JP2007537161A - エプチフィバチドの調製方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本発明は、とりわけ、エプチフィバチドを調製するための収束方法を提供するものであり、２−７エプチフィバチド断片を形成するために２−６エプチフィバチド断片を活性化システインアミド残基に結合させる工程と、ジスルフィド結合形成を介してメルカプトプロピオン酸残基を２−７エプチフィバチド断片に付着させる工程と、分子内でペプチド結合させる工程と、保護基を除去する工程とを含み、エプチフィバチドを形成する収束方法を提供するものである。本発明は更に、記載された方法によって生産される生成物、エプチフィバチドを調製するために合成的中間体として使用され得る新しい化合物、及び構造的にエプチフィバチドに類似した新規化合物を提供する。
【選択図】 なし

Description

本出願は２００４年４月８日に出願された米国仮出願番号第６０／５６０，４５３号に対して優先権を主張するものであり、これは本願明細書に完全に組み込まれるものとする。

特定の実施形態において、本発明はエプチフィバチド及び心臓血管疾患の治療に使用される薬剤の新規な調製方法に関する。本発明はまた、構造的にエプチフィバチドと類似した化合物、エプチフィバチドの合成中間体として使用され得る化合物、及びエプチフィバチドの精製方法に関する。

エプチフィバチドは、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの非常に特異的な環式ヘプタペプチド・アンタゴニストである。エプチフィバチドは、不安定狭心症の治療のための経皮的冠状動脈インターベンションの間に使用される短時間作用性の非経口抗血栓剤、及び急性心筋梗塞症の治療のための血栓溶解剤の補助剤である。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３），２６８（２），１０６６−７３、及びＳｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９９），１３８（６，Ｐｔ．１），１０９３−１１０４を参照。エプチフィバチドはまた、バルーン血管形成術を経験している患者に投与されるものであり、アメリカにおいて年間１００万人以上の候補者に対する手法である。

エプチフィバチドは血小板凝集を抑制することによって、具体的には、血小板受容体ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａを遮断することによって機能すると考えられている。血小板の凝集によって心臓への血液供給が妨げられ、不安定狭心症、及び場合によっては心筋梗塞（心臓麻痺）が引き起こされる可能性がある。エプチフィバチドの効果は血小板に特異的であるために他の正常な心血管経路の障害を避けるものであり、さらにエプチフィバチドの使用が中止された場合には、前記効果が逆転する可能性がある。

エプチフィバチドはＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮＲ（登録商標）として米国において販売されており、医学的に管理されている患者及び経皮冠動脈インターベンション（「ＰＣＩ」）を経験する患者を含む急性冠状血管シンドローム（不安定狭心症及び非Ｑ波梗塞）を有する患者の治療に使用されている。エプチフィバチドはまた、冠動脈内ステント留置術を伴う手法を含んだ経皮冠動脈インターベンションにおける使用にも適用されている。

例えば米国特許第５，３１８，８９９号明細書、第５，６８６，５７０号明細書、及び第５，７４７，４４７号明細書において記載されているように、エプチフィバチドの合成法に関する多くの報告においては、周知の技術である固相ペプチド合成を使用している。商業用の液相方法もまた、１９９９ ＩＢＣ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 「Ｐｅｐｔｉｓｙｎｔｈａ’ｓ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＧＭＰ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃａｌｅ」において報告されている。前記商業用の方法は、２つのフラグメントであるＭｐａ−Ｈａｒ Ｇｌｙ及びＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏを別々に調製することを必要とする収束合成である。これらの２つのフラグメントを結合することによって、エプチフィバチドに必要とされる７つの残基のうちの６つが提供される。最後に結合される残渣は、例えば米国特許５，５０６，３６２号明細書において記載されているように、Ｓ−トリチル保護されたシステインアミドである。Ｓ−トリチル保護基（システインアミド及びメルカプトプロピオニル残渣上）を除去した後、ジスルフィド結合の形成によって閉環が達成される。前記商業用の方法によって得られる粗製エプチフィバチドは、約８０％の純度を有することが報告されている。２つのカラムクロマトグラフィ−の工程によって、９９％を超える純度に改善される。

エプチフィバチドを大規模に製造するためには、一般に、固相合成より液相合成が適していると見なされている。しかし、大規模な液相工程に対しては、溶解性の問題及び複雑な反応混合物が生成するという課題が存在する。このような複雑な反応混合物のために、例えば生成物の精製がより困難になる。これらの問題を解決するために存在する方法としては、例えば米国特許第４，９５４，６１６号明細書に記載されているように、過シリル化（ｐｅｒｓｉｌｙｌａｔｅｄ）アミノ酸及び相間移動試薬を使用すること、及び大規模なクロマトグラフィーによる精製などが挙げられるが、そのような手段は工程全の費用を増加させることになってしまう。

従って、エプチフィバチドの別の製造方法が必要である。

本発明は、特に、エプチフィバチドの調製方法を提供するものである。本発明の特定の方法は、化学式ＩＩの化合物を提供する工程であって、

ここで、Ｈａｒはホモアルギニルであり、Ｇｌｙはグリシルであり、Ａｓｐはアスパルチルであり、Ｔｒｐはトリプトファニルであり、Ｐｒｏはプロリルであり、Ｃｙｓ−ＮＨ_２はシステインアミドであり、Ｍｐａはメルカプトプロミオン酸であり、さらにＰ_２はカルボキシル保護基である前記化学式ＩＩの化合物を提供する工程と、
ＨａｒとＭｐａ残基とを結合させて化学式ＩＩＩの化合物を形成させるものである前記結合させる工程と、

化学式ＩＩＩの化合物のＡｓｐ残基からＰ_２を除去してエプチフィバチドを形成させるものである前記除去する工程と
を有するものである。

本発明はまた、アミノ末端を保護するホモアルギニン残基をグリシン残基と結合させて以下の化学式の２−３エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程を提供するものである。

さらに、本発明は、保護されたカルボキシル側鎖を有するアスパラギン酸残基をジペプチドのトリプトファニル残基を介してトリプトファニル−プロリルジペプチドに結合させて、以下の化学式の保護された４−６エプチフィバチド断片を形成する前記結合させる工程を提供するものである。

脱保護の後、前記２−３エプチフィバチド断片のＧｌｙ残基の前記４−６エプチフィバチド断片のＡｓｐ残基に対する結合を介して、前記２−３エプチフィバチド断片と前記４−６エプチフィバチド断片とを順番に結合させて、２−６エプチフィバチド断片が形成され、

ここで、Ｈａｒはホモアルギニルであり、Ｇｌｙはグリシルであり、Ａｓｐはアスパルチルであり、Ｔｒｐはトリプトファニルであり、Ｐｒｏはプロリルであり、Ｐ_１はアミノ保護基であり、さらにＰ_２はカルボキシル保護基である。好適な実施形態において、２−６エプチフィバチド断片は、前記２−６エプチフィバチド断片のＰｒｏ残基を通じて活性化システインアミド残基に結合し、それによって前記化学式の２−７エプチフィバチド断片が形成されるものであり、

ここで、ＡＣｙｓ−ＮＨ_２は活性化システインアミド残基である。メルカプトプロピオン酸残基は、メルカプトプロピオン酸残基と前記２−７エプチフィバチド断片のＡＣｙｓ−ＮＨ_２残基との間のジスルフィド結合を介して、前記２−７エプチフィバチド断片に結合させることが可能であり、それによって化学式Ｉの化合物が形成されるものであり、

