KR20160147235A - 선별적 용해도를 갖는 트리페닐메탄 유도체 및 그의 용도 - Google Patents

선별적 용해도를 갖는 트리페닐메탄 유도체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음 화학식 I로 표시되는 트리페닐메탄 유도체 및 그의 용도에 관한 것이다:
화학식 Ⅰ
Figure pat00012

본 발명은 제조된 화합물 또는 펩타이드의 분리 및 정제가 용이한 효과를 가짐으로써, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 본 발명은 저렴한 태그를 사용할 뿐만 아니라, 태그를 회수하여 재사용이 가능하므로 생산 비용 면에서 매우 경제적인 효과를 나타낸다.

Description

선별적 용해도를 갖는 트리페닐메탄 유도체 및 그의 용도{Triphenylmethane Derivatives Having Selective Solubility and Their Uses}
본 발명은 선별적 용해도를 갖는 트리페닐메탄 유도체 및 그의 용도에 관한 것이다.
화합물의 정제 과정에 있어서, 통상 사용하는 방법으로 상압 또는 감압 증류와 결정화 방법 등이 있다. 그러나 상압 또는 감압 증류는 분자량이 상대적으로 작고 비등점이 상대적으로 낮은 물질에 국한되어 있다. 의학 연구 개발에 있어서 여러 단계 반응을 거쳐 목적 화합물을 얻게 되는데, 각 단계마다 통상 결정화 방법을 사용하고 있다. 그러나 각 단계 화합물의 성질 및 물성이 상이함으로써, 동일한 결정화 방법으로 정제하는 것이 어렵고, 각 화합물에 상응하는 결정화 방법이 필요하다.
또한 액상-액상 추출 방법으로서, 목적 화합물을 특정상 (special-phase)으로 보내고 기타 불순물을 다른 상 (phase)으로 보내어 분리하는 방법이다. 상기 방법은 신속하고 간편한 방법이지만 각 화합물의 성질 및 물성에 따라 추출 방법 연구가 이루어져야 한다.
미국 특허출원공개 제2009299103호 및 미국 특허출원공개 제2010029904호에는, 벤젠(benzene)링 골격을 가진 소수성 태그를 이용하여, 화합물 또는 펩타이드를 제조 및 분리하는 방법을 일본 연구진에 의해 보고되었다. 그러나 상기 태그는 입체적으로 작은 구조를 갖고 있어서, 태그와 화합물 또는 펩타이드와의 결합이 견고하지 않아 불안정하여 반응 중 분리될 수 있고, 또한 태그에 결합된 화합물 또는 펩타이드를 결정화 할 때 번거러운 감압 증류 방법을 사용하였고, 또한 상기 방법은 펩타이드 합성 수율이 낮아 (3 mer 펩타이드 합성 시 전체 crude 수율 48%) 상업적으로 이용하는데 한계를 갖는 단점이 있다.
또한 미국 특허출원공개 제20140213761호는 디페닐메탄(diphenylmethane) 골격을 가진 소수성 태그를 이용한 화합물 또는 펩타이드를 제조 및 분리하는 방법이 일본 연구진에 의해 보고되었다. 그러나 상기 방법은 C-말단 카르복시아미드(carboxamide) 결합으로의 펩타이드 합성에만 국한되어있다.
펩타이드를 화학적으로 합성하는 방법에는 통상 액상(solution-phase)합성 방법과 고체상(solid-phase)합성 방법이 있다. 액상 합성 방법은 통상의 유기 합성 방법으로서 시약과 재료의 비용이 적게 드는 장점이 있지만 반응 단계 수가 많고 각 단계 별로 중간체를 유리해야 하고 또한 이성체가 생길 가능성이 있어 정제가 어려운 단점이 있다. 고체상 합성 방법은 아미노산 또는 2-mer 펩타이드 조각을 고체 지지체에 순차적으로 결합시켜 조립을 완료한 후에 고체 지지체로부터 서열을 유리한다. 이 방법은 합성속도가 빠르고 부산물이 적고 또한 자동화가 용이하다는 장점이 있으나 과량의 원료를 사용해야하고, 반응 미 완결에 의한 deletion 펩타이드 불순물이 생성될 가능성을 내포하고 있을 뿐만 아니라, 또한 3-mer 이상 펩타이드 조각을 고체 지지체에 부착시키기 어려운 문제가 있다.
최근, 폴리머를 이용한 deletion 펩타이드 불순물을 제거하는 방법이 Org. Lett. 2014, 16, 1290-1293.에 발표되었다. 그러나 상기 방법에는 고가인 메타크릴아미드 링커(linker)를 사용하였고, 또한 펩타이드를 석출 시 -70℃에서 수행하므로 상업적 생산에는 적용하기 어렵다.
이상에서 언급한 바와 같이 화합물 또는 펩타이드의 제조 및 분리하기 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량 생산의 적용에 있어 개선되어야 하는 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 화합물 또는 펩타이드를 효과적으로 제조 및 분리하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.
본 발명자들은 용액 조성 변화에 따라 가역적으로 액체 상태에서 고체 상태로 변화하는 성질을 갖는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 I의 화합물을 합성하고 이러한 신규 화합물은 펩타이드 및 화합물 합성, 분리 공정 및 불순물(예컨대, 펩타이드 합성에서 결손 펩타이드 제거) 제거 과정에서 매우 우수한 응용성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 트리페닐메탄 유도체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 트리페닐메탄 유도체를 이용한 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 분리 또는 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적 펩타이드 합성에서 결손 펩타이드의 제거방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에 의해 보다 명확하게 기술된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 I로 표시되는 트리페닐메탄 유도체를 제공한다:
화학식 Ⅰ
Figure pat00001
화학식 I에서, A는 탄소, 산소, 황, 질소 및 할로겐 원자 중에서 적어도 하나의 원자를 포함한 반응 활성 부위이고; R1 내지 R15은 동일하거나 상이하며, 수소, C1-50 알킬, C3-10 사이클로알킬, C1-50 알콕시, C6-30 아릴, C6-30 아랄킬 또는 C6-30 알카릴이고; R1 내지 R15 중 최소 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이다.
본 발명자들은 용액 조성 변화에 따라 가역적으로 액체 상태에서 고체 상태로 변화하는 성질을 갖는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 I의 화합물을 합성하고 이러한 신규 화합물은 펩타이드 및 화합물 합성, 분리 공정 및 불순물(예컨대, 펩타이드 합성에서 결손 펩타이드 제거) 제거 과정에서 매우 우수한 응용성을 나타냄을 확인하였다.
