MXPA06011904A - Procesos para preparar eptifibatido. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona, entre otras cosas, procesos convergentes para la preparacion de eptifibatido que involucra el acoplamiento de un fragmento 2-6 eptifibatido a un resido de cisteinamida activado a fin de formar un fragmento 2-7 eptifibatido, anexando un residuo de acido mercaptopropionico al fragmento 2-7 eptifibatico a traves de formacion de enlace de disulfuro, acoplando el peptido de manera intramolecular y retirando el grupo protector, para formar el eptifibatico. La invencion proporciona ademas productos producidos mediante los procesos descritos, compuestos novedosos que pueden utilizarse como compuestos intermedios sinteticos para la preparacion del eptifibatico y compuestos novedosos que son estructuralmente similares a eptifibatido.

Description

1 1 04. El eptifibátido también se administra a pacientes que experimentan angioplastía globular, un procedimiento para el cual más de 1 .0 millones de personas en los E. U . son candidatos anualmente. El eptifibátido se cree q ue funciona mediante inhibición de la formación de agregados de plaquetas, específicamente, mediante bloqueo del receptor de plaquetas GP l lb-l l la. La formación de agregados de plaquetas puede obstruir el sumin istro sangu íneo al corazón , originando angina inestable y, posiblemente , infarto al miocardio (ataque al corazón). Los efectos del eptifibátido son específicos a las plaquetas, evitando interferencia con otros procesos cardiovasculares, y los efectos pueden invertirse cuando el eptifibátido se utiliza de manera discontinua. El eptifibátido se comercializa en los E. U . bajo la marca I NTEGRI LI N® y se utiliza para tratar pacientes con síndrome coronario agudo (ang ina inestable y M I de onda no-Q) , incluyendo pacientes que deben manejarse médicamente y aquellos que experimentan intervención coronaria percutánea ("PCI"). El eptifibátido también se indica para utilizarse al momento de intervenciones coronarias percutáneas, incluyendo procedimientos q ue involucran la realización de microandamios intracoronarios. M uchos enfoques sintéticos reportados para eptifibátido han empleado técnicas conocidas de síntesis de péptido de fase sólida, según se describe, por ejemplo, en las Patentes de E. U . 5,31 8 ,899; 5,686,570 Y 5, 747,447. Un proceso de fase líquida, a escala comercial, también se reportó en la Conferencia I BC 1 999 sobre Tecnolog ías de Péptido, "Peptisyntha's Method of Producing GM P Peptides on an Industrial Scale". El proceso comercial es una síntesis convergente que involucra la preparación separada de dos fragmentos: Mpa-Har-Gly o Asp-Trp-Pro. El acoplamiento de estos dos fragmentos proporciona seis de los siete residuos necesarios para eptifibátidos. El último residuo anexo es una cisteinamida protegida por S-tritilo como se describe, por ejemplo, en la Patente de E. U . 5 ,506,362. Después del retiro de los g rupos protectores de S-tritilo (en los residuos de cisteinamida y mercaptopropionilo) , el cierre anular se logra entonces mediante formación de enlace de disulfuro. El eptifibátido crudo, obten ido por el proceso comercial, ha reportado una pureza de aproximadamente 80% . Dos etapas de cromatografía en columna mejoran la pureza hasta más de 99% . La síntesis de fase líquida se ha observado generalmente como más factible que la síntesis de fase sólida para la elaboración a g ran escala del eptifibátido. Sin embargo, los temas de solubilidad y la generación de mezclas de reacción complejas presentan retos para los procesos de fase líquido a g ran escala. Las complejas mezclas de reacción , por ejemplo, hacen más difícil la pu rificación del producto. Existen maneras de superar estos problemas, tal como el uso de amino ácidos persililados y reactivos de transferencia de fase, como se describe, por ejemplo, en la Patente de E. U . 4,954,61 6, y la purificación cromatográfica extensa, pero tales medios ag regan el costo del proceso total.

Existe por lo tanto una necesidad de procesos alternativos para la elaboración del eptifibátido.

Breve Descri pción de la Invención La invención proporciona, entre otras cosas, procesos para la preparación de eptifibátido. Ciertos compuestos de la invención comprenden la proporción de un compuesto de la fórmula I I : (l l) en donde Har es homoarginilo; Gly es glicilo; Asp es aspartilo; Trp es triptofanilo; Pro es prolilo; Cys-NH2 es cisteinamida; Mpa es ácido mercaptopropiónico; y P2 es un grupo protector carboxilo ; acoplando los residuos Har y Mpa para formar un compuesto de la fórmula I I I : (M i) ; y retirando P2 del residuo Asp del compuesto de la fórmula II I para formar eptifibátido. La invención también proporciona procesos en los cuales un residuo de homoarginina protegido por amino-terminal se acopla con un residuo de glicina, formando así un fragmento 2-3 eptifibátido de la fórmula: También se proporcionan procesos en los cuales un residuo de ácido aspártico que tiene una cadena lateral carbóxilo protegida se acopla aun dipéptido de triptofanil-prolilo a través del residuo triptofanilo del dipéptido, formando así un fragmento 4-6 eptifibátido protegido de la fórmula: P3-Asp(0-P2)-Trp-Pro-OH. Después de la desprotección, el fragmento 2-3 eptifibátido y el fragmento 4-6 eptifibátido, a su vez, pueden acoplarse a través de la anexión del residuo Gly del fragmento 2-3 eptifibátido al residuo Asp del fragmento 4-6 eptifibátido, formando así un fragmento 2-6 eptifibátido de la fórmula: P1-Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-OH en donde Har es homoarginilo; Gly es glicilo; Asp es aspartilo, Trp es triptofanilo; Pro es prolilo; P1 es un grupo amino protector; y P2 es un grupo protector carbóxilo. En modalidades preferidas, el fragmento 2-6 eptifibátido se acopla a un residuo de cisteinamida activado a través del residuo Pro del fragmento 2-6 eptifibátido, formando así un fragmento 2-7 eptifibátido de la fórmula: P -Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-ACys-NH2 en donde ACys-NH2 es un residuo de cisteinamida activado. Un residuo de ácido mercaptopropiónico puede anexarse al fragmento 2- 7 eptifibatido a través de un enlace de disulfuro entre el residuo de ácido mercaptopropiónico y el residuo ACys-NH2 del fragmento 2-7 eptifibátido, formando así un compuesto de la fórmula I: Mpa-OH PrHar-Gly-Ásp(0-P2>Trp-Pro-Cys-NH2 (i) en donde Mpa es ácido mercaptopropiónico; Cys-NH2 es cisteinamida. El retiro de P-¡ del residuo Har del compuesto de la fórmula I proporciona un compuesto de la fórmula II: Mpa-OH H-Har-Gly-Asp(0-P2)-Tip-Pro-Cys-NH2 (ll) El acoplamiento de los residuos Har de terminal N y Mpa de terminal C de este compuesto proporciona un compuesto de la fórmula III: (lll) y el posterior retiro de P2 del residuo Asp produce eptifibátido. La presente invención también proporciona productos producidos mediante los procesos descritos, tales como compuestos de la fórmula IV: en donde R-? es hidrógeno o P i ; P-i es un grupo protector amino ; y P2 es un grupo protector carbóxilo. Otros compuestos representativos de la invención incluyen Fmoc-Har-Gly-OH , Fmoc-Har-Giy-0-P4 y Fmoc-Har-Gly-Asp(0-P5)-Trp-Pro-O H donde P4 y P5 son grupos protectores carbóxilo. En ciertas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden eptifibátido y menos de 1 % de ciertas impu rezas de proceso. La invención también proporciona procesos para la purificación de eptifibátido.