ここで、Ｍｐａはメルカプトプロピオン酸であり、Ｃｙｓ−ＮＨ_２はシステインアミドである。化学式Ｉの化合物のＨａｒ残渣からＰ_１を除去することにより、化学式ＩＩの化合物が提供され、

前記化合物のＮ末端のＨａｒ及びＣ末端のＭｐａ残渣を結合させることにより、化学式ＩＩＩの化合物が提供されるものであり、

さらにその後、Ａｓｐ残渣からＰ_２を除去することにより、エプチフィバチドが得られる。

本発明はまた、化学式ＩＶの化合物など、記載された前述の方法によって形成される生成物を提供するものであり、

ここで、Ｒ_１は水素またはＰ_１であり、Ｐ_１はアミノ保護基であり、さらにＰ_２はカルボキシル保護基である。本発明の他の代表的な化合物は、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ｏ−Ｐ_４、及びＦｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｐ_５）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを含み、ここでＰ_４及びＰ_５はカルボキシル保護基である。特定の実施形態において、本発明はエプチフィバチドと１％未満の特定の工程不純物とを含む組成物を提供するものである。本発明はまた、エプチフィバチドの精製方法を提供するものである。

一つの観点において、本発明は、２−３エプチフィバチド断片の調製と、４−６エプチフィバチド断片の調製と、２−６エプチフィバチド断片を形成するための２−３及び４−６エプチフィバチド断片の結合とを含むエプチフィバチドを調製するための収束方法を提供するものである。これらの方法の一部においては、２−６エプチフィバチド断片を活性化システインアミド残基に結合させて２−７エプチフィバチド断片を形成する前記結合工程と、メルカプトプロピオン酸と２−７エプチフィバチド断片間のジスルフィド結合を形成させて先駆物質Ａを形成する前記結合工程と、先駆物質Ａの分子内ペプチド結合をもたらす工程と、前記結合生成物から保護基を除去してエプチフィバチドを形成する前記除去する工程とを含む。

更なる実施形態において、本発明は、本願明細書において記載されたエプチフィバチドの調製方法によって生産される生成物に関するものである。別の実施形態において、本発明は、エプチフィバチドを調製するために中間体として使用され得る新規化合物に関するものである。更なる実施形態において、本発明は、エプチフィバチドの構造類似化合物に関するものである。更なる実施形態において、本発明はまた、エプチフィバチドの精製方法を提供するものである。

本願明細書において使用される「カルボキシル保護基」という用語は、選択的に結合及びカルボキシル基から除去することが可能である部分を指し、所望の反応上においては容認不可能な悪影響を与えることなく、前記部分が不要な化学反応に関与するのを防ぐためのものである。カルボキシル保護基の例には、例えば特にメチル、エチル、ｔ−ブチル非置換ベンジル、及びシリルエステルなどのエステルなどが含まれる。他のカルボキシル保護基は当業者に周知であり、さらにＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．から出版されているＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９において詳述されている。

本願明細書において使用される「アミノ保護基」という用語は、窒素原子に対して選択的に結合及び除去することが可能である部分を指し、所望の反応上受け入れ難い悪影響を与えることなく、前記部分が不要な化学反応に関与するのを防ぐためのものである。アミノ保護基の例には、例えば特にＢｏｃ、Ｃｂｚ、Ｆｍｏｃ、ａｌｌｏｃ、メチル、及びウレタンなどのカルバミン酸エステル；フタルイミドなどの環状イミド誘導体；ホルミル、（非）置換アセチル、及びベンゾイルなどのアミド；及びｔ−ブチルジメチルシリル及びトリイソプロピルシリなどのトリアルキルシリル基などが含まれる。他のアミノ保護基は当技術分野で周知であり、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．において詳細に記載されている。

本願明細書において使用される「カップリング」及びその変化した用語は、任意の方法による結合部分間におけるアミド結合の形成を言及する。

本願明細書において使用される「付着する（ａｔｔａｃｈｉｎｇ）」及びその変化した用語は、結合部分間においてアミドまたはジスルフィド結合を形成するために使用される任意の手段によるアミドまたはジスルフィド結合の形成を言及する。

本願明細書において使用される「活性化システインアミド残基」という用語は、メルカプトプロピオン酸を用いてジスルフィド結合を形成すること可能なシステインアミド残基を言及する。

本願明細書において使用される「Ｇｌｙ−エプチフィバチド」という用語は、構造的にエプチフィバチドに関連するが、単一のグリシン残基よりむしろ２つの隣接したグリシン残基を含む化合物を言及する。

本願明細書において指される全てのアミノ酸残基は、Ｌ−立体配置を有する天然アミノ酸である。

エプチフィバチドは、以下の化学構造を有する。

エプチフィバチドは、また、以下のようにアミノ酸記号を用いて表すことが可能であり、

前記アミノ酸記号は以下に示した化学の図面に相当する。

記述を容易にするために、前記残基はまた、（１）から（７）の番号をつけることが可能である。残基（１）はメルカプトプロピオン酸であり、（２）はホモアルギニル（Ｈａｒ）であり、（３）はグリシル（Ｇｌｙ）であり、（４）はアスパルチル（Ａｓｐ）であり、（５）はトリプトファニル（Ｔｒｐ）であり、（６）はプロリル（Ｐｒｏ）であり、（７）はシステインアミド（システイン−ＮＨ_２）である。

特定の実施形態において、本発明はエプチフィバチドを調製するための収束性方法に関する。第１の配列工程において、アミノ酸（２）及び（３）を含む２−３エプチフィバチドのフラグメントが調製される。第２の配列において、アミノ酸（４）、（５）、及び（６）を含む４−６エプチフィバチド断片が調製される。その後２つのフラグメントが連結され、ペンタペプチドである単一の２−６フラグメントが提供される。エプチフィバチドの２−６断片は、Ｈａｒ残基のＮ末端及びアスパルチル側鎖カルボキシル基で保護されている。スキーム１は、２−６エプチフィバチド断片の調製のための典型的な方法を概説したものである。

スキーム１の配列Ａは２−３エプチフィバチド断片の調整を示しており、配列Ｂは４−６エプチフィバチド断片の調製を示している。２つの配列は、エプチフィバチドの２−６断片を提供するために互いに合流する。スキーム１は典型的なアミノ酸保護基を示しているが、他の周知のアミノ酸保護基が使用可能であることがペプチド合成の当業者によって認められる。Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基の代わりに、例えばＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）、ＲＣｂｚ（芳香環が置換されたベンジルオキシカルボニル基）、９（２−スルホ）フルオロエニルメチルカルバミン酸塩、９（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバミン酸塩、２−クロロ−３−インデニルメチルカルバミン酸塩、ベンズ［ｆ］インデン−３−イルメチルカルバミン酸塩、またはＡｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）基などのカルバミン酸エステル保護基が使用可能である。

アスパラギン酸残基上のｔ−ブチルエステルは、例えばＯＤｐｍ（ジフェニルメチル・エステル）など酸処理によって切断可能な他の任意の保護基、または例えばＯＢｚｌ（ベンジルエステル）など水素化分解によって切断可能な保護基に置き換えることが可能である。

