III）序列，Ac-D-Cys(S-S-(Boc-Cys-OtBu))-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（III）；脱除式（III）序列中的保护基，得到伊特卡肽；K为Mmt或Trt。
进一步地，采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列包括：以Cbz-D-Arg(Pbf)-OH为起始原料，在活化剂的作用下与醋酸氨反应，生成Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2；采用Pd/C加氢脱除Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2中的保护基团Cbz，得到NH2-D-Arg(Pbf)-NH2；采用Cbz-D-Ala-OH为起始原料，在活化剂的作用下与NH2-D-Arg(Pbf)-NH2反应，生成Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；按照脱保护基团Cbz、偶联-脱保护基团Cbz、偶联的循环操作，依次将Cbz-D-Arg(Pbf)-OH、Cbz-D-Ala-OH和Cbz-D-Cys(K)-OH进行偶联，得到式（I）序列。
进一步地，活化剂选自Oxymapure、EDCI及DIPEA、HOBt、HOAt、 HATU、HBTU及PyBop中任意多种；优选地，Oxymapure、EDCI及DIPEA的摩尔数，与各起始原料的摩尔数之比分别为：1.0~1.2M、1.05~1.2M及1.05~1.5M。
进一步地，Cbz-D-Arg(Pbf)-OH与醋酸氨的摩尔比为1:1~6。
进一步地，Cbz-D-Ala-OH与NH2-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1~1:1.1。
进一步地，脱除式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列包括：将式（I）序列置于TFA/DCM溶液中进行脱K保护基反应，得到脱保护产物；优选反应温度为10~30℃，反应时间为0.5~4h；向脱保护产物中添加1.1~1.3倍TFA摩尔量的DIPEA以中和反应体系，得到中和产物；对中和产物依次进行洗涤、纯化，得到式（II）序列。
进一步地，将式（II）序列与Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu按照1:3~4的摩尔比进行反应，得到二硫键连接产物；将二硫键连接产物加入水中析晶，得到式（III）序列。
进一步地，将式（II）序列与Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在20~30℃的反应温度下反应8~24h，得到二硫键连接产物。
进一步地，脱除式（III）序列中的保护基，得到伊特卡肽包括：将式（III）序列溶于温度为0-10℃的TFA/Tips/H2O裂解体系中进行反应，得到脱保护产物；在0~10℃下，将脱保护产物滴加至MTBE中析晶，得到析晶产物；依次对析晶产物进行Pre-HPLC纯化、转盐，得到伊特卡肽。
进一步地，裂解体系中TFA：Tips：H2O的体积比为90~95：2.5~5：2.5~5；优选地，裂解体系在20-30℃下反应2~3小时。
应用本发明的技术方案，通过采用Cbz保护的氨基酸进行液相偶联，易于控制纯度，有效的避免了缺失肽；并通过采用二硫二吡啶与半胱氨酸形成的二硫键的活性中间体Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu与肽链连接，便于对二硫键的合成进行精准控制，提高了目标多肽伊特卡肽的收率（由现有技术的11%提高至25%）和纯度。该方法原料廉价易得，Cbz保护的氨基酸相比较传统的Fmoc或者Boc保护的氨基酸，脱保护经Pd/C加氢后处理简单易纯化，操作方便；且Pd/C经过处理后，可以在后面的脱保护反应中重复使用，故用量不大；适用于工业化大批量的生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的一种优选的实施例中伊特卡肽经HPLC检测纯化后的纯度结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
TFA：三氟乙酸盐，trifluoroacetate。
TIPS：三异丙基硅烷，triisopropylsilane。
DMF：二甲基甲酰胺，dimethylformamiDe.
DIPEA：二异丙基乙胺，diisopropylethylamine.