Descripción Detallada de las Modalidades Ilustrativas En un aspecto, la presente invención proporciona procesos convergentes para la preparación de eptifibátido que involucran la preparación de un fragmento 2-3 eptifibátido, preparación de un fragmento 4-6 eptifibátido y acoplamiento de los fragmentos 2-3 y 4- 6 eptifibátido para formar un fragmento 2-6 eptifibátido. Algunos de estos procesos involucran el acoplamiento del fragmento 2-6 eptifibátido a u n residuo de cisteinamida activado a fin de formar u n fragmento 2-7 eptifibátido, formando un enlace de disulfuro entre ácido mercaptopropiónico y el fragmento 2-7 eptifibátido a fin de formar el Precursor A, efectuando el acoplamiento de péptido intramolecular de Precu rsor A y retirando los grupos protectores del producto de acoplamiento a fin de formar el eptifibátido. En modalidades adicionales, la invención se refiere a prod uctos producidos mediante los procesos descritos para la preparación de eptifibátido. En otras modalidades , la invención se refiere a compuestos novedosos que pueden utilizarse como compuestos intermedios para la preparación de eptifibátido. En modalidades adicionales, la invención se refiere a compuestos que son estructuralmente similares a eptifibátido. La invención también proporciona, en modalidades adicionales, procesos para la purificación de eptifibátido. Según se utiliza en la presente, el término "g rupo protector carbóxilo" se refiere a un elemento q ue puede anexarse de manera selectiva a y retirarse de un grupo carbóxilo a fin de evitar que participe en reacciones químicas indeseadas, sin efectos inaceptablemente adversos en reacciones deseadas. Los ejemplos de grupos protectores carbóxilo incluyen ásteres, tales como metilo, etilo, t-butilo, benzilo (no) sustituido, y ásteres de sililo, entre otros. Otros grupos protectores carbóxilo son muy conocidos en la materia y se describen en detalle en los Grupos Protectores en Síntesis Orgánica, Teodora W. Greene y Peter G . M. Wuts, 3a Edición , 1 999, publicado por Joh n Wiley and Sons, Inc. Según se utiliza en la presente, el término "grupo protector amino" se refiere a un elemento q ue puede anexarse de manera selectiva a y retirarse de un átomo de nitrógeno a fin de evitar que participe en reacciones químicas indeseadas , sin efectos inaceptablemente adversos en reacciones deseadas. Los ejemplos de g rupos protectores amino incluyen carbamatos, tales como Boc, Cbz, Fmoc, alloc, carbamatos de metilo y etilo, entre otros; derivados de ¡mida cíclica , tales como ftalimida; amidas, tales como formilo, acetilo (no) sustituido y benzoilo; y grupos de trialquil sililo, tales como t-butildimetilsililo y triisopropilsililo. Otros grupos protectores amino son muy conocidos en la materia y se describen en detalle en Grupos Protectores en Síntesis Orgánica, Teodora W. Greene y Peter G . M . Wuts, 3a Edición , 1 999, publicado por John Wiley and Son, I nc. Según se utiliza en la presente, el término "acoplamiento" y todas las variaciones del mismo se refieren a la formación de un enlace amida , por cualquier medio, entre los elementos por unirse.