スキーム１の配列Ａにおいて表されるエプチフィバチド断片のＦｍｏｃ−Ｈａｒ部分はＲ_ＮＰ１−Ｈａｒに置き換えることが可能であり、ここで前記Ｒ_ＮＰ１は、例えばＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）基、ＲＣｂｚ（芳香環が置換されたベンジルオキシカルボニル）基、またはＡｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）基などのアミノ保護基である。同様に、配列Ｂにおいて表されるエプチフィバチド断片のＺ−Ａｓｐ（またはＣｂｚ−Ａｓｐ）部分はＲＮＰ２−Ａｓｐと置き換えることが可能であり、ここで、ＲＮＰ２は例えばＦｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニルなど塩基性状態下で切断可能なアミノ保護基であるか、或いはＲＮＰ２は例えばＲＣｂｚ（置換された芳香環を有するベンジロキシカルボニル保護基）基など水素化分解によって切断可能なアミノ保護基である。更に、スキーム１において表されるＯｔＢｕ基はＲＣＰと置き換えることが可能であり、ここでＲＣＰは例えばＯＤｐｍ（ジフェニルメチルエステル）基など酸処理によって切断可能なカルボキシル保護基である。Ｐｆｐ（ペンタフルオロフェニル）はカルボキシル活性化基であるＲＬ１と置き換えることが可能であり、更にＳｕ（スクシンイミド）はカルボキシル活性化基であるＲＬ２と置き換えることが可能である。前記各断片の性質おいて、Ｐｆｐ及びＳｕの両方は、例えばモノ及びジニトロフェニルエステル、トリ及びペンタフェニルエステルなどの他の安定な活性化エステルに置き換えられることが可能である。特定の保護基の選択は、同じ化合物に存在する別の保護基との一致性に依存することが当業者によって認められる。本発明の特定の実施形態において、特定の保護基は、他保護基に影響を及ぼさない反応条件下においてその保護基が選択的に除去され得るように選択される。

本発明の特定の実施例において、保護された２−６エプチフィバチド断片は、次に、例えば３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル−システインアミド（Ｈ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＮＨ_２）；Ｎｐｓ（２−ニトロ−フェニルスルフェニル）；フェニル環が置換されたＳ−フェニルチオシステインアミド；Ｓ−アルキルチオシステインアミド；またはシステインアミドのＳ−スルホナート及びＳ−スルフェニルチオカルバミン酸塩などの「活性化」システインアミド（７）と結合し、エプチフィバチドの２−７ヘキサペプチド断片を形成する。残りのエプチフィバチド残基は、メルカプトプロピオン酸またはＭｐａ−ＯＨ（１）である。１及び２−７断片間のジスルフィド結合を形成する状態下において、Ｍｐａ−ＯＨが２−７ヘキサペプチド断片に付着させられる。この結果から得られるジスルフィド部分は、本願明細書においては前駆体Ａとして示されており、エプチフィバチドを作るために重要で且つ新しい先駆物質である。前記前駆体Ａの構造を以下に示す：

ここでＰ_１はアミノ保護基であり、Ｐ_２はカルボキシル保護基である。前記Ｐ_２基は前記Ｐ_１基の除去に適した状態下において安定していることが好ましい。前記基のうちの１つだけを選択的に除去することが可能である互換性を持ったＰ_１及びＰ_２基の選択は、当業者に周知である。互換性を有する保護基対の例は、基本的な状態下で除去されるＰ_１＝Ｆｍｏｃ、及び同じ状態の下で安定なＰ_２＝ｔ−ブチルである。

スキーム２は、前駆体Ａの調製のための典型的な方法を概説したものである。

スキーム１のように、スキーム２に示されるＦｍｏｃ及びｔ−ブチル基は、一般にペプチド合成に有用であると認められる他の周知の保護基と置き換えることができる。

本発明の特定の実施形態において、前駆体ＡからのＰ_１保護基を除去することによって、エプチフィバチドの前記２−７−１部分である別の前駆体Ｂが提供される。

分子内ペプチドカップリングを経て、先駆物質Ｂは前駆体Ｃに変換される。

分子内ペプチドカップリングは、これらに限定されないが例えばＯ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＯＴＵ）、ＨＢＴＵ、またはＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムヘキサフルオロホスフェイト、及びそれぞれテトラフルオロホウ酸塩）などのウロニウム型カップリング試薬；これらに限定されないが、例えばＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、またはＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）などのカルボジイミド型試薬；活性化エステル；または例えばＢｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イロキシ−トリ（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト）またはＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イロキシ−トリ（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト）などのホスホニウム型カップリング試薬など適切なカップリング試薬がある場合には、有機溶媒中で達成され得る。ペプチドカップリングは、例えばＨｕｍｐｈｒｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，２２４３−２２６６に記載されており、これはこの参照により本願明細書に完全に組み込まれるものとする。

前駆体ＣからＰ_２保護基を除去することにより、エプチフィバチドが提供される。前記Ｐ_２の除去は、酸、塩基、または保護基が不安定となる他の任意の試薬または試薬系の存在下において、有機溶媒中などにおいて達成され得る。スキーム３は、前駆体Ａからエプチフィバチドの調製するための典型的な方法を概説したものである。

Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、２−７−１断片は、分子内ペプチドカップリングによって、エプチフィバチドのｔ−ブチルエステルが提供される。アスパラギン酸残基からｔ−ブチル基を除去することにより、エプチフィバチドが得られる。

特定の実施形態において、本発明は、構造的にあるエプチフィバチドに類似した化合物、及びエプチフィバチドを調製するために上述した方法に類似した方法に従って調製した化合物に関する。例えば、そのような化合物は、エプチフィバチドに記載したような単一のグリシン残基よりむしろ２つの隣接したグリシン残基を含むＧｌｙ−エプチフィバチドを含む。

Ｇｌｙ−エプチフィバチドは、例えばエプチフィバチドの調製のために上述した方法によって調製され得る。但し、グリシンがホモアルギニンに結合して断片を形成するよりむしろ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドがホモアルギニンに結合して２−３エプチフィバチド断片に相当するものを形成する場合を除く。例えば、この改良方法によれば、スキーム１に示されるＨ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ（３）基は、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯｔＢｕと置き換えられる。

エプチフィバチドを調製するために上述した方法に従ってエプチフィバチドを調製している間、本発明の一部の実施形態においては、Ｇｌｙ−エプチフィバチドが生じる。本発明の特定の実施形態は、エプチフィバチドとＧｌｙ−エプチフィバチドとを有する組成物に関し、少なくとも９９％のエプチフィバチドと約０．０１％〜約１％の範囲のＧｌｙ−エプチフィバチドとを有する組成物、及び少なくとも９９％のエプチフィバチドと約０．０１％〜約０．１％の範囲のＧｌｙ−エプチフィバチドとを有する組成物を含むものである。

本発明はまた、エプチフィバチドの精製方法を提供するものであり、例えば、エプチフィバチド水溶液をシリカが結合したオクタデシル炭素連鎖などを含む固定相に接触させる工程と、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液を有するエプチフィバチド水溶液と接触させた前記固定相を洗浄する工程と、選択的に酢酸／アセトニトリル溶液を有するエプチフィバチド水溶液と接触させた前記固定相を洗浄する工程と、アンモニウム酸／アセトニトリル溶液を有するエプチフィバチド水溶液と接触させた固定相を洗浄する工程とを含む。逆固定相は当業者に周知であり、そのような相の他のものはシリカを基盤としたオクタデシル炭素と置換すること可能である。

本発明の特定の実施形態において、エプチフィバチド水溶液と接触した固定相は、９５％の０．１％トリフルオロ酢酸水溶液及び５％のアセトニトリル溶液の初期濃度、及び５０％の０．１％トリフルオロ酢酸水溶液及び５０％のアセトニトリル溶液の最終濃度を有するグラジエントで洗浄される。

本発明は、エプチフィバチド水溶液と接触した固定相が、９５％の０．５％酢酸水溶液及び５％アセトニトリル溶液の初期濃度、及び５０％の０．５％酢酸水溶液及び５０％のアセトニトリル溶液の最終濃度を有するグラジエントによって洗浄される更なる実施形態を提供するものである。一部の実施形態において、前記固定相は、のトリフルオロ酢酸／アセトニトリルのグラジエントを用いた１若しくはそれ以上の洗浄の後、酢酸／アセトニトリルグラジエントで洗浄される。