Oxymapure：乙基2-氰基-2-（羟氨）醋酸酯，ethyl 2-cyano-2-(hrdroxyimino)acetate，升温条件下多肽合成的最佳激活剂。
DMAc：二甲基乙酰胺，dimethylacetamide，在有机合成中，二甲基乙酰胺是很好的催化剂，可使环化、卤化、氰化、烷基化及脱氢反应加速，且能提高主要产物收率。也可以作为溶剂或助催化剂，均有助于产品质量和收率的提高。
EDCI：1-乙基-3（3-二甲基丙胺）碳二亚胺，1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ehtylcarbodiimide Hydrochloride, CAS#25952-53-8.可溶于水，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂。
Pd/C：钯碳催化剂，用于催化脱氢。
TFA/DCM：一种脱保护方式，TFA可以脱除一些不耐酸的保护基，如Boc。该方法比较温和，反应时间短，产率高，副反应少。根据具体实验条件又可以分为溶液法和微波辐射法。其中，溶液法是将TFA溶于二氯甲烷（DCM）中，配成溶液然后进行脱保护。一般地，都是采用25%的TFA溶液在室温下反应30min，即可脱除N-Boc保护基。
MTBE：甲基叔丁基醚，methyl tert-tutyl ether，有机合成，尤其是HPLC中用作脱剂。
tBu：叔丁基。
Mmt：对甲氧基三苯甲基。
常用的氨基保护基团：类型有上百种，主要包括烷氧羰基型保护基团、酰基型保护基团和烷基型保护基团。苄氧羰基（Cbz）、叔丁氧羰基（Boc）、9-芴氧羰基（Fmoc）是最常见的三种氨基保护基团。Z基的优点是制备容易、得到的Z-氨基酸基结晶且稳定，活化时不易消旋，可以在HBr/AcOH、Na/液氮等条件下脱去该保护基团。Fmoc基是氨基甲酸酯型氨基酸保护基团中，唯一广泛应用的可以在弱碱条件下解离的基团。Fmoc脱保护可以使用稀哌啶溶液或二乙胺/DMF溶液，在室温下完成。Boc脱保护几乎可以定量，可用于固相合成法中。
如背景技术所提到的，现有固相合成法中伊特卡肽的二硫键容易错接，且粗产物纯度低，而现有的液相合成方法步骤比较繁琐。为了改善这一状况，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种伊特卡肽的液相合成方法，该合成方法包括：
S101，采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列，
Ac-D-Cys(K)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（I） ；
S102，脱除式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列，
Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（II）；
S103，通过Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在式（II）序列的D-Cys处形成二硫键获得式（III）序列，
Ac-D-Cys(S-S-(Boc-Cys-OtBu))-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2 （III）；
S104，脱除式（III）序列中的保护基，得到伊特卡肽。
本申请的上述合成方法，通过采用Cbz（苄氧羰基，一种氨基保护基）保护的氨基酸进行液相偶联，易于控制纯度，有效的避免了缺失肽；并通过采用二硫二吡啶与半胱氨酸形成的二硫键的活性中间体Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu，与肽链连接，便于对二硫键的合成进行精准控制，提高了目标多肽伊特卡肽的收率（由现有技术的11%提高至25%）和纯度。该方法原料廉价易得，Cbz保护的氨基酸相比较传统的Fmoc或者Boc保护的氨基酸，脱保护经Pd/C加氢后处理简单易纯化，操作方便；且Pd/C经过处理后，可以在后面的脱保护反应中重复使用，故用量不大；适用于工业化大批量的生产。
上述Ac-D-Cys(K)中的侧链保护基团可以是Mmt，也可以是Trt。上述通过Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在式（II）序列的D-Cys处形成二硫键获得式（III）序列，其中L-Cys(S-S-Py)-OtBu选用Boc保护，是因为该氨基酸的位置为末端氨基酸，在后面的切割反应中采用TFA就能很容易地将Boc脱除。
上述合成方法中，采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列的具体步骤不做特殊限定。在本申请一种优选的实施例中，该步骤包括：以Cbz-D-Arg(Pbf)-OH为起始原料，在活化剂的作用下与醋酸氨反应，生成Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2；采用Pd/C加氢脱除Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2中的保护基团Cbz，得到NH2-D-Arg(Pbf)-NH2；采用Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2为起始原料，在活化剂的作用下与NH2-D-Arg(Pbf)-NH2反应，生成Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；按照脱保护基团Cbz、偶联-脱保护基团Cbz、偶联的循环操作，依次将D-Arg(Pbf)、D-Ala-D和Ac-D-Cys(K)进行偶联，得到式（I）序列。
本申请的上述反应，先与醋酸氨反应形成末端为氨基的氨基酸，一方面是合成目标肽化合物前端本就是需要氨基化，另一方面如果选用其他保护基，比如酯基，则会导致合成中发生酯交换的副反应，而直接氨基化能避免酯交换的副反应，采用Pd/C经过简单的催化加氢即可脱除Cbz保护基，从而使得贵金属Pd/C可重复使用，且不影响反应效率，7个D-构型的氨基酸经过6次重复的脱保护基团Cbz、偶联操作，即可得到7个氨基酸的肽链。