Según se utiliza en la presente, el término "anexo" y todas las variaciones del mismo se refieren a la formación de un enlace de amida o disulfuro, por cualquier medio que pueda utilizarse para formar un enlace de amida o disulfuro , entre los elementos por unirse. Según se utiliza en la presente, el término "residuo de cisteinamida activado" se refiere a un residuo de cisteinamida que es capaz de formar un enlace de disulfuro con ácido mercaptoprop iónico. Según se utiliza en la presente, el término "Gly-eptifibátido" se refiere a un compuesto que se relaciona estructuralmente con el eptifibátido, pero contiene dos residuos adyacentes de glicina en vez de un solo residuo de glicina. Todos los residuos amino ácidos referidos en la presente son amino ácidos naturales que tienen la configuración en L. El eptifibátido tiene la siguiente estructura química: El eptifibátido también puede representarse mediante el designaciones amino acidas como sigue: 1 2 3 4 5 6 7 Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys*NH2 donde las designaciones amino ácidas corresponden al dibujo químico mostrado a continuación: Para facilidad de descripción, los residuos también pueden numerarse desde (1) hasta (7). El residuo (1) es ácido mercaptopropiónico; (2) es homoarginilo (Har); (3) es glicilo (Gly); (4) es aspartilo (Asp); (5) es triptofanilo (Trp); (6) es prolilo (Pro); y (7) es cisteinamida (Cys-NH2). En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a procesos convergentes para la preparación de eptifibátido. En u na primer secuencia de etapas, se prepara un fragmento 2-3 eptifibátido que contiene amino ácidos (2) y (3). En una segunda secuencia, se prepara un fragmento 4-6 eptifibátido que contiene amino ácidos (4) , (5) y (6). Los dos fragmentos se acoplan entonces para proporcionar un solo fragmento 2-6, el cual es un pentapéptido. El fragmento 2-6 de eptifibátido se protege en la terminal amino del residuo Har y en el grupo carbóxilo de cadena lateral de aspartilo. El Esquema 1 delinea un proceso ejemplar para la preparación del fragmento 2-6 eptifibátido: Esquema 1 . Preparación del Fragmento 2-6 de Eptifibátido 1 2 3 4 5 6 7 Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(NH2) S •S Secuencia A Secuencia B Fmoc-HarOH H-Gly-OIBu OH Fmoc-Har-Giy-OH Z-Asp(OtBu)-Trp-Prc-OH Pro-OH La Secuencia A del Esquema 1 muestra la preparación del fragmento 2-3 eptifibátido y la Secuencia B muestra la preparación del fragmento 4-6 eptifibátido. Las dos secuencias convergen para proporcionar el fragmento 2-6 de eptifibátido. Au nq ue el Esquema 1 muestra grupos protectores amino ácidos ejemplares, se apreciará por aq uellos expertos en la materia de síntesis péptida que también pueden utilizarse otros grupos protectores amino ácidos conocidos. Por ejemplo, en lugar del grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , pueden utilizarse otros grupos protectores de carbamato tales como grupos Cbz (benziloxicarbonilo, RCbz (g rupos benziloxicarbonilo sustituidos en el anillo aromático) , 9(2-sulfo)fIuorenilmetilcarbamato, 9(2 , 7-dibromo)fluorenilmetilcarbamato, 2-cloro-3-indenilmetilcarbamato, Benz[f]inden-3-ilmetilcarbamato o Alloc (Aliloxicarbon ilo) . El éster de t-butilo en el residuo aspartilo puede reemplazarse por cualquier otro grupo protector que puede disociarse por hidrogenolisis, tal como, por ejemplo, OBzl (éster de benzilo). El elemento Fmoc-Har en los fragmentos de eptifibátido ilustrados en la Secuencia A del Esquema 1 puede reemplazarse por RN p i-Har, donde RNp i es un grupo protector amino ácido tal como, por ejemplo, un g rupo Cbz (benziloxicarbonilo), un grupo RCbz (benziloxicarbonilo sustituido en el anillo aromático), o un grupo Alloc (Aliloxicarbonilo) . De manera similar, el elemento Z-Asp (o Cbz-Asp) en los fragmentos eptifibátidos ilustrados en la Secuencia B puede reemplazarse por RN P2-Asp, donde RN P2 es un grupo protector amino que puede disociarse en condiciones básicas tales como, por ejemplo, Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo), o donde RNP2 es un grupo protector amino que puede disociarse por hidrogenelisis, tal como, por ejemplo, un grupo RCbz (grupo protector benziloxicarbonilo con anillo aromático sustituido). Además, el grupo -OtBu ilustrado en el Esquema 1 puede reemplazarse por RCp , donde RC P es un protector carbóxilo que puede disociarse por tratamiento ácido, tal como, por ejemplo, un grupo Odpm (éster de difenilmetilo) . Pfp (pentafluorofenilo) puede reemplazarse por RLi , donde RU es un grupo activador carbóxilo; y Su (succinimida) puede reemplazarse por R|_2 , donde R|_2 es un grupo activador carbóxilo. De manera independiente a la naturaleza del fragmento, tanto Pfp como Su pueden reemplazarse por otros ésteres activos estables, tales como, por ejemplo, ésteres de mono y dinitrofenilo, éster de tri- y pentafenilo. Se apreciará por aquellos expertos en la materia q ue la selección de gru pos protectores en particular depende de la identidad de otros grupos protectores que existen en el mismo compuesto. En ciertas modalidades de la invención , se selecciona un g rupo protector en particular a fin de q ue pueda retirarse de manera selectiva bajo condiciones de reacción q ue no afectan otros grupos protectores . En ciertas modalidades de la invención , el fragmento protegido de 2-6 eptifibátido se acopla enseg uida a una cisteinamida "activada" (7) , tal como, por ejemplo, 3-nitro-2-piridinosulfenil-cisteinamida (H-Cys(Npys)-N H2) ; Nps (2-n itro-fen il-su lfenil) , S-feniltiocisteinamida, donde el anillo fenilo se sustituye; S-alquiltiocisteinamida; o el S- sulfonato y S-sulfeniltiocarbonatos de cisteinamida, a fin de formar el fragmento 2-7 hexapéptido de eptifibátido. El residuo eptifibátido remanente es ácido mercaptopropiónico o Mpa-OH (1). Mpa-OH se anexa al fragmento 2-7 hexapéptido bajo condiciones que forman un enlace de disulfuro entre el fragmento 1 y 2-7. La pieza de disulfuro resultante, designada en la presente como Precursor A, es una clave y precursor novedoso para la elaboración de eptifibátido. La estructura del Precursor A se muestra a continuación: donde P-\ es un grupo protector amino y P2 es un grupo protector carbóxilo. Preferentemente, el grupo P2 es estable bajo condiciones que son adecuadas para el retiro del grupo P-\. La selección de grupos compatibles P-i y P2 que permite el retiro selectivo de solo uno de los grupos es muy conocida en la materia. Un ejemplo de un par compatible de grupos protectores es P^ = Fmoc, el cual puede retirarse bajo condiciones básicas, y P2 = t-butilo, el cual es estable bajo las mismas condiciones. El Esquema 2 perfila un proceso ejemplar para la preparación del Precursor A: Esquema 2. Preparación de Precursor A de 2-6 Fmo )-NH2 FmoG-Har-Gly-Asp(OíBu)-Trp-Pro-Cys(Npys)-NH2 Precursor A Fmoc2-7-l) Como en el Esquema 1, los grupos Fmoc y t-butilo mostrados en el Esquema 2 pueden reemplazarse por otros grupos protectores conocidos que se reconocen generalmente como útiles para síntesis péptida. En ciertas modalidades de la invención, el retiro del grupo protector P del Precursor A proporciona otro precursor, el Precursor B, el cual es la porción 2-7-1 del eptifibátido: El Precursor B puede convertirse, a través de un acoplamiento a péptido intramolecular, en el Precursor C: Mpa-Har-GIy-Asp(0-p2 Trp-Pro-Cys-NH2 El acoplamiento de péptido intramolecular puede efectuarse, por ejemplo , en un solvente orgán ico en presencia de un reactivo de acoplamiento adecuado tal como, por ejemplo, un agente de acoplamiento de tipo uronio, tal como, pero sin limitarse, tetrafluoroborato de 0-[ciano(etoxicarbonil)metilenamino]-A/, /V, A/', /V'-tetrametiluronio (TOTU) , HBTU o TBTU (hexafluorofosfato y tetrafluoroborato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)-1 , 1 ,3,3-tetrametiluronio, respectivamente) ; un reactivo tipo carbodiimida tal como, pero sin limitarse, DCC (diciclohexilcarbodiimida), DIC (diisopropilcarbodiimida) o EDC (1 -etil-3-(3-dimetilamipropil)-carbodiimida) ; ésteres activos; o reactivos de acoplamiento tipo fosfonio tal como, por ejemplo, Bop (hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxi-tri(dimetilamino)-fosfonio) o PyBO P (hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxi-tri(pirrolidino)-fosfonio) . El acoplamiento péptido se describe , por ejemplo, en Humphrey y Chamberlin , Chem . Rev. 1 997 , 97, 2243-2266, incorporado en la presente para referencia en su totalidad . El retiro del grupo protector P2 del Precursor C proporciona eptifibátido. El retiro de P2 puede efectuarse, por ejemplo, en un solvente orgánico en presencia de ácido, base o cualquier otro reactivo o sistema reactivo en el cual es lábil el grupo protector. El Esquema 3 perfila un proceso ejemplar para la preparación de eptifibátido a partir de Precursor A: Esquema 3. Preparación de Eptifibátido a partir de Precursor A Precursor A (Fmoc2-7-1) Precursor B (2-7-1) Mpa-Har-GIy-Asp(OtBu>Trp-Pro-Cys-NH2 Precursor C (Eptifibátido-(OtBu)) Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pra-Cys-NH2 Eptifibátido Después del retiro del grupo protector Fmoc, el fragmento 2-7- experimenta un acoplamiento péptido intramolecular para proporcionar el éster de f-butilo de eptifibátido. El retiro del g rupo f- butilo del resid uo de aspartilo produce eptifibátido. En ciertas modalidades, la presente invención también se refiere a compuestos que son estructu ralmente similares a eptifibátido y se preparan de acuerdo con procesos que son similares a los procesos arriba descritos para la preparación de eptifibátido. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, -Gly-eptifibátido, que contiene dos residuos de glicina adyacentes, en vez de un solo residuo de glicina como en eptifibátido: Gly-eptifibátido puede prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento arriba descrito para la preparación de eptifibátido, excepto si u n dipéptido Gly-Gly se acopla a homoarginina para formar lo que corresponde al fragmento 2-3 eptifibátido, en vez del acoplamiento de glicina a homoarginina para formar el fragmento. Por ejemplo, de acuerdo con este procedimiento modificado, el grupo H-G ly-OtBu (3) mostrado en el Esquema 1 se reemplaza con H-Gly-OtBu . Gly-eptifibátido también se produce, en algunas modalidades de la invención , d urante la preparación de eptifibátido de acuerdo con los métodos arriba descritos para la preparación de eptifibátido. Ciertas modalidades de la invención se relacionan con composiciones que comprenden eptifibátido y Gly-eptifibátido, incluyendo composiciones que comprenden al menos 99% eptifibátido y Gly-eptifibátido en el rango de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 1 % y composiciones que comprenden al menos 99% eptifibátido y Gly-eptifibátido en el rango de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 0.1 % . La presente invención también proporciona métodos para la purificación de eptifibátido que comprenden, por ejemplo, contactar una sol ución de eptifibátido con una fase estacionaria q ue comprende, por ejemplo, cadenas de octadecil carbono anexas a sílice, enjuagar la fase estática contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido trifluoroacético/acetonitrilo, opcionalmente enjuagar la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido acético/acetonitrilo y enjuagar la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido de amoniaco/acetonitrilo. Las fases estacionarias inversas son muy conocidas por aquellos expertos en la materia y otras de tales fases pueden sustituirse para sílice a base de octadecil carbono. En modalidades particulares de la invención , la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido se enjuaga con una gradiente q ue tiene concentraciones iniciales de 95% de una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0.1 % y de 5% de una solución de aceton itrilo, y concentraciones finales de 50% de una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0.1 % y 50% de una solución de acetonitrilo .

