JP6858950B2 - 液相法によるセレノグルタチオンの製造方法 - Google Patents
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Description
[1]
L−セレノシステインを出発原料として、L−セレノシステインとグリシンとを連結してL−セレノシステイニルグリシンを得る工程(第1工程)、L−セレノシステイニルグリシンとL−グルタミン酸とを連結してγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンを得る工程(第2工程)、およびγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンを脱保護してセレノグルタチオンを得る工程(第3工程)を有する、液相法によるセレノグルタチオンの製造方法であって、
前記第1工程は、アミノ基およびセレン原子が保護されたL−セレノシステイン誘導体と、アミノ基が脱保護され、カルボキシ基が保護されたグリシン誘導体とを反応させることで前記連結を行う工程であり、
前記第2工程は、アミノ基が脱保護され、カルボキシ基およびセレン原子が保護されたL−セレノシステイニルグリシン誘導体と、アミノ基およびα炭素に結合したカルボキシ基が保護されたL−グルタミン酸誘導体とを反応させることで前記連結を行う工程であり、
前記第1工程および第2工程それぞれの連結における、所定のカルボキシ基とアミノ基との反応を、カルボキシ基の活性化剤としてのカルボジイミド類および反応促進用添加剤を用いて行うことを特徴とする、セレノグルタチオンの液相製造方法。
[2]
前記カルボジイミド類が1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)またはN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)であり、前記反応促進用添加剤が1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)であることを特徴とする、項1に記載の製造方法。
[3]
前記第3工程におけるγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンの脱保護を、チオアニソール(TA)とトリフルオロ酢酸(TFA)の混合物を脱保護剤として用いて、全ての保護基について一段階で行うことを特徴とする、項1または2に記載の製造方法。
[4]
前記出発原料としてのL−セレノシステインが、N−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)−Se−(4−メトキシフェニルメチル)−L−セレノシステイン(Fmoc−Sec(MPM)−OH)であることを特徴とする、項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
セレノグルタチオンの液相製造方法における第1工程は、L−セレノシステインとグリシンとを連結し、L−セレノシステイニルグリシン(5)を合成する工程である。ここでいう「L−セレノシステイン」は、アミノ基およびセレン原子が保護された(保護基が結合した)誘導体(2)を指し、「グリシン」は、アミノ基およびカルボキシ基が保護された誘導体(3)を指す。グリシン誘導体(3)のアミノ基を脱保護してグリシン誘導体(4)とした後、L−セレノシステイン誘導体(2)のカルボキシ基を所定の化合物で活性化させて、グリシン誘導体(4)の脱保護されたアミノ基と反応させる。
グリシン誘導体(3)の保護基、代表的にはFmoc基の脱保護処理に用いる脱保護剤は、公知の脱保護剤の中から適宜選択することができる。例えば、ジメチルアミン(Me2NH)、ジエチルアミン(Et2NH)などの直鎖状アルキル基を有する第二級アミンや、ピロリジン、ピペリジンなどの環状の第二級アミンを脱保護剤として用いることができるが、減圧下での留去が容易なジメチルアミンとジエチルアミンを用いるのが好ましく、水溶液ではなく純粋な液体として入手が可能なジエチルアミンを用いるのがより好ましい。また、この脱保護処理のための溶媒も適宜選択することができる。例えばジメチルホルムアミド(DMF)を単独で、N−メチルピロリドン(NMP)を単独で、ジクロロメタン(DCM)を単独で、またはこれらの溶媒と水(H2O)とを混合して用いることができるが、溶媒中に水が存在しないようにすることが第1工程の収率を高める上で好ましく、そのような観点からは、DMFを溶媒とし、DMFへの溶解性に優れ水を含まない純粋な液体として入手が可能なEt2NHを脱保護剤として組み合わせて用いることが好ましい。溶媒中の脱保護剤の濃度も適宜調節することができるが、通常5〜30体積%、好ましくは10〜20体積%である。脱保護処理の時間は、通常1〜30分、好ましくは5〜20分である。処理温度は室温程度でよいが、化合物(アミノ酸およびペプチド)に悪影響を与えない範囲で、必要に応じて適宜40℃以下の範囲で調節してもよい。脱保護処理の後、必要に応じて過剰のEt2NH等の脱保護剤を減圧留去した後、グリシン誘導体(4)を次のL−セレノシステイン誘導体(2)との反応に用いる。