상기 화학식 I에서, A는 탄소, 산소, 황, 질소 및 할로겐 원자 중에서 적어도 하나의 원자를 포함한 반응 활성 부위이고, 여러 개의 동종 원자를 포함할 수도 있다. 예를 들면, A는 할로겐 (halogen)기, 하이드록실 (hydroxyl)기, 설포닐 (sulfonyl)기, 싸이올 (thiol)기, 아미노 (amino)기, 니트로(nitro)기, 카르복실 (carboxyl)기, 카르보네이트 (carbonate)기, 카르바메이트 (carbamate)기 또는 클로로포르메이트(chloroformate)기 등이며, 바람직하게는 할로겐 (halogen)기, 하이드록실 (hydroxyl)기, 아미노 (amino)기, 카르복실(carboxyl)기, 카르보네이트 (carbonate)기(예컨대, p-니트로페닐 카르보네이트기), 카르바메이트 (carbamate)기 또는 클로로포르메이트 (chloroformate)기이다.
본 명세서에서, 사용되는 용어 “할로”는 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함하고, 구체적으로 클로로이다.
상기 화학식 I에서, R1 내지 R15은 동일하거나 상이하며, 수소, C1-50 알킬, C3-10 사이클로알킬, C1-50 알콕시, C6-30 아릴, C6-30 아랄킬 또는 C6-30 알카릴이고; R1 내지 R15 중 최소 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이다.
본 명세서에서 용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미한다. C1 -50 알킬은 탄소수 1 내지 50의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-50 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
용어 “사이클로알킬”은 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며, 이는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다. C3 -10 사이클로알킬은 링 구조를 형성하는 탄소수가 3-10인 사이클로알킬을 의미하며, C3-10 사이클로알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
용어, “알콕시”는 -O알킬기를 의미한다.
용어 “아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미한다. C6 -30 아릴은 탄소수 6 내지 30의 탄소 고리 원자를 가지는 아릴기를 의미하며, C6-30 아릴이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 바람직하게는 아릴은 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다.
용어 “아랄킬”은 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다. C6 -30 아랄킬은 탄소수 6 내지 30의 아랄킬 유니트를 가지는 아랄킬을 의미하며, C6-30 아랄킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
용어 “알카릴”은 알킬기로 치환된 아릴기를 의미한다. C6 -30 알카릴은 탄소수 6 내지 30의 알카릴 유니트를 가지는 알카릴을 의미하며, C6-30 알카릴이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
구체적으로, 화학식 I에서 R1 내지 R5 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이고, R6 내지 R10 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이며 또는 R11 내지 R15 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이다. 보다 구체적으로, 화학식 I에서 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시는 2개 또는 3개이다. 구체적으로, C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시는 R3, R8 및/또는 R13에 위치할 수 있다. 보다 구체적으로, C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시는 R3 및 R8에 위치할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시는 C12-40 알킬 또는 C12-40 알콕시, 보다 더 구체적으로 C12-30 알킬 또는 C12-30 알콕시, 보다 더욱 더 구체적으로 C12-20 알킬 또는 C12-20 알콕시, 보다 더욱 더 더 구체적으로 C12-18 알킬 또는 C12-18 알콕시, 가장 구체적으로 C12-16 알킬 또는 C12-16 알콕시이다(예컨대, C12 알킬 또는 C12 알콕시, C14알킬 또는 C14 알콕시, 또는 C16 알킬 또는 C16 알콕시).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 분리 또는 제조방법을 제공한다:
(a) 태그로서 상기 본 발명의 트리페닐메탄 유도체를 이용하여 액상에서 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 제조하는 단계;
(b) 상기 트리페닐메탄 유도체가 태깅된 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 고체 상태로 전환시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물로부터 상기 트리페닐메탄 유도체가 태깅된 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 분리하는 단계; 및
(d) 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드로부터 상기 트리페닐메탄 유도체를 제거하는 단계.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 제조 및 분리에 있어서, 태그와 화합물(또는 펩타이드) 결합 반응은 액상에서 진행하고, 반응 완료 후 용매 조성 변화로 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 쉽게 분리하고, 또한 간단하게 태그에서 유리하여 고 순도로 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 태그로서 트리페닐메탄 유도체는 화학식 I의 A를 통하여 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 작용기와 결합되어 있으며, 상기 결합은 아미드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 설파이드(sulfide) 결합, 아민 결합, 우레아 (Urea) 결합, 카보네이트 (carbonate) 결합 또는 카바메이트 (carbamate) 결합이이고, 구체적으로 에테르 결합, 에스테르 결합, 아민 결합 또는 카르바메이트 결합이고, 보다 구체적으로 에스테르 결합, 아민 결합 및 카르바메이트 결합이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 디클로로메탄 (dichloromethane), 1,2-디클로로에탄 (1,2-dichloroethane), 클로로포름 (chloroform), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아미드 (N,N-dimethylacetamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), 디옥산 (dioxane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 아세톤 (acetone) 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 실시된다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그와 화합물 결합 반응 또는 태그와 화합물이 결합된 상태에서의 화학 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 -80~150℃이고, 보다 바람직하게는 0~100℃, 보다 더 바람직하게는 0~60℃이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그와 화합물 결합 반응 또는 태그와 화합물 결합된 상태에서의 화학 반응 완료 후 용매 조성 변화로 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 고체 상태로 전환시켜 쉽게 분리한다. 용매 조성 변화에 사용되는 용매로는 탄소수 1-3의 알코올(예컨대, 메탄올 및 에탄올), 아세트니트릴 (acetonitrile), 물(H2O) 또는 이들의 혼합용매이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성 부위인 A에 출발물질이 공유결합된 트리페닐메탄 유도체-출발물질이고 상기 트리페닐메탄 유도체-출발물질 및 반응물을 이용하여 실시한다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 목적 화합물 또는 펩타이드의 제조 및 분리에 있어서, 태그와 출발물질(화합물 또는 아미노산)이 결합된 상태에서 여러 단계의 화학 반응을 거쳐 최종 목적 화합물 또는 펩타이드를 얻을 수 있다. 각 단계의 화학 반응은 액상에서 진행하고, 반응 완료 후 용매 조성 변화로 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 화합물 또는 펩타이드를 쉽게 분리하고, 또한 마지막 단계 반응 완료 후, 간단하게 태그에서 유리하여 고 순도로 목적 화합물 또는 펩타이드를 얻을 수 있다. 이때 각 단계 화학 반응마다 분리 과정을 거치지 않고 다음 단계 화학 반응을 진행할 수도 있다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그와 출발물질(화합물 또는 아미노산) 결합 반응 및 태그와 출발물질(화합물 또는 아미노산) 결합된 상태에서의 화학 반응 완료 후, 반응에 사용한 용매의 부피를 줄인 후 용매 조성 변화를 통하여 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 쉽게 분리할 수도 있다. 