La invención proporciona además modalidades en las cuales la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido se enjuaga con una gradiente que tiene concentraciones iniciales de 05% de una solución acuosa al 0.5% de ácido acético y 5% de una solución de acetonitrilo, y concentraciones finales de 50% de una solución acuosa al 0.5% de ácido acético y 50% de una solución de acetonitrilo. En algunas modalidades, la fase estacionaria se enjuaga con la gradiente de ácido acético/acetonitrilo después de uno o más enj uag ues con una gradiente de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. La invención también proporciona modalidades en las cuales la solución de ácido de amoniaco/acetonitrilo es una solución q ue comprende 95% de una solución acuosa de 1 00 mM de ácido de amoniaco y 5% de una solución de acetonitrilo. En ciertos aspectos de la invención , la fase estacionaria se enj uaga con una solución de ácido de amoniaco/acetonitrilo después de enjuagar con una gradiente de ácido trifluoroacético/acetonitrilo y/o una gradiente de ácido acético/acetonitrilo. El acoplamiento de los residuos amino ácidos que ocurre en los procesos descritos puede llevarse a cabo a través de métodos conocidos de síntesis péptida que son familiares para aquellos expertos en la materia. Cualquier procedimiento de acoplamiento adecuado para la formación de péptidos puede emplearse. Los sig uientes ejemplos son ilustrativos de ciertas modalidades de la invención y no debe considerarse que limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Preparación de Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH se obtuvo mediante procedimientos conocidos que inician con lo comerciaimente disponible Z-Asp(OtBu)- OSu y H-Trp-Pro-OH, como se describe, por ejemplo, en Bodanszky, M. (1979), Esteres activos en síntesis péptida, The Peptides, Vol. 1 (ed. E. Gross y J. Meienhofer), Capítulo 3. Academic Press, Londres, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Ejemplo 2: Preparación de H-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-OH A un reactor de 2 litros cargado con dimetilacetamida (DMAC, 1.2 L) a una temperatura de aproximadamente 20°C se agregaron 0.300 kg de material de inicio Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH, manteniendo la temperatura a aproximadamente 20°C. El Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH se permitió disolver y la mezcla de reacción se purgó entonces y protegió por una atmósfera de nitrógeno. Se agregó paladio en carbón (5% en peso) (0.015 kg) a la mezcla de reacción, seguido por hidrogenación a una presión de 2 barios mientras que la mezcla de reacción se mantuvo a aproximadamente 20°C. Después de dos horas, y después de esto cada hora, se analizó por HPLC una muestra de la reacción. El análisis por HPLC se condujo en una columna Purospher Star C18 de 55*4 mm con una mezcla de agua/solvente de acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) con una gradiente de 98:2 agua/acetonitrilo hasta 2:98 agua/acetonitrilo en 1 0 minutos. La detección de HPLC fue a 21 5 nm, el flujo fue de 2.0 mL/min y la temperatura fue de 40°C. La reacción se consideró completa cuando el análisis por HPLC mostró el material de inicio menor o igual a 0.2% con relación al por ciento de área de producto . Cuando la reacción se mostró completa por HPLC , una solución acuosa de ácido p-toluenosulfónico (0.094 kg p-TsO H en 0.1 50 L de agua) se agregó a la mezcla de reacción . La mezcla de reacción se filtró entonces a través de Celite® que se pre-enjuagó con DMAC (Celite® se enjuagó tres veces con 0.6 L). Después de la filtración de la mezcla de reacción , la torta de filtro se enjuagó tres veces con DMAC fresco (0.3 L) . El análisis por HPLC después del último enjuague se llevó a cabo para confirmar que no permaneció producto en la torta de filtro. Los filtrados combinados se transfirieron a un nuevo recipiente a aproximadamente 20°C, a cuya temperatura se agregó N-etilmorfolina (0.066 L). La temperatura se mantuvo por debajo de aproximadamente 22°C d urante la adición . La mezcla se enfrió entonces hasta aproximadamente 8-1 2°C y se agregó agua (3 L) lentamente a fin de mantener la temperatu ra por debajo de aproximadamente 1 5°C. La mezcla se agitó entonces a aproximadamente 8-12°C durante aproximadamente 30 min utos y se mantuvo esa temperatura durante 8 horas. Durante este tiempo, el producto se cristalizó de la solución . El sobrenadante puede analizarse por HPLC para determinar la cantidad de producto aún en la solución y si es necesario enfriamiento adicional. La mezcla acuosa obtenida se filtró y los sólidos recolectados se enjuagaron dos veces con una solución 2: 1 de agua: DMAC (0.9 L cada uno) . Los sólidos se enjuagaron entonces dos veces con acetonitrilo (0.9 L cada uno) y se secaron al vacío por debajo de aproximadamente 25°C hasta un peso constante. El contenido de agua después del secado fue de 3.5% (análisis Karl-Fisher). El producto se analizó mediante H PLC de fase inversa mediante el uso de una gradiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. U n análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 473.0 de H-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-OH . El rendimiento de recuperación fue de 93.2% (0.218 kg) ; el rendimiento neto fue de 93.1 % (en base al contenido de nitrógeno : 95.4%) .

Ejemplo 3: Preparación de Fmoc-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-OH A una mezcla acuosa de Fmoc-Har-Gly-OH (0.163 kg neto; en base a contenido péptido: 90.5%) en TH F: DMAC (0.71 7 L y 0,1 79 L, respectivamente) se agregó ácido metanosulfónico (0.027 L) y pentafluorofenol (0.083 kg). La mezcla se agitó a aproximadamente 20°C hasta que se disolvió el sólido. Se ag regó N-etilmorfolina (NE M) (0.030 L) gota a gota , seguido por diciclohexilcarbodiimida (DCC) (0.072 kg) en TH F (0.1 79 L) y la mezcla se agitó a aproximadamente 20°C . la formación de Fmoc-Har-Gly-OPfp se siguió por ensayo de HPLC . Después de aproximadamente 1 7 horas, la proporción de Fmoc-Har-Gly-O H/Fmoc-Har-Gly-OPfp fue de 1 .5/98.5. A la mezcla de reacción se agregó H-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-O H (0.146 kg , aproximadamente 3.5peso/% en peso H20) y N EM (0.049 L) . La mezcla se agitó a aproximadamente 20°C durante 3 horas. En ese momento, el análisis de HPLC mostró q ue la mezcla contiene aproximadamente 87% de producto, <2% Fmoc-Har-Gly-O Pfp, 6% de Fmoc-Har-G ly-O H, aproximadamente 0.5% de H-Asp(0-tBu)-Trp-Pro- OH , y aproximadamente 5.5% de una impureza que se identificó como Fmoc-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-OH ("impureza d .a.") . El análisis por H PLC se cond ujo en una columna Purospher Star C 18 55*4 mm con una mezcla de agua/solvente de aceton itrilo que contiene 0.1 % de ácido trifluoroacético (TFA) con una gradiente de 98:2 de agua/acetonitrilo hasta 2:98 agua:aceton itrilo en 1 0 minutos. La detección por H PLC fue a 21 5 nm, el flujo fue de 2.0 mL/min y la temperatura fue de 40°C. La mezcla de reacción se filtró y el sólido se enjuagó dos veces con una mezcla de 5/1 de THF/D AC (2 x 0.489 L) . El filtrado se concentró hasta aproximadamente 0.815 L a no más de 35°C bajo presión reducida (aproximadamente 20 mBar). La mezcla concentrada se ag regó lentamente du rante 1 hora a ¼ la mezcla de acetonitrilo/H20 (4.1 L) que contiene bicarbonato de sodio (0.059 kg). La velocidad de adición se controló cuidadosamente para evitar la formación de un precipitado gomoso. Aproximadamente 3.5% de la solución se agregó durante aproximadamente 1 5 min y la adición se interrumpió para agitar la mezcla a aproximadamente 20°C durante 1 h . El precipitado de pasta se convirtió en una mezcla acuosa blanca. 7.5% extra de la solución se agregó durante 1 5 hasta 30 minutos y la adición se interrumpió nuevamente para agitar la mezcla a aproximadamente 20°C d urante 1 2 h , después se filtró. El sólido se enjuagó con ¼ de mezcla de acetonitrilo/H20 (3 x 0.7 L) , 2/3 de mezcla de aceton itrilo/di-idopropiléter (DI PE) (3 x 0.7 L) y DI PE (2 x 0.7 L). El producto sólido se secó a T<30°C hasta que se logró un peso constante. El contenido de agua después del secado fue de 3.3% (análisis Karl-Fisher). El prod ucto se analizó mediante H PLC de fase inversa utilizando una g radiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo.