上述合成方法中，活化剂包括但不仅限于Oxymapure、EDCI及DIPEA， HOBt，HOAt,HATU、HBTU、PyBop。其中，Oxymapure、EDCI及DIPEA三者是一起配合使用的，DIPEA作为碱，用于中和ECDI的盐酸，从而增加EDCI的缩合能力。其余按照如下组合方式一起配合使用，PyBop/DIPEA、 HBTU/DIPEA、 HATU/DIPEA、 HOBT/DIC、HOAT/DIC、HOBT/EDCI/DIPEA。
根据反应效率，优选地，Oxymapure、EDCI及DIPEA的摩尔数，与各起始原料的摩尔数之比分别为：1.0~1.2M、1.05~1.2M及1.05~1.5M。在该用量范围内，具有反应快速，后处理简便的有益效果。
上述与醋酸氨反应的步骤中，本申请中优选将Cbz-D-Arg(Pbf)-OH与醋酸氨的摩尔比控制为1:1~6。
上述连接D反应的步骤中，优选将Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2与NH2-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比控制为1:1~1:1.1。
上述合成方法中，各氨基酸可以采用各自活化状态的氨基酸。比如D-Arg可以采用Cbz-D-Arg(Pbf)-OH，D-Ala可以采用Cbz-D-Ala-OH，而D-Cys可以采用Cbz -D-Cys(Mmt)-OH。上述活化型的氨基酸的侧链的保护基团不限，可以根据需要进行合理选择。上述依次偶联各氨基酸时是脱除Cbz保护基，而为了方便后续连接形成二硫键，需要将Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K脱除。在一种优选的实施例中，脱除式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列包括：将式（I）序列置于TFA/DCM溶液（优选为1v%~3v%）中进行脱K保护基反应，得到脱保护产物；优选反应温度为10~30℃，反应时间为0.5~4h，能够有效的脱除保护；向脱保护产物中添加1.1~1.3倍TFA摩尔量的DIPEA（这样的用量有助于除去过量的TFA），以中和反应体系，得到中和产物；对中和产物依次进行洗涤（优选用纯水洗涤多次，比如3~5次）、（有机相浓缩后）纯化（优选采用Pre-HPLC），得到式（II）序列。
在利用含二硫键的半胱氨酸活性中间体与肽链连接的步骤中，根据原料合理设置连接条件进行连接即可。为了更好地控制反应产品的纯度，在本申请一种优选的实施例中，将式（II）序列与Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu按照1:3~4的摩尔比进行反应，得到二硫键连接产物；将二硫键连接产物加入水中析晶，得到式（III）序列。优选地，将式（II）序列与Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在20~30℃的反应温度下反应8~24h，得到二硫键连接产物。
具体地，将式（II）序列溶液于DMF中后，加入Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu，控制反应温度和时间在上述优选的范围内，通过HPLC监控反应终点，待反应结束后，将反应液滴加入水中控温0~10℃搅拌析晶2小时左右，过滤，对滤饼干燥即可得到目标连接产物。
上述脱除式（III）序列中的保护基得到伊特卡肽的步骤，可以根据现有的脱除条件进行调整得到。在本申请一种优选的实施例中，该步骤包括：将式（III）序列溶于温度为0-10℃的TFA/Tips/H2O裂解体系中进行反应，得到脱保护产物；在0~10℃下，将脱保护产物滴加至MTBE中析晶，得到析晶产物；依次对析晶产物进行Pre-HPLC纯化、转盐，得到伊特卡肽。优选地，裂解体系中TFA：Tips：H2O的质量比为90~95：2.5~5：2.5~5；优选地，裂解体系在20-30℃下反应2~3小时。
采用TFA/Tips/H2O裂解体系相比，其他的裂解体系如TFA/H2O=95/5，具有有效减少副反应的优势。在该裂解体系中，将三者的质量比控制在上述范围内，具有反应快，所得产物纯度高，副产物少的有益效果。
本申请所提供的一种具体的合成路线如下：
具体地，上述各步骤的具体操作如下：
步骤1：Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
Cbz-D-Arg(Pbf)-OH (1.0eq)溶解在（基础溶剂）DMAc(20vol.)中，加入Oxymapure(1.2eq),：EDCI (23.2g, 1.2eq), DIPEA(1.5eq)（用作碱），反应液搅拌30分钟后，加入醋酸氨(5.0eq)，反应在20-30度搅拌4~12h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入水(100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼干燥后收料，收率93%；
步骤2：Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2(1.0eq)溶解在DMAc(10vol.)中，Pd/C(0.1eq)加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应2~12h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Ala-OH (1.0eq)溶解在DMAc(10vol.)中，加入Oxymapure (1.0eq), EDCI(1.05eq), DIPEA(1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌4~12h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2，收率85~93%；
步骤3~8：
Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
参照步骤2的操作依次偶联，最终得到Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-
D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
步骤9：Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2
Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2溶解在1%的TFA/DCM(40vol.)的溶液中（1~3%的TFA/DCM酸性溶液均可），反应控温10-30度反应0.5~4h；HPLC监控反应终点；反应结束后，加入1.1倍的TFA摩尔量的DIPEA中和反应体系，搅拌0.5~4h；再用纯化水洗涤三次；有机相浓缩后，使用Pre-HPLC制备纯化，收率81%；
步骤10：
Ac-D-Cys(S-S-(Boc-Cys-OtBu))-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
取步骤9的产品用DMF(20vol.)溶解，加入Boc-Cys(S-S-Py)-OtBu(3.0eq)，反应控温20-30度反应8~24h，HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入水(100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼干燥，收率84%
步骤11：伊特卡肽的合成
取步骤10的产品，控温0-10度，用TFA/Tips/H2O=95/2.5/2.5(10vol.)溶解；反应控温20-30度反应2~3小时；反应结束后，控温0-10度，反应液滴加至MTBE(80vol.)中，搅拌析晶2h；过滤，滤饼干燥后用Pre-HPLC制备纯化，转盐，得到伊特卡肽产品，收率71%。
上述反应共11步，其中步骤2至步骤8用到的贵金属Pd/C可重复使用，且不影响反应效率。步骤9与步骤11使用了Pre-HPLC制备纯化，每步收率均在71%~93%之间，总收率25%。
需要说明的是，上述反应活性氨基酸所带有的保护基团中，Cbz保护基采用Pd/C加氢反应来进行脱保护；而Pbf、Boc及OtBu保护基团采用TFA/Tips/H2O进行脱保护。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是以下实施例中， 各氨基酸原料具体情况如下：
表1：
上表中各氨基酸的纯度均为98% HPLC。
附注①：
Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH（65g, 0.1mol）溶解在DMF（330mL）中，加入哌啶（66mL）反应控温20-30度搅拌2小时；反应液油泵浓缩干，并用DMF（200mL X 3）缩带哌啶；浓缩残渣用MTBE（300mL）打浆，过滤；滤饼用DCM（400mL）溶解澄清，加入DIPEA（38.7g, 0.3mol）,控温10-30度滴加入Cbz-Cl（37.4g, 0.15mol）的DCM（200mL）溶液；反应搅拌6小时；反应结束后，反应液浓缩，过硅胶柱子（EA/PE=10/1）得到Cbz- D-Arg(Pbf)-OH（43.5g, 77.6%）。
附注②：
Fmoc-D-Cys(Mmt)-OH（62g, 0.1mol）溶解在DMF（330mL）中，加入哌啶（66mL）反应控温20-30度搅拌2小时；反应液油泵浓缩干，并用DMF（200mL X 3）缩带哌啶；浓缩残渣用MTBE（300mL）打浆，过滤；滤饼用DCM（400mL）溶解澄清，加入DIPEA（38.7g, 0.3mol）,控温10-30度滴加入Cbz-Cl（37.4g, 0.15mol）的DCM（200mL）溶液；反应搅拌6小时；反应结束后，反应液浓缩，过柱子（EA/PE=10/1）得到Cbz- D- Cys(Mmt)-OH（45.3g, 85.9%）。
实施例1：Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
Cbz-D-Arg(Pbf)-OH (56.5g, 0.1mmol)溶解在DMAc(1.2L,20V)中，加入Oxymapure(17.2g, 1.2eq); EDCI (23.2g, 1.2eq), DIPEA(19.4g, 1.5eq)，反应液搅拌30分钟后，加入醋酸氨(38.5g, 5.0eq)，反应在26度搅拌7.5h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入水(6.0L, 100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼干燥后收料52.5g，纯度99.5% 收率93%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表2：
实施例2：Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2(52.5g, 1.0eq)溶解在DMAc(530ml, 10vol.)中，Pd/C(5.3g, 0.1eq)加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应2h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(100 ml,2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Ala-OH (20.8g, 1.0eq)溶解在DMAc(208ml, 10vol.)中，加入Oxymapure(13.22g, 1.0eq), EDCI(18.72g, 1.05eq), DIPEA(12.62g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌6h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(2.1L, 100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(100ml, 5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2共53.9g, 纯度98.8%，收率92%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表3：