상기 화학식 I로 표시되는 태그에 결합된 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 태그에서 유리하는 반응은 산성 조건, 염기성 조건, 환원 반응, 수소 반응 등으로 그 제한은 없으나, 바람직하게는 산성을 나타내는 용액의 존재 하에서 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (a)는 아미노산 또는 2-20개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합시키고 이어 반응 활성부위 A에 결합된 상기 아미노산 또는 펩타이드에 추가적인 아미노산 또는 펩타이드를 연속적으로 결합시켜 실시된다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 펩타이드의 제조 및 분리 방법에 있어서, 태그에 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각을 순차적으로 결합시켜 목적 펩타이드의 조립을 완료한다. 이때 각 단계의 반응은 액상에서 진행하고, 각 단계 반응 완료 후 용매 조성 변화로 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 펩타이드를 고체 상태로 전환시켜 여과로 쉽게 분리하고, 또한 마지막 단계 반응 완료 후, 간단하게 태그에서 유리하여 고 순도로 목적 펩타이드를 얻을 수 있다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그와 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각의 결합은 에스테르 (ester) 결합, 아미드 (amide) 결합, 에테르 (ether) 결합, 아민 (amine) 결합, 카르보네이트 (carbonate) 결합, 카르바메이트 (carbamate) 결합 등으로 이루어지고, 바람직하게는 에스테르 (ester) 결합, 아미드 (amide) 결합 및 카르바메이트 (carbamate) 결합 등이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그에 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각을 부착시키는 결합 반응에 사용되는 용매는 디클로로메탄 (dichloromethane), 1,2-디클로로에탄 (1,2-dichloroethane), 클로로포름 (chloroform), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아미드 (N,N-dimethylacetamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), 디옥산 (dioxane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 아세톤 (acetone)등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 하나 이상의 용매이며, 바람직하게는 디클로로메탄 (dichloromethane), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone) 또는 이들의 혼합 용매이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그에 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각을 결합시키는 결합 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 -50~100℃이고, 보다 바람직하게는 0~60℃, 보다 더 바람직하게는 0~40℃이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그에 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각을 부착시키는 결합 반응 완료 후 용매 조성 변화에 사용되는 용매로는 탄소수 1-3의 알코올(예컨대, 메탄올 및 에탄올), 아세트니트릴 (acetonitrile), 물(H2O) 또는 이들의 혼합용매이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그에 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 조각을 부착시키는 결합 반응 완료 후, 반응에 사용한 용매의 부피를 줄인 후 용매 조성 변화를 통하여 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 펩타이드를 쉽게 분리할 수도 있다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 펩타이드의 제조 및 분리에 있어서, 태그에 결합된 펩타이드를 태그에서 유리하는 반응은 산성 조건, 염기성 조건, 환원 반응, 수소 반응 등으로 그 제한은 없으나, 바람직하게는 산성을 나타내는 용액의 존재 하에서 실시되고, 보다 바람직하게는, 0.1-95% 부피의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이 포함된 용액 하에서 수행한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 펩타이드 합성에서 결손 펩타이드의 제거방법을 제공한다:
(a) 고상 지지체에 N-보호화 아미노산을 순차적으로 부착하는 반응들을 포함하는 목적 펩타이드의 합성 단계; 상기 단계 (a)의 결과물은 상기 목적 펩타이드 및 상기 목적 펩타이드의 결손 펩타이드를 포함하는 혼합물이고; 상기 단계 (a)는 상기 반응들의 각각 또는 상기 반응들의 일부 단계 이후에 상기 고상 지지체에 결합된 펩타이드의 N-말단을 아세틸화 하는 반응을 포함하며; 상기 아세틸화 반응은 상기 결손 펩타이드의 N-말단을 아세틸화 하고;
(b) (i-1) 태그로서 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 트리페닐메탄 유도체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계; 상기 목적 펩타이드는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합하며; 및 (i-2) 상기 (i-1) 단계의 결과물을 고상 지지체 제거 과정에 적용하는 단계를 포함하거나; 또는 (ii-1) 상기 (a) 단계의 결과물을 고상 지지체 제거 과정에 적용하는 단계; 및 (ii-2) 태그로서 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 트리페닐메탄 유도체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계; 상기 목적 펩타이드는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합하며;
(c) 상기 트리페닐메탄 유도체가 결합된 상기 목적 펩타이드를 고체 상태로 전환시키는 단계; 상기 트리페닐메탄 유도체가 결합되지 않은 상기 결손 펩타이드는 고체 상태로 전환되지 않으며; 그리고,
(d) 상기 단계 (c)의 결과물로부터 상기 결손 펩타이드를 제거하는 단계.
고상 펩타이드 합성에 있어서, 주로 생성되는 불순물들은 고상 반응 미 완결에 의한 결손 펩타이드 불순물과 측쇄 보호기의 탈 보호화 반응에서 생성되는 작은 분자의 불순물이다. 후자인 측쇄 보호기의 탈 보호화 반응에서 생성되는 작은 분자의 불순물은 펩타이드 결정화시 제거 되지만, 반응 미 완결에 의한 deletion 펩타이드 불순물은 목적 펩타이드와 유사한 물리적 성질을 갖고 있으므로 결정화 시 제거가 어렵고, 또한 HPLC상 목적 펩타이드 피크에 근접되어 있어 정제가 어렵게 된다. 따라서 최종 합성 수율 및 순도의 저하에 많은 영향을 준다.
본 발명은 용액 조성 변화에 따라 가역적으로 액체 상태에서 고체 상태로 변화하는 성질을 갖는 상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용하여, 고상 펩타이드 합성에서 생성되는 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 새로운 방법을 제공한다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 태그와 펩타이드 결합은 아민 (amine) 결합, 카르바메이트(carbamate) 결합 등으로 이루어지고, 바람직하게는 카르바메이트(carbamate) 결합 등이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 테그와 펩타이드 결합 반응에 사용되는 용매는 디클로로메탄 (dichloromethane), 1,2-디클로로에탄 (1,2-dchloroethane), 클로로포름 (chloroform), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아미드 (N,N-dimethylacetamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), 디옥산 (dioxane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 아세톤 (acetone)등으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매이며, 바람직하게는 디클로로메탄 (dichloromethane), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone)의 단독 또는 이들의 혼합 용매이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 태그와 펩타이드 결합 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 -50~100℃이고, 보다 바람직하게는 0~60℃, 보다 더 바람직하게는 0~40℃이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 태그와 펩타이드 결합 반응 완료 후 용매 조성 변화에 사용되는 용매로는 탄소수 1-3의 알코올(예컨대, 메탄올 및 에탄올), 아세트니트릴 (acetonitrile), 물(H2O) 또는 이들의 혼합용매이다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 태그와 펩타이드 결합반응 완료 후, 반응에 사용한 용매의 부피를 줄인 후 용매 조성 변화를 통하여 반응 혼합물로부터 태그에 결합된 목적 화합물을 쉽게 분리할 수도 있다.