Un análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 922.5 de Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH . El rendimiento de recuperación fue de 81 .8% (0.234 kg); el rendimiento neto fue de 82.3% (en base al contenido de nitrógeno: 96.0%) .

Ejemplo 4: Preparación de Fmoc-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(N Pys)-NH2 En un reactor cargado con DM F de g rado de síntesis péptida (0.675 L) a aproximadamente 20°C se agregó Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH (0.225 kg) . La mezcla se enfrió hasta aproximadamente 0°C y se agregó H-Cys(N Pys)-N H2 como la sal sólida de hidrocloruro (0.080 kg). Se agregó tetrafluoroborato de O- Benzotriazol-1 -il-/V, N, A/^ /v'-tetrametiluronio (TBTU) (0.082 kg) a la mezcla de reacción . El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 6.5 hasta 7.0 mediante la adición por porción de diisopropiletilamina (D I PEA) (0.1 1 2 L) , mientras mantiene la temperatura a aproximadamente 0°C . La mezcla se agitó a esa temperatura, durante cuyo momento las muestras se analizaron por H PLC para formación del prod ucto aproximadamente cada 45 min utos. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a un pH de 6.5 hasta 7.0 con la adición de DI PEA según sea necesario. El análisis de HPLC se condujo en una columna Platinum EPS 1 00-5 C 1 8 5µ 250*4.6 mm; Solvente A:TFA 0.1 % en ag ua; Solvente B:TFA 0.1 % en acetonitrilo; gradiente: 12 hasta 98% B en 1 5 minutos. La detección por HPLC fue a 21 5 nm, flujo de 2.0 mL/min y la temperatura fue de 40°C. La reacción se consideró completa cuando el pentapéptido y los materiales de inicio de Cys(N Pys)-N H2 se mostraron cada uno en menos de 1 % por HPLC . De otro modo, se agrega TBTU adicional, DI PEA y el material de inicio q ue mostró ser deficiente en la mezcla.

La mezcla de reacción se agregó a otro recipiente que contuvo agua (4.5 L) a una temperatura de aproximadamente 5°C. Esta temperatura se mantuvo d urante la adición con agitación . Después de agitación durante 1 0 minutos a aproximadamente 5°C, la mezcla se filtró y el sólido se enjuagó cinco veces con agua (0.9 L cada uno) . El sólido se enjuagó entonces tres veces con tolueno (0.675 L cada uno). Los enjuagues con tolueno pueden reemplazarse por enjuagues con éter de diisopropilo. El sólido se secó al vacío a 35°C o por debajo hasta que se log ró un peso constante. El contenido de agua después del secado fue de 1 .2% (análisis Karl-Fisher) . El producto se analizó por H PLC de fase inversa mediante el uso de una gradiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Un análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 1 1 78.4 de Fmoc- Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(N Pys) N H2. El rendimiento de recuperación fue de 1 02.4% (0.295 kg) y el rendimiento neto fue de 87.7% (en base al contenido de péptido: 82.0%).

Ejemplo 5: Preparación de Fmoc-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa(Fmoc[2-7-1 ]) En un reactor cargado con acetonitrilo de grado HPLC (0.570 L) y DM F de grado de s íntesis péptida (0.285 L), bajo un atmósfera de nitrógeno a aproximadamente 20°C, se agregaron 0.285 kg de Fmoc-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(N Pys)N H2(Fmoc[2-7]) lentamente con agitación . Después de disolución del Fmoc[2-7] , la mezcla se enfrió hasta aproximadamente -3°C. U na solución de ácido mercaptopropiónico (Mpa, 0.023 kg) en acetonitrilo (0.057 L) , preparada a aproximadamente 20°C, se agregó a la mezcla de reacción a u na velocidad tal para mantener la temperatura de reacción a aproximadamente -3°C. La reacción se monitoreó por análisis de H PLC y se consideró completa cuando el análisis demostró ser menor de 1 % de Fmoc[2-7] en comparación con Fmoc[2-7-1 ] . El análisis de H PLC se condujo en una columna Purospher Star C1 8 55*4 mm con una mezcla de agua/solvente de acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético al 0.1 % (TFA) con una gradiente de 98 :2 agua/acetonitrilo hasta 2:98 de agua:acetonitrilo en 10 minutos. La detección de HPLV fue a 21 5 nm, el flujo fue de 2.0 mL/min y la temperatura fue de 40°C. La mezcla de reacción se ag regó a un segundo recipiente q ue se cargó con acetonitrilo de grado H PLC (5.7 L) y N-etilmorfolina (N EM , 0.033 L) a aproximadamente 20°C. Después de que se completó la adición , la reacción se agitó a esa temperatura durante aproximadamente 30 minutos. La mezcla acuosa se enfrió lentamente hasta aproximadamente 0°C y la agitación se continuó a esa temperatura d u rante aproximadamente 45 minutos. El siguiente procedimiento se llevó a cabo entonces tres veces: (a) la agitación se detuvo para permitir que el precipitado y el sobrenadante se separen ; (b) el sobrenadante se bombeó del recipiente (c) a aproximadamente 0°C, se agregó acetonitrilo de grado H PLC fresco (1 .425 L) al reactor y la agitación se re-inicio; y (d) la mezcla acuosa se agitó du rante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 0°C. La mezcla acuosa restante se filtró y el solidó se enjuagó dos veces con acetonitrilo de grado H P LC (1 .140 L cada uno) y una vez con tolueno (1 .425 L) . El enjuague con tolueno puede reemplazarse por un enjuag ue con éter de diisopropilo. El sólido se secó al alto vacío a no más de 20°C . El prod ucto se analizó por H PLC de fase inversa mediante el uso de una gradiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Un análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 1 128.4 de Fmoc- Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)- pa. El rendimiento de recuperación fue de 93.8% (0.256 kg) y el rendimiento neto fue cuantitativo (en base al contenido de péptido: 87.4%).