实施例3：Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(53.9g，1.0eq)溶解在DMAc(540ml, 10vol.)中，实施例2中的Pd/C(5.3g, 0.1eq)加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应3h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(120 ml, 2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Arg(pbf)-OH (48.0g, 1.0eq)溶解在DMAc(480ml, 10vol.)中，加入Oxymapure (12.16g, 1.0eq), EDCI(17.22g, 1.05eq), DIPEA(11.62g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌4h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(4.8L,100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(240ml, 5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2共80.0g, 纯度97.2%，收率90%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表4：
实施例4：Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(80.0g，1.0eq)溶解在DMAc(800ml, 10vol.)中，实施例3中的Pd/C(5.3g, 0.1eq)加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应5h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(160 ml, 2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Arg(pbf)-OH (43.2g, 1.0eq)溶解在DMAc(430ml, 10vol.)中，加入Oxymapure (10.9g, 1.0eq), EDCI(15.5g, 1.05eq), DIPEA(10.5g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2- D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌4h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(4.4L,100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(220ml, 5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz- D-Arg(Pbf)- D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2共99.6g, 收率90%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表5：
实施例5：Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(99.6g，1.0eq)溶解在DMAc(1000ml, 10vol.)中，实施例4中的Pd/C(5.3g; 补加新鲜Pd/C 4.7g, 共0.1eq )加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应5h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(200 ml, 2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Arg(pbf)-OH (38.9g, 1.0eq)溶解在DMAc(380ml, 10vol.)中，加入Oxymapure (10.0g, 1.0eq), EDCI(13.9g, 1.05eq), DIPEA(9.4g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2- D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌6h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(6.0L, 150 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(220ml,5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz-D-Arg(Pbf)- D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2共114.5g, 纯度95.1%，收率89%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表6：
实施例6：Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(114.5g，1.0eq)溶解在DMAc(1.1L, 10vol.)中，实施例5中的Pd/C(10.0g, 0.1eq )加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应7h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(230 ml, 2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Ala-OH (13.8g, 1.0eq)溶解在DMAc(130ml, 10vol.)中，加入Oxymapure(8.7g, 1.0eq), EDCI(12.42g, 1.05eq), DIPEA(8.4g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2- D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌6h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(6.0L, 150 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(220ml,5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2共103.4g, 纯度96.0%，收率87%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表7：