상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 방법에 있어서, 태그에 결합된 펩타이드를 태그에서 유리하는 반응은 산성 조건, 수소 반응 등으로 그 제한은 없으나, 바람직하게는 산성을 나타내는 용액의 존재 하에서 실시되고, 보다 바람직하게는, 0.1-95% 부피의 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid)이 포함된 용액 하에서 수행한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 용액 조성 변화에 따라 가역적으로 액체 상태에서 고체 상태로 변화하는 성질을 갖는 상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용한 화합물 및 펩타이드의 제조 및 분리하는 새로운 방법을 제공한다.
(ii) 또한 본 발명은 용액 조성 변화에 따라 가역적으로 액체 상태에서 고체 상태로 변화하는 성질을 갖는 상기 화학식 I로 표시되는 태그를 이용하여, 고체상(solid phase) 펩타이드 합성에서 생성되는 결손 펩타이드 불순물을 제거하는 새로운 방법을 제공한다.
(iii) 또한 본 발명은 제조 합성된 화합물 또는 펩타이드의 분리 및 정제가 용이한 효과를 가짐으로써, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.
(iv) 또한, 본 발명은 저렴한 태그를 사용할 뿐만 아니라, 태그를 회수하여 재사용이 가능하므로 생산 비용 면에서 매우 경제적인 효과를 나타낸다.
약어의 정리
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972).
본 명세서에서 사용한 아미노산, 보호기 및 커플링 시약의 약어는 다음과 같다:
Leu: 루신 (Leucine)
Phe: 페닐알라닌 (Phenylalanine)
Ala: 알라닌 (Alanine)
Ser: 세린 (Serine)
Val: 발린 (Valine)
Glu: 글루타믹 애시드 (Glutamic acid)
Ile: 이소루신 (Isoleucine)
Gln: 글루타민 (Glutamine)
Met: 메티오닌 (Methionine)
His: 히스티딘 (Histidine)
Asn: 아스파라긴 (Asparagine)
Gly: 글리신 (Glycine)
Lys: 라이신 (Lysine)
Arg: 아르기닌 (Arginine)
Trp: 트립토판 (Triptophan)
Asp: 아스파틱 애시드 (Aspartic acid)
Boc: t-부틸옥시카보닐 (t-butyloxycarbonyl)
tBu: t-부틸 (t-butyl)
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시옥시카보닐 (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)
Trt: 트리페닐메틸 (triphenylmetyl)
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐 (2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸 (1-hydroxybenzotriazole)
EDCHCl: 엔-(3-디메틸아미노프로필)-엔-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w, 중량/중량) %, 고체/액체는 (w/v, 중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (v/v, 부피/부피) %이다.
실시 예 1: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올(화합물 3)의 제조
반응식 I
Figure pat00002
반응기에 4,4`-디히드록시벤조페논 (4,4`-dihydroxybenzophenone)(화합물1) (12.85 g, 60 mmol, Alfa), 1-브로모테트라데칸 (1-bromotetradecane) (49.91 g, 180 mmol, 3 당량, TCI) 및 K2CO3 (49.74 g, 360 mmol, 6 당량)을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (210mL, 대정화금)에 넣고, 80℃에서 12 시간 교반시켰다. 이어서 물 (210 mL) 및 톨루엔 (210 mL, 대정화금)을 넣고 80℃ 온도에서 10 분간 교반 후 층 분리하여 물 층을 제거하였다. 유기 층을 실온으로 냉각 후 메탄올 (600 mL, 대정화금)을 넣어 결정화 시켰다. 여과하여 얻은 고체를 핵산 (600 mL, 대정화금)로 재 결정화하여 비스(4-테트라데실옥시페닐)메타논 (bis(4-tetradecyloxyphenyl)methanone) (화합물 2)을 34.5 g (수율 95%) 얻었다.
비스(4-테트라데실옥시페닐)메타논(화합물 2) (12.14 g, 20 mmol) 을 테트라히드로퓨란 (400 mL, 대정화금)에 넣고, 1M의 페닐마그네슘브롬아이드(phenylmagnesium bromide)의 테트라히드로퓨란용액(24 mL, 24 mmol, Aldrich)을 실온에서 20분에 걸쳐 적가하고, 이어서 실온에서 5 시간 교반시켰다. 물 1 mL을 넣어 반응을 종료시킨 후, 반응 혼합물을 감압 증류하여 반응물 부피를 1/3로 줄이고, 물과 아세토니트릴의 1:1의 혼합용매 (300 mL)를 넣어 결정화시켜 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (phenylbis(4-tetradecyloxyphenyl)methanol) (화합물 3)를 12.7 g (수율 93%)얻었다.
실시 예 2: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)의 제조
반응식 II
Figure pat00003
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (3.43 g, 5 mmol)을 디클로로메탄 (90 mL, 대정화금)에 녹이고, 실온에서 아세틸 클로라이드 (acetyl chloride) (10 mL, Aldrich)를 넣은 후 12 시간 교반시켰다. 이어서 감압 증류로 반응 혼합물 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (100 mL)을 넣어 결정화시켜 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드 (phenylbis(4-tetradecyloxyphenyl)methyl chloride) (화합물 4)을 3.16 g (수율 90%) 얻었다.
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δppm
실시 예 3: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-4-니트로페닐카보네이트(화합물 5)의 제조
반응식 III
Figure pat00004
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (3.43 g, 5 mmol) 및 4-니트로클로로포메이트 (4-nitrophenylchloroformate) (1.26 g, 6.25 mmol, 1.25 당량, Aldrich)을 디클로로메탄 (100 mL)에 녹이고, 질소 보호 하에서 피리딘 (pyridine) (2.01 mL, 25 mmol, 5 당량)을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 이어서 10% 암모니윰클로라이드 (NH4Cl) 용액 (50 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하였다. 유기 층을 감압 증류로 1/3부피로 줄인 후 아세토니트릴 (100 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻은 고체를 디클로로메탄 (50 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (150 mL)로 재 결정화시켜 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-4-니트로페닐카보네이트 (phenylbis(4-tetradecyloxyphenyl)methyl- 4-nitrophenyl carbonate) (화합물 5)을 3.49 g (수율 82%) 얻었다.
실시 예 4: 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올(화합물 6)의 제조
반응식 IV
Figure pat00005
비스(4-테트라데실옥시페닐)메타논(화합물 2) (12.14 g, 20 mmol) 을 테트라히드로퓨란 (400 mL, 대정화금)에 넣고, 1M의 4-메톡시페닐마그네슘브롬아이드(4-methoxyphenylmagnesium bromide)의 테트라히드로퓨란용액(24 mL, 24 mmol, Adrich)을 실온에서 1 시간에 걸쳐 적가하고, 이어서 실온에서 5 시간 교반시켰다. 물 1 mL을 넣어 반응을 종료시킨 후, 반응 혼합물을 감압 증류하여 반응물 부피를 1/3로 줄이고, 물과 아세토니트릴의 1:1의 혼합용매 (300 mL)를 넣어 결정화시켜 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (4-methoxyphenylbis(4-tetradecyloxyphenyl)methanol) (화합물 6)를 13.6 g (수율 95%) 얻었다.