本発明はまた、アンモニウム酸／アセトニトリル溶液が、９５％の１００ｍＭアンモニウム酸水溶液と５％のアセトニトリル溶液とを有する水溶液である実施形態を提供するものである。本発明の特定の観点において、前記固定相は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリルグラジエントおよび／または酢酸／アセトニトリルグラジエントによる洗浄の後、アンモニウム酸／アセトニトリル溶液によって洗浄されるものである。

前記記載方法で生じるアミノ酸残基のカップリングは、当業者に知られたペプチド合成の既知の方法によって達成され得るものである。ペプチドを形成するための任意の適切なカップリング方法が使用可能である。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を図示したものであり、本発明の範囲を限定するものとして考慮されるべきではない。

Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの調製
Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨは、例えばＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９７９），Ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．１（ｅｄ．Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ），Ｃｈａｐｔｅｒ３において記載されているように、市販のＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ及びＨ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを出発とした周知の方法によって得た。Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎはこの参照によりその全体が本願明細書に組み込まれるものである。

Ｈ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの調製
約２０℃の温度において、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ、１．２Ｌ）で満たした２リットルの反応装置に、約２０℃の温度を維持しながら０．３００ｋｇの出発物質Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを添加した。Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨを溶解させた後、前記反応混合物をパージし、窒素雰囲気下にした。炭素上のパラジウム（５重量％）（０．０１５ｋｇ）を前記反応混合物に添加し、前記反応混合物を約２０℃で維持しながら、２バール圧力下で水素化した。

２時間後、以後１時間毎に、前記反応物からの検体をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳｔａｒＣ１８ ５５＊４ｍｍカラムにおいて、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリル溶媒混合物を用いて、水／アセトニトリルの１０分間９８：２から２：９８へのグラジエントで実施した。ＨＰＬＣは、検出２１５ｎｍ、流速２．０のｍｌ／ｍｉｎ、さらに温度４０℃であった。

ＨＰＬＣ分析おいて、前記出発物質が生成物面積パーセントに対して０．２％以下を示した時に前記反応が完結したものと考慮した。ＨＰＬＣによって前記反応が完結したことが示されたときに、ｐ−トルエンスルホン酸水溶液（０．１５０Ｌの水中０．０９４ｋｇのｐ−ＴｓＯＨ）を前記反応混合物に添加した。その後前記反応混合物は、ＤＭＡＣ（０．６Ｌで３回洗浄したＣｅｌｉｔｅ（登録商標））で前もって洗浄したＣｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾過した。反応混合物を濾過した後、フィルターケーキ（ｆｉｌｔｅｒ ｃａｋｅ）を新しいＤＭＡＣ（０．３Ｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、ＨＰＬＣ分析を行い、フィルターケーキ中に生成物が残っていないことを確認した。

約２０℃において混合濾液を新しい容器に移し、同じ温度でＮ−エチルモルホリン（０．０６６Ｌ）を添加した。前記添加の間、温度を約２２℃以下に維持した。その後前記混合物を約８〜１２℃に冷却し、温度を約１５℃以下に維持しながら水（３Ｌ）をゆっくり添加した。その後、前記混合物を８〜１２℃で約３０分間撹拌し、８時間のその温度で保持した。この間に生成物が水溶液から結晶化した。更なる冷却が必要であるか否かに関わらず、上清をＨＰＬＣで分析することにより、水溶液中に残った生成物量を決定することが可能である。得られたスラリーを濾過し、収集した固体を２：１の水：ＤＭＡＣ溶液で２回（各０．９Ｌ）洗浄した。その後、前記固体をアセトニトリルで２回（各０．９Ｌ）洗浄し、約２５℃の減圧下で一定重量になるまで乾燥した。乾燥後の含水量は３．５％であった（Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｈｅｒ分析）。

前記生成物はトリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣで分析した。

ＬＣ／ＭＳ分析によって、Ｈ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの質量［Ｍ＋Ｈ］４７３．０を確認した。

回収率は９３．２％（０．２１８ｋｇ）であり、純収率（ｎｅｔ ｙｉｅｌｄ）は、９３．１％であった（窒素含有量に基づき９５．４％）。

Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの調製
ＴＨＦ：ＤＭＡＣ（それぞれ０．７１７Ｌ及び０．１７９Ｌ）中、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨのスラリーに（純量０．１６３ｋｇ：ペプチド含有量に基づき９０．５％）、メタンスルホン酸（０．０２７Ｌ）及びペンタフルオロフェノール（０．０８３ｋｇ）を添加した。固体が溶けるまで前記混合物を２０℃で撹拌した。Ｎ−エチルモルホリン（ＮＥＭ）（０．０３０Ｌ）を滴下して加えた後、ＴＨＦ（０．１７９Ｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．０７２ｋｇ）を滴下して加え、混合物を約２０℃で撹拌した。Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐを形成した後、ＨＰＬＣアッセイを行った。約１７時間後、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ／Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ ＯＰｆｐの比は１．５／９８．５であった。

前記反応混合物にＨ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．１４６ｋｇ、約３．５ｗ／ｗ％ Ｈ_２Ｏ）及びＮＥＭ（０．０４９Ｌ）を添加した。前記混合物を約２０℃で３時間撹拌した。この時のＨＰＬＣ分析によって、前記混合物が約８７％の生成物、<２％ Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、６％のＦｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ、約０．５％のＨ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（「ｄ．ａ．不純物」）と確認された不純物を約５．５％含むことが示された。ＨＰＬＣ分析は、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｔａｒ Ｃ１８ ５５＊４ｍｍカラムにおいて、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含む水／アセトニトリル溶媒混合物を用いて、水／アセトニトリルを１０分間で９８：２から２：９８のグラジエントによって実施した。ＨＰＬＣ検出は２１５ｎｍ、流速は２．０ｍｌ／分、及び温度は４０℃であった。

前記反応混合物を濾過し、固体をＴＨＦ／ＤＭＡＣの５／１混合物で２回（２×０．４８９Ｌ）洗浄した。濾液を３５℃、減圧下（約２０ｍＢａｒ）において、約０．８１５Ｌに濃縮した。炭酸水素ナトリウム（０．０５９ｋｇ）を含むアセトニトリル／Ｈ_２Ｏ（４．１Ｌ）の１／４混合物に、前記濃縮混合物を１時間以上かけてゆっくり加えた。添加速度を注意深く制御することにより、粘着性の沈殿物の形成を避けた。前記溶液の約３．５％を約１５分以上かけて加え、前記添加を中断して約２０℃で１時間スラリーを撹拌した。糊のような沈殿物が白色スラリーに変わった。前記溶液の７．５超過％を１５〜３０分以上かけて加え、前記添加を再び中断して約２０℃で２時間スラリーを撹拌した。残った８９％の溶液は、約２時間以上かけて添加した。前記混合物は約２０℃で１２時間撹拌した後、濾過した。前記固体をアセトニトリル／Ｈ_２Ｏの１／４混合物（３×０．７Ｌ）、アセトニトリル／ジ−イソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）の２／３混合物（３×０．７Ｌ）及びＤＩＰＥ（２×０．７Ｌ）で洗浄した。前記固体生成物をＴ≦３０℃で一定重量になるまで乾燥した。乾燥後の含水量は３．３％であった（Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｈｅｒ分析）。
前記生成物は、水のトリフルオロ酢酸／アセトニトリルグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣによって分析した。