L−セレノシステイン誘導体(2)のカルボキシ基は、グリシン誘導体(4)の脱保護されたアミノ基との反応のために、所定の活性化剤および反応促進用添加剤を用いて活性化される。そのため本発明では、カルボキシ基があらかじめペンタフルオロフェニルエステル(Pfpエステル)によって活性化処理された、L−セレノシステイン誘導体を用いる必要がない。
セレノグルタチオンの液相製造方法における第2工程は、L−セレノシステイニルグリシンとL−グルタミン酸とを連結してγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシン(8)を合成する工程である。ここでいう「L−セレノシステイニルグリシン」は、グリシン誘導体(4)に由来する保護された(保護基が結合した)カルボキシ基と、L−セレノシステインに由来する保護されたアミノ基および保護されたセレン原子とを有する誘導体(5)を指し、「L−グルタミン酸」は、アミノ基およびα炭素に結合した(α位にある)カルボキシ基が保護された誘導体(7)を指す。L−セレノシステイニルグリシン誘導体(5)のアミノ基を脱保護してL−セレノシステイニルグリシン誘導体(6)とし、L−グルタミン酸誘導体(7)の側鎖のγ炭素に結合した(γ位にある)カルボキシ基を所定の化合物で活性化させて、L−セレノシステイニルグリシン誘導体(6)の脱保護されたアミノ基と反応させる。
L−セレノシステイニルグリシン誘導体(5)の保護基、代表的にはFmoc基の脱保護処理に用いる脱保護剤は、公知の脱保護剤の中から適宜選択することができるが、例えば、第1工程におけるグリシン誘導体(3)の脱保護処理と同様、ジメチルアミン(Me2NH)、ジエチルアミン(Et2NH)などの直鎖状アルキル基を有する第二級アミンや、ピロリジン、ピペリジンなどの環状の第二級アミンを脱保護剤として用いることができ、次に述べる溶媒への溶解性に優れ、純粋な液体として入手が可能なEt2NHが好ましい。また、この脱保護処理のための溶媒も適宜選択することができるが、例えばジメチルホルムアミド(DMF)を単独で、NMPを単独で、またはこれらの溶媒とジクロロメタン(DCM)とを混合して用いることができる。脱保護剤の溶解性と、脱保護剤の第二級アミンによるセレノシステイン残基のα水素の引き抜きに伴うSe原子の脱離がDMF中で徐々に進行すること(その脱離を防ぐ必要があること)を考慮すると、DMFとDCMの混合溶媒を用いることが好ましい。溶媒中の脱保護剤の濃度も適宜調節することができるが、通常5〜30体積%、好ましくは10〜20体積%である。脱保護処理の時間は、通常1〜30分、好ましくは5〜20分である。処理温度は室温程度でよいが、化合物(アミノ酸およびペプチド)に悪影響を与えない範囲で、必要に応じて適宜40℃以下の範囲で調節してもよい。脱保護処理の後、必要に応じて過剰のEt2NH等の脱保護剤およびDCM等の溶媒を減圧留去した後、L−セレノシステイニルグリシン誘導体(6)を次のL−グルタミン酸誘導体(7)との反応に用いる。
L−グルタミン酸誘導体(7)の側鎖のγ位のカルボキシ基は、L−セレノシステイニルグリシン誘導体(6)の脱保護されたアミノ基との反応のために、所定の活性化剤および反応促進用添加剤を用いて活性化される。
セレノグルタチオンの液相製造方法における第3工程は、γ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシン(8)の脱保護、すなわち当該誘導体が有する2つのカルボキシ基の保護基(例えばtBu基)、アミノ基の保護基(例えばBoc基)、およびセレン原子の保護基(例えばMPM基)の全てについて、一段階で(途中で分離工程等を挟まずに)除去する工程である。
Fmoc-Gly-OtBu (3)の脱Fmoc保護とFmoc-Sec(MPM)-OH (2)との連結反応それぞれの条件について、脱Fmoc保護剤および反応時間、ならびにカルボキシ基の活性化剤(カルボジイミド)の種類と反応促進用添加剤(HOBt)との当量比および反応時間を変更しながら検討した。結果を表1に示す。
実施例1で述べた条件を適用して、ジペプチド5とL-グルタミン酸誘導体(7)との連結反応の条件の検討を行った。結果を表2に示す。
化合物8の脱保護条件について、チオアニソール(TA)およびトリフルオロ酢酸(TFA)の混合比および化合物8との反応時間を変更しながら検討した。結果を表3に示す。
1.化合物5の合成(第1工程)
1.1 Fmoc-Gly-OtBu(化合物3)(0.1145 g, 0.32 mmol)を30 mLナス型フラスコにとり、10%-Et2NH/DMF(4 mL)に溶かし5分間室温で攪拌した。Fmoc基の脱保護が完了後、エバポレーターで過剰のEt2NHを減圧留去した。得られた溶液にFmoc-Sec(MPM)-OH(化合物2)(0.1025 g, 0.20 mmol)、HOBt(0.0677 g, 0.44 mmol)、EDCI(0.0807 g, 0.42 mmol)、DMF(2 mL)を順次加え、室温で2時間攪拌した。撹拌後、反応液を酢酸エチル―水で抽出し、得られた有機層を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液の順に洗浄した後、硫酸マグネシウムで脱水した。濾過後、エバポレーターで溶媒を減圧留去した。得られた粗製の化合物5を酢酸エチル:ヘキサン(3:7)を溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製することで、目的物(化合物5)を収量0.1198 g、収率95.7 %で得た。