실시 예 5: 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 7)의 제조
반응식 V
Figure pat00006
4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (3.58 g, 5 mmol)을 디클로로메탄 (90 mL, 대정화금)에 녹이고, 실온에서 아세틸 클로라이드 (acetyl chloride) (10 mL, Aldrich)를 넣은 후 12 시간 교반시켰다. 이어서 감압 증류로 반응 혼합물 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (100 mL)을 넣어 결정화시켜 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드 (4-methoxyphenylbis (4-tetradecyloxyphenyl)methyl chloride) (화합물 7)을 3.3 g (수율 90%) 얻었다.
실시 예 6: 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-4-니트로페닐카보네이트(화합물 8)의 제조
반응식 VI
Figure pat00007
4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올 (3.58 g, 5 mmol) 및 4-니트로클로로포메이트 (4-nitrophenylchloroformate) (1.26 g, 6.25 mmol, 1.25 당량, Aldrich)을 디클로로메탄 (100 mL)에 녹이고, 질소 보호 하에서 피리딘 (pyridine) (2.01 mL, 25 mmol, 5 당량)을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 이어서 10% 암모니윰클로라이드 (NH4Cl) 용액 (50 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층 하였다. 유기 층을 감압 증류로 1/3부피로 줄인 후 아세토니트릴 (100 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻은 고체를 디클로로메탄 (50 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (150 mL)로 재 결정화시켜 4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-4-니트로페닐카보네이트 (4-methoxyphenylbis(4-tetradecyloxyphenyl)methyl-4-nitrophenyl carbonate) (화합물 8)을 3.78 g (수율 86%) 얻었다.
실시 예 7: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)를 이용한 3-mer 펩타이드 합성
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드 (화합물 4) (1.4 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Leu-OH (1.06 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.05 mL, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재결정화시켜 Crude H-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Phe-OH (0.93 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt (0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 크루드 H-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Ala-OH (0.79 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt (0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL)용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻는다.
상기에서 얻은 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액 (20 mL)에 녹이고 30분간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴 (30 mL)를 넣어 결정화시켰다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르 (30 mL)을 넣어 결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH를 1.06 g (수율 93%) 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH을 0.87 g을 얻었다 (정제수율 82%, 순도 98% 이상).
실시 예 8: 4 - 메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 7)를 이용한 3-mer 펩타이드 합성
4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드 (화합물 7) (1.47 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Leu-OH (1.06 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.05ml, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 Crude H-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Phe-OH (0.93 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt (0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 Crude H-Phe-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 Crude H-Phe-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Ala-OH (0.79 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt (0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL)용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 Crude Fmoc-Ala-Phe-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-4-메톡시페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액 (20 mL)에 녹이고 30분간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴 (30 mL)를 넣어 결정화시킨다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르 (30 mL)을 넣어 결정화시켜 crude Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH를 1.02 g (수율 89%) 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH을 0.86 g을 얻었다 (정제수율 84%, 순도 98% 이상).
실시 예 9: 클로로페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄 (화합물 4)를 이용한 3-mer 펩타이드 조각의 결합 반응
클로로페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄 (화합물 4) (0.7 g, 1 mmol) 및 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH (0.86 g, 1.5 mmol, 1.5 당량)을 디클로로메탄 (10 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.52 mL, 3.0 mmol, 3.0 당량)을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 반응액을 감암 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (15 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (10 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (15 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (10 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 재 결정화시켜 크루드 H-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH (0.69 g, 1.2 mmol, 1.2 당량) 및 HOBt (0.178 g, 1.32 mmol, 1.32 당량)을 디클로로메탄 (10 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl (0.23 g, 1.2 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (15 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (10 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (15mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (5 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (20mL)을 넣어 재 결정화시켜 크루드 H-Ala-Phe-Leu-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Ala-Phe-Leu-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액 (10 mL)에 녹이고 30분간 교반하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴 (15 mL)를 넣어 결정화하였다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르 (25 mL)을 넣어 결정화시켜 크루드H-Ala-Phe-Leu-Ala-Phe-Leu-OH를 0.65 g (수율 95%) 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 H-Ala-Phe-Leu-Ala-Phe-Leu-OH을 0.51 g을 얻었다 (정제수율 78%, 순도 98% 이상).
실시 예 10: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 -4- 니트로페닐카보네이트 (화합물 5)를 이용하여 고상 펩타이드 합성에서 생성되는 deletion 불순물 제거방법
(1) 화학식 II로 표시되는 펩타이드의 제조
화학식 II
H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진
9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-2-클로로트리틸 레진 (2-chlorotrityl resin)의 제조
여과막이 장착된 고체상 (solid-phase) 합성 반응기(제이오텍)에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (치환율=1.27 mmol/g의 레진, 5 mmol, 비드텍) 및 디클로로메탄 (60 mL, 대정화금)를 넣고, 15 분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-OH (2.32 g, 6.0 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.)이 포함된 디클로로메탄 (60 mL)을 상기 처리된 레진에 첨가하고, 이어서 디이소프로필에틸아민 (1.74 mL, 10 mmol, 2 당량, 대정화금)을 첨가한 후, 실온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 1회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄:메탄올:디이소프로필에틸아민=17:2:1 (v/v/v 비, 60 mL)을 넣고 20 분간 교반하였다. 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.38 mmol/g이었다.
9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산-OH 커플링 반응
(a) H- Phe -2- 클로로트리틸 레진의 수득
여과막이 장착된 고상 합성 반응기에 9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-2-클로로트리틸 레진 (Loading 율=0.38 mmol/g, 2 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (24 mL, 대정화금)를 넣고, 15 분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (24 mL)를 상기 레진에 넣은 다음, 15 분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Phe-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(b) 9- 플루오레닐옥시카보닐 - Asn ( Trt )- Phe -2- 클로로트리틸 레진의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H-Phe-2-클로로트리틸 레진 (2 mmol)에, 9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(Trt)-OH (3.58 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량, GL Biochem Ltd.)의 N,N-디메틸포름아미드 (21 mL)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드 (GL Biochem Ltd.)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3당량)을 첨가한 후, 실온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(c) H- Asn ( Trt )- Phe -2- 클로로트리틸 레진의 수득
상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘 (대정화금)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (24 mL)를 넣어 15 분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(d) 9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산-OH의 커플링
상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-His(Trt)-OH (3.72g, 6mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89g, 6.6mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Val-OH (2.04 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Asp(OtBu)-OH (2.47 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Gln(Trt)-OH (3.66 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (2.12g, 6mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89g, 6.6mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ㎖, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH (2.81 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH (2.81 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (3.89 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (2.12 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Trp(Boc)-OH (3.16 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Glu(OtBu)-OH (2.55 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ㎖, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Val-OH (2.04 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-OH (3.89 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Glu(OtBu)-OH (2.55 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Met-OH (2.23 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH (2.30 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(Trt)-OH (3.58 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (2.12 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)
21번째 아미노산 유도체부터는 이상에서와 같은 커플링 반응 후 아세틸 캡핑(Capping)반응을 추가로 실시하였다.