ＬＣ／ＭＳ分析によって、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨの質量［Ｍ＋Ｈ］９２２．５が確認された。

回収率は８１．８％（０．２３４ｋｇ）であり、純収率は８２．３％であった（窒素含有量に基づくと９６．０％）。

Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＮＨ_２の調製
Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．２２５ｋｇ）を、２０℃においてペプチド合成グレードのＤＭＦ（０．６７５Ｌ）で満たした反応装置に添加した。前記混合物を約０℃に冷却し、Ｈ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＮＨ_２を固体塩酸塩（０．０８０ｋｇ）として加えた。Ｏ−ベンゾトリアゾール１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）（０．０８２ｋｇ）を前記反応混合物に添加した。約０℃に温度を維持しながら、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１１２Ｌ）を滴下して加えることによって、前記反応混合物のｐＨを７．０まで６．５に合わせた。前記温度において前記混合物を撹拌し、この間、約４５分毎に検体における生成物の形成をＨＰＬＣで分析した。前記反応混合物のｐＨは、必要に応じてＤＩＰＥＡを添加してｐＨ６．５〜７．０に維持した。ＨＰＬＣ分析は、プラチナＥＰＳ １００−５ Ｃ１８ ５μ ２５０＊４．６ｍｍカラム；溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ；グラジエント：Ｂを１５分後に１２から９８％において実施した。ＨＰＬＣ検出は２１５ｎｍ、流速は２．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度は４０℃であった。ペンタペプチド及びＣｙｓ（ＮＰｙｓ）−ＮＨ_２出発物質がそれぞれＨＰＬＣにおいて１％未満を示すときに、前記反応は完結したとみなした。さもなければ、更なるＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、及び前記混合物において不足していることを示す出発物質を加えた。

前記反応混合物を約５℃の温度で水（４．５Ｌ）を含む別の容器に添加した。前記添加物を撹拌している間、この温度は維持した。約５℃で１０分間の撹拌の後、前記混合物を濾過し、更に前記固体を水で５回（各０．９Ｌ）洗浄した。その後、前記固体をトルエン（各０．６７５Ｌ）で３回洗浄した。トルエンによる洗浄液は、ジイソプロピルエーテルによる洗浄と置き換えることが可能である。前記固体は、減圧下３５℃以下の温度で一定重量になるまで乾燥した。乾燥後の含水量は１．２％（Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｈｅｒ分析）であった。

前記生成物は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを用いた逆相ＨＰＬＣで分析した。

ＬＣ／ＭＳ解析によって、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）ＮＨ_２の質量［Ｍ＋Ｈ］１１７８．４を確認した。

回収率は１０２．４％（０．２９５ｋｇ）であり純収率は８７．７％であった（ペプチド含有量に基づくと８２．０％）。

Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａ（Ｆｍｏｃ［２−７−１］）の調製
ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（０．５７０Ｌ）及びペプチド合成グレードＤＭＦ（０．２８５Ｌ）によって満たされた反応装置中、約２０℃の窒素雰囲気下において、０．２８５ｋｇのＦｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＰｙｓ）ＮＨ_２（Ｆｍｏｃ［２−７］）をゆっくり攪拌して加えた。Ｆｍｏｃ［２−７］の溶解後、前記混合物を約−３℃に冷却した。２０℃で調製したアセトニトリル（０．０５７Ｌ）中のメルカプトプロピオン酸水溶液（Ｍｐａ，０．０２３ｋｇ）を反応温度が約−３℃に維持できる速度で前記反応混合物に添加した。前記反応はＨＰＬＣ分析で観察し、この分析において、Ｆｍｏｃ［２−７−１］と比較してＦｍｏｃ［２−７］が１％未満を示した場合に反応が完了したと考慮した。ＨＰＬＣ分析は、Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｔａｒ Ｃ１８ ５５＊４ ｍｍカラムにおいて、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含む水／アセトニトリル溶媒混合物を用いて、水／アセトニトリルを１０分間で９８：２から２：９８のグラジエントで実施した。ＨＰＬＣ検出は２１５ｎｍ、流速は２．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度は４０℃であった。

前記反応混合物は、約２０℃において、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（５．７Ｌ）及びＮ−エチルモルホリニウム（ＮＥＭ、０．０３３Ｌ）で満たした第２の容器に加えた。前記添加が完了した後、前記反応物をその温度で約３０分撹拌した。前記スラリーは約０℃にゆっくり冷却し、その温度で約４５分間撹拌し続けた。以下の方法はその後３回実施した：（ａ）攪拌を停止し、沈殿物と上清を分離した；（ｂ）前記上清をポンプで容器から取り除き；（ｃ）０℃において新しいＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（１．４２５Ｌ）を前記反応装置に添加し、攪拌を再開した；（ｄ）前記スラリーを約０℃で５分間撹拌した。残留スラリーを濾過し、固体をＨＰＬＣグレードのアセトニトリルで２回（各１．１４０Ｌ）、及びトルエン（１．４２５Ｌ）で１回洗浄した。トルエンを用いた前記洗浄液は、ジイソプロピルエーテルを用いた洗浄液と置き換えることが可能である。前記固体を２０℃以下高真空下で乾燥した。

前記生成物はトリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣで分析した。

ＬＣ／ＭＳ解析によって、Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａの質量［Ｍ＋Ｈ］１１２８．４を確認した。

回収率は９３．８％（０．２５６ｋｇ）、純収率は定量的であった（ペプチド含有量に基づくと８７．４％）。

Ｈ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａの調製（［２−７−１］）
ペプチド合成グレードＤＭＦ（０．７５０Ｌ）で満たした反応装置に、約２０℃において、０．２５０ｋｇのＦｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａ（Ｆｍｏｃ［２−７−１］）をゆっくり攪拌して加えた。前記混合物を１０℃まで冷却し、この温度でジエチルアミン（０．０３４Ｌ）を加えた。ジエチルアミンの添加後、前記混合物温度を約２０℃に上げた。前記反応の進行は、毎時採取される検体をＨＰＬＣ分析することによって観察した。ＨＰＬＣ分析は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＰＳ １００−５ Ｃ１８ ５μ ２５０＊４．６ ｍｍカラムにおいて実施した；溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ；グラジエント：１５分後Ｂを２２から９８％。ＨＰＬＣ検出は２１５ｎｍ、流速は２．０ｍｌ／ｍｉｎ、温度は４０℃であった。前記反応は、Ｆｍｏｃ［２−７−１］のパーセントが［２−７−１］に対して約０．５％未満である場合に完結したと考慮した。前記反応は通常３時間後に完了した。

前記反応混合物を酢酸エチル（５．０Ｌ）で満たした第２の容器に添加し、約１０℃に冷却した。結果として生じる懸濁液を約１０℃で１０分間撹拌した。その後以下の方法を２回行った：（ａ）前記攪拌を停止し、約１５分間、沈殿物を上清から分離した；（ｂ）ポンプを用いて上清を容器から取り除いた；（ｃ）新鮮なエチルアセテート（０．７５０Ｌ）を約１０℃で加えた；（ｃ）懸濁液を約１０℃で約５分間撹拌した。前記スラリーを濾過し、この固体をエチルアセテートで６回（毎回０．７５０Ｌ）洗浄した。エチルアセテート残渣を除去するために、ジイソプロピルエーテルによる更なる洗浄を行っても良い。前記固体は２５℃以下で最高１８時間、高真空下で乾燥した。

前記生成物は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣによって分析した。

ＬＣ／ＭＳ解析によって、Ｈ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａの質量［Ｍ＋Ｈ］９０６．３を確認した。