Ejem plo 6: Preparación de H-Har-Gly-As p(0-tBu)-Trp-Pro- Cys(N H2)-M pa ([2-7-1 ]) A un reactor cargado con DM F de grado de síntesis péptida (0.750 L) a aproximadamente 20°C, se agregaron 0.250 kg de Fmoc- Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(N H2)-Mpa (Fmoc[2-7-1 ]) lentamente con agitación . La mezcla se enfrió hasta aproximadamente 10°C a cuya temperatura se agregó dietiiamina (0.034 L) . después de la adición de dietiiamina, la temperatu ra de la mezcla se permitió elevar hasta aproximadamente 20°C . El progréso de la reacción se monitoreó por análisis de HPLC de las muestras tomadas cada hora. El análisis de HPLC se condujo en una columna Platinum EPS 100-5 C1 8 5µ 250*4.6mm ; Solvente A;TFA 0.1 % en agua ; Solvente B.TFA 0.1 %) en acetonitrilo; gradiente: 22 hasta 96% B en 1 5 minutos. La reacción se consideró completa cuando el por ciento de Fmoc[2-7-1 ] fue de menos de aproximadamente 0.5% con respecto a [2-7-1 ]. La reacción se completó usualmente en 3 horas. La mezcla de reacción se agregó a un segundo recipiente cargado con acetato de etilo (5.0 L) y se enfrió hasta aproximadamente 1 0°C. La suspensión resultante se agitó durante 1 0 minutos a aproximadamente 1 0°C . El siguiente procedimiento se llevó a cabo entonces dos veces: (a) la agitación se detuvo y el precipitado se permitió separarse del sobrenadante durante aproximadamente 1 5 minutos; (b) el sobrenadante se bombeó fuera del recipiente; (c) acetato de etilo fresco (0.750 L) se agregó a aproximadamente 1 0°C ; (c) la suspensión se agitó a aproximadamente 1 0°C durante aproximadamente 5 minutos. La mezcla acuosa se filtró y el sólido se enjuagó 6 veces con acetato de etilo (0.750 L cada vez) . Pueden llevarse a cabo enjuag ues adicionales con éter de diisopropilo para retirar los residuos de acetato de etilo. El sólido se secó al vacío a no más de 25°C por un máximo de 1 8 horas. El producto se analizó por H P LC de fase inversa mediante el uso de u na g radiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. U n análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 906.3 de H-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(N H2)-Mpa. Un análisis de GC mostró 3.4% de dietilamina residual. El rendimiento de recuperación fue de 1 06.1 % (0.21 3 kg) y el rendimiento neto fue de 99.2% (en base al contenido de péptido: 81 .9%) .

Ejem plo 7: Preparación de [MPA-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys](NH2) (ciclo-[1 -7](OtBu)-NH2) Al reactor se cargó D M F de g rado de síntesis péptida (0.768 L) y la solución se enfrió hasta aproximadamente 1 0°C. Se ag regó tetrafluo robo rato de 0-[ciano(etoxicarbonil)metilenamino]-/V, A/, /V', /\T- tetrametiluronio (TOTU) (0.070 kg) segu ido por dilución con diclorometano de grado de síntesis péptida (1 .536 L) mientras mantiene la temperatura por debajo de 15°C. La solución resultante se enfrió hasta aproximadamente -6°C y se agregó NEM (0.024 L) en porciones pequeñas manten iendo la temperatura a aproximadamente -6°C . El pH se midió antes y después de la adición de NEM . Se tomó una muestra para análisis de HPLC. El análisis de H PLC fue en una columna Phenomenex Luna C1 8(2) , 5um, 1 50*4.6mm , gradiente 1 2 hasta 98% B en 1 5 minutos. Solvente A: TFA 0.1 % en agua, Solvente B: TFA 0.1 % en acetonitrilo. La detección fue a 215 nm, el flujo fue de 2 mL/min y la temperatura fue de 40°C. A un reactor separado se cargó DM F de grado de síntesis péptida (0.768 L) a aproximadamente 20°C seg uidos por 0.1 92 kg de H-Har-Gly-Asp(0-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa ([2-7-1 ]) . Cuando el sólido se disolvió, la solución resultante se enfrió hasta aproximadamente 0°C. HOBt (0.026 kg) se diluyó con diclorometano de grado de síntesis péptida (0.384 L). Se tomó una muestra para análisis por H P LC. La solución de [2-7-1 ] se ag regó en la solución de TOTU muy lentamente con una bomba de adición sobre un mín imo de 3 horas mientras la temperatura se mantuvo a aproximadamente 6°C . Se tomó una muestra después de la adición de 50% de la solución [2-7- 1 ] para análisis por HPLC. El pH también se midió en este punto. También se tomaron muestras de pH y H PLC cuando se completó la adición de [2-7-1 ]. El pH se ajustó a 7-7.5 mediante la adición de N EM is es necesario, mientras que la temperatura se mantuvo a aproximadamente -6°C. El pH se verificó cada 1 5 minutos y se ajustó a 7-7.5 según los necesario con N EM , mientras que la temperatura se mantuvo a aproximadamente -6°C . Se tomó u na muestra de H PLC cada 45 minutos hasta que se completó el ciclo. La reacción se consideró completa cuando el por ciento de área de [2-7-1 ] fue de <0.5% con relación al producto por ciclo. Si la reacción se detiene, se ag regan 1 .1 equivalencias de TOTU por cantidad residual de [2-7-1 ] y el pH se ajustó a 7-7.5 seg ún lo necesario mientras la temperatura se mantuvo a — 6°C. Cuando la reacción se completó, la mezcla se concentró al vacío a <40°C hasta un volumen final de aproximadamente 0.8 L. La solución viscosa resultante se enfrió hasta aproximadamente 5°C y se agregó lentamente hasta que la agitación rápida de acetato de etilo fue de aproximadamente 0°C (7.0 L) . La mezcla acuosa resultante se agitó a aproximadamente 0°C durante 20 minutos. El siguiente procedimiento se llevó a cabo entonces tres veces: (a) la agitación se detuvo para perm itir que el precipitado y el sobrenadante se separaran ; (b) el sobrenadante se bombeó fuera del recipiente; (c) a aproximadamente 0°C , se agregó acetato de etilo fresco (1 . 1 5 L) al reactor y la agitación se re-inició; (d) la mezcla acuosa se agitó durante aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 0°C. El tiempo final en que se llevó a cabo el procedimiento anterior, se agregó un volumen menor de acetato de etilo (0.768 L) a la reacción y la agitación se re-inició du rante 1 0 minutos a 0°C. La mezcla acuosa resultante se filtró y el sólido se enjuagó una vez con acetato de etilo (0.576 L) y tres veces con éter de di-isopropilo (0.576 L). El sólido se secó al alto vacío a aproximadamente 25°C. El producto se analizó por HPLC de fase inversa mediante el uso de una gradiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Un análisis de LC/MS confirmó la masa [M+H] 888.2 de (ciclo-[1 -7](0-tBu)-N H2. El rendimiento de recuperación fue de 103.7% (0.1 94 kg) y el rendimiento neto fue cuantitativo (en base al contenido de péptido: 79.7%).

Ejemplo 8: Preparación de [ PA-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys](NH2) (ciclo-[1 -7]-NH2) Una mezcla de diclorometano (0.573 L) , anisol (0.086 L) y TFA (0.122 L) se preparó a aproximadamente 20°C. La solución resultante se enfrió hasta 1 5°C y se agregó [1 -7](OtBu)-NH2 sólido (0.1 91 kg) lentamente. La temperatura se mantuvo por debajo de 20°C d urante la adición de [1 -7](OtBu)-N H2. La mezcla de reacción se enfrió además hasta 1 0°C y una porción extra de TFA (0.365 L) se agregó en aproximadamente 1 0 min utos. La temperatura se mantuvo por debajo de 20°C durante la adición. Después de la adición de todo el TFA, la reacción se permitió agitar a 20°C y seguida por HPLC. El análisis pro HPLC se condujo en una columna Platinum EPS 100-5 C18, 250*4.6mm. La gradiente fue de 22 hasta 98% B en 15 minutos donde el solvente A fue de 0.1% TFA en agua y el solvente B fue de 0.1% TFA en acetonitrilo. La detección fue a 215 nm, el flujo fue de 1.5 mL/minuto, y la temperatura fue de 40°C. La reacción se completó cuando >3.0 Área% [1 -7](OtBu)-NH2 permaneció con relación al producto. Cuando la reacción se completó, la mezcla se enfrió hasta 10°C y se agregó a una solución de 2/1 de éter de diisopropilo (DIPE)/acetonitrilo (3.78 L) a 10°C. La mezcla acuosa resultante se agitó durante 10 minutos a 10°C y después se filtró al vacío. El sólido se enjuagó tres veces con una mezcla 7/3 de DIPE y acetonitrilo (0.573 L) y tres veces con DIPE (0.573 L). El producto se secó a no más de 25°C. El producto se analizó por HPLC de fase inversa mediante el uso de una gradiente acuosa de ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Un análisis de LC/MS confirmó la masa [M + H] 832.3 de (ciclo-[1-7]-NH2). El rendimiento de recuperación fue de 0.157 kg (87.9%) y el rendimiento neto fue de 87.2% (en base al contenido de péptido: 79.1%). El contenido en API puro fue de 45.8%. Este valor se obtuvo mediante el siguiente método de HPLC: Sinergi Max-RP 4 µ?? 80Á 250*4.6 mm; solvente A: 52 mM H3P04/CH3CN/1 OOmM H7SA (86/14/0.80); Solvente B: 52 mM H3P04/CH3CN /100 mM H7SA (50/50/0.80); 220 nm; 1.3 ml/min; 50°C; gradiente: 0%B durante 45 minutos, entonces hasta 45% B durante 13 minutos, d espués hasta 100% B durante 1 minuto.