(e) 9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산의 커플링 및 아세틸 Capping
상기 반응 (d)에서 얻은 H-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val- Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진에, 9-플루오레닐옥시카보닐-His(Trt)-OH (3.72 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량, GL Biochem Ltd.)의 N,N-디메틸포름아미드 (21 mL)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드 (GL Biochem Ltd.)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량)을 첨가한 후, 실온에서 4 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척한 후, 무수 초산 (acetic anhydride) (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량, Aldrich) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (24 mL)를 첨가한 후, 실온에서 30 분 동안 반응시켰다. 상기 반응 결과물을 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu (OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(f) H-His( Trt )-Leu- Asn ( Trt )- Ser ( tBu )-Met- Glu ( OtBu )- Arg ( Pbf )-Val- Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진의 수득
상기 반응 (e)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘 (대정화금)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (24 mL)를 넣어 15 분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)- Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.
(g) 9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산의 커플링 및 캡핑 (capping)
상기 반응 (e) 및 (f) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH (2.81 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Gly-OH (1.78 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (2.12 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(Trt)-OH (3.58 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-His(Trt)-OH (3.72 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Met-OH (2.23 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Leu-OH (2.12 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Gln(Trt)-OH (3.66 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Ile-OH (2.12 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Glu(OtBu)-OH (2.55 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH (2.30 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Val-OH (2.04 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH (2.30 g, 6 mmol, 3 당량, GL Biochem Ltd.), 1-히드록시벤조트리아졸 (0.89 g, 6.6 mmol, 3.3 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 mL, 2 M 용액, 3 당량), 무수 초산 (3.78 mL, 40 mmol, 20 당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (10.4 mL, 60 mmol, 30 당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액.
9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(tBu)-OH의 커플링 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하여 상기 화학식 II로 표시되는 펩타이드를 얻었다.
(2) 화학식 III로 표시되는 펩타이드의 제조
화학식 III
H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-OH
상기 실시 예 10의 (1)에서 얻은 상기 화학식 II로 표시되는 펩타이드에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=8:1:1(v/v/v)의 혼합액 (50 mL)를 넣고 2 시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 III으로 표시되는 Crude 펩타이드를 13.8 g (수율 100%) 얻었다.
(3) 화학식 IV로 표시되는 펩타이드의 제조(결손 펩타이드의 제거)
화학식 IV
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-
Gln(trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-OH
상기 실시 예 10의 (2)에서 얻은 화학식 III으로 표시되는 펩타이드 (13.8 g, 2 mmol) 및 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸-4-니트로페닐카보네이트 (화합물 5)(1.87 g, 2.2 mmol)를 디클로로메탄 (24 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.52 mL, 3.0 mmol, 1.5 당량)을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 여과로 결손 펩타이드를 제거하여 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 얻었다.
(4) 화학식 V로 표시되는 테리파라타이드(Teriparatide) 펩타이드의 제조
화학식 V
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
상기에서 얻은 화학식 IV로 표시되는 펩타이드를 1% 트리플루오로아세트산/ 디클로로메탄 용액 (25 mL)에 녹이고 30시간 교반시킨다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴 (30mL)를 넣어 결정화시킨다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르 (30mL)을 넣어 결정화시켜 화학식 III로 표시되는 펩타이드를 고체 상태로 얻는다. 이어서 화학식 III로 표시되는 펩타이드에 암모늄아이오다이드 0.15%가 함유된 트리플루오로아세트산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물=87.5:12.5:5:5 (v/v/v/v, 100 mL) 혼합 용액을 넣고, 3 시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 이어서 냉각된 디에틸에테르 600 mL (대정화금)를 넣어 고체를 형성시켰다. 얻어진 고체를 여과하고, 디에틸에테르 200 mL로 세척하여 화학식 V로 표시되는 Crude 테리파라타이드 8.0 g (crude 수율=97%)을 얻었다. 이어서, 역상 HPLC 로 정제하여 화학식 V로 표시되는 테리파라타이드 1.76 g (정제 수율 22%, HPLC 순도 98%)을 수득하였다.
실시 예 11: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)를 이용한 화학식 VI로 표시되는 Pal-KTTKS의 펩타이드 합성
화학식 VI
Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH
(a) H-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)(1.4 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Ser(tBu)-OH(1.15 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.05 mL, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재결정화시켜 H-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(b) 9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Lys(Boc)-OH (1.12 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켜 9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(c) H-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄에 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액(20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄 (15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 H-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(d) 9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH의 커플링
상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(tBu)-OH(0.95 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl (0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액
9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(tBu)-OH(0.95 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액
9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(Boc)-OH(1.12 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액
(e) Palmitic acid의 커플링
상기 반응 (d)에서 얻은 H-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Palmitic acid(0.61 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, Aldrich) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켜 Pal-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)- Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(f) 화학식 VI로 표시되는 Pal-KTTKS 펩타이드의 제조
상기 반응 (e)에서 얻은 Pal-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)- Ser(tBu)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/ 디클로로메탄 용액(25 mL)에 녹이고 30시간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴(30mL)를 넣어 결정화시켰다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르(30 mL)을 넣어 결정화시켜 Pal-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-OH 펩타이드를 고체 상태로 얻었다. 얻어진 고체에 트리플루오로아세트산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물=87.5:12.5:5:5 (v/v/v/v, 100 mL) 혼합 용액을 넣고, 3 시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 이어서 냉각된 디에틸에테르 600 mL (대정화금)를 넣어 고체를 형성시켰다. 얻어진 고체를 여과하고, 디에틸에테르 200 mL로 세척하여 화학식 VI로 표시되는 Crude Pal-KTTKS 1.52 g (crude 수율=95%)을 얻었다. 이어서, 역상 HPLC 로 정제하여 화학식 VI로 표시되는 Pal-KTTKS 0.79 g (정제 수율 52%, HPLC 순도 98%)을 수득하였다.
실시 예 12: 페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)를 이용한 화학식 VII로 표시되는 Argireline 펩타이드 합성
화학식 VII
Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2
(a) H-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 4)(1.4 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.95 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.05 mL, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액(20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재결정화시켜 H-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(b) 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
상기 반응 (a)에서 얻은 H-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1.56 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량) 및 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켜 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(c) H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄의 수득
상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄에 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액(20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 H-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(d) 9-플루오레닐옥시카보닐-아미노산-OH의 커플링
상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.