ＧＣ解析によって３．４％の残存ジエチルアミンが示された。

回収率は１０６．１％（０．２１３ｋｇ）であり、純収率は９９．２％であった（ペプチド含有量に基づくと８１．９％）。

［ＭＰＡ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］（ＮＨ_２）（ｃｙｃｌｏ−［１−７］（ＯｔＢｕ）−ＮＨ_２）の調製
反応装置をペプチド合成グレードのＤＭＦ（０．７６８Ｌ）で満たし、この溶液を約１０℃に冷却した。Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチルエナミノール］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＯＴＵ）（０．０７０ｋｇ）を加え、その後１５℃に温度を維持しながらペプチド合成グレードのジクロロメタン（１．５３６Ｌ）で希釈した。得られた水溶液を約−６０℃に冷却し、温度を−６０℃に維持しながらＮＥＭ（０．０２４Ｌ）を少しずつ添加した。ＮＥＭの添加の前後でｐＨを測定した。ＨＰＬＣ分析のために検体を採取した。

ＨＰＬＣ分析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム，５μｍ，１５０＊４．６ｍｍで行い、１５分後にＢを１２から９８％にグラジエントした。溶媒Ａ：水中０．１％のＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ。検出は２１５ｎｍ、流速は２ｍｌ／ｍｉｎ、温度は４０℃であった。

別の反応装置を約２０℃においてペプチド合成グレードのＤＭＦ（０．７６８Ｌ）で満たした後、０．１９２ｋｇのＨ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（ＮＨ_２）−Ｍｐａ（［２−７−１］）で満たした。固体が溶けた時に得られた水溶液を約０℃に冷却した。ＨＯＢｔ（０．０２６ｋｇ）を少しずつ（ＨＯＢｔの重量は純度補正した）に添加した。得られた水溶液をペプチド合成グレードのジクロロメタン（０．３８４Ｌ）で希釈した。ＨＰＬＣ解析のために検体を採取した。

温度を−６０℃に維持しながら、付加ポンプを使用して前記［２−７−１］の水溶液を非常にゆっくり最低３時間かけてＴＯＴＵ水溶液に添加した。前記［２−７−１］水溶液を５０％添加した後、ＨＰＬＣ分析のために検体を採取した。この時点でｐＨも測定した。ＨＰＬＣ及びｐＨのサンプリングはまた、［２−７−１］の添加が完了したときにも採取した。温度を−６０℃に維持しながら、必要に応じてＮＥＭを添加することによって前記ｐＨを７〜７．５に合わせた。

温度を−６０℃に維持しながら、前記ｐＨを１５分毎に点検し、必要に応じてＮＥＭを用いて７〜７．５に合わせた。環化が完了するまで４５分毎にＨＰＬＣのためにサンプリングした。環化生成物に対する［２−７−１］の面積パーセントが<０．５％となった時に反応が完了したとみなした。

反応が失速した場合、［２−７−１］の残渣に対して１．１当量のＴＯＴＵを添加し、温度を−６０℃に維持しながら、必要に応じてｐＨを７〜７．５に合わせた。

反応が完了したとき、<４０℃の減圧下において、前記混合物を約０．８Ｌの最終容積に濃縮した。得られた粘着性の水溶液を約５℃に冷却し、速く撹拌した約０℃の酢酸エチル（７．０Ｌ）にゆっくり加えた。得られたスラリーを約０℃で２０分間撹拌した。その後以下の方法を３回行った：（ａ）前記攪拌を停止し、沈殿物と上清とを分離した；（ｂ）上清を容器からポンプで取り除いた；（ｃ）約０℃において、新鮮な酢酸エチル（１．１５Ｌ）を反応装置に添加し、攪拌を再開した；（ｄ）前記スラリーを約０℃で約２０分撹拌した。上記方法を最後に実施した時、小容量の酢酸エチル（０．７６８Ｌ）を前記反応物に添加し、０℃で１０分間の攪拌を再開した。得られたスラリーを濾過し、この固体を酢酸エチル（０．５７６Ｌ）で１回、さらにジイソプロピルエーテル（０．５７６Ｌ）で３回洗浄した。前記固体を約２０℃の高真空下で乾燥した。

前記生成物は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣで分析した。

ＬＣ／ＭＳ解析によって、（ｃｙｃｌｏ−［１−７］（ＯｔＢｕ）−ＮＨ_２）の質量［Ｍ＋Ｈ］８８８．２が確認された。

回収率は１０３．７％（０．１９４ｋｇ）であり；純収率は定量的であった（ペプチド含有量に基づくと７９．７％）。

［ＭＰＡ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］（ＮＨ_２）（ｃｙｃｌｏ−［１−７］−ＮＨ_２）の調製
ジクロロメタン（０．５７３Ｌ）、アニソール（０．０８６Ｌ）、及びＴＦＡ（０．１２２Ｌ）の混合物を約２０℃で調製した。得られた水溶液を１５℃に冷却し、［１−７］（ＯｔＢｕ）−ＮＨ_２（０．１９１ｋｇ）の固体をゆっくり加えた。前記［１−７］（ＯｔＢｕ）−ＮＨ_２の添加の間、温度を２０℃に維持した。前記反応混合物を更に１０℃に冷却し、約１０分後に過剰部分のＴＦＡ（０．３６５Ｌ）を添加した。前記添加の間、温度を２０℃以下に保持した。全てのＴＦＡを添加した後、反応物を２０℃で撹拌し、その後ＨＰＬＣを行った。

ＨＰＬＣ分析は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＥＰＳ １００−５ Ｃ１８カラム２５０＊４．６ｍｍにおいて実施した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液であり、グラジエントは１５分後にＢを２２から９８％することによって行った。検出は２１５ｎｍ、流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎ、及び温度は４０℃であった。生成物に対して残存［１−７］（ＯｔＢｕ）−ＮＨ_２が<３．０面積％であるとき、前記反応が完了した。

前記反応が完了したとき、この混合物を１０℃に冷却し、１０℃において２／１ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）／アセトニトリル（３．７８Ｌ）の水溶液に添加した。得られたスラリーを１０℃で１０分間撹拌し、その後減圧下で濾過した。前記固体を、ＤＩＰＥ及びアセトニトリルの７／３混合物（０．５７３Ｌ）で３回、更にＤＩＰＥ（０．５７３Ｌ）で３回洗浄した。この生成物を２５℃以下で乾燥した。

前記生成物は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル水溶液のグラジエントを使用した逆相ＨＰＬＣによって分析した。

ＬＣ／ＭＳ解析によって、（シクロ−［１−７］−ＮＨ_２）の質量［Ｍ＋Ｈ］８３２．３が確認された。

回収率は０．１５７ｋｇ（８７．９％）であり、純収率は８７．２％であった（ペプチド含有量に基づくと７９．１％）。

純粋なＡＰＩの含有量は４５．８％であった。この値は以下のＨＰＬＣ方法によって得られた：Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ ４μｍ ８０Ａ ２５０＊４．６ｍｍ；溶媒Ａ：５２ｍＭのＨ_３ＰＯ_４／ＣＨ_３ＣＮ／１００ｍＭのＨ７ＳＡ（８６／１４／０．８０）；溶媒Ｂ：５２ｍＭのＨ_３ＰＯ_４／ＣＨ_３ＣＮ／１００ｍＭのＨ７ＳＡ（５０／５０／０．８０）；２２０ｎｍ；１．３ｍｌ／ｍｉｎ；５０℃；グラジエント：４５分以上０％Ｂの後、１３分にわたってＢを４５％にした後、１分にわたってＢを１００％にした。