Ejemplo 9: Purificación de Eptifibátido Purific a ció n-prim a ria La purificación primaria fue una purificación en base a ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Las normas aplicadas para las principales fracciones individuales fueron > 92.0 %. La fase estacionaria fue un Kromasil C18, 10 µ??, 100 A columna con un diámetro de 5 cm. La presión de la columna fue de 50 barios, la velocidad de flujo fue de 50 ml/min, y la longitud de onda de detección fue de 215 nm. Las fases móviles fueron las siguientes: Solvente A: TFA 0.1% en agua procesada / CH3CN (95/5); y Solvente B: TFA 0.1% en agua procesada / CH3CN (50/50). La columna se equilibró mediante levigación de 100% solvente A durante 5 minutos. La gradiente de purificación fue la siguiente: levigación de 100% solvente A durante 10 minutos; gradiente: 15%B hasta 45%B durante 60 minutos; y levigación de 100% solvente B durante 15 minutos. La purificación se monitoreó mediante el uso del método MAD-009-SF323TG1 y los criterios de aceptación objetivo fueron los siguientes: Fracción principal (F1): > 92%; y Fracción Secundaria (Fp): > 60% y < 92%. Las fracciones recolectadas se almacenaron a 2°C hasta 8°C.

Purificación secundaria: La purificación secundaria fue una purificación a base de ácido acético/acetonitrilo. Las normas para las principales fracciones individuales fueron > 99.0% con impurezas individuales <0.3 / 0.5%. La fase estacionaria fue una columna Kromasil C18, 10 µ?t?, 100 A con un diámetro de 5 cm. La presión de la columna fue de 40 + 5 barios, la velocidad de flujo fue de 50 ml/min, y la detección fue a una longitud de onda de 215 nm. Las fases móviles fueron las siguientes: Solvente A: AcOH 0.5% en agua procesada / CH3CN (95/5); y Solvente B: AcOH 0.5% en agua procesada / CH3CN (50/50). La columna se equilibró por levigación de 100% solvente A durante 15 minutos. La gradiente de purificación fue la siguiente: levigación de 100% solvente A durante 10 minutos; gradiente: 0%B hasta 15%B durante 5 minutos; 15%B hasta 35%B durante 60 minutos; y levigación de 100% solvente B durante 15 minutos. La purificación se monitoreó mediante el uso del método MAD-009-SF323TG1 y los criterios de aceptación objetivo son como sigue: Fracción principal (F1): > 99% con impurezas <0.3 / 0.5%; y Fracción Secundaria (Fp): > 80% y < 99%.

Las fracciones recolectadas se almacenaron a 2°C hasta 8°C.

Desalación/concentración: Se llevó a cabo una etapa de desalación doble en solución de acetato de amoniaco antes de la etapa de concentración para retirar el contra ión de trifluoroacetato residual y para obtener la forma de acetato del péptido. La etapa de concentración redujo el volumen de la solución procesada. La fase estacionaria de la desalación por N H4Oac/concentración de AcOH fue una columna Krpmasil C1 8, 1 0 µ? , 1 00 A con un diámetro de 5 cm. La presión de la columna fue de 40+5 barios, la velocidad de flujo fue de 50 ml/min , y la longitud de onda de detección fue de 21 5 nm . Las fases móviles fueron las siguientes: Solvente A: AcOH 0.5% en agua procesada / CH3CN (95/5); Solvente B: AcOH 0.5% en agua procesada / CH3C N (50/50); y Solvente C : NH4Oac 1 00 mM pH : 6.5 en agua procesada / CH3CN (95/5) . La columna se equilibró por elusión de 1 00% solvente A du rante 1 5 minutos . Para carga de la columna, la fracción principal de la pu rificación AcOH se diluyó con 2 volúmenes de agua procesada. La desalación se llevó a cabo como sigue: 1 0 minutos de solvente A; 1 0 minutos de solvente C; 1 0 min utos de solvente A; y 1 0 minutos de solvente C .

La concentración se llevó a cabo como sigue: 1 0 minutos de solvente A y 50% de B du rante 1 5 minutos. La desalación y concentración se monitorearon mediante el uso del método MAD-009-SF323TG 1 y los criterios de aceptación de objetivo fueron los siguientes: Fracción principal (F1 ) : >99.0% con impurezas <0.3 / 0.5% ; y Fracción secundaria (Fp): >80.0% y <99.0% . Las fracciones recolectadas se almacenaron a 2°C hasta 8°C.