9-플루오레닐옥시카보닐-Gln(Trt)-OH(1.47 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액
9-플루오레닐옥시카보닐-Met-OH(0.89 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액
9-플루오레닐옥시카보닐-Glu(tBu)-OH(1.06 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액
9-플루오레닐옥시카보닐-Glu(tBu)-OH(1.06 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.), HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)이 포함된 디클로로메탄(20 mL) 및 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액
(e) Acetic acid의 커플링
상기 반응 (d)에서 얻은 H-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Acetic acid(0.14 ml, 2.4 mmol, 1.2 당량, Aldrich) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켜 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
(f) Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH의 수득
상기 반응 (e)에서 얻은 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf) -Arg(Pbf)-페닐비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액(25 mL)에 녹이고 30시간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴(30mL)를 넣어 결정화시켰다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르 (30 mL)을 넣어 결정화시켜 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH 펩타이드를 고체 상태로 얻었다.
(g) 펩타이드 C-말단 amidation
상기 반응 (f)에서 얻은 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-OH, HOBtNH2(0.45 g, 3.0 mmol, 1.5 당량) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDCHCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)이 포함된 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 에틸에테르 (30 mL)을 넣어 결정화시켜 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-NH2을 얻었다.
(h) 화학식 VII로 표시되는 Argireline의 수득
상기 반응 (f)에서 얻은 Ac-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-NH2에 트리플루오로아세트산:티오에니솔:2,2-에탄디티올:물=87.5:12.5:5:5 (v/v/v/v, 100 mL) 혼합 용액을 넣고, 3 시간 동안 탈 보호화 반응을 수행하였다. 이어서 냉각된 에틸에테르 600 mL (대정화금)를 넣어 고체를 형성시켰다. 얻어진 고체를 여과하고, 에틸에테르 200 mL로 세척하여 화학식 VII로 표시되는 Crude Argireline 1.74 g (crude 수율=98%)을 얻었다. 이어서, 역상 HPLC 로 정제하여 화학식 VII로 표시되는 Argireline 1.08g (정제 수율 62%, HPLC 순도 98%)을 수득하였다.
실시 예 13(비교예): 비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 10)의 제조
반응식 VII
Figure pat00008
비스(4-테트라데실옥시페닐)메타논(화합물 2) (4.85 g, 8 mmol)을 테트라히드로퓨란 (240 mL, 대정화금)에 녹이고, NaBH4(0.33 g, 8.8 mmol, 1.1 당량, Aldrich)을 넣었다. 이어서 MeOH(40ml, 대정화금)을 넣고, 실온에서 16시간 교반시켰다. 감압증류로 1/3부피로 줄인 후 디클로로메탄(200 ml)에 녹이고, 순차적으로 물(150 ml), 1M HCl용액(150 ml) 및 물(150 ml)로 추출하였다. 유기층을 감압증류로 1/3부피로 줄인 후 아세토니트릴(300 ml)을 넣어 결정화시켜 비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올(화합물 9)을 4.13 g(수율 85%) 얻었다.
비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄올(3.04 g, 5 mmol)을 디클로로메탄(90 mL, 대정화금)에 녹이고, 실온에서 아세틸 클로라이드(acetyl chloride)(10 mL, Aldrich)를 넣은 후 12 시간 교반시켰다. 이어서 감압 증류로 반응 혼합물 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(100 mL)을 넣어 결정화시켜 비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(bis(4-tetradecyloxyphenyl)methyl chloride)(화합물 10)을 2.7 g (수율 86%) 얻었다.
실시 예 14( 비교예 ): 비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 10)를 이용한 3-mer 펩타이드 합성
비스(4-테트라데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 10)(1.25 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Leu-OH (1.06 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄 (20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.05 mL, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액(20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴 (30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴 (45 mL)을 넣어 재결정화시켜 크루드(crude) H-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Phe-OH(0.93 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물 (20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액(20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 크루드 H-Phe-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Phe-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Ala-OH(0.79 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(4 mL)용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-비스(4-테트라데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액(20 mL)에 녹이고 30분간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴 (30 mL)를 넣어 결정화시켰다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르(30 mL)을 넣어 결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH를 0.9 g(수율 79%) 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH을 0.92 g을 얻었다(정제수율 80%, 순도 98% 이상).
실시예 14(비교예)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 보다 크루드(crude) 수율이 10% 이상 저하됨을 알 수 있었다.
실시 예 15: 페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄올(화합물 12)의 제조
반응식 VIII
Figure pat00009
반응기에 4,4`-디히드록시벤조페논 (4,4`-dihydroxybenzophenone)(화합물1) (12.85 g, 60 mmol, Alfa), 1-브로모도데칸 (1-bromododecane) (44.82 g, 180 mmol, 3 당량, TCI) 및 K2CO3 (49.74 g, 360 mmol, 6 당량)을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)(210 mL, 대정화금)에 넣고, 80℃에서 12 시간 교반시켰다. 이어서 물(210 mL) 및 톨루엔(210 mL, 대정화금)을 넣고 80℃ 온도에서 10 분간 교반 후 층 분리하여 물 층을 제거하였다. 유기 층을 실온으로 냉각 후 메탄올(600 mL, 대정화금)을 넣어 결정화 시켰다. 여과하여 얻은 고체를 핵산(600 mL, 대정화금)로 재 결정화하여 비스(4-도데실옥시페닐)메타논(bis(4-dodecyloxyphenyl)methanone)(화합물 11)을 29.7 g (수율 90%) 얻었다.
비스(4-도데실옥시페닐)메타논(화합물 11)(11.0 g, 20 mmol)을 테트라히드로퓨란(400 mL, 대정화금)에 넣고, 1M의 페닐마그네슘브롬아이드(phenylmagnesium bromide)의 테트라히드로퓨란용액(24 mL, 24 mmol, Aldrich)을 실온에서 20분에 걸쳐 적가하고, 이어서 실온에서 5 시간 교반시켰다. 물 1 mL을 넣어 반응을 종료시킨 후, 반응 혼합물을 감압 증류하여 반응물 부피를 1/3로 줄이고, 물과 아세토니트릴의 1:1의 혼합용매(300 mL)를 넣어 결정화시켜 페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄올(phenylbis(4-dodecyloxyphenyl)methanol)(화합물 12)를 11.1 g(수율 88%)얻었다.
실시 예 16: 페닐비스(4-도데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 13)의 제조
반응식 IX
Figure pat00010
페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄올(3.15 g, 5 mmol)을 디클로로메탄(90 mL, 대정화금)에 녹이고, 실온에서 아세틸 클로라이드(acetyl chloride)(10 mL, Aldrich)를 넣은 후 12 시간 교반시켰다. 이어서 감압 증류로 반응 혼합물 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(100 mL)을 넣어 결정화시켜 페닐비스(4-도데실옥시페닐)메틸 클로라이드(phenylbis(4-dodecyloxyphenyl)methyl chloride)(화합물 13)을 2.65 g (수율 82%) 얻었다.