エプチフィバチドの精製
一次精製
一次精製は、トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに基づく精製で行った。個々の主要フラクションに対して適用される基準は≧９２．０％にした。固定相は、５ｃｍの直径を有するＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８，１０μｍ，１００Ａカラムを用いた。カラム圧力は５０バール、流速は５０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長は２１５ナノメートルとした。移動相は以下のように行った：
溶媒Ａ：処理水（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｗａｔｅｒ）中０．１％のＴＦＡ／ＣＨ_３ＣＮ（９５／５）；及び
溶媒Ｂ：処理水中０．１％のＴＦＡ／ＣＨ_３ＣＮ（５０／５０）。

前記カラムは、１５分にわたって１００％溶媒Ａで溶出することよって平衡させた。精製グラジエントは以下のように行った：１０分にわたり１００％溶媒Ａの溶出；グラジエント：６０分にわたりＢを１５％から４５％；及び１５分にわたり１００％溶媒Ｂの溶出。

精製はＭＡＤ−００９−ＳＦ３２３ＴＧ１方法を使用して観察し、標的受入れ基準は次の通りであった：
主要フラクション（Ｆ１）：≧９２％；及び
側面フラクション（ｆｐ）：≧６０％及び<９２％。
収集したフラクションは、２℃〜８℃で保存した。

二次性精製
二次精製は、酢酸／アセトニトリルに基づく精製で行った。個々の主要フラクションの基準は９９％であり、単一不純物は<０．３／０．５％であった。固定相は、５ｃｍの直径を有するＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８，１０μｍ，１００Ａカラムで行った。カラム圧力は４０±５バール、流速は５０ｍｌ／ｍｉｎ、検出は波長２１５ｎｍであった。移動相は以下のように行った：
溶媒Ａ：処理水中０．５％のＡｃＯＨ／ＣＨ_３ＣＮ（９５／５）；及び
溶媒Ｂ：処理水中０．５％のＡｃＯＨ／ＣＨ_３ＣＮ（５０／５０）。

前記カラムは、１５分にわたる１００％溶媒Ａの溶出によって平衡化した。精製グラジエントは次の通りであった：１０分にわたって溶媒Ａを１００％溶出；グラジエント：５分にわたって溶媒Ｂを１５％から０％；６０分にわたって溶媒Ｂを１５％から３５％；及び１５分にわたって溶媒Ｂを１００％溶出。

前記精製はＭＡＤ−００９−ＳＦ３２３ＴＧ１方法を使用して観察し、標的受入れ基準は以下のように行った：
主要フラクション（Ｆ１）：≧９９．０％不純物<０．３／０．５％；及び
サイドフラクション（ｆｐ）：>８０．０％及び<９９．０％。
収集フラクションは、２℃〜８℃で保存した。

脱塩／濃縮：
酢酸アンモニウム水溶液の二重脱塩工程は、残存性のトリフルオロアセテート対イオンを除去するため及びペプチドのアセテート型を得るために、濃縮工程の前に実行した。前記濃縮工程によって処理溶液の体積を減量させた。

ＮＨ_４ＯＡｃ脱塩／ＡｃＯＨ濃縮のための固定相は、５ｃｍの直径を有するＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８，１０μｍ，１００Ａカラムで行った。カラム圧力は４０±５バール、流速は５０ｍｌ／ｍｉｎ、及び検出波長は２１５ナノメートルであった。移動相は以下のように行った：
溶媒Ａ：処理水中０．５％のＡｃＯＨ／ＣＨ_３ＣＮ（９５／５）；
溶媒Ｂ：処理水中０．５％のＡｃＯＨ／ＣＨ_３ＣＮ（５０／５０）；及び
溶媒Ｃ：処理水中ＮＨ_４ＯＡｃ１００のｍＭ ｐＨ６．５／ＣＨ３ＣＮ（９５／５）。

前記カラムは、１５分にわたり１００％溶媒Ａの溶出によって平衡化した。カラム充填のために、Ａｃ０Ｈ精製からの主要フラクションは、処理水の２容積で希釈した。

脱塩は次のように行った：溶媒Ａ１０分；溶媒Ｃ１０分；溶媒Ａ１０分；及び溶媒Ｃ１０分。
濃縮は次のように行った：溶媒Ａ１０分及び溶媒Ｂ１５分以上。

脱塩及び濃縮はＭＡＤ−００９−ＳＦ３２３ＴＧ１方法を使用して観察し、標的受入れ基準は次のように行った：
主要フラクション（Ｆ１）：≧不純物と共に９９．０％<０．３／０．５％；及び
サイドフラクション（ｆｐ）：>８０．０％及び<９９．０％。

収集フラクションは、２℃〜８℃で保存した。

本願明細書において引用または記載した各特許、特許出願、及び公開物の全ての開示は、この参照によって本願明細書に組み込まれるものとする。

Claims (46)

1. 方法であって、
   化学式ＩＩの化合物を提供する工程であって
   

   

   ここで、
   Ｈａｒはホモアルギニル、
   Ｇｌｙはグリシル、
   Ａｓｐはアスパルチル、
   Ｔｒｐはトリプトファニル、
   Ｐｒｏはプロリル、
   Ｃｙｓ−ＮＨ_２はシステインアミド、
   Ｍｐａはメルカプトプロピオン酸、及び、
   Ｐ_２はカルボキシル保護基である前記化学式ＩＩの化合物を提供する工程と、
   化学式ＩＩＩの化合物を形成するためにＨａｒ及びＭｐａ残基を結合させる工程と
   

   

   を有する方法。
2. 請求項１の方法において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
3. 請求項１の方法において、この方法は、さらに、
   エプチフィバチドを形成するために前記化学式ＩＩＩの化合物のＡｓｐ残基から前記Ｐ_２を除去する工程を有するものである。
4. 請求項１の方法において、この方法は、さらに、
   化学式Ｉの化合物のＨａｒ残基からＰ_１を除去する工程を有し、
   

   

   ここで、前記Ｐ_１はアミノ保護基であり、これによって前記化学式ＩＩの化合物が形成されるものである。
5. 請求項４の方法において、前記Ｐ_２は前記Ｐ_１を除去するのに適した条件下において安定なものである。
6. 請求項４の方法において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
7. 請求項４の方法において、前記Ｐ_１は９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルである。
8. 請求項４の方法において、この方法は、さらに、
   Ｍｐａ残基を以下の化学式の２−７エプチフィバチド断片に結合させる工程であって、
   

   

   ここで、ＡＣｙｓ−ＮＨ_２は活性化システインアミド残基であり、
   前記２−７エプチフィバチド断片のＭｐａ残基と前記ＡＣｙｓ−ＮＨ_２残基との間におけるジスルフィド結合を介して化学式Ｉの化合物を形成させるものである前記結合させる工程を有するものである。
9. 請求項８の方法において、この方法は、さらに、
   以下の化学式の２−６エプチフィバチド断片を、
   

   

   前記２−６エプチフィバチド断片のプロ残基を介して、活性化システインアミド残基に結合させて前記２−７エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程を有するものである。
10. 請求項９の方法において、前記活性化システインアミド残基はＨ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＮＨ_２である。
11. 請求項９の方法において、この方法は、さらに、
    以下の化学式の２−３エプチフィバチド断片と、
    

    

    以下の化学式の４−６エプチフィバチド断片と
    

    