1H NMR (CDCl3): δH 1.39 (9H, s, tBu), 2.69 (1H, m, Sec βH), 2.87 (1H, m, Sec βH), 3.68 (3H, s, MPM OMe), 3.71 (2H, s, MPM CH2), 3.84 (2H, m, Gly), 4.15 (1H, t, JHH 6.9 Hz, Fmoc 1H), 4.34 (3H, m, Fmoc 2H + Sec αH ), 5.52 (H, d, JHH 6.5 Hz, NH), 6.58 (1H, s, NH), 6.74 (2H, d, JHH 7.8 Hz, MPM Ar), 7.16 (2H, d, JHH 8.4 Hz, MPM Ar), 7.24 (2H, t, JHH 7.2 Hz, Fmoc Ar), 7.32 (2H, t, JHH 7.4 Hz, Fmoc Ar), 7.51 (2H, d, JHH 6.8 Hz, Fmoc Ar), 7.69 (2H, d, JHH 7.5 Hz, Fmoc Ar). 13C NMR (CDCl3): δC 25.8, 27.5, 28.1, 42.2, 47.1 54.5, 55.2, 67.3, 82.5, 114.1, 120.0, 125.2, 127.1, 127.8, 130.1, 130.8, 141.3, 143.8, 156.0, 158.6, 168.5, 170.5. 77Se NMR (CDCl3): δSe 221.6. [α]D:-3.4°(in CHCl3)。
2.1 Fmoc-Sec(MPM)-Gly-OtBu(0.0669 g : 0.11 mmol)を10 mLナス型フラスコにとり、10%-Et2NH/20%-DCM/DMF(2 mL)に溶かした。この溶液を5分間攪拌することで脱Fmocを行った。反応終了後、エバポレーターでEt2NHとDCMを減圧留去した。得られた溶液にBoc-Glu-OtBu(0.0580 g : 0.19 mmol)、HOBt(0.0269 g : 0.18 mmol)、EDCI(0.0807 g : 0.16 mmol)とDMF(1 mL)を加え、室温で2時間攪拌した。撹拌後、反応液を酢酸エチル−水で抽出し、得られた有機層を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液の順に洗浄した後、硫酸マグネシウムで脱水した。濾過後、エバポレーターで溶媒を減圧留去した。得られた粗製の化合物8を酢酸エチル:ヘキサン(45:55)を溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製することで、目的物(化合物8)を収量0.0700 g、収率95.0 %で得た。
1H NMR (CDCl3): δH 1.47 (9H, s, tBu), 1.48 (9H, s, tBu), 1.49 (9H, s, tBu), 1.90 (1H, m, Glu βH), 2.18 (1H, m, Glu βH), 2.30 (2H, m, Glu γH), 2.81 (1H, dd, JHH 6.4 Hz and 12.9 Hz, Sec βH), 2.99 (1H, dd, JHH 6.2 Hz and 13.2 Hz, Sec βH), 3.81 (3H, s, MPM OMe), 3.82 (2H, s, MPM CH2), 3.93 (2H, m, Gly), 3.86-4.00 (1H, m, Glu αH), 4.61 (1H, dd, JHH 6.5 Hz and 13.5 Hz, Sec αH), 5.27 (1H, d, JHH 6.8 Hz, NH), 6.70 (1H, d, JHH 7.4 Hz, NH), 6.82 (1H, t, JHH 7.3 Hz, NH), 6.86 (2H, d, JHH 8.5 Hz, MPM Ar), 7.26 (2H, d, JHH 8.4 Hz, MPM Ar). 13C NMR (CDCl3): δC 25.1, 27.4, 28.0, 28.0, 28.3, 28.9, 32.4, 42.1, 52.7, 53.4, 55.2, 79.9, 82.2, 82.2, 114.0, 130.0, 131.0, 155.8, 158.5, 168.5, 170.6, 171.5, 172.3. 77Se NMR (CDCl3): δSe 225.9. [α]D:-8.6°(in CHCl3)。
3.1 γ-L-グルタミル-L-セレノシステイニルグリシン(34.7 mg : 0.051 mmol)を15 mL遠沈管にとり、20%-TA/TFA(1.5 mL)に溶かした。37℃で4時間振盪した後、窒素を吹きかけることでTFAを気化させた。得られた残渣にEt2Oを加えることでペプチドを沈殿させ、溶液をデカンテーションした。同様の操作を3回繰り返すことでペプチドを洗浄し、エバポレーターで溶媒を減圧留去した。0.1%-TFA含有50%-MeCN/H2Oに溶かし、凍結乾燥を行うことによって目的物(化合物1)をTFA塩として定量的に得た。