실시 예 17: 페닐비스(4-도데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 13)를 이용한 3-mer 펩타이드 합성
페닐비스(4-도데실옥시페닐)메틸 클로라이드(화합물 13)(1.29 g, 2 mmol) 및 Fmoc-Leu-OH(1.06 g, 3 mmol, 1.5 당량, GL Biochem Ltd.)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민(1.05 mL, 6 mmol, 3 당량, Aldrich)을 넣은 후 실온에서 3 시간 교반시켰다. 감압 증류로 반응액을 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 20분간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재결정화시켜 크루드(crude) H-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Phe-OH(0.93 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(4 mL) 용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 5% 디에틸아민/디클로로메탄 용액 (20 mL)으로 Fmoc 제거 반응을 1 시간 실시하였다. 감압 증류로 용액의 부피를 1/3으로 줄인 후 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화 시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재 결정화시켜 크루드 H-Phe-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 H-Phe-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄, Fmoc-Ala-OH(0.79 g, 2.4 mmol, 1.2 당량, GL Biochem Ltd.) 및 HOBt(0.36 g, 2.6 mmol, 1.3 당량)을 디클로로메탄(20 mL)에 녹이고, 이어서 EDC HCl(0.46 g, 2.4 mmol, 1.2 당량)의 N,N-디메틸포름아미드(4 mL)용액을 넣은 후 실온에서 2 시간 교반시켰다. 물(20 mL)을 넣고 5 분간 교반 후 분층하여 물 층을 제거하고, 유기 층을 감압 증류로 1/3 부피로 줄인 후, 아세토니트릴(30 mL)을 넣어 결정화시켰다. 얻어진 고체를 디클로로메탄(15 mL)에 녹인 후 아세토니트릴(45 mL)을 넣어 재결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄을 얻었다.
상기에서 얻은 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-페닐비스(4-도데실옥시페닐)메탄을 1% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액(20 mL)에 녹이고 30분간 교반시켰다. 감압 증류로 용매의 부피를 1/3로 줄이고, 아세토니트릴(30 mL)를 넣어 결정화시켰다. 여과로 고체를 제거하고, 여액을 감압 증류로 부피를 5 mL로 농축한 후, 에틸에테르(30 mL)을 넣어 결정화시켜 크루드 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH를 0.8 g(수율 70%) 얻었다. 역상 HPLC로 정제하여 Fmoc-Ala-Phe-Leu-OH을 0.67 g을 얻었다(정제수율 84%, 순도 98% 이상).

Claims (11)

  1. 다음 화학식 I로 표시되는 트리페닐메탄 유도체:
    화학식 Ⅰ
    Figure pat00011

    화학식 I에서, A는 탄소, 산소, 황, 질소 및 할로겐 원자 중에서 적어도 하나의 원자를 포함한 반응 활성 부위이고; R1 내지 R15은 동일하거나 상이하며, 수소, C1-50 알킬, C3-10 사이클로알킬, C1-50 알콕시, C6-30 아릴, C6-30 아랄킬 또는 C6-30 알카릴이고; R1 내지 R15 중 최소 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I에서 A는 할로겐기, 하이드록실기, 아미노 기, 니트로기, 카르복실기, 카르보네이트기, 카르바메이트기 또는 클로로포르메이트기를 포함하는 반응 활성 부위인 것을 특징으로 하는 트리페닐메탄 유도체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I에서 R1 내지 R5 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이고, R6 내지 R10 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시이며 또는 R11 내지 R15 중 어느 하나는 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시인 것을 특징으로 하는 트리페닐메탄 유도체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 화학식 I에서 C12-50 알킬 또는 C12-50 알콕시는 2개 또는 3개인 것을 특징으로 하는 트리페닐메탄 유도체.
  5. 다음 단계를 포함하는 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 분리 또는 제조방법:
    (a) 태그로서 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 트리페닐메탄 유도체를 이용하여 액상에서 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 제조하는 단계;
    (b) 상기 트리페닐메탄 유도체가 태깅된 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 고체 상태로 전환시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 결과물로부터 상기 트리페닐메탄 유도체가 태깅된 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드를 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드로부터 상기 트리페닐메탄 유도체를 제거하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 태그로서 트리페닐메탄 유도체는 화학식 I의 A를 통하여 상기 목적 화합물 또는 목적 펩타이드의 작용기와 결합되어 있으며, 상기 결합은 아미드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 설파이드(sulfide) 결합, 아민 결합, 우레아 (Urea) 결합, 카보네이트 (carbonate) 결합 또는 카바메이트 (carbamate) 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 디클로로메탄 (dichloromethane), 1,2-디클로로에탄 (1,2-dichloroethane), 클로로포름 (chloroform), N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아미드 (N,N-dimethylacetamide), N-메틸피롤리디논 (N-methylpyrrolidinone), 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofurane), 디옥산 (dioxane), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 아세톤 (acetone) 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 탄소수 1-3의 알코올, 아세트니트릴 (acetonitrile), 물(H2O) 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성 부위인 A에 출발물질이 공유결합된 트리페닐메탄 유도체-출발물질이고 상기 트리페닐메탄 유도체-출발물질 및 반응물을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 아미노산 또는 2-20개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합시키고 이어 반응 활성부위 A에 결합된 상기 아미노산 또는 펩타이드에 추가적인 아미노산 또는 펩타이드를 연속적으로 결합시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 다음 단계를 포함하는 목적 펩타이드 합성에서 결손 펩타이드의 제거방법:
    (a) 고상 지지체에 N-보호화 아미노산을 순차적으로 부착하는 반응들을 포함하는 목적 펩타이드의 합성 단계; 상기 단계 (a)의 결과물은 상기 목적 펩타이드 및 상기 목적 펩타이드의 결손 펩타이드를 포함하는 혼합물이고; 상기 단계 (a)는 상기 반응들의 각각 또는 상기 반응들의 일부 단계 이후에 상기 고상 지지체에 결합된 펩타이드의 N-말단을 아세틸화 하는 반응을 포함하며; 상기 아세틸화 반응은 상기 결손 펩타이드의 N-말단을 아세틸화 하고;
    (b) (i-1) 태그로서 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 트리페닐메탄 유도체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계; 상기 목적 펩타이드는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합하며; 및 (i-2) 상기 (i-1) 단계의 결과물을 고상 지지체 제거 과정에 적용하는 단계를 포함하거나; 또는 (ii-1) 상기 (a) 단계의 결과물을 고상 지지체 제거 과정에 적용하는 단계; 및 (ii-2) 태그로서 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 트리페닐메탄 유도체를 상기 단계 (a)의 결과물에 접촉시키는 단계; 상기 목적 펩타이드는 상기 트리페닐메탄 유도체의 반응 활성부위 A에 결합하며;
    (c) 상기 트리페닐메탄 유도체가 결합된 상기 목적 펩타이드를 고체 상태로 전환시키는 단계; 상기 트리페닐메탄 유도체가 결합되지 않은 상기 결손 펩타이드는 고체 상태로 전환되지 않으며; 그리고,
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물로부터 상기 결손 펩타이드를 제거하는 단계.
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