实施例7：Cbz-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)- NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(103.5g，1.0eq)溶解在DMAc(1.1L, 10vol.)中，实施例5中的Pd/C(10.0g, 0.1eq )加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应8h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤饼用DMAc(230 ml, 2vol.)浸泡，氮气保护下暂存(下一步加氢反应仍可以使用)；滤液直接用于下一步反应。
Cbz-D-Cys(Mmt)-OH (28.3g, 1.0eq)溶解在DMAc(280ml, 10vol.)中，加入Oxymapure (7.6g, 1.0eq), EDCI(10.8g, 1.05eq), DIPEA(7.3g, 1.05eq)，反应液搅拌30分钟后，加入NH2- D-Ala D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌6h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(6.0L, 150 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(220ml, 5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Cbz-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-NH2共112.3g，纯度94.7%，收率91%。
缩合步骤操作一致，仅改变氨基酸原料保护基团为Boc或者Fmoc保护的氨基酸；所得产品的收率以及纯度对比参见下表：
表8：
实施例8：Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)- NH2的合成
氮气保护下，Cbz-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf) -NH2(112.3g，1.0eq)溶解在DMAc(1.1L, 10vol.)中，实施例5中的Pd/C(10.0g,0.1eq )加入反应体系中；氢气置换反应体系六次；反应控温20-30度反应9h； HPLC监控反应终点；反应结束后，反应体系用氮气置换六次；过滤，滤液直接用于下一步反应。
Ac2O (14.9g, 3.0eq)溶解在DMAc(150ml, 10vol.)中，加入DIPEA(37.8g,6.0eq)，反应液搅拌10分钟后，加入NH2- D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-NH2的DMAc溶液(1.05eq)，反应在20-30度搅拌3h；HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入5%的磷酸水溶液(6.0L, 150 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼用饱和NaHCO3(220ml, 5vol.)淋洗两次，水淋洗两次，然后干燥得到Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-NH2共100.0g, 收率93%。
实施例9：Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
Ac-D-Cys(Mmt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2(100.0g, 1eq)溶解在1%的TFA/DCM(4.0L, 40vol.)的溶液中，反应控温10-30度反应4h；HPLC监控反应终点；反应结束后，加入1.1倍的TFA摩尔量的DIPEA中和反应体系，搅拌1h；再用纯化水洗涤三次；有机相浓缩后，使用Pre-HPLC制备纯化得到Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D- Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2 共71.1g，收率81%。
实施例10：Ac-D-Cys(S-S-(Boc-Cys-OtBu))-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D- Ala-D-Arg(Pbf)-NH2的合成
取实施例9 的产品(71.1g,1.0eq)用DMF(1.5L, 20vol.)溶解，加入Boc-Cys(S-S-Py)-OtBu(42.5g, 3.0eq)，反应控温20-30度反应20h，HPLC监控反应终点；反应结束后，反应液滴加入水(7.1L, 100 vol.)中，控温0-10度搅拌析晶2小时；过滤，滤饼干燥，收料81.2g，收率84%。
实施例11：Ac-D-Cys(S-S-Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2的合成
取实施例10的产品(81.2g, 1.0eq)，控温0-10度，用TFA/Tips/H2O=95/2.5/2.5(800ml, 10vol.)溶解；反应控温20-30度反应3小时；反应结束后，控温0-10度，反应液滴加至MTBE(6.4L, 80vol.)中，搅拌析晶2h；过滤，滤饼干燥后用Pre-HPLC制备纯化，转盐，得到伊特卡肽产品27.3g，收率71%。
上述反应共11步，其中步骤2至步骤8用到的贵金属Pd/C可重复使用，且不影响反应效率。步骤9与步骤11使用了Pre-HPLC制备纯化，每步收率均在71%~93%之间，总收率22.9%。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请采用了Cbz保护的氨基酸，脱保护采用Pd/C加氢的方式，简便有效；避免了Fmoc保护的氨基酸或者Boc保护的氨基酸脱保护以及纯化困难的困扰；且Pd/C实现了重复利用，有效的降低了生产成本。相比较固相合成法，液相偶联便于控制纯度，有效的避免了缺失肽；最后通过用二硫二吡啶来与半胱氨酸形成中间体，再与肽链连接，对二硫键的合成精准控制，有效的避免了二硫键的错接，最终降低了伊特卡肽的纯化难度，提高了收率。