1H NMR (D2O): δH 2.10 (2H, q, JHH 7.3 Hz, Glu βH), 2.46 (2H, m, Glu γH), 3.07 (1H, dd, JHH 9.3 and 13.0 Hz, Sec βH), 3.33 (1H, dd, JHH 4.9 and 13.2 Hz, Sec βH), 3.83 (1H, t, JHH 6.2 Hz, Glu αH), 3.91 (2H, s, Gly), 4.60 (1H, dd, JHH 4.9 Hz and 9.2 Hz, Sec αH). 13C NMR (CDCl3): δC 25.8, 29.2, 31.1, 41.2, 53.1, 53.9, 172.7, 172.8, 173.0, 174.5. 77Se NMR (CDCl3): δSe 292.4. [α]D:-59.3°(in H2O)。
上記の合成法で得られたセレノグルタチオンは、各種NMRスペクトルおよび旋光度([α]D)の測定によって、その純度を確認することができる。必要に応じて、次に示す手段によって純度をより高めることができる。
GLサイエンス社製の逆相カラムInertsil C18(粒径 5 μm, 直径4.6 mm×長さ150 mm)を用いて、以下のHPLC条件で、得られたセレノグルタチオンの分析及び精製を行った。カラム温度は35℃、溶媒の流速は1.0 mL/min、検出波長は220 nmとした。溶媒Aは0.1%TFA−アセトニトリル、溶媒Bは0.1%TFA−水とし、サンプル注入後20分かけて溶媒Bの濃度を1%から21%に徐々に増加した。少量のセレノグルタチオンを水に溶かしてサンプルとした。セレノグルタチオンは約9.5分後に溶出し、これを捕集し、凍結乾燥した。この精製法では、一回に精製できるセレノグルタチオンはごく少量(〜100 μg)であった。
関東化学社製の逆相クロマト用シリカゲルSilica gel 120 (spherical) RP-18 (粒径 40〜50 μm)を0.1%TFA含有30%アセトニトリル−水に膨潤させ、カラム管(直径2.5 cm×長さ30 cm)に詰めた。溶媒の流速を3.4 mL/min、検出波長を220 nmとして、セレノグルタチオンを同溶媒に溶かしてカラムに注入した。セレノグルタチオンは25〜30分後に溶出し、これを捕集し、凍結乾燥した。この精製法では、一回に精製できるセレノグルタチオンは〜40 mgであった。
Claims (4)
- L−セレノシステインを出発原料として、L−セレノシステインとグリシンとを連結してL−セレノシステイニルグリシンを得る工程(第1工程)、L−セレノシステイニルグリシンとL−グルタミン酸とを連結してγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンを得る工程(第2工程)、およびγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンを脱保護してセレノグルタチオンを得る工程(第3工程)を有する、液相法によるセレノグルタチオンの製造方法であって、
前記第1工程は、アミノ基およびセレン原子が保護されたL−セレノシステイン誘導体と、アミノ基が脱保護され、カルボキシ基が保護されたグリシン誘導体とを反応させることで前記連結を行う工程であり、
前記第2工程は、アミノ基が脱保護され、カルボキシ基およびセレン原子が保護されたL−セレノシステイニルグリシン誘導体と、アミノ基およびα炭素に結合したカルボキシ基が保護されたL−グルタミン酸誘導体とを反応させることで前記連結を行う工程であり、
前記第1工程および第2工程それぞれの連結における、所定のカルボキシ基とアミノ基との反応を、カルボキシ基の活性化剤としてのカルボジイミド類および反応促進用添加剤を用いて行い、
前記反応促進用添加剤が1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)であることを特徴とする、セレノグルタチオンの液相製造方法。 - 前記カルボジイミド類が1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)またはN,N'−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)であることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
- 前記第3工程におけるγ−L−グルタミル−L−セレノシステイニルグリシンの脱保護を、チオアニソール(TA)とトリフルオロ酢酸(TFA)の混合物を脱保護剤として用いて、全ての保護基について一段階で行うことを特徴とする、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記出発原料としてのL−セレノシステインが、N−(9−フルオレニルメトキシカルボニル)−Se−(4−メトキシフェニルメチル)−L−セレノシステイン(Fmoc−Sec(MPM)−OH)であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
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