    を結合させる工程であって、前記２−３エプチフィバチド断片のＧｌｙ残基を前記４−６エプチフィバチド断片のＡｓｐ残基に結合させて前記２−６エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程を有するものである。
12. 請求項１１の方法において、この方法は、さらに、
    保護されたカルボキシル側鎖を有するアミノ末端が保護されたＡｓｐ残基をＴｒｐ−Ｐｒｏジペプチドに結合させる工程であって、この結合は前記ジペプチドのＴｒｐ残基を介するものである、前記結合させる工程と、
    前記アミノ末端保護基をＡｓｐ残基から除去して４−６エプチフィバチド断片を形成させるものである前記除去する工程と
    を有するものである。
13. 請求項１２の方法において、この方法は、さらに、
    アミノ末端が保護されたＨａｒ残基と、保護されているか又は保護されていないＧｌｙ残基とを結合させて２−３エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程を有するものである。
14. 方法であって、
    アミノ末端が保護されたホモアルギニン残基と、保護されているか又は保護されていないグリシンとを結合させて以下の化学式の２−３エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程と、
    

    

    保護されたカルボキシル側鎖を有するアミノ末端が保護されたアスパラギン酸残基をトリプトファン−プロリンジペプチドに結合させる工程であって、この結合は前記ジペプチドのトリプトファン残基を介するものである、前記結合させる工程と、
    前記アスパラギン酸残基から前記アミノ末端保護基を除去して以下の化学式の保護された４−６エプチフィバチド断片を形成させるものである前記除去する工程と、
    

    

    前記２−３エプチフィバチドのＧｌｙ残基の前記４−６エプチフィバチドのＡｓｐ残基に対する付着を介して、前記２−３エプチフィバチド断片と４−６エプチフィバチド断片とを結合させて、以下の化学式の２−６エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程と、
    

    

    ここで、
    Ｈａｒはホモアルギニルであり、
    Ｇｌｙはグリシルであり、
    Ａｓｐはアスパルチルであり、
    Ｔｒｐはトリプトファニルであり、
    Ｐｒｏはプロリルであり、
    Ｐ_１及びＰ_３はアミノ保護基であり、及び
    Ｐ_２はカルボキシル保護基であり、
    前記２−６エプチフィバチド断片のＰｒｏ残基を介して前記２−６エプチフィバチド断片を活性化システインアミド残基に結合させて、以下の化学式の２−７エプチフィバチド断片を形成させるものである前記結合させる工程と、
    

    

    ここで、ＡＣｙｓ−ＮＨ_２は活性システインアミドであり、
    前記２−７エプチフィバチド断片のメルカプトプロピオン酸残基とＡＣｙｓ−ＮＨ_２残基との間のジスルフィド結合を介して、前記メルカプトプロピオン酸残基を前記２−７エプチフィバチド断片に付着させて、化学式Ｉの化合物を形成させるものである前記付着させる工程と、
    

    

    ここで、
    Ｍｐａはメルカプトプロピオン酸であり、
    Ｃｙｓ−ＮＨ_２はシステインアミドであり、
    前記化学式Ｉの化合物のＨａｒ残基からＰ_１を除去して化学式ＩＩの化合物を形成させるものである前記除去する工程と、
    

    

    前記化学式ＩＩの化合物のＨａｒとＭｐａ残基とを結合させて化学式ＩＩＩの化合物を形成させるものである前記結合させる工程と、
    

    

    前記化学式ＩＩＩの化合物のＡｓｐ残基のＰ_２残基を除去してエプチフィバチドを形成する前記除去する工程と
    を有する方法。
15. 請求項１４の方法において、前記Ｐ_２はＰ_１を除去するのに適した条件下において安定なものである。
16. 請求項１４の方法において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
17. 請求項１４の方法において、前記Ｐ_１は９−フルオレニルメトキシカルボニル又はベンジルオキシカルボニルである。
18. 請求項１４の方法において、前記ＡＣｙｓ−ＮＨ_２はＨ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＮＨ_２である。
19. 化学式ＩＶを有する化合物であって、
    

    

    ここで、
    Ｒ_１は水素またはＰ_１であり、
    Ｐ_１はアミノ保護基であり、
    Ｐ_２はカルボキシル保護基である化合物。
20. 請求項１９の化合物において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
21. 請求項１９の化合物において、前記Ｒ_１は水素である。
22. 請求項２１の化合物において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
23. 請求項１９の化合物において、前記Ｒ_１はＰ_１である。
24. 請求項２３の化合物において、前記Ｐ_１は９−フルオレニルメトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルである。
25. 請求項２４の化合物において、前記Ｐ_２はｔ−ブチルである。
26. 化合物であって、
    Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
    Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ｏ−Ｐ_４、及び
    Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏ−Ｐ_５）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ
    から成る群から選択され、
    ここで、
    Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニルであり、
    Ｈａｒはホモアルギニンであり、
    Ｇｌｙはグリシンであり、
    Ａｓｐはアスパラギン酸であり、
    Ｔｒｐはトリプトファンであり、
    Ｐｒｏはプロリンであり、
    Ｐ_４及びＰ_５はカルボキシル保護基である
    化合物。
27. 請求項２６の化合物において、前記Ｐ_４はペンタフルオロフェノールである。
28. 請求項２６の化合物において、前記Ｐ_５はｔ−ブチルである。
29. ３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル−システインアミド（Ｈ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＮＨ_２）。
30. 化合物であって、
    

    

    の化学式を有する化合物。
31. エプチフィバチド及びＧｌｙ−エプチフィバチドを有する組成物。
32. 請求項３１の組成物において、この組成物は、さらに、
    少なくとも９９％のエプチフィバチドと、約０．０１％〜約１％の範囲のＧｌｙエプチフィバチドとを有するものである。
33. 請求項３２の組成物において、この組成物は、さらに、
    少なくとも９９％のエプチフィバチドと、約０．０１％〜約０．１％の範囲のＧｌｙエプチフィバチドとを有するものである。
34. 請求項１の方法により形成される生成物。
35. 請求項４の方法により形成される生成物。
36. 請求項８の方法により形成される生成物。
37. 請求項９の方法により形成される生成物。
38. 請求項１１の方法により形成される生成物。
39. 請求項１２の方法により形成される生成物。
40. 請求項１３の方法により形成される生成物。
41. エプチフィバチドの精製方法であって、
    エプチフィバチド溶液をシリカに付着したオクタデシル炭素鎖を有する固定相と接触させる工程と、
    前記エプチフィバチド溶液と接触させた前記固定相をトリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液で洗浄する工程と、
    選択的に、前記エプチフィバチド溶液と接触させた前記固定相を酢酸／アセトニトリル溶液で洗浄する工程と、
    前記エプチフィバチド溶液と接触させた前記固定相をアンモニウム酸／アセトニトリル溶液で洗浄する工程と
    を有するエプチフィバチドの精製方法。
42. 請求項４１の方法において、前記トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液９５％と、アセトニトリル溶液５％とを有するものである。
43. 請求項４２の方法において、この方法は、さらに、
    前記エプチフィバチド溶液と接触させた前記固定相を、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液５０％とアセトニトリル溶液５０％とを有するトリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液を用いて洗浄する工程を有するものである。
44. 請求項４１の方法において、前記酢酸／アセトニトリル溶液は、０．５％酢酸水溶液９５％とアセトニトリル溶液５％とを有するものである。
45. 請求項４４の方法であって、この方法は、さらに、
    前記エプチフィバチドと接触させた前記固定相を、０．５％酢酸水溶液５０％とアセトニトリル溶液５０％とを有する酢酸／アセトニトリル溶液を用いて洗浄する工程を有するものである。
46. 請求項４１の方法において、前記アンモニウム酸／アセトニトリル溶液は１００ｍＭアンモニウム酸水溶液９５％とアセトニトリル溶液５％とを有する溶液である。