La exposición entera de cada patente, solicitud de patente y publicación citadas o descritas en este documento se incorpora en la présente para referencia.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso caracterizado porque comprende: proporcionar un compuesto de la fórmula II: en donde Har es homoarginilo; Gly es glicilo; Asp es aspartilo; Trp es triptofanilo; Pro es prolilo; Cys-NH2 es cisteinamida; Mpa es ácido mercaptopropiónico; y P2 es un grupo protector carboxilo; y • acoplar los residuos Har y Mpa para formar un puesto de la fórmula III: (III) proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque P2 es t-butilo. 3. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende además el retiro de P2 del residuo de Asp del compuesto de la fórmula I I I para formar eptifibátido. 4. El proceso según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende además el retiro de P-i del residuo Har de un compuesto de la fórmula I : 0) en donde P1 es un grupo protector amino, formando así el compuesto de la fórmula I I . 5. El proceso según la reivindicación 4, caracterizado porque P2 es estable bajo condiciones adecuadas para el retiro de 6. El proceso seg ún la reivindicación 4, caracterizado porque P2 es t-butilo. 7. El proceso según la reivindicación 4, caracterizado porque P es 9-fluorenilmetoxicarbonilo o benziloxicarbonilo. 8. El proceso seg ún la reivindicación 4, caracterizado porque comprende además la sujeción de un residuo Mpa a un fragmento 2-7 eptifibátido de la fórmula : P1 -Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-ACys-N H2 en donde ACys-N H2 es un residuo de cisteinamida activado, a través de un enlace de disulfuro entre el residuo Mpa y el residuo ACys-N H2 del fragmento eptifibátido 2-7, formando así el compuesto de la fórmula I . 9. El proceso según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además el acoplamiento de un fragmento 2-6 eptifibátido de la fórmula: P1-Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-OH a un residuo de cisteinamida activado a través del residuo Pro del fragmento 2-6 eptifibátido, formando así el fragmento 2-7 eptifibátido. 1 0. El proceso según la reivindicación 9, caracterizado porque el residuo de cisteinamida activado es H-Cys(Npys)-NH2. 1 1 . El proceso según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además el acoplamiento de un fragmento 2-3 eptifibátido de la fórmula: ?-,-Har-Gly-OH y un fragmento 4-6 eptifibátido de la fórmula: H-Asp(0-P2)-Trp-Pro-OH a través del residuo Gly del fragmento 2-3 eptifibátido al resid uo Asp del fragmento 4-6 eptifibátido, formando así el fragmento 2-6 eptifibátido. 12. El proceso según la reivindicación 1 1 , caracterizado porque comprende además el acoplamiento de un residuo Asp protegido, de terminal am ino, que tiene una cadena lateral carbóxilo protegida, a un dipéptido Trp-Pro a través del residuo Trp del dipéptido y el retiro del grupo protector de terminal amino proveniente del residuo Asp para formar el fragmento 4-6 eptifibátido. 1 3. El proceso seg ún la reivindicación 1 2 , caracterizado porque comprende además el acoplamiento de un residuo Har protegido por terminal amino y un residuo Gly no protegido o protegido para formar el fragmento 2-3 eptifibátido. 14. Un proceso caracterizado porque comprende: el acoplamiento de un residuo de homoarginina protegido, de terminal amino, y u n residuo de glicina, protegido o no protegido, formando así un fragmento 2-3 eptifibátido de la fórmula : ?t-Har-Gly-O H ; el acoplamiento de un residuo de ácido aspártico, protegido, de terminal amino, que tiene una cadena lateral , carbóxilo, protegida, a un dipéptido de triptofano-prolina a través del residuo triptofano del dipéptido; y el retiro del grupo protector de terminal amino del resid uo de ácido aspártico, formando así un fragmento 4-6 eptifibátido protegido de la fórmula: P3-Asp(0-P2)-Trp~Pro-OH ; el acoplamiento del fragmento 2-3 eptifibátido y el fragmen4-6 eptifibátido a través de la sujeción del residuo Gly del fragmento 2-3 eptifibátido al residuo Asp del fragmento 4-6 eptifibátido, formando así un fragmento 2-6 eptifibátido de la fórmula : P1-Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-OH en donde Har es homoarginilo; G ly es glicilo; Asp es aspartilo; Trp es triptofanilo; Pro es prolilo; P1 y P3 son grupos protectores amino ; y P2 es un grupo protector carbóxilo; el acoplamiento del fragmento 2-6 eptifibátido a u n residuo de cisteinamida activado a través del residuo Pro del fragmento eptifibátido, formando as í u n fragmento 2-7 eptifibátido de la fórmula: P1-Har-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pro-ACys-NH2 en donde ACys-NH2 es una cisteinamida activada; la sujeción de un residuo de ácido mercaptopropiónico al fragmento 2-7 eptifibátido a través de un enlace de disulfuro entre el resid uo de ácido mercaptopropiónico y el residuo ACys-NH2 del fragmento 2-8 eptifibátido, formando así un compuesto de la fórmula Mpa-OH PrHar-Gly-Asp(0-P2)-Trp-Pto-Cys-NH2 S S 0) en donde Mpa es ácido mercaptopropiónico; Cys-N H2 es cisteinamida; el retiro de Pi del residuo Har del compuesto de la fórmula I, formando así un compuesto de la fórmula II: m el acoplamiento de los residuos Har y Mpa del compuesto de la fórmula II, formando así un compuesto de la fórmula III: (ni); y el retiro de P2 del residuo Asp del compuesto de la fórmula III para formar eptifibátido. 15. El proceso- según la reivindicación 14, caracterizado porque P2 es estable bajo condiciones adecuadas para el retiro de 16. El proceso según la reivindicación 14, caracterizado porque P2 es t-butilo. 17. El proceso según la reivindicación 14, caracterizado porque P-i es 9-fluorenilmetoxicarbonilo o benziloxicarbonilo. 18. El proceso según la reivindicación 14, caracterizado porque ACys-NH2 es H-Cys(Npys)-NH2. 19. Un compuesto caracterizado porque tiene la fórmula IV: (IV) en donde R-? es hidrógeno o P^ P-i es un grupo protector amino; y P2 es un grupo protector carbóxilo. 20. El compuesto según la reivindicación 19, caracterizado porque P2 es t-butilo. 21. El compuesto según la reivindicación 19, caracterizado porque P es hidrógeno. 22. El compuesto según la reivindicación 21, caracterizado porque P2 es t-butilo. 23. El compuesto según la reivindicación 19, caracterizado porque Ri es Pi. 24. El compuesto según la reivindicación 23, caracterizado porque P1 es 9-fluorenilmetoxicarbonilo o benziloxicarbonilo. 25. El compuesto según la reivindicación 24, caracterizado porque P2 es t-butilo. 26. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en: Fmoc-Har-Gly-OH; Fmoc-Har-Gly-0-P4; y Fmoc-Har-Gly-Asp(0-P5)-Trp-Pro-OH en donde Fmoc es 9-fluorenilmetocarbonilo; Har es homoarginina; Gly es glicina; Asp es ácido aspártico; Trp es triptofano; Pro es prolina; P4 y P5 son grupos protectores carbóxilo. 27. El compuesto según la reivindicación 26, caracterizado porque P4 es pentafluorofenol. 28. El compuesto según la reivindicación 26, caracterizado porque P5 es t-butilo. 29. 3-nitro-2-piridinosulfenil-cisteinamida (H-Cys(Npys)-NH2). 30. Un compuesto caracterizado porque tiene la siguiente fórmula: 31 . Una composición caracterizada porque comprende eptifibátido y Gly-eptifibátido. 32. La composición según la reivindicación 31 , caracterizada porque comprende al menos 99% eptifibátido y Gly-eptifibátido en el rango de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 1 % . 33. La composición según la reivindicación 32, caracterizada porque comprende al menos 99% eptifibátido y G ly-eptifibátido en el rango de aproximadamente 0.01 % hasta aproximadamente 0.1 % . 34. El producto producido mediante un proceso seg ún la reivindicación 1 . 35. El producto producido mediante un proceso seg ún la reivindicación 4. 36. El producto producido med iante un proceso seg ún la reivindicación 8. 37. El producto prod ucido mediante un proceso seg ún la reivindicación 9. 38. El producto producido mediante un proceso seg ún la reivindicación 1 1 . 39. El producto producido mediante un proceso seg ún la reivindicación 12. 40. El prod ucto prod ucido mediante un proceso seg ún la reivindicación 1 3. 41 . Un proceso para purificar eptifibátido, caracterizado porque comprende: contactar u na solución de eptifibátido con una fase estacionaria que comprende cadenas de octadecil carbono anexas a sílice; enjuague de la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido acético/acetonitrilo; opcionalmente enjuague de la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibático con una solución de ácido acético/acetonitrilo; y enjuague de la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido de amoniaco/acetonitrilo. 42. El proceso según la reivindicación 41 , caracterizado porque la solución de ácido trifluoroacético/acetonitrilo es una solución que comprende 95% de una solución acuosa de ácido trifluoroacético al 0.1 % y 5% de una solución de acetonitrilo. 43. El proceso según la reivindicación 42 , caracterizado porque comprende además la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido trifluoroacético/acetonitrilo q ue comprende 50% de una solución acuosa de ácido trifluroacético al 0.1 % y 50% de una solución de acetonitrilo. 44. El proceso seg ún la reivindicación 41 , caracterizado porque la solución de ácido acético/acetonitrilo es una solución que comprende 95% de una solución acuosa al 0.5% de ácido acético y 5% de una solución de acetonitrilo. 45. El proceso según la reivindicación 44, caracterizado porque comprende además el enjuague de la fase estacionaria contactada con la solución de eptifibátido con una solución de ácido acético/acetonitrilo que comprende 50% de una solución acuosa al 0.5% de ácido acético y 50% de una solución de acetonitrilo. 46. El proceso seg ún la reivindicación 41 , caracterizado porque la solución de ácido de amoniaco/acetonitrilo es una solución que comprende 95% de una solución de 100 mM de ácido de amoniaco y 5% de una solución de acetonitrilo.