该合成方法成本低廉，后处理操作简单，产品易于分离纯化，可以有效的精准的控制二硫键的反应过程，且原料廉价易得，使用于工业化大规模生产。按照本申请的工艺制备新型的中间体进行实验，得到的切割后的粗品纯度在90%以上，含量60%以上，制备纯化后纯度99.5%，最大单杂小于0.2% （参见附图1）。
此外，本申请采用Cbz保护的氨基酸，通过Pd/C脱除，全液相方法合成伊特卡肽，与固相方法比较使用更少的试剂及溶剂，绿色环保，并且不使用价格高昂的树脂，降低了成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种伊特卡肽的液相合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：
采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列，Ac-D-Cys(K)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（I）；
脱除所述式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列，Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（II）；
通过Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在所述式（II）序列的D-Cys处形成二硫键获得式（III）序列，Ac-D-Cys(S-S-(Boc-Cys-OtBu))-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2（III）；
脱除所述式（III）序列中的保护基，得到所述伊特卡肽；
所述K为Mmt或Trt。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，采用Cbz作为保护基团液相顺序合成式（I）序列包括：
以Cbz-D-Arg(Pbf)-OH为起始原料，在活化剂的作用下与醋酸氨反应，生成Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2；
采用Pd/C加氢脱除所述Cbz-D-Arg(Pbf)-NH2中的保护基团Cbz，得到NH2-D-Arg(Pbf)-NH2；
采用Cbz-D-Ala-OH为起始原料，在活化剂的作用下与所述NH2-D-Arg(Pbf)-NH2反应，生成Cbz-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH2；
按照脱保护基团Cbz、偶联-脱保护基团Cbz、偶联的循环操作，依次将Cbz-D-Arg(Pbf)-OH、Cbz-D-Ala-OH和Cbz-D-Cys(K)-OH进行偶联，得到所述式（I）序列。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述活化剂选自Oxymapure、EDCI及DIPEA、HOBt、HOAt、 HATU、HBTU及PyBop中任意多种；
优选地，Oxymapure、EDCI及DIPEA的摩尔数，与各起始原料的摩尔数之比分别为：1.0~1.2M、1.05~1.2M及1.05~1.5M。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述Cbz-D-Arg(Pbf)-OH与所述醋酸氨的摩尔比为1:1~6。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述Cbz-D-Ala-OH与所述NH2-D-Arg(Pbf)-NH2的摩尔比为1:1~1:1.1。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，脱除所述式（I）序列中Ac-D-Cys(K)的侧链保护基团K，得到式（II）序列包括：
将所述式（I）序列置于TFA/DCM溶液中进行脱K保护基反应，得到脱保护产物；优选反应温度为10~30℃，反应时间为0.5~4h；
向所述脱保护产物中添加1.1~1.3倍TFA摩尔量的DIPEA以中和反应体系，得到中和产物；
对所述中和产物依次进行洗涤、纯化，得到所述式（II）序列。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
将所述式（II）序列与所述Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu按照1:3~4的摩尔比进行反应，得到二硫键连接产物；
将所述二硫键连接产物加入水中析晶，得到所述式（III）序列。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，将所述式（II）序列与所述Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu在20~30℃的反应温度下反应8~24h，得到二硫键连接产物。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，脱除所述式（III）序列中的保护基，得到所述伊特卡肽包括：
将所述式（III）序列溶于温度为0-10℃的TFA/Tips/H2O裂解体系中进行反应，得到脱保护产物；
在0~10℃下，将所述脱保护产物滴加至MTBE中析晶，得到析晶产物；
依次对所述析晶产物进行Pre-HPLC纯化、转盐，得到所述伊特卡肽。
10.根据权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述裂解体系中TFA：Tips：H2O的体积比为90~95：2.5~5：2.5~5；
优选地，所述裂解体系在20-30℃下反应2~3小时。
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| CN111925418B (zh) | 2021-01-22 |
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